小RNA miR-20b在制備抗炎藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種非編碼小RNA基因miR-20b在制備抗炎藥物中的應(yīng)用，所述炎癥是主要由反應(yīng)性Th17細胞廣泛參與并發(fā)揮重要致病作用的炎癥反應(yīng)。本發(fā)明所述的miR-20b在反應(yīng)性Th17細胞中特異性低表達，且分別給na?veCD4+T細胞轉(zhuǎn)染miR-20b模擬體或miR-20b陰性對照后，miR-20b模擬體能夠顯著減少細胞因子白介素17A基因水平以及蛋白水平表達，且miR-20b不改變Th17細胞增殖和凋亡的水平，表明miR-20b能夠有效抑制Th17細胞的分化且不依賴對細胞數(shù)量的調(diào)控。
【專利說明】小RNA miR-20b在制備抗炎藥物中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物制藥【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及非編碼小RNA基因 miR-20b在藥物上的應(yīng)用， 特別涉及miR-20b在制備涉及自身免疫性疾病相關(guān)藥物和抗炎藥物的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)是維持機體正常運行的基礎(chǔ)，其通過產(chǎn)生各種免疫細胞及分泌各種 細胞因子和抗體來抵御外來物侵擾或調(diào)控相關(guān)免疫進程，而免疫細胞的異常分化或細胞因 子的表達異常則會導致各種炎癥的發(fā)生。
[0003] Thl7細胞可以分泌細胞因子IL-17A和IL-17F，并表達亞系特異性轉(zhuǎn)錄因子R0RC (小鼠中為RORYt)。在Thl7細胞的產(chǎn)生過程中，轉(zhuǎn)錄生長因子-β (TGF-β)和炎癥細胞 因子IL-6, IL-21，IL-Ιβ和IL-23等發(fā)揮重要調(diào)控作用。Thl7細胞對于胞外病原體的清 除至關(guān)重要，其中包括念球菌屬和克雷伯氏菌屬等病原菌，但是，在特定條件下，Thl7細胞 及其效應(yīng)性細胞因子IL-17、IL-21、IL-22、GM-CSF和CCL20等也會引起一些自身免疫性和 炎癥性疾病的發(fā)生，例如類風濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化癥、銀屑病、腸炎、過 敏和哮喘等。
[0004] 微小RNA (microRNAs，miRNAs)是一個龐大的家族，大約為21nt (核苷酸）長度的 非編碼RNAs，通過轉(zhuǎn)錄水平或翻譯水平調(diào)節(jié)基因表達從而發(fā)揮其調(diào)控作用，廣泛存在于包 括植物和動物在內(nèi)的真核生物中。miRNAs可以影響生長發(fā)育、細胞進程(增殖、凋亡、粘附、 遷移等）等，對人類癌癥發(fā)生及免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)均發(fā)揮重要調(diào)控作用。
[0005] 近年，miRNAs在免疫系統(tǒng)中的重要作用日益被揭示，已經(jīng)證實miRNAs廣泛參與了 免疫系統(tǒng)的發(fā)育，以及各種淋巴細胞的分化和抗體產(chǎn)生。在一些炎癥性疾病中，諸如類風濕 關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥和系統(tǒng)性紅斑狼瘡，miRNAs廣泛參與了疾病的起始和進展。而通過 干預相關(guān)miRNAs的異常表達可以有效緩解疾病的發(fā)生和發(fā)展。
[0006] 我們認為通過鑒定并研究miRNAs在某些炎癥中的表達及作用，可以發(fā)現(xiàn)一批關(guān) 鍵的miRNAs從而可以有效提商這種炎癥的診斷及治療水平。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明目的是提供一種小分子RNA基因 miR_20b在制備抗炎藥物中的應(yīng)用，該 miR-20b能夠有效抑制由Thl7細胞引起的炎癥反應(yīng)。
[0008] 本發(fā)明所述的miR-20b在Thl7細胞中特異性低表達，且分別給na'ive⑶4+ T細 胞轉(zhuǎn)染miR-20b模擬體或miR-20b陰性對照后，miR-20b模擬體能夠顯著減少細胞因子白 介素17A基因水平以及蛋白水平表達，且miR-20b不改變Th 17細胞增殖和凋亡的水平，表 明miR-20b能夠有效抑制Thl7細胞的分化且不依賴對細胞數(shù)量的調(diào)控。
