一種新型納米診斷治療膠束及其應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種新型納米膠束，包括嵌段共聚物、抗癌藥物、熒光探針，其中各組分的重量比為：100:80:1~400:16:1。本發(fā)明主要是利用嵌段共聚物，將兩種或多種抗癌藥物及熒光探針制備成納米診療膠束，并使其中的藥物與探針同步釋放，進而兼具診斷與治療的作用。所述的多種藥物聯(lián)合應用，可達到增加療效，減少毒副作用，減少或延緩耐藥的出現(xiàn)，達到最大藥效能力的作用。所包載的熒光探針，有些不僅具有成像診斷作用，同時還具有光熱治療的作用，進一步增加治療效果。
【專利說明】
一種新型納米診斷治療膠束及其應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥制劑技術領域，具體涉及一種新型納米膠束，并提供了所述納米 膠束的應用。
【背景技術】
[0002] 共聚物膠束作為一種有效的納米載體已在醫(yī)藥領域受到廣泛關注，其利用兩親性 的高分子材料在水中自發(fā)形成一種自組裝結構，疏水嵌段形成包載藥物的內(nèi)殼，親水嵌段 包繞在外起到保護作用。在共聚物膠束中，嵌段共聚物膠束是常見的一種，其具有以下優(yōu) 點：（1)粒徑較小，使之不易被網(wǎng)狀內(nèi)皮組織吞噬，因而能長時間在血液中循環(huán)并保持穩(wěn)定；
[2] 納米級的粒徑使載藥膠束在靶部位表現(xiàn)出更強的細胞穿透力；（3)具有較低的臨界膠束 濃度值，在血液循環(huán)中不易被血液稀釋而破壞膠束的結構，較穩(wěn)定；（4)增溶難溶性藥物，將 難溶性藥物包裹在聚合物膠束的疏水內(nèi)殼中，提高生物利用度，由于外部有親水部分的保 護，使其不易于蛋白質(zhì)和吞噬細胞吸附和識別，不易因酶降解而失活，從而保證在血漿與組 織中的停留時間，通過增加滲透與滯留達到被動靶向的效果。因此，聚合物膠束作為藥物載 體，具有廣闊的應用前景。
[0003] -般共聚物膠束都只包載一種藥物，但是長期使用單一藥物，會使病人對藥物產(chǎn) 生一定的抗性，耐藥性增加，療效降低，尤其是癌癥的治療。以抗癌藥物為例，目前使用的抗 腫瘤藥物對腫瘤細胞缺乏靶向性，在殺傷癌細胞的同時，對正常細胞表現(xiàn)出強烈的毒副作 用，或自身水溶性很差，或在血液中半衰期短，或易與血漿蛋白結合，從而不能很好地發(fā)揮 藥效。多種化療藥物聯(lián)合用藥已成為成功治療許多癌癥的策略之一。由于腫瘤細胞對藥物 抗性的頻頻發(fā)生，越來越多的研究者將注意力集中在聯(lián)合用藥上，尤其是不同作用機制的 抗腫瘤藥物聯(lián)合應用、多管齊下，形成一種獨特的細胞毒性機制，從而減少抗性的發(fā)生，特 別是吉西他濱與紫衫燒類藥物聯(lián)合用藥（Biochemical and Biophysical Research Communications. ,2004,316:71-77.)，如胰腺癌的治療，已經(jīng)形成了幾種不同的多藥聯(lián)合 的策略，如F0LFIRN0X方案和吉西他濱與白蛋白結合的紫杉醇聯(lián)合用藥應用方案 (Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A.,2006,103:4028-4033.)〇
[0004] 聯(lián)合化療指聯(lián)合應用兩種或兩種以上無交叉性且有協(xié)同作用的藥物治療腫瘤性 疾病。聯(lián)合化療方案應遵循以下原則：1、聯(lián)合化療方案中的各種藥物，在單獨使用時對該癌 癥是有效的；2、盡量選擇作用機制、作用時間不同的藥物組成聯(lián)合化療方案，以便更好的發(fā) 揮協(xié)同作用；3、盡量選擇毒副作用不同的藥物聯(lián)合，以免毒性相加，使患者難以忍耐。故根 據(jù)抗腫瘤藥的作用機制和腫瘤細胞增殖動力學進行合理聯(lián)合用藥，是近年來化療給藥治療 腫瘤中的重要進展之一。與傳統(tǒng)的單藥治療相比，多藥治療可促進增效作用，增加治療的靶 向選擇性，克服癌細胞對不同作用機制藥物的抗性，減少不良反應的發(fā)生。
[0005] 在傳統(tǒng)臨床應用中，疾病的診斷與治療是兩個相對獨立的過程，診斷用藥和治療 用藥也是兩種獨立的藥物。在這種情況下，患者往往需要接受先診斷后治療兩次醫(yī)療過程， 而且中間往往間隔時間較長，常常貽誤了疾病治療的最佳時期。另外，診斷用藥物和治療用 藥物往往都對患者有一定的副作用，分為兩次用藥會增大患者不必要的痛苦和風險。于是， 在最近幾年，一種全新的疾病處理方式--治療診斷學(1116^110 81：；[08)作為一種新的理 念，逐漸發(fā)展起來。
[0006] 治療診斷學將診斷和治療兩個過程合二為一，在得到診斷結果的同時，立即基于 診斷結果進行對癥治療。用于治療診斷學的制劑被稱為治療診斷制劑，簡稱診療制劑 (Theranostic Agent)。診療制劑非常適用于癌癥的診斷和治療，因為腫瘤組織的不均一性 和癌細胞的自適應耐藥性一直是癌癥治療中一個棘手的問題，治療診斷學的出現(xiàn)使這一復 雜問題的解決重現(xiàn)曙光。使用治療診斷制劑可以顯現(xiàn)腫瘤內(nèi)部不同變性的亞型，然后基于 不同診斷結果進行靶向治療。
