一種三嵌段聚合物膠束、制備方法及應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種三嵌段聚合物膠束、制備方法及應用。它由三嵌段聚合物自組裝形成膠束，以脂肪酸為內核，中間層為聚-L-賴氨酸，外殼為N-琥珀酰殼聚糖；疏水性內核用于包載疏水性的抗癌藥物，攜帶正電荷的中間層用于吸附基因，膠束降解后能夠釋放所負載的基因，親水性的外殼用于降低聚-L-賴氨酸的毒性，延長其在系統(tǒng)給藥后的血液循環(huán)時間。本發(fā)明提供的膠束在顆粒形成后再吸附基因，有利于控制膠束顆粒的尺寸以及膠束顆粒的規(guī)?；苽?。這種遞送系統(tǒng)可以在血清存在的條件下轉染基因進入靶細胞并調節(jié)目的蛋白的表達，具有良好的生物相容性。本發(fā)明提供的膠束能同時攜載疏水性的抗癌藥物和基因，發(fā)揮協(xié)同增效的抗腫瘤作用。
【專利說明】一種三嵌段聚合物膠束、制備方法及應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于藥物制劑領域，涉及一種N-琥珀酰殼聚糖（NSC)-聚-L-賴氨酸 (PLL)-脂肪酸（FA)三嵌段聚合物膠束、制備方法及其應用。

【背景技術】
[0002] 隨著惡性腫瘤的發(fā)病率與死亡率劇增，腫瘤的治療已經(jīng)成為亟待解決的全球性 難題。然而在治療腫瘤疾病時，藥物治療的效果欠佳，大部分化療藥物水溶性差，對腫瘤 部位缺乏選擇性（Cheong I，Huang X，Bettegowda C, Diaz LAJ, Kinzler KW, Zhou SB, et al. A bacterial protein enhances the release and efficacy of liposomal cancer drugs. Science. 2006; 314:1308 - 1311)，并且隨著抗腫瘤藥物的廣泛使用，多 數(shù)腫瘤細胞產(chǎn)生多藥耐藥性，成為腫瘤化療失敗的關鍵因素之一（Gullotti E, Yeo Y. Extracellulary activated nanocarriers: a new paradigm of tumor targeted drug delivery. Mol. Pham. 2009, 6:1041-1051. )〇
[0003] 腫瘤產(chǎn)生多藥耐藥現(xiàn)象的機制比較復雜，一般認為有兩種：一種是由于膜轉運 蛋白的過度表達所導致耐藥機制，包括腫瘤細胞表面表達的大量的外排蛋白（P-糖蛋白， p_gp)及多藥耐藥相關蛋白（Multidrug resistance-associated proteins, MRPs)，可 以將進入腫瘤細胞中的藥物排出細胞外，降低藥物在細胞內的濃度而產(chǎn)生耐藥（Fletcher JI, Haber M, Henderson MJ, Norris MD. ABC transporter in cancer: more than just drug dfflux pumps. Nat Rev Cancer. 2010, 10:147-156)。二是非轉運機制導 致的耐藥，包括細胞解毒系統(tǒng)活性增強、胞內抗凋亡防御機制激活等（Zhao W，Bao P， You H. Resveratrol down-regulates surviving and induces apoptosis in human multidrug-resistant SPC-A-l/CDDP cells. Oncol Rep. 2010, 23:279-286·)，如凋亡相 關基因 Survivin、Bcl-2等表達異常，影響對凋亡過程調控，抑制藥物誘導的細胞凋亡而引 起耐藥，同時也能特異性激活P-糖蛋白的表達而產(chǎn)生耐藥。大部分抗腫瘤藥物在誘導細胞 凋亡的同時也激活了多藥耐藥性。
[0004] siRNA通過干擾細胞內基因的表達開啟了逆轉細胞耐藥的新方法。siRNA入胞后 與細胞中的蛋白質結合形成RNA誘導沉默復合物（RNA- induced silencing complex, RISC)，該復合物尋找并結合特定序列的mRNA， 對mRNA進行酶切。酶切后的mRNA 片段被胞質中的核酸酶非特異性降解，結果使特定蛋白無法表達，實現(xiàn)基因沉默 (Jackson AL, Linsley PS. Recognizing and avoiding siRNA off target effects for target identification and therapeutic application. . Nat Rev Drug Discov. 2010,9:57-67. )〇
