一種具有抗腫瘤和凝集活性的猴頭菌糖蛋白及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種具有抗腫瘤和凝集活性的猴頭菌糖蛋白及其制備方法，屬于活性蛋白制備【技術(shù)領(lǐng)域】。以猴頭深層發(fā)酵制備的菌絲體或固體栽培技術(shù)獲得的子實(shí)體為原料，經(jīng)勻漿破碎、冷水浸提、離心、取上清液、硫酸銨沉淀、透析、DEAE-SepharoseFastFlow柱層析等步驟分離純化獲得的。該糖蛋白中多糖的含量為2~20%；蛋白質(zhì)含量為80~90%，其分子量范圍為10~80KDa。該糖蛋白具有對(duì)血紅細(xì)胞凝集活性，并對(duì)腫瘤細(xì)胞，如肝癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞等的生長(zhǎng)有顯著抑制作用，可用于制備可能的抗癌藥物或開發(fā)成保健品。
【專利說明】一種具有抗腫瘤和凝集活性的猴頭菌糖蛋白及其制備方法
[0001]【技術(shù)領(lǐng)域】本發(fā)明屬于活性蛋白制備【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種具有抗腫瘤活性和凝集活性的猴頭菌糖蛋白及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002]食藥用真菌具有抗腫瘤、降血脂、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、保護(hù)心腦血管等多種藥用價(jià)值，關(guān)于其有效成分的分離、純化及結(jié)構(gòu)測(cè)定是目前研究熱點(diǎn)之一。已經(jīng)從其中分離出的活性成分包括:多糖、糖蛋白、萜類化合物和酚類化合物等。近年來，隨著對(duì)食用真菌多糖復(fù)合物分離研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)其具有顯著的抗腫瘤作用。例如:PCP-3A，是一種從金頂側(cè)耳的干子實(shí)體中提取分離出的糖蛋白，在濃度為50 yg/mL，作用于U937白血病細(xì)胞72 h后，對(duì)其抑制率達(dá)到97.70 土 2.31% ;HM-3A，是一種從真姬菇鮮子實(shí)體中提取分離出的糖蛋白，其多糖和蛋白含量分別為21.7 土 1.9%和70.2 土 1.6%，在濃度為100 yg/mL，作用于U937白血病細(xì)胞72 h后，對(duì)其抑制率達(dá)到96.2%。
[0003]猴頭菌是一種珍貴的食藥用真菌，肉質(zhì)鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，有“山珍”之稱，與熊掌、燕窩和魚翅并列為四大名菜。它隸屬于擔(dān)子菌綱多孔菌目齒菌科，具有抗腫瘤、抗肥胖、抗氧化和抗菌等活性，能夠有效治療胃炎、胃潰瘍和十二指腸潰瘍等疾病。目前關(guān)于猴頭菌活性成分的研究主要集中在多糖上，例如專利(CN 101921343A)公開了一種利用鮮猴頭菇子實(shí)體提取多糖的方法，專利(CN 101560262)公開了一種從猴頭菌絲體中提取胞內(nèi)多糖的工藝組合及方法。而關(guān)于猴頭菌糖蛋白成分的研究很少，僅有專利(CN 1772287)公開了一種猴頭菌絲體發(fā)酵浸膏糖蛋白在制藥中的應(yīng)用。為了進(jìn)一步促進(jìn)關(guān)于猴頭菌糖蛋白成分的研究，本發(fā)明以猴頭菌深層發(fā)酵菌絲體或固體栽培的子實(shí)體為原料，分離純化得到一種高純度的具有抗腫瘤活性和凝集活性的猴頭菌糖蛋白，并結(jié)合紅外、氣相色譜、氨基酸分析儀等確定了其理化性質(zhì)。成果為猴頭菌糖蛋白的分離純化提供了參考價(jià)值，所提取到的猴頭糖蛋白可用于制備可能的抗癌藥物或開發(fā)成保健品。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種具有抗腫瘤活性和凝集活性的猴頭菌糖蛋白及其制備方法。該方法是以猴頭深層發(fā)酵制備的菌絲體或固體栽培技術(shù)獲得的子實(shí)體為原料，從中分離純化出具有凝集活性和抗腫瘤活性的猴頭菌糖蛋白，獲得其基本的理化性質(zhì)，所用方法簡(jiǎn)便安全。這種糖蛋白可用于開發(fā)成保健品或制備可能的抗癌藥物。