[0009] 本發(fā)明所述的應(yīng)用為小RNA miR-20b在制備抗炎藥物中的應(yīng)用，該治療抗炎的藥 物為治療由反應(yīng)性Thl7細胞廣泛參與并發(fā)揮重要致病作用的炎癥反應(yīng)的藥物，如特別參 與的涉及自身免疫性疾病及炎癥相關(guān)的藥物。
[0010]本發(fā)明提供的 miR-20b 由以下核苷酸組成：5' -CAAAGUGCUCAUAGUGCAGGUAG-3'。 [0011] 本發(fā)明首先在體外分化由流式細胞儀分選的幼稚型（na'ive)CD4 + T細胞，從而得 到體外分化的中性（1^11壯&1)、1111、1112、11117、誘導型調(diào)節(jié)性1'(1'^8)細胞，并利用實時定 量PCR (real-time PCR)技術(shù)分析miR-20b的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分別與neutral分化細胞相 t匕，miR-20b在Thl7細胞中較之Thl、Th2和Treg細胞特異性低表達。
[0012] 其次，本發(fā)明中流式分選na'ive⑶4+ T細胞，在Thl7條件下分化培養(yǎng)，分別給細胞 轉(zhuǎn)染 miR_20b 陰性對照（miR_20b NC)及模擬體（miR_20b mimics)后，miR_20b mimics 能 夠顯著減少細胞因子白介素17A基因水平以及蛋白水平表達，表明miR-20b能夠有效抑制 Thl7細胞的分化。
[0013] 同時，本發(fā)明中流式分選na'ive⑶4+ T細胞，在Thl7條件下分化培養(yǎng)，分別給細 胞轉(zhuǎn)染miR-20b陰性對照（miR-20b NC)及模擬體（miR-20b mimics)后，檢測發(fā)現(xiàn)miR-20 mimics在體外對Thl7細胞的增殖和凋亡是沒有影響的。說明miR-20b在本質(zhì)上對Thl7細 胞的分化產(chǎn)生了抑制，而不會改變細胞的數(shù)量。
[0014] 因此，miR-20b在制備由Thl7細胞特別參與的涉及自身免疫性疾病及炎癥相關(guān)的 藥物方面有巨大潛力。
[0015] 為讓本發(fā)明的上述和其它目的、特征和優(yōu)點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例， 并配合附圖，作詳細說明如下。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016] 圖1 :體外不同分化方向⑶4+ T細胞中miR-20b的表達檢測； 圖2 :流式細胞術(shù)檢測miR-20b在體外抑制Thl7細胞表達IL-17A ; 圖3 :real-time PCR技術(shù)檢測miR-20b在體外抑制Thl7細胞表達IL-17A ; 圖4 :ELISA技術(shù)檢測miR-20b在體外抑制Thl7細胞分泌IL-17A ; 圖5 :miR-20b在體外對Thl7細胞增殖影響的統(tǒng)計學分析； 圖6 :流式細胞術(shù)檢測miR-20b在體外對Thl7細胞的增殖沒有影響； 圖7 :流式細胞術(shù)檢測miR-20b在體外對Thl7細胞的凋亡沒有影響。

【具體實施方式】
[0017] 實施例1 : 選取6-8周野生型小鼠，制備脾及淋巴結(jié)單細胞懸液，用APC-anti⑶4, Pe-Cy5-anti CD44，PE-anti CD62L抗體，4°C避光表面染色15min;RPMI 1640培養(yǎng)基，4°C洗細胞兩次； 用RPMI 1640培養(yǎng)基將細胞濃度調(diào)整為5X107 cell/ml，流式分選CD4+ 0)44^0)621^^10 為naive CD4+ T細胞；得到naive CD4+ T細胞前，用10 μ g/ml CD3抗體包板，37°C，2h備 用；按下面細胞因子濃度刺激細胞，使其向neutral (培養(yǎng)48小時）、Thl (培養(yǎng)48小時）、 Th2 (培養(yǎng)48小時）、Thl7 (培養(yǎng)72小時）和Treg (培養(yǎng)72小時）方向分化。
[0018] Neutral: anti_CD28 1 μ g/ml; rmIL-2 2ng/ml; anti-IL-4 10 μg/ml; anti-IFN-y 10 μ g/ml〇