[0007] 在最近的研究中，納米材料由于其獨特而優(yōu)越的特性，如較小的尺寸，良好的生物 相容性，可控的結構成分，表面易被生物親和分子修飾等等，被越來越多地應用于生物醫(yī)藥 制劑的開發(fā)和研制中。用于診療制劑研究中的納米材料即被稱為納米診療制劑 (Nanotheranostic Agent)。通過納米技術將診斷制劑和治療制劑整合為一體，得到納米診 療制劑。首先使用納米診療制劑，通過診斷成像技術確定疾病尤其是腫瘤的位置和形態(tài);之 后在診斷結果的基礎上進行對癥治療，這樣將診斷和治療兩個過程合二為一，畢其功于一 役，提尚了診療效率。
[0008] 腫瘤的診療制劑是將抗癌藥物與成像探針結合到一個納米傳遞系統(tǒng)的平臺上，可 將藥物與探針以有效的濃度選擇性地傳遞到腫瘤部位，從而起到腫瘤監(jiān)測與治療的作用。 目前的腫瘤診療制劑是將抗癌藥物和納米探針共同包載在一個納米粒上，但是由于所包載 藥物和探針性質(zhì)的不同，這使得它們在腫瘤細胞中的釋放速率和滯留時間也不同，所以制 劑中探針的診斷和藥物的治療是不同步的、脫節(jié)的，兩者之間沒有很好的相關性，診斷和治 療就不能有機地結合起來，就無法進行同步的診斷與治療。
[0009] 光動力治療(Photodynamic Therapy ,Ρ?Τ)是一種臨床上獲得批準，可以選擇性殺 傷惡性腫瘤細胞的微創(chuàng)治療方法。該方法的過程涉及光敏化劑的給藥，以及隨后用適當波 長的光對其進行照射，在有氧氣存在的情況下產(chǎn)生活性氧物質(zhì)，雖然引發(fā)腫瘤細胞直接死 亡，但也損害微血管，誘導局部炎癥反應等。PDT具有特異性和選擇性，一方面光敏劑能特異 性地在病變組織富集，另一方面光照的部位可直接定位到病變組織，從而可以選擇性地治 療病變區(qū)域。正因如此，PDT正成為各種腫瘤治療研究的熱點。
[00?0] 光熱治療（Photodynamic Therapy,ΡΤΤ)是應用可見光或近紅外光照射病變組織 進而引發(fā)熱損傷的治療方法，與光動力療法通過激發(fā)光敏劑產(chǎn)生活性氧物質(zhì)不同，光熱治 療是通過光吸收劑將激光能量轉化為熱量。光熱治療能引發(fā)一系列生物學變化，如蛋白結 構變化和組織碳化等。在光熱治療中，溫度可升至45~300°C，通過使用近紅外光使其治療 效果也能達到足夠深度。與光動力治療相似，光熱治療具有特異性，只有在被光照射到的病 變組織才有治療效果，而對周圍正常組織的損傷非常小，這種空間特異性和非侵入性治療 方式使光熱治療相比其它手術或者侵入性治療方法，更成為一種廣受歡迎的治療方式。 [0011]光動力療法與光熱療法具有其獨特的優(yōu)點，但是，由于缺乏理想的光敏劑，制約了 它們在臨床上更廣泛的應用。目前常用的光敏劑大多數(shù)呈疏水性，在生理條件下容易聚集， 導致熒光淬滅和光動力療效大幅下降。因此，尋找一種適合的光敏劑成為了光動力療法與 光熱療法亟待解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 本發(fā)明設計了一種新型納米膠束，利用嵌段共聚物，將兩種或多種抗癌藥物和熒 光探針，共同包載于納米膠束中，克服了以上所述的目前診療制劑的不足。同時，該診療制 劑可將所包載的藥物與納米探針同步釋放，起到同步的診斷與治療作用。
[0013] 本發(fā)明所設計的新型納米膠束可同時包載兩種或多種抗癌藥物，聯(lián)合用藥，在增 大療效的同時，克服或減緩了多藥耐藥性，最大限度地發(fā)揮藥效。
[0014] 本發(fā)明所述的納米膠束包含嵌段共聚物、抗癌藥物、熒光探針，所述的嵌段共聚 物、抗癌藥物、熒光探針的重量比為：100:80:1~360:16:1，但包載不同材料時，該重量比不 同，如MPEG-PLGA膠束的重量比為1000:80:1~400:16:1，優(yōu)選比例為：1200:80:1~360:16: 1 ;PEG-VE膠束（或FA-PEG-VE膠束）的重量比為100:80:1~100 :16:1，優(yōu)選比例為100:80:1 ~60:16:1; PLA-PEG-PLA 膠束的重量比為 1000:80:1~400:16:1，優(yōu)選比例為：1200:80:1~ 360:16:1; Phi s-PLA-PEG-PLA-Phi s膠束的重量比為 1200 :80 :1 ~400:16:1，優(yōu)選比例為： 1800:80:1~400:16:1。
[0015] 其中，所述的嵌段共聚物可為兩嵌段共聚物、三嵌段共聚物或多嵌段共聚物中的 一種或幾種：