[0005] 但是siRNA體內易降解，且?guī)в胸撾姾桑茈y透過細胞膜，因此需要借助載體提高 siRNA的穩(wěn)定性和跨膜轉運能力，促進其發(fā)揮干擾效應。目前，siRNA的遞送載體主要分為 病毒與非病毒兩類。前者包括各種逆轉錄病毒、腺病毒等[Robbins PD, Ghivizzani SC. Viral vectors for gene therapy. Pharmacol Ther. 1998, 80(1): 35-47·]，其轉染率高， 但存在免疫原性，毒性大和缺乏靶向性等缺點，且病毒載體攜帶的基因大小受限，不易大量 生產(chǎn)和控制；非病毒載體包括脂質體、膠束等具有低免疫原性和相對高安全性等優(yōu)點已經(jīng) 日益受到國內外學者重視，成為研究熱點。非病毒載體中由于陽離子聚合物其穩(wěn)定性好，制 備成熟，結構可調易控，且方便修飾等已成為基因藥物或抗腫瘤藥物的主要載體。報道的陽 離子聚合物種類很多，如聚乙烯亞胺（polyethylenimine，PEI)、聚酰胺（polymidoamine， PAMAM)、多聚賴氨酸（PLL)、魚精蛋白、殼聚糖（chitosan，CS)等。其中PEI和PAMAM，由于 其表面有豐富氨基，生理條件下質子化而具有較高正電荷，能與帶負電荷的siRNA發(fā)生靜 電作用，形成復合納米粒子。同時，利用載體外部的正電作用，可以與帶負電荷的細胞膜相 互作用，達到保護siRNA不受細胞溶酶體酶降解的作用。但該類聚合物由于細胞內難以降 解，加至較高的細胞毒性，一定程度上限制了其應用。


【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明針對現(xiàn)有技術存在的缺陷與不足，提供一種具有良好的生物相容性和生物 可降解性，可同時攜載疏水性藥物與基因，發(fā)揮協(xié)同增效的抗腫瘤作用的共轉運疏水性藥 物與基因的兩親性三嵌段聚合物膠束、制備方法及其應用。
[0007] 實現(xiàn)本發(fā)明目的的技術方案之一是提供一種三嵌段聚合物膠束的制備方法，包括 以下步驟： 1、 將N-琥珀酰殼聚糖溶解于蒸餾水中，再將聚L賴氨酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙 基）碳二亞胺和N -羥基琥珀酰亞胺分別加入到N-琥珀酰殼聚糖溶液中，攪拌溶解得到反 應液；所述的反應液中，N-琥珀酰殼聚糖、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺和N -羥 基琥拍酰亞胺的濃度依次為10?15 mg · mL-1、5?10 mg · mL-1和2?3 mg · mL-1 ;調節(jié) 反應液的pH為5.0?6.0,磁力攪拌、室溫條件下反應48?72 h后，反應液用截留分子量 為3500?5000的透析袋透析，透析液經(jīng)過濾、冷凍干燥，得到N-琥珀酰殼聚糖-聚L賴氨 酸二嵌段聚合物； 2、 將脂肪酸加入到干燥的二氯甲烷中，磁力攪拌溶解得到濃度為4?12 mg · ml/1的 溶液，再緩慢加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺和N -羥基琥珀酰亞胺，1-乙 基-(3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺和N -羥基琥珀酰亞胺的濃度分別為5?10 mg · ml/1 和4?6 mg ^!/1，在40?60°C的溫度條件下反應2?4 h后，旋轉蒸發(fā)除去溶劑，得到白 色粉末狀固體即為活化的脂肪酸； 3、 將步驟2得到的活化的脂肪酸加入到甲醇中，攪拌溶解得到濃度為5?10 mg · ml/1 的活化脂肪酸甲醇溶液；將步驟1得到的N-琥珀酰殼聚糖-聚L賴氨酸溶解于蒸餾水中， 得到濃度為10?30 mg 1171的N-琥珀酰殼聚糖-聚L賴氨酸水溶液；將等體積的N-琥 珀酰殼聚糖-聚L賴氨酸水溶液緩慢滴加到活化脂肪酸甲醇溶液中，在溫度為60?70 °C 的條件下反應24?48 h后，反應液用截留分子量為3500?5000的透析袋透析，得到的 透析液經(jīng)2000?3000 rpm離心處理，取上清液冷凍干燥，得到N-琥珀酰殼聚糖-聚L賴 氨酸-脂肪酸三嵌段聚合物；將得到的三嵌段聚合物溶于去離子水中，制備濃度為1?2 mg. ml/1的空白膠束溶液； 4、 將疏水性藥物用適量DMS0溶液溶解，緩慢滴加到步驟3得到的空白膠束溶液中，藥 物的終濃度為0. 1?0. 3 mg. ml/1 ;超聲處理20?30 min,磁力攪拌1?2 h后，置于截留 分子量為3500?5000的透析袋中透析處理；透析液用0.45 μ m微孔濾膜過濾，得到載 藥膠束； 5、將步驟4得到的載藥膠束與基因按N/P為20?40 :1混合，N為載藥膠束三嵌段聚合 物中的氨基，P為基因中磷酸根基團，在溫度為25?37 °C的條件下震蕩孵育20?30 min， 即得N-琥珀酰殼聚糖-聚-L-賴氨酸-脂肪酸三嵌段聚合物共轉運疏水性藥物與基因膠 束。