[0019] Thl:anti_CD28 1 μ g/ml; rmIL-2 2ng/ml; rmIL-12 5 ng/mL; anti-IL-4 10 μ g/ml〇
[0020] Th2:anti_CD28 1 μ g/ml; rmIL-2 2ng/ml; IL-4 20 ng/mL; anti-IFN-γ 10 μ g/ml〇
[0021] Thl7:anti-CD28 lug/ml; TGF-β 2ng/mL; IL-6 10 ng/mL; anti-IL-4 10ug/ ml; anti-IFN- γ 10ug/ml〇
[0022] Treg:anti_CD28 1 μ g/ml; rmIL-2 2ng/ml; TGF-β 2 ng/mL。
[0023] 上面培養(yǎng)細胞用Trizol法提取細胞總RNA，分別取總RNA各10ng為模板，然后利 用 TaqMan? MicroRNA Reverse Transcription Kit (Life Technologies)反轉(zhuǎn)錄為 cDNA， 反應(yīng)體系如下：dNTPs (100mM)0. 15 ul;MultiScribe? 逆轉(zhuǎn)錄酶1 ul;10XRTbuffer 1. 5 μ 1 ；RNase inhibitor (20 U/ μ 1)0. 19 μ 1 ；RT primer 2. 0 μ 1 ；Total RNA 5 μ 1 ； DEPC H20 補至總體積 15μ1。反應(yīng)條件：16°C 30 min，42°C 30 min，85°C 5 min 使酶失活， 4°C保存。
[0024] 再以 cDNA 為模板，利用 Premix Ex Taq? (Probe qPCR) (Takara)試劑盒進行 Real-time PCR。反應(yīng)體系如下：2XPCR mix 10 ul;cDNA 2 ul;Probe 0.4 ul;DEPC H20 7.6 μ?。反應(yīng)條件：95DC，2 min;95DC 15 sec，60DC 30 sec，40 個循環(huán)，以 U6 為內(nèi)參 對照。采用f λλ ct相對定量法來處理數(shù)據(jù)。
[0025] Real-time PCR 結(jié)果顯不，相對于 neutral 分化細胞，miR_20b 在 Thl、Th2、Treg 分 化細胞中高表達，分別上調(diào)為1. 54、3. 07和1. 53倍，在Thl7分化細胞中特異性低表達，下 調(diào)達0. 53倍（圖1)。
[0026] 實施例2 : 按照實施例1中方法分選得到na'ive⑶4+ T細胞。FAM標記的miR_20b mimics及nc 由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成，序列分別如下： miR-20b mimics ： 5, -CAAA⑶GCUCAUA⑶GCAG⑶AG-3， 5, -ACCUGCACUAUGAGCACUU腳U-3 miR-20b nc ： 5, -UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3， 5, -ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3， 所得na'ive CD4+ T細胞按照實施例1中方法使其向Thl7細胞方向分化，同時將FAM 標記的miR-20b mimics及nc分別轉(zhuǎn)染至上面細胞中，轉(zhuǎn)染試劑為美國invitrogen公司 的Lipofectamine? 2000試劑，繼續(xù)培養(yǎng)72h后，收獲細胞前4-6h，在新鮮的培養(yǎng)基中加入 PMA、Inomycin和Golgi Plug以刺激細胞分泌相應(yīng)細胞因子達到檢測豐度。吸取細胞于5ml BD流式管，補加冰冷的1 XPBS，4°C，1400rpm離心7min，棄上清，lml 2%甲醛重懸細胞，室溫 避光固定30min。固定結(jié)束，用冰冷的PBS清洗細胞兩次后，用2ml 0.5% Saponin重懸，室 溫避光打孔 30min。爾后 4°C，1400rpm 離心 7min，棄上清，加 FITC- anti-mouse IFN-γ、 PE- anti-mouse IL_17A、APC_ anti-mouse CD4,4°C，避光染色30min。染色結(jié)束，補滿0.5% Saponin，4°C，1400rpm 離心 7min，棄上清。用 4ml 1 XPBS 重懸，4°C，1400rpm 離心 7min 后 用美國BD公司FACS Calibur Flow Cytometer儀器檢測CD4+IL-17A+細胞比例。