[0016] 所述的兩嵌段共聚物為聚氧乙烯-聚芐基天冬氨酸共聚物(PE0-PBLA)、苯乙烯-丁 二烯共聚物（SRB)、單甲氧基聚乙二醇外消旋聚乳酸乙醇酸共聚物(MPEG-PLGA)、聚甲基丙 烯酸甲酯-聚苯乙烯(PMMA-PS)、聚丙烯酸甲酯-聚苯乙烯(PMA-PS)、聚環(huán)氧乙烷-聚苯乙烯 (PE0-PS，PEG-b-PS)、聚環(huán)氧乙烷-聚（烷基）丙烯酸酯（ΡΕ0-ΡΜΜΑ，PEG-PMMA)、聚環(huán)氧乙烷-聚乳酸(PEG-PLA)或聚乙二醇-維生素 E (PEG-VE)、葉酸-聚乙二醇-維生素 E (FA-PEG-VE)中 的一種或幾種，優(yōu)選為單甲氧基聚乙二醇外消旋聚乳酸乙醇酸共聚物(MPEG-PLGA)、聚乙二 醇-維生素 E(roG-VE)和葉酸-聚乙二醇-維生素 E(FA-PEG-VE)。其中，聚乙二醇-維生素 E (PEG-VE)和葉酸-聚乙二醇-維生素 E(FA-PEG-VE)為實驗室自制。此外，單甲氧基聚乙二醇 外消旋聚乳酸乙醇酸共聚物(MPEG-PLGA)中PLGA的分子量范圍為1000~14000,優(yōu)選為2000 ~9000〇
[0017] 所述的三嵌段共聚物為苯乙烯-丁二烯-苯乙烯（SBS)、苯乙烯-丁二烯-內(nèi)酯嵌段 共聚物、苯乙烯-丁二烯-3-氯丙烯共聚物、聚（環(huán)氧乙烷）-聚（環(huán)氧丙烷）-聚（環(huán)氧乙烷） (ΡΕ0-ΡΡ0-ΡΕ0)、三嵌段共聚物P123、聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸三嵌段共聚物（PLA-PEG-PLA)中的一種或幾種，優(yōu)選為聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸三嵌段共聚物(PLA-PEG-PLA);
[0018] 所述的多嵌段共聚物為苯乙烯-丁二烯-苯乙烯-甲基丙烯酸酯嵌段共聚物、 PHBPEG多嵌段共聚物或聚組氨酸-聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸-聚組氨酸（Phis-PLA-PEG-PLA-Phis)嵌段共聚物中的一種或幾種，優(yōu)選為:聚組氨酸-聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸-聚組 氨酸(Phis-PLA-PEG-PLA-Phis)嵌段共聚物，其為實驗室自制。
[0019] 本發(fā)明中，所述自制的兩嵌段共聚物的合成步驟如下：
[0020] 以維生素 E琥珀酸單酯(VES)為起始原料，在（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞 胺鹽酸鹽(EDC)和1-羥基苯并三唑(Η0ΒΤ)催化下，與H-lys-Obzl?；芍虚g體1，1先后經(jīng) 過Pd/C催化氫化脫芐基，與PEG2000和葉酸(FA)酯化生成目標化合物PEG-VE和FA-PEG-VE， 合成路線如下：
[0021]
[0022] Reagents and condition:a)EDC，H0BT，DCM;b)Pd/C，H2,3(TC;c)FA，mPEG-2000， EDC，DMAP
[0023] 本發(fā)明中，所述自制的多嵌段共聚物的合成步驟如下：
[0024] 以Nim-DNP-L-histidine為起始原料，經(jīng)鹵代，環(huán)合，縮合反應，生成中間體A (PHis);丙交酯單體和PEG，在Sn(0Ct)2的催化下生成中間體B，B與⑶I在乙腈溶液中反應生 成中間體C，中間體A和C在DMS0中反應生成中間體D，D與2-巰基乙醇在室溫下反應生成終產(chǎn) 物 PHi s-PLA-PEG-PLA-PHi s。合成路線如下：
[0026] Reagents and condition：a)S0C12,THF,rt.；b)isopropyl amine,DMF,rt.；c)Sn (0ct)2,150°C ;d)CDl，CH3CN，rt · ; e)DMS0，rt · ;f)2-mercaptoethanol，DMS0，rt ·
[0027] 本發(fā)明中所述的抗癌藥物為吉西他濱、阿霉素、奧沙利鉑、依鉑、紫杉醇、多烯紫杉 醇、5_氟尿嘧啶、依托泊苷、長春新堿、羥基喜樹堿等中的兩種或多種，最佳的為吉西他濱和 紫杉醇;此外，所述的抗癌藥物為VE修飾后的藥物，如將吉西他濱(GEM)、紫杉醇(PTX)通過 維生素 E(VE)進行修飾，合成步驟如下：
[0028] 維生素 E丁二酸單酯(VE-SA)與吉西他濱在苯并三氮唑-N，N，N'，N'_四甲基脲六氟 磷酸鹽(HBTU)做縮合劑的條件下，以酰胺鍵連接為目標化合物GEM-VE，合成路線如下：
[0030] 在二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)和二甲氨基吡啶(DMAP)的催化下，紫杉醇與維生素 E琥 珀酸單酯縮合，生成目標化合物PTX-VE，合成路線如下：
[0032]本發(fā)明中所述的熒光探針為磺酰羅丹明B、吲哚菁綠、異硫氰酸熒光素、溴化乙錠、 水溶性熒光藍、萘酐類水溶性熒光染料、水溶性菁染料琥珀酰亞胺酯類染料、藻紅蛋白香豆 素，Dil(細胞膜紅色熒光探針），羅丹明200,熒光素酯中的一種或幾種，首選磺酰羅丹明B或 吲哚菁綠;此外，所述的熒光探針為VE修飾后的探針。熒光探針的主要作用是在腫瘤發(fā)生部 位顯色，從而起到診斷作用。如將磺酰羅丹明B(SRB)、吲哚菁綠（ICG)通過維生素 E進行修 飾，合成步驟如下：