[0005]為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的:
1、一種具有抗腫瘤和凝集活性的猴頭菌糖蛋白，該糖蛋白中多糖含量為2、％，由D-葡萄糖，L-鼠李糖，D-半乳糖、D-甘露糖、D-阿拉伯糖、D-木糖和D-果糖等多種單糖組成；蛋白質(zhì)含量為80-90%，由天冬氨酸、谷氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸等17種氨基酸組；其分子量范圍為10~80 KDa0
[0006] 2、上述糖蛋白具有顯著的抗腫瘤作用，比如對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901的生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用，因此，該糖蛋白具有成為抗腫瘤藥物的可能性，具有極大的應(yīng)用和推廣前景。
[0007]3、上述糖蛋白對(duì)小鼠血紅細(xì)胞具有顯著的凝集作用。
[0008]4、一種制備上述具有抗腫瘤活性以及凝集活性的猴頭糖蛋白的方法:按照下述步驟進(jìn)行:(I)猴頭菌子實(shí)體制備:將菌種保藏中心保藏的猴頭菌種，如中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心保藏菌株猴頭菌ACCC 50011栽培在豆秸粉、玉米桿粉、麥麩、闊葉樹木糠、甜菜渣、甘蔗渣或棉籽殼等基質(zhì)上，2(T30 °e培養(yǎng)15~30 d，采集得到的子實(shí)體。
[0009](2)猴頭菌深層發(fā)酵菌絲體制備:將菌種保藏中心保藏的猴頭菌種如中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心保藏菌株猴頭菌ACCC 50011活化，將菌種斜面切割成小塊接種到液體種子培養(yǎng)基中25 °e條件下培養(yǎng)7 d后收集種子液，接種于發(fā)酵罐中25 oC, 100 r/min進(jìn)行發(fā)酵7天，8000 r/min離心后獲得猴頭菌絲體。
[0010](3)將上述所得子實(shí)體或者菌絲體加入0.8^3倍體積的水后勻漿破碎，4-20 浸提，離心，棄沉淀，取上清液，上清液濃縮后加入硫酸銨至飽和度為60-90%，靜置24-48 h，高速離心取沉淀，加少量水復(fù)溶沉淀，將沉淀復(fù)溶液置入8000-14(ΚΚ) Da的透析袋，去離子水透析，收集透析液后濃縮，進(jìn)行DEAE-Sepharose Fast Flow柱層析,依次用蒸懼水和0.1,
0.3,0.5 mol/L NaCl溶液為洗脫液進(jìn)行階段式洗脫，收集各階段洗脫得到的糖蛋白組分，濃縮后冷凍干燥即得到具有抗腫瘤和凝集活性的猴頭菌糖蛋白。
[0011 ] 用紅外、氣相色譜、氨基酸分析儀、SDS-PAGE、MALD1-TOF-MS等確定了其理化性質(zhì)。該糖蛋白中雜多糖含量為2、％，由D-葡萄糖，L-鼠李糖，D-半乳糖和D-甘露糖等4種單糖組成；蛋白質(zhì)含量為80-90%，由天冬氨酸、谷氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸等17種氨基酸組成；其分子量范圍為1(T80 KDa0
[0012]本發(fā)明所提供的猴頭菌糖蛋白為一種全新的物質(zhì)，且具有凝集活性和抗腫瘤活性，這種猴頭菌糖蛋白可望成為有開發(fā)前景的抗癌藥物。該復(fù)合物的制備方法可以固態(tài)栽培獲得的猴頭菌子實(shí)體或者深層發(fā)酵技術(shù)培養(yǎng)猴頭菌絲體為原料，從中分離純化出具有抗腫瘤活性與凝集活性的糖蛋白，制備工藝簡(jiǎn)單、易行，糖蛋白提取率較高，因此具有廣闊的應(yīng)用前景和潛在的經(jīng)濟(jì)效益。
[0013]

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1為本發(fā)明猴頭菌糖蛋白的DEAE-Sepharose Fast Flow層析圖
圖2為本發(fā)明猴頭菌糖蛋白的Superdex?75 prep grad柱層析和SDS-PAGE圖3為本發(fā)明猴頭菌糖蛋白經(jīng)NCBI檢索的肽指紋圖譜(圖中灰色注明分子量的部分為匹配得到的相同肽段的氨基酸序列)