[0008] 本發(fā)明技術方案中，所述的疏水性藥物為阿霉素、蛇床子素、紫杉醇、去氫駱駝蓬 堿、喜樹堿中的一種。
[0009] 所述的基因為多藥耐藥mdrl基因、Bcl-2家族bax基因、bak基因、腫瘤壞死因 子-α基因、白細胞介素-2基因及所述基因所對應的siRNA中的一種。
[0010] 所述的N-琥珀酰殼聚糖的粘均分子量為8000?15000道爾頓。
[0011] 所述的N-琥珀酰殼聚糖中琥珀?；娜〈葹?0 %?50 %。
[0012] 所述的聚-L-賴氨酸的粘均分子量為2000?5000道爾頓。
[0013] 所述的脂肪酸的碳鏈長度為8?18,包括正辛酸、癸酸、月桂酸、豆蘧酸、軟脂酸和 硬脂酸中的一種。
[0014] 實現(xiàn)本發(fā)明目的的技術方案還包括一種按上述制備方法得到的三嵌段聚合物膠 束，及其將其用作同時攜載疏水性的抗癌藥物和基因的抗腫瘤靶向藥物制劑。
[0015] 本發(fā)明所述的三嵌段聚合物，它的結構式為 y 0)z，其中，X為未經(jīng)琥珀?；〈臍ぞ厶菃误w在總殼聚糖單體中所占的比例，X 的范圍為0. 5?0. 8 ;l-x為殼聚糖單體中琥珀酰基的取代度，1-x的范圍為0. 2?0. 5 ;n 為聚-L-賴氨酸中L-賴氨酸的聚合度，η的范圍為10?30 ;y為聚-L-賴氨酸的接枝率，y 的范圍為0. 02?0. 08 ;m為脂肪酸中碳的個數(shù)，m的范圍為8?18 ;z為脂肪酸的接枝率， z的范圍為0. 2?0. 4 ;所述的三嵌段聚合物以脂肪酸為內核，內核表面接枝的聚-L-賴氨 酸為中間層，外殼為N-琥珀酰殼聚糖。
[0016] 本發(fā)明的原理是：N-琥珀酰殼聚糖具有良好水溶性，可以作為親水性外殼，但其 氨基在生理條件下不被質子化，在作為基因載體方面受到了一定的限制。聚-L-賴氨酸廣 泛的用于基因的轉染，但單獨使用聚-L-賴氨酸轉染基因的效率很低。為了解決這一問題， 本發(fā)明將N-琥珀酰殼聚糖與聚-L-賴氨酸耦連，帶正電荷聚-L-賴氨酸用于吸附siRNA，并 且聚-L-賴氨酸在體內能夠降解為α-氨基酸而被人體吸收，具有良好的生物相容性。而 脂肪酸具有良好的柔韌性和疏水性，可以作為疏水端包載疏水性藥物。
[0017] 本發(fā)明提供的Ν-琥珀酰殼聚糖-聚-L-賴氨酸-脂肪酸三嵌段聚合物共轉運疏 水性藥物與基因膠束，它可以同時攜載疏水性的抗癌藥物和基因，因此，在用于癌癥治療給 藥系統(tǒng)時，能夠發(fā)揮協(xié)同增效的作用。并且，相對于將水溶性的陽離子聚合物與基因混合 后可能會導致不可控的大尺寸顆粒的形成，這種具有獨特的三層結構的膠束顆粒在顆粒 形成后再吸附基因，有利于控制膠束顆粒的尺寸以及膠束顆粒的規(guī)?；苽?。合適粒徑 的聚合物膠束具有優(yōu)良的組織透過性以及增強透過和滯留（enhancedpermeability and retention，EPR)效應，因而，具有天然的被動祀向作用。
[0018] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點： 1、本發(fā)明所采用的載體材料N-琥珀酰殼聚糖和聚-L-賴氨酸具有良好的良好的生物 相容性和生物可降解性，所制備的聚合物膠束具有優(yōu)良的組織透過性以及增強滲透和滯留 效應，從而具備天然的被動靶向作用。
[0019] 2、本發(fā)明制備的具有獨特的三層結構的膠束顆粒在顆粒形成后再吸附基因，有利 于控制膠束顆粒的尺寸以及膠束顆粒的規(guī)?；a(chǎn)。