[0033]以SRB為起始原料，在三乙胺和二甲基吡啶存在下，與叔丁基-2-氨基氨基甲酸乙 酯成酰胺，生成中間體1，1在低溫下，由三氟乙酸催化脫去B0C保護基，得到中間體2,2與維 生素 E琥珀酸單酯在DCC和DMAP作用下生成目標化合物SRB-VE，合成路線如下：
[0035]將琥珀酸，單[(2R)-3，4-二氫-2，5，7，8-四甲基-2-[ (4R，8R)-4，8，12-三甲基十三 烷基]-2H-1-苯并吡喃-6-基]酯（4)和60mg(0.08mmol)lH-苯并[e]吲噪-2-[7-[3-(3-羧丙 基)-1，3_二氫-1，1-二甲基-2H-苯并[e]吲哚-2-叉基]-1，3,5-庚三烯-1-基]-1，1-二甲基-3-(4-磺丁基）內(nèi)銨鹽(3)溶于二氯甲烷中，再加入DCC和催化量的DMAP，混合物在氮氣保護 下室溫攪拌5h，得ICG-VE，合成路線如下：
[0037]本發(fā)明通過如下方法制備：
[0038] (1)將嵌段共聚物、抗癌藥物與熒光探針溶于可與水互溶的有機溶劑中，得有機溶 液(若嵌段共聚物為水溶性的，則將其溶于水中）；
[0039] (2)將上述有機溶液滴加至水中，并攪拌；
[0040] (3)蒸發(fā)除去溶劑，除雜，即可；
[0041] 其中，步驟（1)中，有機溶劑可為丙酮、二甲基亞砜、甲醇、乙醇、乙腈、二甲基甲酰 胺或四氫呋喃等;為獲得更佳的效果，首選丙酮。
[0042]其中，步驟(2)中，所述的有機溶劑滴加至水時體系的溫度控制，較佳的為50°C~ 70°(：，最佳為60°(：。
[0043]其中，步驟（3)中，所述的蒸發(fā)除去溶劑中，攪拌時間的控制，較佳的是30min~ 50min，較佳的為40min。
[0044] 其中，步驟(3)中，所述的除雜為過0.22μπι濾膜。
[0045] 本發(fā)明中，所述的制備方法，有機溶液與水的比例為1:1~1:3,最佳為1: 2。，
[0046] 本發(fā)明中，所述納米診療膠束制劑中殘留的丙酮含量少于lOppm。
[0047] 本發(fā)明中，所述納米診療膠束的平均粒徑在90nm~170nm之間。
[0048]本發(fā)明中，所述納米診療膠束在4°C穩(wěn)定性超過168h。
[0049] 本發(fā)明所設計的新型納米診療膠束中可包載的熒光探針，有些除具有熒光顯色的 作用，還具有光動力學治療或光熱治療的作用，如吲哚菁綠，在治療癌癥時，除具有熒光成 像的作用，即診斷腫瘤病灶的同時，還可殺傷腫瘤細胞，起到治療的目的，進一步增加抗腫 瘤效果。
[0050] 本發(fā)明所設計的新型納米診療膠束可通過溶劑揮發(fā)法制備，本法操作簡便，包封 率高，所制備的納米膠束粒徑均勻，分散較好，且較穩(wěn)定。
[0051] 本發(fā)明的納米診療膠束，可同時包載兩種或多種的藥物，充分利用了聯(lián)合用藥的 優(yōu)勢，嚴格遵循了聯(lián)合用藥的原則，使治療效果更佳，克服或減緩了多藥耐藥現(xiàn)象。同時，本 發(fā)明的納米診療膠束包載的熒光探針，一般選擇理想的可作為熒光探針的物質(zhì)，特別是在 針對腫瘤的診療時。其中，吲哚菁綠在充分發(fā)揮熒光探針作用的同時，還具有光熱效應，在 光的激發(fā)下，產(chǎn)生有毒物質(zhì)和局部產(chǎn)熱殺死腫瘤細胞，進而發(fā)揮治療的效用。此外，本發(fā)明 中納米診療膠束所用的制備方法為溶劑揮發(fā)法，該法操作簡便，包封率較高，所制備的膠束 性質(zhì)穩(wěn)定，兼具診斷與治療雙重功效，具有良好的應用前景。
【附圖說明】
[0052] 圖1為本發(fā)明實施例1的MPEG-PLGA2Q(X)膠束的粒徑分布圖。
[0053]圖2為本發(fā)明實施例2的MPEG-PLGA5Q(X)膠束的體外釋放曲線圖。
[0054]圖3為本發(fā)明實施例3的MPEG-PLGA9Q(X)膠束的透射電鏡圖。
[0055] 圖4為本發(fā)明實施例6的FA-PEG-VE膠束的小動物活體成像圖。
[0056] 圖5為本發(fā)明實施例6的FA-PEG-VE膠束的離體組織分布圖。
【具體實施方式】
[0057] 為了進一步理解本發(fā)明，下面結合實施例對本發(fā)明實施方案進行描述，但是應當 理解，這些描述只是為進一步說明本發(fā)明的特征和優(yōu)點，而不是對本發(fā)明權利要求的限制。
[0058] 本發(fā)明采用微柱離心法測定所制備膠束的載藥量和包封率，具體步驟如下：將制 備好的膠束溶液200yL于葡聚糖凝膠柱(G50)上，2000rpm離心2min，后加200yL去離子水， 2000rpm離心2min，并重復3次。收集4次離心所得的液體，用十倍量的甲醇破壞，4000rpm離 心5min，取上清液測定藥物的含量，計算載藥量和包封率，計算公式如下：
[0059] 載藥量=所測得的藥物含量/載體與藥物的總量X 100%
[0060] 包封率=所測得的藥物含量/初始加入的藥物量X 100%