圖4為本發(fā)明猴頭菌糖蛋白對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901生長(zhǎng)的抑制作用(圖中分別是猴頭菌糖蛋白HE-1，HE-2, HE-3等樣品在不同濃度下對(duì)SGC-7901細(xì)胞的抑制率)
圖5為本發(fā)明猴頭菌糖蛋白對(duì)小鼠紅細(xì)胞的凝集作用及其熱穩(wěn)定性(圖a為PBS及猴頭菌糖蛋白HE-3對(duì)小鼠紅細(xì)胞的凝集活性對(duì)比，圖b為不同溫度對(duì)猴頭菌糖蛋白HE-3樣品處理后其對(duì)小鼠紅細(xì)胞的凝集活性變化)。

【具體實(shí)施方式】
[0015]以下以具體實(shí)施例來說明本發(fā)明的技術(shù)方案，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此: 本發(fā)明所述方法制備的具有凝集和抗腫瘤活性的猴頭菌糖蛋白各項(xiàng)功能的測(cè)定試驗(yàn)
(I)抗腫瘤活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)
用完全培養(yǎng)基將猴頭糖蛋白樣品稀釋成不同濃度的樣品溶液:200、100、50、25 μ g/mL ;取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人胃癌細(xì)胞SGC-7901，用RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為5 X 105/mL，將細(xì)胞加入96孔板中，每孔加入100 μ L，置于37 °C、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，再加入不同濃度的蛋白樣品溶液100 μ L，空白對(duì)照組為加入等體積的RPMI1640完全培養(yǎng)基；每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，將細(xì)胞培養(yǎng)板移入CO2培養(yǎng)箱中，在37 °C、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)48 h后，用MTT法于490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定并記錄其吸光值，計(jì)算其對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖抑制率。經(jīng)測(cè)定猴頭菌糖蛋白對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901的生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用(見附圖4)。
[0016](2)凝集活性
取小鼠新鮮血液，用加有檸檬酸鈉的采血管采集，在2000 rpm，4 °C離心10 min，用PBS (pH 7.2,0.02 M磷酸鹽緩沖液)洗滌4次，再次離心，去上清。按紅細(xì)胞壓積用PBS配成2%的紅細(xì)胞懸液。
[0017]在“V”型血凝板中加入25 μ L的PBS，取猴頭菌糖蛋白樣品I mg/mL，25 yL作倍比稀釋，每孔加入2%的紅細(xì)胞懸液，充分震蕩混勻，血凝板在室溫放置I h，肉眼或顯微鏡檢測(cè)觀察結(jié)果。無血凝時(shí)血球沉于“V”型孔底部，呈一小圓點(diǎn)，凝集時(shí)血球相互集聚形成一片網(wǎng)絡(luò)，血球不下沉。血凝滴度以2n(n為使血球凝集的最末孔數(shù))表示。經(jīng)測(cè)定猴頭菌糖蛋白具有凝集活性，血凝滴度為24 (見附圖5)。
[0018](3)熱穩(wěn)定性
取猴頭菌糖蛋白(I mg/mL)溶液，在恒溫水浴中保溫處理30 min, 30-100 0C (30,40,50、60、70、80、90、100 °G)，取出后立即冰浴，在“V”型血凝板上分別進(jìn)行倍比稀釋，檢測(cè)其對(duì)小鼠紅細(xì)胞的凝集活性。
[0019](4)理化特性