[0027] 結(jié)果顯示miR-20b mimics可以顯著抑制CD4+IL-17A+細胞的比例（圖2)。
[0028] 實施例3 : 完全按照實施例2中方法得到na'ive CD4+ T細胞，同時使其向Thl7細胞方向分化并 將miR-20b抑制劑（inhibitor)、mimics及nc分別轉(zhuǎn)染至上面細胞中，培養(yǎng)72h后，收獲 細胞，按照實施例1中方法得到細胞的總RNA，并按照實施例1中Real-time PCR方法分析 IL-17A 和 IL-17F 表達。
[0029] miR_20b inhibitor 序列如下： 5, -CUACCUGCACUAUGAGCACUUUG-3， 結(jié)果顯示miR-20b mimics可以顯著抑制IL-17A和IL-17F的表達（圖3)。
[0030] 實施例4 : 按照實施例3中方法得到na'ive CD4+ T細胞，同時使其向Thl7細胞方向分化并將 miR-20binhibitor、mimics及nc分別轉(zhuǎn)染至上面細胞中，培養(yǎng)72h后，收獲上清，用美國 BioLegend公司的Mouse IL-17 ELISA kits試劑盒按照ELISA方法分析IL-17A的分泌表 達。
[0031] 結(jié)果顯不miR_20b mimics可以顯著抑制IL-17A的分泌表達（圖4)。
[0032] 實施例5 : 用美國BD公司的APC BrdU Flow Kit檢測miR-20b對Thl7細胞增殖的影響。按照 實施例2中方法得到na'ive CD4+ T細胞，同時使其向Thl7細胞方向分化并將FAM熒光標 記miR-20b mimics及nc分別轉(zhuǎn)染至上面細胞中。按照終濃度為10 μΜ在培養(yǎng)細胞起始或 者收獲細胞1小時前于細胞培養(yǎng)上清中加入BrdU進行孵育。轉(zhuǎn)染72小時后，細胞用ΡΕ-antinouse CD4 抗體于冰上染色 15min。然后用 Cytofix/Cytoperm Buffer 和 Cytoperm Permeabilization Buffer Plus對細胞進行固定和打孔，并用APC標記的BrdU抗體染色， 最后用美國BD公司FACS Calibur Flow Cytometer儀器檢測細胞增殖。
[0033] 結(jié)果顯示miR-20b對Thl7細胞增殖沒有影響（圖5和圖6)。
[0034] 實施例6 : 按照實施例2中方法得到na'ive⑶4+ T細胞，同時使其向Thl7細胞方向分化并將FAM 突光標記miR-20b mimics及nc分別轉(zhuǎn)染至上面細胞中。細胞轉(zhuǎn)染72小時后，用天津三箭 生物技術(shù)有限公司的Annexin V-APC Cell Apoptosis Analysis Kit檢測miR_20b對Thl7 細胞凋亡的影響。
[0035] 結(jié)果顯示miR-20b對Thl7細胞凋亡沒有影響（圖7)。
[0036] 雖然本發(fā)明已以較佳實施例披露如上，然而其并非用以限定本發(fā)明，任何所屬技 術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明精神和范圍內(nèi)，當可作些許之更動與改進，因此本發(fā)明 之保護范圍當視權(quán)利要求所界定者為準。
【權(quán)利要求】
1. 小RNA miR-20b在制備抗炎藥物中的應(yīng)用。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述抗炎藥物為治療由反應(yīng)性Thl7細胞廣 泛參與并發(fā)揮重要致病作用的炎癥反應(yīng)的藥物。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述miR-20b由以下核苷酸組成： 5, -CAAA⑶GCUCAUA⑶GCAG⑶AG-3，。
【文檔編號】A61P37/02GK104147615SQ201410349266
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年7月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月22日
【發(fā)明者】尹芝南, 吳震州, 趙立青, 朱恩東 申請人:南開大學