[0061 ] 本發(fā)明采用1&8丨6181261'激光粒度儀測定所制備膠束的粒徑、？01值和26丨3電位 值。
[0062]本發(fā)明采用動態(tài)透析法進行膠束的體外釋放研究:精密量取MPEG-PLGA2Q(X)膠束于 透析袋(截留分子量8000~14000)內(nèi)，扎緊透析袋，然后置于100mL含0.5%十二烷基硫酸鈉 (SDS)的pH 7.4的磷酸鹽緩沖液(？85)中（參照藥典2015版8004緩沖液的配制），37°(：攪拌， 轉速為 l〇〇rpm/min，分別于0.5，1，2,4,6,8，10，12,24,36,48,60,7211時間點取樣，并補充相 應量新鮮的釋放介質(zhì)，計算累計釋放度，并繪制釋放曲線，并用f 2相似因子法對兩種藥物與 熒光探針的釋放進行擬合:若f 2值均大于50，說明三者可達到同步釋放。
[0063] 實施例1MTOG-PLGA2_載藥納米診療膠束的制備（載體：藥物：熒光探針為1200: 80:1)
[0064] 將吉西他濱（Gemcitabine,GEM)、紫杉醇（Paclitaxel ,ΡΤΧ)及橫酰羅丹明B (Sulforhodamine B，SRB)用維生素 E(Vitamine E，VE)進行修飾。
[0065] 將 12mg MPEG-PLGA2_溶于含GEM-VE 740yg、PTX-VE 62yg、SRB-VE 10yg的3mL丙 酮中，攪拌使其溶解成為有機相。精密量取6mL水于燒杯中（有機溶劑:水=1: 2)，在60 °C水 浴下將有機相緩緩滴至水中，并不斷攪拌，滴加完成后繼續(xù)攪拌直至丙酮揮發(fā)完成。將所制 備的納米診療膠束過ο. 22μπι濾膜除雜，即得。
[0066] 采用微柱離心法測得MPEG-PLGA2QQ()膠束的載藥量和包封率，結果為:GEM-VE的載 藥量和包封率為4.74 %、82.07 %，PTX-VE的載藥量和包封率為0.39 %、80.64 %。
[0067]采用動態(tài)光散射法測定所制備Μ P E G - P L G Α 2 ο ο 〇膠束的粒徑，結果為：粒徑為 152 · 6nm，PDI值為0 · 083，Zeta電位為-19 · 9mV。粒徑分布圖如圖1。
[0068] 采用JEM-2100透射電子顯微鏡觀察所制備MPEG-PLGA2Q(X)膠束的形態(tài)。
[0069] 實施例2MPEG-PLGA5Q(X)載藥納米診療膠束的制備(載體:藥物：熒光探針為750:40: 1)
[0070] 將吉西他濱（Gemcitabine,GEM)、紫杉醇（Paclitaxel ,ΡΤΧ)及橫酰羅丹明B (Sulforhoda mine B，SRB)用維生素 E(Vitamine E，VE)進行修飾。
[0071] 將 15mg MPEG-PLGA5_溶于含GEM-VE 740yg、PTX-VE 62yg、SRB-VE 20yg的3mL丙 酮中，攪拌使其溶解成為有機相。精密量取6mL水于燒杯中（有機溶劑:水=1: 2)，在60 °C水 浴下將有機相緩緩滴至水中，并不斷攪拌，滴加完成后繼續(xù)攪拌直至丙酮揮發(fā)完成。將所制 備的納米診療膠束過〇. 22μπι濾膜除雜，即得。
[0072] 采用微柱離心法測得MPEG-PLGAsooo膠束的載藥量和包封率，結果為:GEM-VE的載 藥量和包封率為4.10%、87.80%，PTX-VE的載藥量和包封率為0.33%、83.87%。
[0073]采用動態(tài)光散射法測定所制備Μ P E G - P L G Α 5 ο ο 〇膠束的粒徑，結果為：粒徑為 118.9nm，PDI 值為 0.132,26七&電位為-11.411^〇
[0074] 本發(fā)明采用JEM-2100透射電子顯微鏡觀察所制備MPEG-PLGAsooo膠束的形態(tài)。
[0075]本發(fā)明采用動態(tài)透析法進行膠束的體外釋放研究，釋放曲線如圖2。用5相似因子 法對兩種藥物與熒光探針的釋放進行擬合，擬合結果見表l，f2值均大于50,說明三者可達 到同步釋放，體外診斷與治療可達到同步。
[0076] 表1 MPEG-PLGA·。膠束體外釋放的f2值
[0078] 實施例3 MPEG-PLGA.o載藥納米診療膠束的制備（載體：藥物：熒光探針為360: 16:1)
[0079] 將吉西他濱（Gemcitabine, GEM)、紫杉醇（Paclitaxel ,ΡΤΧ)及吲噪菁綠 (Indocyanine Green，ICG)用維生素 E(Vitamine E，VE)進行修飾。
[0080] 將 18mg MPEG-PLGA9_溶于含GEM-VE 740yg、PTX-VE 62yg、ICG-VE50yg的3mL丙酮 中，攪拌使其溶解成為有機相。精密量取6mL水于燒杯中（有機溶劑:水=1:2)，在60 °C水浴 下將有機相緩緩滴至水中，并不斷攪拌，滴加完成后繼續(xù)攪拌直至丙酮揮發(fā)完成。將所制備 的納米診療膠束過〇. 22μπι濾膜除雜，即得。
[0081 ] 采用微柱離心法測得MPEG-PLGA9000膠束的載藥量和包封率，結果為:GEM-VE的載 藥量和包封率為3.19 %、81.40 %，PTX-VE的載藥量和包封率為0.25 %、77.40 %。