①分子量
采用凝膠過濾層析法和SDS - PAGE垂直板凝膠電泳法，測(cè)得猴頭糖蛋白的分子量為10~80 kDa，結(jié)果見圖2 ；
②氨基酸序列分析
將SDS-PAGE中的猴頭抗腫瘤糖蛋白的單條帶膠體切出，經(jīng)還原烷基化蛋白質(zhì)消化處理，再經(jīng)MALD1-T0F-MS測(cè)定，其主要氨基酸序列包括QLNDETTQLRQHR、TDQYAALGQQLSALYR、MQAYMNRLTEAR,GVVSNLDDRYGSEEER,VVFADWMR 以及 GGEPINPQRWIAR，并通過 NCBI 檢索與其匹配度較高的同源蛋白質(zhì)序列，結(jié)果見圖3。
[0020]本發(fā)明中的猴頭菌糖蛋白，與其他糖蛋白的提取方法相比較，制備純度更高，技術(shù)優(yōu)勢(shì)明顯，能獲得組分單一的活性組分。
[0021]實(shí)施例1
將中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物囷種保減管理中心保減囷株猴頭囷ACCC 50011栽培在?稻粉、玉米桿粉、麥麩、闊葉樹木糠、甜菜渣、甘蔗渣或棉籽殼等基質(zhì)上，2(T30 °G培養(yǎng)15~30d，采集得到猴頭菌子實(shí)體。
[0022] 實(shí)施例2將中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心保藏菌株猴頭菌ACCC 50011活化，在PDA斜面培養(yǎng)基(200 g馬鈴薯沸水煮20 min后，過濾取濾液，加入20 g葡萄糖和20 g瓊脂，補(bǔ)加水至I L，pH自然)中培養(yǎng)菌種。培養(yǎng)用的試管以及棉塞均需在121 °e滅菌30 min，再裝入培養(yǎng)基121 oC滅菌30 min，斜放冷卻使其凝固成斜面。然后超凈臺(tái)接種。斜面培養(yǎng)在恒溫25 oC左右進(jìn)行，為期7天。將斜面菌種切割成小塊接種到種子培養(yǎng)液，培養(yǎng)基分裝完畢后，在錐形瓶上塞上棉塞，以防止外界微生物進(jìn)入培養(yǎng)基內(nèi)而造成污染，并保證有良好的通氣性能。種子培養(yǎng)液組成為:玉米粉30.85 8/1，酵母膏2.81 8/1，玉米漿16.9 mL/L，葡萄糖10 g/L, KH2PO4 I g/L，MgSO4.7H20 0.5 g/L，其余為水，pH 自然；在 25 ' 100 rpm 條件下培養(yǎng) 7d后收集種子液，接種于20 L發(fā)酵罐中得發(fā)酵培養(yǎng)液中，液體培養(yǎng)基的組成為:(/L):玉米粉 30~50 g，酵母膏 1-10 g，葡萄糖 I~10 g, KH2PO4 0.2~I g, MgSO4.7H20,0.Tl g，其余為7jC,pH自然；25 °e發(fā)酵7天。
[0023]實(shí)施例3
500 g猴頭菌子實(shí)體加入0.8倍體積的水后勻漿破碎，4 0C浸提，離心，棄不溶物，收集上清液，上清液濃縮后加入硫酸銨至飽和度為80%，靜置24 h，高速離心取沉淀，加少量水復(fù)溶上述沉淀，將復(fù)溶液置入8000-1 4000 Da的透析袋，去離子水透析，收集透析液，濃縮，進(jìn)行DEAE-Sepharose Fast Flow柱層析,用蒸懼水洗脫掉不結(jié)合組分,并依次用0.1 mol/L、
0.3 mol/L和0.5 mol/L的NaCl為洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，收集NaCl溶液各階段洗脫的糖蛋白組分，冷凍干燥各收集液；其中，將HE-1組分進(jìn)行Superdex? 75 prep grad柱層析用蒸餾水洗脫收集得到單一組分。糖蛋白樣品呈淺黃色絮狀，采用紅外、氣相色譜、氨基酸分析儀、SDS-PAGE、MALD1-TOF-MS等確定了其理化性質(zhì)。該糖蛋白中雜多糖含量為5.2%，由D-葡萄糖，L-鼠李糖，D-阿拉伯糖和D-甘露糖等單糖組成；蛋白質(zhì)含量為89.5%，由天冬氨酸、谷氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸等17種氨基酸組成；該糖蛋白復(fù)合物分子量為14.4kDa ο
[0024]實(shí)施例4