[0020] 3、本發(fā)明制備的具有獨特的三層結構的膠束顆?？梢栽谘宕嬖诘臈l件下轉染 基因進入靶細胞并調節(jié)目的蛋白表達，并且可以同時攜載抗腫瘤藥物和基因，發(fā)揮協(xié)同增 效的抗腫瘤作用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021] 圖1為本發(fā)明提供的N-琥珀酰殼聚糖-聚-L-賴氨酸-軟肪酸三嵌段聚合物合 成示意圖； 圖2為本發(fā)明實施例制備N-琥珀酰殼聚糖-聚-L-賴氨酸-軟肪酸三嵌段聚合物及 其中間產(chǎn)物的紅外圖譜； 圖3為本發(fā)明實施例制備N-琥珀酰殼聚糖-聚-L-賴氨酸-軟肪酸三嵌段聚合物及 其中間產(chǎn)物的iH-NMR圖譜； 圖4為本發(fā)明實施例采用芘熒光探針法測定N-琥珀酰殼聚糖-聚-L-賴氨酸-軟肪 酸三嵌段聚合物在不同緩沖液中的臨界膠束濃度； 圖5為本發(fā)明實施例中N-琥珀酰殼聚糖-聚-L-賴氨酸-軟肪酸三嵌段聚合物在水 溶液中自組裝形成膠束的透射電鏡圖； 圖6為本發(fā)明實施例中N-琥珀酰殼聚糖-聚-L-賴氨酸-軟肪酸三嵌段聚合物在水 溶液中自組裝形成膠束的粒徑分布圖； 圖7為本發(fā)明實施例1中N-琥珀酰殼聚糖-聚-L-賴氨酸-軟肪酸三嵌段聚合物載 阿霉素膠束在不同緩沖液中的體外釋放曲線； 圖8為本發(fā)明實施例2中利用瓊脂糖凝膠電泳測定N-琥珀酰殼聚糖-聚-L-賴氨 酸-軟肪酸三嵌段聚合物載siRNA膠束結合siRNA的能力的結果圖； 圖9為本發(fā)明實施例2中利用瓊脂糖凝膠電泳測定N-琥珀酰殼聚糖-聚-L-賴氨 酸-軟肪酸三嵌段聚合物載siRNA膠束的血清穩(wěn)定性實驗的結果圖； 圖10為本發(fā)明實施例2中利用瓊脂糖凝膠電泳測定N-琥珀酰殼聚糖-聚-L-賴氨 酸-軟肪酸三嵌段聚合物載siRNA膠束的核酸酶穩(wěn)定性實驗的結果圖； 圖11為本發(fā)明實施例3中N-琥珀酰殼聚糖-聚-L-賴氨酸-軟肪酸三嵌段聚合物共 轉運阿霉素與siRNA膠束的透射電鏡圖； 圖12為本發(fā)明實施例3中N-琥珀酰殼聚糖-聚-L-賴氨酸-軟肪酸三嵌段聚合物共 轉運阿霉素與siRNA膠束的粒徑分布圖； 圖13為本發(fā)明實施例3中N-琥珀酰殼聚糖-聚-L-賴氨酸-軟肪酸三嵌段聚合物共 轉運阿霉素與siRNA膠束在不同緩沖液中放置不同時間后粒徑和電位變化的結果對比圖。

【具體實施方式】
[0022] 下面結合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步描述。
[0023] 實施例1 本實施例提供一種N-琥珀酰殼聚糖-聚-L-賴氨酸-軟肪酸三嵌段聚合物載阿霉素 膠束。
[0024] 參見附圖1，它為本發(fā)明提供的N-琥珀酰殼聚糖-聚-L-賴氨酸-軟肪酸三嵌段 聚合物合成路線示意圖。在本實施例中，具體的合成方法包括以下步驟： 1、N-琥珀酰殼聚糖-聚L賴氨酸（NSC-PLL)的合成 將0.4 g NSC溶解于25 mL蒸餾水中，攪拌形成溶液。將0. 32 g PLL、0. 192 g EDOHC1 和0.057 g NHS分別投入上述反應液中，LI mol.L-1 HcL調ρΗ5·6，反應液磁力攪拌，室溫 反應7 2h后，置透析袋（MWC0=3 500)中，蒸餾水透析3 d，過濾后冷凍干燥，得NSC-PLL。
[0025] 2、軟肪酸（PA)的活化 將0.128 g軟肪酸加入到25 ml干燥的二氯甲烷中，磁力攪拌溶解，然后緩慢加入 0. 192 g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺（EDC)，和0.115 g N-羥基琥珀酰亞胺 (NHS)，40°C繼續(xù)反應2 h。旋轉蒸發(fā)除去溶劑，得到白色粉末狀固體即為PA-NHS。
[0026] 3、N-琥珀酰殼聚糖-聚L賴氨酸-軟肪酸（NSC-PLL-PA)的合成 將0. 175 g活化的軟肪酸加入到25 ml甲醇的燒瓶中，攪拌至其溶解。0.5 g NSC-PLL 加入到25 mL蒸餾水中，溶解后緩慢將其滴加入燒瓶中，70 °C下反應24 h.反應結束后將 燒瓶內的液體加入到透析袋中（MW=3500)，蒸餾水透析3 d后，將透析液3000 rpm離心10 min，取上清液冷凍干燥，得NSC-PLL-PA。
[0027] 本實施例提供的N-琥珀酰殼聚糖-聚-L-賴氨酸-軟肪酸三嵌段聚合物及其中 間產(chǎn)物的紅外圖譜如圖2所示，圖中：曲線a為CS，曲線b為NSC，曲線c為PLL，曲線d為 NSC-PLL，曲線e為NSC-PLL-PA ;從圖2可以看出，與CS相比，NSC中1750 cnf1處為游離羧 基吸收峰，1625 cnf1和1550 cnf1處分別為酰胺中C = 0伸縮振動吸收峰和N-Η彎曲振 動吸收峰，NSC-PLL中保留了 NSC中1600 cnf1和1525 cnf1處酰胺中C = 0伸縮振動吸收 峰和N-Η彎曲振動吸收峰，1750 cnf1處游離羧基吸收峰，并且在3500 cnf1處出現(xiàn)PLL中 氨基N-Η吸收峰，NSC-PLL-PA中由于軟肪酸的連接，在2886 cnT1處表征出亞甲基C-Η伸縮 振動峰強度。