[0082]采用動態(tài)光散射法測定所制備Μ P E G - P L G A 9 ο ο 〇膠束的粒徑，結果為：粒徑為 109 · 6nm，PDI 值為 Ο · 172，Zeta 電位為-22 · 4mV〇
[0083] 采用JEM-2100透射電子顯微鏡觀察所制備MPEG-PLGA9Q(X)膠束的形態(tài)，如圖3。
[0084]實施例4PEG-VE載藥納米診療膠束的制備(載體:藥物:熒光探針為100:40:1)
[0085] 將吉西他濱（Gemcitabine,GEM)、紫杉醇（Paclitaxel ,ΡΤΧ)及橫酰羅丹明B (Sulforhodamine B，SRB)用維生素 E(Vitamine E，VE)進行修飾。
[0086] 將GEM-VE 740yg、PTX-VE 62yg、SRB-VE 20yg溶于3mL丙酮中，攪拌成為有機相。精 密稱取2mg PEG-VE于6mL水中（有機溶劑:水=1:2)，在60°C水浴下將有機相緩緩滴至水中， 并不斷攪拌，滴加完成后繼續(xù)攪拌直至丙酮揮發(fā)完成。將所制備的納米診療膠束過〇.22μπι 濾膜除雜，即得。
[0087] 采用微柱離心法測得PEG-VE膠束的載藥量和包封率，結果為:GEM-VE的載藥量和 包封率為23·76%、90·62%，PTX-VE的載藥量和包封率為1.95%、88.71%。
[0088]采用動態(tài)光散射法測定所制備PEG-VE膠束的粒徑，結果為:粒徑為95.58nm，PDI值 為 0.139,26七3電位為-14.211^。
[0089] 本發(fā)明采用JEM-2100透射電子顯微鏡觀察所制備PEG-VE膠束的形態(tài)。
[0090] 實施例5FA-PEG-VE載藥納米診療膠束的制備(載體:藥物:熒光探針為100:80:1)
[0091 ] 將吉西他濱（Gemcitabine, GEM)、紫杉醇（Paclitaxel ,ΡΤΧ)及吲噪菁綠 (Indocyanine Green，ICG)用維生素 E(Vitamine E，VE)進行修飾。
[0092]將GEM-VE 740yg、PTX-VE 62yg、ICG-VE 10yg溶于3mL丙酮中，攪拌成為有機相。精 密稱取lmg FA-PEG-VE及2mg碳酸鈉于3mL水中（有機溶劑:水=1:1)，在60°C水浴下將有機 相緩緩滴至水中，并不斷攪拌，滴加完成后繼續(xù)攪拌直至丙酮揮發(fā)完成。將所制備的納米診 療膠束過0.22μπι濾膜除雜，即得。
[0093] 采用微柱離心法測得FA-PEG-VE膠束的載藥量和包封率，結果為:GEM-VE的載藥量 和包封率為29.40%、72.00%，PTX-VE的載藥量和包封率為2.80%、82.00%。
[0094]采用動態(tài)光散射法測定所制備FA-PEG-VE膠束的粒徑，結果為:粒徑為156.7nm， PDI 值為 0 · 145，Zeta 電位為-62 · 5mV。
[0095] 本發(fā)明采用JEM-2100透射電子顯微鏡觀察所制備FA-PEG-VE膠束的形態(tài)。
[0096] 實施例6 FA-PEG-VE載藥納米診療膠束的制備(載體:藥物:熒光探針為100:40:1)
[0097] 將吉西他濱（Gemcitabine，GEM)、紫杉醇（Paclitaxel ,ΡΤΧ)及橫酰羅丹明B (Sulforhodamine B，SRB)用維生素 E(Vitamine E，VE)進行修飾。
[0098] 將GEM-VE 740yg、PTX-VE 62yg、SRB-VE 20yg溶于3mL丙酮中，攪拌成為有機相。精 密稱取2mg FA-PEG-VE及6mg碳酸鈉于6mL水中（有機溶劑:水=1:2)，在60 °C水浴下將有機 相緩緩滴至水中，并不斷攪拌，滴加完成后繼續(xù)攪拌直至丙酮揮發(fā)完成。將所制備的納米診 療膠束過0.22μπι濾膜除雜，即得。
[0099] 采用微柱離心法測得FA-PEG-VE膠束的載藥量和包封率，結果為:GEM-VE的載藥量 和包封率為23.88 %、91.08 %，PTX-VE的載藥量和包封率為1.98 %、90.32 %。
[0100]采用動態(tài)光散射法測定所制備FA-PEG-VE膠束的粒徑，結果為：粒徑為96.93nm， PDI 值為 0 · 151，Zeta 電位為-55mV。
[0101] 采用JEM-2100透射電子顯微鏡觀察所制備FA-PEG-VE膠束的形態(tài)。
[0102]以口腔上皮敏感細胞株MCF-7和耐藥株MCF-7/adv為腫瘤模型，建立荷瘤小鼠模 型。尾靜脈注射上述所制備的FA-PEG-VE膠束后，在不同時間點利用小動物活體成像儀觀察 所制備膠束在活體小鼠腫瘤部位的分布，如圖4。之后處死小鼠，取其心、肝、脾、肺、腎及腫 瘤，測定膠束在荷瘤小鼠各組織中的分布，如圖5。說明所制備的納米膠束可良好地應用于 活體成像及組織分布，兼具診斷與治療的作用。
[0103] 實施例7 FA-PEG-VE載藥納米診療膠束的制備(載體:藥物:熒光探針為60:16:1)