500 g猴頭發(fā)酵菌絲體加入2倍體積的水后勻漿破碎，10 °C浸提，離心，棄不溶物，收集上清液，上清液濃縮后加入硫酸銨至飽和度為70%，靜置24 h，高速離心取沉淀，加少量水復(fù)溶上述沉淀，將復(fù)溶液置入8000-14000 Da的透析袋，去離子水透析，收集透析液，濃縮，進(jìn)行DEAE-Sepharose Fast Flow柱層析,用蒸懼水洗脫掉不結(jié)合組分并依次用不同濃度的NaCl為洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，收集不同濃度的NaCl溶液洗脫的糖蛋白復(fù)合物組分，冷凍干燥各收集液。其中，將HE-2組分進(jìn)行Superdex? 75 prep grad柱層析,用蒸懼水洗脫得I個(gè)組分，說明其為單一組分，冷凍干燥后即得到猴頭菌糖蛋白復(fù)合物，樣品呈淺黃色絮狀，采用紅外、氣相色譜、氨基酸分析儀、SDS-PAGE, MALD1-T0F-MS等確定了其理化性質(zhì)。該糖蛋白中雜多糖含量為7.2%，由D-葡萄糖，L-鼠李糖，D-阿拉伯糖和D-木糖等單糖組成；蛋白質(zhì)含量為85.2%，由甲硫氨酸、谷氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、半胱氨酸等17種氨基酸組成；該糖蛋白復(fù)合物分子量為18.20 kDa。
[0025]實(shí)施例5
500 g猴頭菌絲體加入3倍體積的水后勻漿破碎，20 0C浸提，離心，棄不溶物，收集上清液，上清液濃縮后加入硫酸銨至飽和度為60%，靜置24 h，高速離心取沉淀，加少量水復(fù)溶上述沉淀，將復(fù)溶液置入8000-14000 Da的透析袋，去離子水透析，收集透析液，濃縮，進(jìn)行DEAE-Sepharose Fast Flow柱層析,用蒸懼水洗脫掉不結(jié)合組分并依次用不同濃度的NaCl為洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，收集不同濃度的NaCl溶液洗脫的糖蛋白復(fù)合物組分，冷凍干燥各收集液；其中，將HE-3組分進(jìn)行Superdex? 75 prep grad柱層析,用蒸懼水洗得到單一組分的猴頭菌糖蛋白復(fù)合物；樣品呈淺黃色絮狀，采用紅外、氣相色譜、氨基酸分析儀、SDS-PAGE、MALD1-TOF-MS等確定其理化性質(zhì)。糖蛋白樣品中雜多糖含量為8.86%，由D-葡萄糖，D-阿拉伯糖、D-果糖和D-甘露糖等4種單糖組成；蛋白質(zhì)含量為81.8%，由天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、纈氨酸、丙氨酸等17種氨基酸組成；該糖蛋白復(fù)合物分子量為55.10 kDa。
[0026]實(shí)施例6
用完全培養(yǎng)基將猴頭菌糖蛋白樣品稀釋成不同濃度的樣品溶液:200、100、50、25μ g/mL ;取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人胃癌細(xì)胞SGC-7901，用RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為5 X 105/mL，將細(xì)胞加入96孔板中，每孔加入100 μ L，置于37 °C、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，再加入不同濃度的猴頭菌糖蛋白樣品溶液100 μ L，空白對(duì)照組為加入等體積的RPMI 1640完全培養(yǎng)；每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，將細(xì)胞培養(yǎng)板移入CO2培養(yǎng)箱中，在37 °C、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)48 h后，用MTT法于490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定并記錄其吸光值，計(jì)算其對(duì)該癌細(xì)胞增殖抑制率。經(jīng)測(cè)定猴頭菌糖蛋白對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901的生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用，結(jié)果見圖4。