[0028] 本實施例提供的N-琥珀酰殼聚糖-聚-L-賴氨酸-軟肪酸三嵌段聚合物及其中 間產(chǎn)物的 1H-NMR圖譜如圖3所示，圖中：曲線a為CS，曲線b為NSC，曲線c為PLL，曲線d 為NSC-PLL，曲線e為NSC-PLL-PA ;從圖3可以看出，NSC的1HNMR譜a可歸屬如下：δ =4. 5 〇11，糖鏈），3=3.35?3.83(!13，！14，冊，冊糖鏈），2.61〇12糖鏈），3=2.35 ppm (multiplet, CH2CH2 of succinyl). NSC-PLL 除保留 NSC 中的質子峰以外，還出現(xiàn)了 PLL的質子峰，歸屬如下：δ =4. 1 (單峰，a)，δ =3. 0?3. 2 (多峰，f)，δ =3. 0?3. 2 (多 峰，b，c，e)而在NSC-PLL-PA的圖譜中，除保留上述質子峰以外，δ =〇· 82 ppm附近出現(xiàn)了 CH2對應的質子峰，NSC-PLL-PA在D20溶劑中，軟脂?；膩喖谆鶜湫盘柡苋?，產(chǎn)生這種現(xiàn) 象的原因是在重水溶劑中，NSC-PLL-PA因自聚集使得疏水?；奂谀z束粒子的內部，從 而核磁共振信號減弱，該現(xiàn)象也顯示了 NSC-PLL-PA在D20溶劑中有很強的膠束化行為。
[0029] 對本實施例提供的N-琥珀酰殼聚糖-聚-L-賴氨酸-軟肪酸三嵌段聚合物在不 同緩沖液中的臨界膠束濃度采用芘熒光探針法進行測定，取2. 021 mg芘用100 mL丙酮溶 解，配成ΚΓ4 mol. ml/1的丙酮溶液，分別精密量取50 μ?該溶液，置于10個相同的EP管中， 于50 °C條件下用Ν2氣吹干，至丙酮全部揮發(fā)。將聚合物溶液配制成不同的濃度（0.5, 1，2 ，4, 8, 16, 32, 64, 125, 250, 500, 1000 Pg. ml/1)，分別精密量取 5 ml 加入上述 10 個 EP 管中， 各管中芘的濃度均為1〇-6 mol · Γ1，將各管溶液放入超聲儀中超聲0. 5 h，設定超聲功率為 200 W，放置12 h，測定各管中芘溶液的熒光發(fā)射光譜。按照以激發(fā)波長測最大發(fā)射波長， 以發(fā)射波長測最大激發(fā)波長的原則，確定芘熒光探針的激發(fā)波長為332 nm。以該激發(fā)波長 測定樣品于350 nnT450 nm范圍內的熒光發(fā)射光譜，發(fā)射狹縫帶寬為3 nm，激發(fā)狹縫帶寬 為5nm。分別測定各樣品溶液在λ1=372 nm處和λ 2=383 nm處的熒光強度，以lgC為橫 坐標，以測定的13/%的比值為縱坐標，根據(jù)各點作出數(shù)據(jù)點的水平切線，以及突變曲線的 切線，兩個切線的交點所對應的聚合物濃度，即為臨界膠束濃度（CMC);結果如圖4所示，圖 中，A和B圖為pH=7.4，C和D圖為pH=5.3;從圖4可以看出，芘在某一濃度范圍內，1 372/ 1383值保持不變，并且較高，表明聚合物未形成膠束，當濃度達到一定值以后，1 372/1383值急 劇下降，證明聚合物在該濃度形成膠束1372/1 383與lgC作圖可以得到該納米膠束的CMC為 0.0064 mg. mL'與小分子表面活性劑相比，聚合物的可以達到ΚΓ3 mg. ml/1 ,這說明在稀 釋過程中，該產(chǎn)物形成的膠束相對穩(wěn)定，有作為藥物載體的可能性；運用芘熒光探針法測定 聚合物在ρΗ7· 4和ρΗ5· 3處的CMC，分別為0· 0064 mg. ml/1和0· 0158 mg. ml/1，說明膠束在 ΡΗ5. 3的條件下沒有在ΡΗ7. 4條件下穩(wěn)定，這有利于膠束在內涵體酸性條件下釋放藥物。
[0030] 本實施提供的Ν-琥珀酰殼聚糖-聚-L-賴氨酸-軟肪酸三嵌段聚合物在水溶液中 自組裝形成的膠束透射電鏡圖如圖5所示；從圖5可以看出，Ν-琥珀酰殼聚糖-聚-L-賴 氨酸-軟肪酸三嵌段聚合物在水溶液中自組裝形成的膠束呈均勻分散的球狀顆粒，粒徑約 為 120 nm 本實施提供的N-琥珀酰殼聚糖-聚-L-賴氨酸-軟肪酸三嵌段聚合物在水溶液中自 組裝形成的膠束的粒徑分布圖如圖6所示；從圖6可以看出，N-琥珀酰殼聚糖-聚-L-賴 氨酸-軟肪酸三嵌段聚合物在水溶液中自組裝形成的膠束在125nm左右具有較窄的粒徑分 布，顯示了其良好的分散性，與透射電鏡結果一致。