[0104] 將吉西他濱（Gemcitabine,GEM)、紫杉醇（Paclitaxel ,ΡΤΧ)及橫酰羅丹明B (Sulforhodamine B，SRB)用維生素 E(Vitamine E，VE)進行修飾。
[0105] 將GEM-VE 740yg、PTX-VE 62yg、SRB-VE 50yg溶于3mL丙酮中，攪拌成為有機相。精 密稱取3mg FA-PEG-VE及9mg碳酸鈉于9mL水中（有機溶劑:水=1:3)，在60 °C水浴下將有機 相緩緩滴至水中，并不斷攪拌，滴加完成后繼續(xù)攪拌直至丙酮揮發(fā)完成。將所制備的納米診 療膠束過0.22μπι濾膜除雜，即得。
[0106] 采用微柱離心法測得FA-PEG-VE膠束的載藥量和包封率，結果為:GEM-VE的載藥量 和包封率為16.08%、83.70%，PTX-VE的載藥量和包封率為1.30%、80.64%。
[0107]采用動態(tài)光散射法測定所制備FA-PEG-VE膠束的粒徑，結果為：粒徑為168.9nm， PDI 值為 0 · 132，Zeta 電位為-66 · 5mV。
[0108] 采用JEM-2100透射電子顯微鏡觀察所制備FA-PEG-VE膠束的形態(tài)。
[0109] 實施例8 PLA-PEG-PLA載藥納米診療膠束的制備(載體:藥物：熒光探針為1200: 80:1)
[0110] 將吉西他濱（Gemcitabine，GEM)、紫杉醇（Paclitaxel ,ΡΤΧ)及橫酰羅丹明B (Sulforhodamine B，SRB)用維生素 E(Vitamine E，VE)進行修飾。
[0111] 將 12mg PLA-PEG-PLA溶于含GEM-VE 740yg、PTX-VE 62yg、SRB-VE 10yg的3mL丙酮 中，攪拌使其溶解成為有機相。精密量取6mL水于燒杯中（有機溶劑:水=1:2)，在60 °C水浴 下將有機相緩緩滴至水中，并不斷攪拌，滴加完成后繼續(xù)攪拌直至丙酮揮發(fā)完成。將所制備 的納米診療膠束過〇. 22μπι濾膜除雜，即得。
[0112] 采用微柱離心法測得PLA-PEG-PLA膠束的載藥量和包封率，結果為:GEM-VE的載藥 量和包封率為4.76 %、82.43 %，PTX-VE的載藥量和包封率為0.40 %、82.01 %。
[0113] 采用動態(tài)光散射法測定所制備PLA-PEG-PLA膠束的粒徑，結果為:粒徑為157.4nm， PDI 值為 0 · 154，Zeta 電位為-12 · 6mV。
[0114] 采用JEM-2100透射電子顯微鏡觀察所制備PLA-PEG-PLA膠束的形態(tài)。
[0115] 實施例9 PLA-PEG-PLA載藥納米診療膠束的制備(載體:藥物:熒光探針為360:16: 1)
[0116] 將吉西他濱（Gemci tab ine，GEM)、紫杉醇（Paclitaxel ,ΡΤΧ)及橫酰羅丹明B (Sulforhodamine B，SRB)用維生素 E(Vitamine E，VE)進行修飾。
[0117] 將 18mg PLA-PEG-PLA溶于含GEM-VE 740yg、PTX-VE 62yg、SRB-VE 50yg的3mL丙酮 中，攪拌使其溶解成為有機相。精密量取6mL水于燒杯中（有機溶劑:水=1:2)，在60 °C水浴 下將有機相緩緩滴至水中，并不斷攪拌，滴加完成后繼續(xù)攪拌直至丙酮揮發(fā)完成。將所制備 的納米診療膠束過〇. 22μπι濾膜除雜，即得。
[0118] 采用微柱離心法測得PLA-PEG-PLA膠束的載藥量和包封率，結果為:GEM-VE的載藥 量和包封率為3.26 %、83.07 %，PTX-VE的載藥量和包封率為0.26 %、80.71 %。
[0119]采用動態(tài)光散射法測定所制備PLA-PEG-PLA膠束的粒徑，結果為:粒徑為162. lnm， PDI 值為 0.123,26七3電位為-11.911^。
[0120] 采用JEM-2100透射電子顯微鏡觀察所制備PLA-PEG-PLA膠束的形態(tài)。
[0121] 實施例10 Phis-PLA-PEG-PLA-Phis載藥納米診療膠束的制備(載體:藥物:熒光探 針為 1800:80:1)
[0122] 將吉西他濱（Gemcitabine，GEM)、紫杉醇（Paclitaxel ,ΡΤΧ)及磺酰羅丹明B (Sulforhodamine B，SRB)用維生素 E(Vitamine E，VE)進行修飾。
[0123] 將 18mg Phis-PLA-PEG-PLA-Phis溶于含GEM-VE 740yg、PTX-VE 62yg、SRB-VE 10μ g的3mL丙酮中，攪拌使其溶解成為有機相。精密量取6mL水于燒杯中（有機溶劑:水=1:2)， 在60°C水浴下將有機相緩緩滴至水中，并不斷攪拌，滴加完成后繼續(xù)攪拌直至丙酮揮發(fā)完 成。將所制備的納米診療膠束過〇. 22μπι濾膜除雜，即得。
[0124] 采用微柱離心法測得Phis-PLA-PEG-PLA-Phis的載藥量和包封率，結果為:GEM-VE 的載藥量和包封率為3.28%、83.47%，PTX-VE的載藥量和包封率為0.27%、82.33%。