[0031] 將按上述技術方案制備的N-琥珀酰殼聚糖-聚-L-賴氨酸-軟肪酸三嵌段聚合 物溶于5 ml去離子水中制備1 mg. ml/1的空白膠束溶液；將鹽酸阿霉素用適量DMS0溶液 溶解，加入與鹽酸阿霉素摩爾比1:2的三乙胺進行脫鹽處理，然后將脫鹽后的阿霉素緩慢 滴加到上述空白膠束溶液中，使藥物終濃度為0.2 mg. ml/1;超聲30 min，磁力攪拌2 h，然 后置于透析袋中透析4 h，每1 h換一次蒸餾水，透析液用0.45 μ m微孔濾膜過濾，得到 載阿霉素膠束樣品。
[0032] 對本實施例提供的N-琥珀酰殼聚糖-聚-L-賴氨酸-軟肪酸三嵌段聚合物 載阿霉素膠束的體外釋放采用透析法進行測定，分別選PBS (pH=5. 3)、PBS (pH=6. 8)和 PBS(pH=7. 4)作為釋放介質考察載藥膠束在不同pH環(huán)境下的釋放特征，將阿霉素聚合 物膠束溶于不同的釋放介質中，分別吸取5ml上述阿霉素聚合物膠束溶液于透析袋 (MWC0=3500)中，并將透析袋置于50mL的釋放介質中，每組平行三個樣品，在37 °C，100 rpm/min條件下進行體外釋放實驗，間隔一定時間取樣3 mL，并補充3 mL新鮮介質于其中， 每個時間點釋放的藥物量通過紫外法定量。另取載藥膠束，用提取溶劑（DMS0:H20=9:1混 合溶劑，v/V)稀釋，渦旋1 min后超聲1 h，作為總藥量。計算累積釋放百分率，結果如圖 7所示；從圖7可以看出，原料藥在24 h時即釋放完畢，而膠束中的藥物僅釋放了 40 %? 60 %，具有明顯的緩釋作用，且呈典型的納米制劑釋藥模型即突釋-緩釋模型，膠束前24小 時出現(xiàn)了較明顯的突釋，此后進入緩慢釋藥階段，長達60 h，有利于維持體內的藥物濃度的 維持。并且藥物在酸性條件下的釋藥速度明顯較快，這對腫瘤治療非常有利。
[0033] 實施例2 本實施例提供一種N-琥珀酰殼聚糖-聚-L-賴氨酸-軟肪酸三嵌段聚合物載siRNA膠 束，制備的具體步驟包括：按實施例1技術方案制備將N-琥珀酰殼聚糖-聚-L-賴氨酸-軟 肪酸三嵌段聚合物，將其溶于5 ml去離子水中制備1 mg. ml/1的空白膠束溶液。將空白膠 束與siRNA (N/P=20-40)37°C震蕩孵育30 min即得N-琥珀酰殼聚糖-聚-L-賴氨酸-軟 肪酸三嵌段聚合物載siRNA膠束。
[0034] 該N-琥珀酰殼聚糖-聚-L-賴氨酸-軟肪酸三嵌段聚合物載siRNA膠束結合 siRNA的能力采用瓊脂糖凝膠電泳進行測定，分別取25 pmol siRNA至不含RNase的6個 EP管中，然后分別加入17 yLDEPC處理過的水、1 yL、2 yL、4 yL、8 yL、16 yL膠束 溶液，并用DEPC處理過的水將各組補足到18 μ L。將各EP管中的溶液充分混合后室 溫靜置30 min，分別取15 yL加入3yL 6Xloading buffer混勻后上樣，50 V，電泳 30 min后用凝膠成像儀觀察實驗結果。結果如圖8所示，圖中，泳道1?6, N/P比分別為 0,5, 10,20,40,80 ;從圖8可以看出，NSC-PLL-PA納米膠束的中間層帶有正電荷，與帶負電 荷的siRNA孵育時，siRNA能通過靜電吸附作用進入納米膠束中間層，進而中間層溶解度降 低，siRNA被壓縮進膠束內核。通過凝膠電泳實驗可以看到siRNA和NSC-PLL-PA納米膠束 已經(jīng)形成復合物，隨著N/P比的增加，更多的siRNA被載體靜電吸附，游離siRNA條帶的熒 光強度減弱，當N/P比20時，siRNA的包封率約為88%，而當N/P比40時，siRNA幾乎被全 部包載，其包封率約為97%。
[0035] 對得到的N-琥珀酰殼聚糖-聚-L-賴氨酸-軟肪酸三嵌段聚合物載siRNA膠束 的血清穩(wěn)定性實驗采用瓊脂糖凝膠電泳進行測定，以siRNA DEPC水溶液作對照，分別取25 pmol siRNA至不含RNase的6個EP管中，1?2號管中加入17 μ L DEPC處理過的水，3?6 管中分別加入4 yL膠束溶液合13 yL DEPC水，將各ΕΡ管中的溶液充分混合后室溫靜 置30分鐘。2?6管分別加入20%的牛血清，分別室溫孵育30 min、30 min、60 min、90 min、120 min。3?6管分別加入36U肝素鈉 /yg siRNA，室溫孵育15 min，從膠束中解絡 出siRNA。分別取1?6號管樣品15 μ L與3 μ L 6X loading buffer混勻后上樣，50 V， 電泳30 min后凝膠成像系統(tǒng)觀察并分析結果。其結果如圖9所示，圖中，泳道1，裸siRNA; 泳道2,裸siRNA與20%血清孵育30min ;泳道3-6, siRNA膠束分別與20%血清孵育30,60， 90，120min ;從圖9可以看出，負載的siRNA經(jīng)肝素解絡后，在電場中由負極向正極移動，在 凝膠板上被溴化乙啶染色，出現(xiàn)白色亮帶。圖表明，裸露的siRNA與20%的牛血清孵育30 min后即發(fā)生降解(條帶2)，而載siRNA納米膠束與20%的牛血清孵育120 min后仍能較好 的保持siRNA的完整性(條帶6)。說明裸露的siRNA與血清孵育，易被血清中的酶降解，表 現(xiàn)出血清不穩(wěn)定性；而載siRNA納米膠束與血清共孵育后，siRNA降解減少，降解時間延長， 說明膠束能夠可降低血清中酶對siRNA的降解。結果表明制備的膠束對siRNA具有一定的 保護作用。
[0036] 對N-琥珀酰殼聚糖-聚-L-賴氨酸-軟肪酸三嵌段聚合物載siRNA膠束的核酸酶 穩(wěn)定性實驗采用瓊脂糖凝膠電泳進行測定，以siRNA DEPC水溶液作對照。分別取25 pmol siRNA至不含RNase的6個EP管中，1?2號管中加入17 μ L DEPC處理過的水，3?6管 中分別加入4 μ L膠束溶液合13 μ L DEPC水，將各EP管中的溶液充分混合后室溫靜置 30分鐘。2?6管分別加入1 U of RNase I/yg siRNA，分別室溫孵育30 min、30 min、60 min、90 min、120 min。3?6管分別加入36U肝素鈉 /yg siRNA,室溫孵育15 min,從膠 束中解絡出siRNA。分別取1飛號管樣品15 μ L與3 μ L 6X loading buffer混勻后上 樣，50 V，電泳30 min后凝膠成像系統(tǒng)觀察并分析結果。結果如圖10所示，圖中，泳道1， 裸siRNA ;泳道2,裸siRNA與36U肝素/ μ g siRNA孵育30min ;泳道3-6, siRNA膠束分別 與36U肝素 /yg siRNA孵育30,60,90，120min;從圖10可以看出，裸露的siRNA與1 U of RNase 1/μ g siRNA孵育30 min后即發(fā)生降解(條帶2)，而載siRNA納米膠束與RNase I孵育30 min后幾乎沒有發(fā)生降解(條帶3)，孵育120 min后仍能較好的保持siRNA的完 整性(條帶6)。結果表明制備的膠束能夠保護siRNA減緩核酸酶的降解。
[0037] 實施例3 本實施例制備N-琥珀酰殼聚糖-聚-L-賴氨酸-軟肪酸三嵌段聚合物共轉運阿霉素 與siRNA膠束。將按實施例1技術方案制備的N-琥珀酰殼聚糖-聚-L-賴氨酸-軟肪酸 三嵌段聚合物溶于5 ml去離子水中，得到1 mg. ml/1的空白膠束溶液；將鹽酸阿霉素用適 量DMS0溶液溶解，加入與鹽酸阿霉素摩爾比1:2的三乙胺進行脫鹽處理，然后將脫鹽后的 阿霉素緩慢滴加到上述空白膠束溶液中，使藥物終濃度為〇. 2 mg. ml/1 ;超聲30 min，磁力 攪拌2 h，然后置于透析袋中透析4 h，每1 h換一次蒸餾水，透析液用0.45μπι微孔濾膜過 濾，得到載阿霉素膠束樣品。將載藥膠束與siRNA (N/P=20-40)37°C震蕩孵育30min即得 N-琥珀酰殼聚糖-聚-L-賴氨酸-軟肪酸三嵌段聚合物共轉運阿霉素與siRNA膠束。
[0038] 對該N-琥珀酰殼聚糖-聚-L-賴氨酸-軟肪酸三嵌段聚合物共轉運阿霉素與 siRNA膠束的透射電鏡圖如圖11所示；從圖11可以看出，N-琥珀酰殼聚糖-聚-L-賴氨 酸-軟肪酸三嵌段聚合物共轉運阿霉素與siRNA膠束呈均勻分散的球狀顆粒，粒徑約為170 nm〇
[0039] 該N-琥珀酰殼聚糖-聚-L-賴氨酸-軟肪酸三嵌段聚合物共轉運阿霉素與siRNA 膠束的粒徑分布圖如圖12所示；從圖12可以看出，N-琥珀酰殼聚糖-聚-L-賴氨酸-軟 肪酸三嵌段聚合物共轉運阿霉素與siRNA膠束在170nm左右具有較窄的粒徑分布，顯示了 其良好的分散性，與透射電鏡結果一致。
[0040] 本實施例提供的N-琥珀酰殼聚糖-聚-L-賴氨酸-軟肪酸三嵌段聚合物共轉運 阿霉素與siRNA膠束在不同緩沖液中放置不同時間后粒徑和電位變化如圖13所示；從圖 13可以看出，在pH=7. 4的環(huán)境中，載siRNA膠束的粒徑和Zeta電位能保持相對穩(wěn)定。而 在pH=5. 3的緩沖液中，粒徑增大，Zeta電位升高，推測可能是由于在pH=5. 3的條件下，聚 L-賴氨酸層中N的質子化程度增大，親水性增加，可能翻轉到殼聚糖外殼的外層，而疏水端 軟肪酸鏈較短，不足以維持膠束的穩(wěn)定，從而使膠束粒徑增大，并且由于聚L-賴氨酸的外 露而使Zeta電位升高。
【權利要求】