[0125] 采用動態(tài)光散射法測定所制備Phis-PLA-PEG-PLA-Phis膠束的粒徑，結果為:粒徑 為 162.5nm，PDI 值為 0.154,26七3電位為-15.611^〇
[0126] 采用JEM-2100透射電子顯微鏡觀察所制備Phis-PLA-PEG-PLA-Phis膠束的形態(tài)。
[0127] 實施例llPhiS-PLA-PEG-PLA-PhiS載藥納米診療膠束的制備(載體 :藥物:熒光探 針為400:16:1)
[0128] 將吉西他濱（Gemcitabine，GEM)、紫杉醇（Paclitaxel ,ΡΤΧ)及磺酰羅丹明B (Sulforhodamine B，SRB)用維生素 E(Vitamine E，VE)進行修飾。
[0129] 將20mg Phis-PLA-PEG-PLA-Phis溶于含GEM-VE 740yg、PTX-VE 62yg、SRB-VE 50μ g的3mL丙酮中，攪拌使其溶解成為有機相。精密量取6mL水于燒杯中（有機溶劑:水=1:2)， 在60°C水浴下將有機相緩緩滴至水中，并不斷攪拌，滴加完成后繼續(xù)攪拌直至丙酮揮發(fā)完 成。將所制備的納米診療膠束過〇. 22μπι濾膜除雜，即得。
[0130] 采用微柱離心法測得Phis-PLA-PEG-PLA-Phis的載藥量和包封率，結果為:GEM-VE 的載藥量和包封率為2.85%、80.32%，PTX-VE的載藥量和包封率為0.24%、81.08%。
[0131] 采用動態(tài)光散射法測定所制備Phis-PLA-PEG-PLA-Phis膠束的粒徑，結果為:粒徑 為 173.1nm，PDI 值為 0.168,26七3電位為-14.811^〇
[0132] 采用JEM-2100透射電子顯微鏡觀察所制備Phis-PLA-PEG-PLA-Phis膠束的形態(tài)。
【主權項】
1. 一種新型的納米膠束，其特征在于，包括嵌段共聚物、抗癌藥物、熒光探針，其中各組 分的重量比為：100:80:1~400:16:1。2. 根據(jù)權利要求1所述的納米膠束，其特征在于:所述的嵌段共聚物為兩嵌段共聚物、 三嵌段共聚物或多嵌段共聚物中的一種或幾種。3. 根據(jù)權利要求1或2所述的納米膠束，其特征在于:所述的兩嵌段共聚物為聚氧乙烯-聚芐基天冬氨酸共聚物、苯乙烯-丁二烯共聚物、單甲氧基聚乙二醇外消旋聚乳酸乙醇酸共 聚物、聚甲基丙烯酸甲酯-聚苯乙烯、聚丙烯酸甲酯-聚苯乙烯、聚環(huán)氧乙烷-聚苯乙烯、聚環(huán) 氧乙烷-聚(烷基)丙烯酸酯、聚環(huán)氧乙烷-聚乳酸、聚乙二醇-維生素 E、葉酸-聚乙二醇-維生 素 E中的一種或幾種，優(yōu)選為單甲氧基聚乙二醇外消旋聚乳酸乙醇酸共聚物、聚乙二醇-維 生素 E及葉酸-聚乙二醇-維生素 E。4. 根據(jù)權利要求1-3任何一項所述的納米膠束，其特征在于:所述的三嵌段共聚物為苯 乙烯-丁二烯-苯乙烯、苯乙烯-丁二烯-內(nèi)酯嵌段共聚物、苯乙烯-丁二烯-3-氯丙烯共聚物、 聚（環(huán)氧乙烷)-聚(環(huán)氧丙烷)-聚（環(huán)氧乙烷）、三嵌段共聚物P123、聚乳酸-聚乙二醇-聚乳 酸三嵌段共聚物中的一種或幾種，優(yōu)選為聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸共聚物。5. 根據(jù)權利要求1-4任何一項所述的納米膠束，其特征在于:所述的多嵌段共聚物為苯 乙烯-丁二烯-苯乙烯-甲基丙烯酸酯嵌段共聚物、PHBPEG多嵌段共聚物或聚組氨酸-聚乳 酸-聚乙二醇-聚乳酸-聚組氨酸嵌段共聚物中的一種或幾種，優(yōu)選為聚組氨酸-聚乳酸-聚 乙二醇-聚乳酸-聚組氨酸嵌段共聚物。6. 根據(jù)權利要求1-5任何一項所述的納米膠束，其特征在于:所述的抗癌藥物為吉西他 濱、阿霉素、奧沙利鉑、依鉑、紫杉醇、多烯紫杉醇、5-氟尿嘧啶、依托泊苷、長春新堿、羥基喜 樹堿中的兩種或多種，優(yōu)選為吉西他濱和紫杉醇。7. 根據(jù)權利要求1-6任何一項所述的納米膠束，其特征在于:所述的熒光探針為磺酰羅 丹明B、吲哚菁綠、異硫氰酸熒光素、溴化乙錠、水溶性熒光藍、萘酐類水溶性熒光染料、水溶 性菁染料琥珀酰亞胺酯類染料、藻紅蛋白香豆素，Dil(細胞膜紅色熒光探針），羅丹明200， 熒光素酯中的一種或幾種，優(yōu)選為磺酰羅丹明B或吲哚菁綠。8. 根據(jù)權利要求1-7中任何一項所述的納米膠束，其特征在于:所述的抗癌藥物及熒光 探針均為經(jīng)VE修飾的藥物和探針。9. 根據(jù)權利要求1-8任何一項所述的納米膠束，其特征在于，用溶劑揮發(fā)法、薄膜水化 法或透析法制備，優(yōu)選溶劑揮發(fā)法。10. 權利要求1-9任何一項所述的納米膠束在制備實現(xiàn)腫瘤診斷和治療同步進行的藥 物中的應用。
【文檔編號】A61K47/32GK105833293SQ201511020259
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2015年12月30日
【發(fā)明人】楊星鋼, 高云云, 狄?guī)r, 潘衛(wèi)三
【申請人】沈陽藥科大學