1. 一種三嵌段聚合物膠束的制備方法，其特征在于包括以下步驟： (1) 將N-琥珀酰殼聚糖溶解于蒸餾水中，再將聚L賴氨酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙 基）碳二亞胺和N -羥基琥珀酰亞胺分別加入到N-琥珀酰殼聚糖溶液中，攪拌溶解得到反 應液；所述的反應液中，N-琥珀酰殼聚糖、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺和N -羥 基琥拍酰亞胺的濃度依次為10?15 mg · mL-1、5?10 mg · mL-1和2?3 mg · mL-1 ;調節(jié) 反應液的pH為5.0?6.0,磁力攪拌、室溫條件下反應48?72 h后，反應液用截留分子量 為3500?5000的透析袋透析，透析液經(jīng)過濾、冷凍干燥，得到N-琥珀酰殼聚糖-聚L賴氨 酸二嵌段聚合物； (2) 將脂肪酸加入到干燥的二氯甲烷中，磁力攪拌溶解得到濃度為4?12 mg · ml/1的 溶液，再緩慢加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺和N -羥基琥珀酰亞胺，1-乙 基-(3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺和N -羥基琥珀酰亞胺的濃度分別為5?10 mg · ml/1 和4?6 mg ^!/1，在40?60°C的溫度條件下反應2?4 h后，旋轉蒸發(fā)除去溶劑，得到白 色粉末狀固體即為活化的脂肪酸； (3) 將步驟（2)得到的活化的脂肪酸加入到甲醇中，攪拌溶解得到濃度為5?10 mg · ml/1的活化脂肪酸甲醇溶液；將步驟（1)得到的N-琥珀酰殼聚糖-聚L賴氨酸溶解于 蒸餾水中，得到濃度為10?30 mg 1171的N-琥珀酰殼聚糖-聚L賴氨酸水溶液；將等體 積的N-琥珀酰殼聚糖-聚L賴氨酸水溶液緩慢滴加到活化脂肪酸甲醇溶液中，在溫度為 60?70 °C的條件下反應24?48 h后，反應液用截留分子量為3500?5000的透析袋透 析，得到的透析液經(jīng)2000?3000 rpm離心處理，取上清液冷凍干燥，得到N-琥珀酰殼聚 糖-聚L賴氨酸-脂肪酸三嵌段聚合物；將得到的三嵌段聚合物溶于去離子水中，制備濃度 為1?2 mg. ml/1的空白膠束溶液； (4) 將疏水性藥物用適量DMSO溶液溶解，緩慢滴加到步驟（3)得到的空白膠束溶液 中，藥物的終濃度為0. 1?0. 3 mg. ml/1 ;超聲處理20?30 min,磁力攪拌1?2 h后，置 于截留分子量為3500?5000的透析袋中透析處理；透析液用0.45 μ m微孔濾膜過濾，得 到載藥膠束； (5) 將步驟（4)得到的載藥膠束與基因按N/P為20?40 :1混合，N為載藥膠束三嵌段 聚合物中的氨基，P為基因中磷酸根基團，在溫度為25?37 °C的條件下震蕩孵育20?30 min，即得N-琥珀酰殼聚糖-聚-L-賴氨酸-脂肪酸三嵌段聚合物共轉運疏水性藥物與基 因膠束。
2. 根據(jù)權利要求1所述的三嵌段聚合物膠束的制備方法，其特征在于：所述的疏水性 藥物為阿霉素、蛇床子素、紫杉醇、去氫駱駝蓬堿、喜樹堿中的一種。
3. 根據(jù)權利要求1所述的三嵌段聚合物膠束的制備方法，其特征在于：所述的基因為 多藥耐藥mdrl基因、Bcl-2家族bax基因、bak基因、腫瘤壞死因子-α基因、白細胞介 素-2基因及所述基因所對應的siRNA中的一種。
4. 根據(jù)權利要求1所述的三嵌段聚合物膠束的制備方法，其特征在于：所述的N-琥珀 酰殼聚糖的粘均分子量為8000?15000道爾頓。
5. 根據(jù)權利要求1所述的三嵌段聚合物膠束的制備方法，其特征在于：所述的N-琥珀 酰殼聚糖中琥珀酰基的取代度為20 %?50 %。
6. 根據(jù)權利要求1所述的三嵌段聚合物膠束的制備方法，其特征在于：所述的 聚-L-賴氨酸的粘均分子量為2000?5000道爾頓。
7. 根據(jù)權利要求1所述的三嵌段聚合物膠束的制備方法，其特征在于：所述的脂肪酸 的碳鏈長度為8?18。
8. 根據(jù)權利要求1或7所述的三嵌段聚合物膠束的制備方法，其特征在于：所述的脂 肪酸包括正辛酸、癸酸、月桂酸、豆蘧酸、軟脂酸和硬脂酸中的一種。
9. 采用權利要求1所述制備方法得到的三嵌段聚合物膠束。
10. 權利要求9所述的三嵌段聚合物膠束的應用，其特征在于：用作同時攜載疏水性的 抗癌藥物和基因的抗腫瘤靶向藥物制劑。
【文檔編號】A61K31/704GK104095814SQ201410327372
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年7月10日 優(yōu)先權日:2014年7月10日
【發(fā)明者】張學農, 張春歌 申請人:蘇州大學