[0027]實(shí)施例7
取小鼠新鮮血液，用加有檸檬酸鈉的采血管采集，在2000 rpm,4 °C離心10 min，用PBS (pH 7.2,0.02 M磷酸鹽緩沖液)洗滌4次，再次離心，去上清。按紅細(xì)胞壓積用PBS配成2%的紅細(xì)胞懸液。
[0028]在“V”型血凝板中加入25 μ L的PBS，取猴頭菌糖蛋白樣品I mg/mL，25 μ L作倍比稀釋，每孔加入2%的紅細(xì)胞懸液，充分震蕩混勻，血凝板在室溫放置I h，肉眼或顯微鏡檢測(cè)觀察結(jié)果。無血凝時(shí)血球沉于“V”型孔底部，呈一小圓點(diǎn)，凝集時(shí)血球相互集聚形成一片網(wǎng)絡(luò)，血球不下沉。血凝滴度以2n(n為使血球凝集的最末孔數(shù))表示。經(jīng)測(cè)定猴頭菌糖蛋白具有凝集活性，血凝滴度為24，結(jié)果見圖5及表1。
[0029]取猴頭菌糖蛋白(I mg/mL)溶液，在恒溫水浴中不同溫度30-100 °C，保溫處理30min，取出后立即冰浴，在“V”型血凝板上分別進(jìn)行倍比稀釋，檢測(cè)其對(duì)小鼠紅細(xì)胞的凝集活性。從圖5及表1可知，HE-3的凝集活性在30 oC以下時(shí)穩(wěn)定，當(dāng)熱處理溫度為40-60 oC時(shí)，其凝集活力減半，90 oC以上溫度熱處理時(shí)，其凝集活性完全喪失。
[0030]本發(fā)明以猴頭深層發(fā)酵制備的菌絲體或固體栽培技術(shù)獲得的子實(shí)體為原料，分離純化出了猴頭菌糖蛋白，保持了糖蛋白的活性，經(jīng)驗(yàn)證，該糖蛋白具有抗腫瘤活性以及凝血活性。本發(fā)明能普遍用于各種食藥用真菌子實(shí)體以及菌絲體糖蛋白的分離純化。
[0031]表1溫度對(duì)猴頭菌糖蛋白凝集活性的影響作用

【權(quán)利要求】
1.一種猴頭菌糖蛋白，其特征在于:該糖蛋白中多糖含量為2~20%，由D-葡萄糖、L-鼠李糖、D-半乳糖、D-甘露糖、D-阿拉伯糖、D-木糖和D-果糖等多種單糖組成；蛋白質(zhì)含量為80、0%，由天冬氨酸、谷氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸等17種氨基酸組成；其分子量范圍為l(T80KDa。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的猴頭菌糖蛋白，其特征在于該糖蛋白可以制備得到具有對(duì)抑制腫瘤細(xì)胞的藥物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的猴頭菌糖蛋白，其特征在于該糖蛋白可以制備得到對(duì)血紅細(xì)胞具有凝集活性的藥物。
4.權(quán)利要求1所述的猴頭菌糖蛋白的制備方法，其特征在于按照下述步驟進(jìn)行: (1)取猴頭菌子實(shí)體或液體深層發(fā)酵得到的菌絲體，加0.5^3倍體積(w/v)的水，勻漿破碎，1~20 °C浸提24 h，離心，收集上清液，低溫濃縮后，加入硫酸銨至飽和度為60-90%，靜置12~48 h，高速離心取沉淀； (2)取上述(I)中的沉淀，加少量水復(fù)溶，將復(fù)溶液置入800(Tl4000Da的透析袋中，去離子水透析； (3)收集上述(2)中的透析液,低溫濃縮后,進(jìn)行DEAE-SepharoseFast Flow柱層析，依次用蒸餾水和0.1 mol/L,0.3 mol/L,0.5 mol/L NaCl為洗脫液進(jìn)行梯度洗脫；OD280 nm在線檢測(cè)，收集的各洗脫部分等組分； (4 )收集上述(3 )中的所有糖蛋白組分，低溫濃縮后，經(jīng)真空冷凍干燥，即得猴頭菌糖蛋 白。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的猴頭菌糖蛋白的制備方法，其特征在于:猴頭菌子實(shí)體制備方法如下:將菌種保藏中心保藏的猴頭菌種，如中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心保藏菌株猴頭菌ACCC 50011栽培在豆秸粉、玉米桿粉、麥麩、闊葉樹木糠、甜菜渣、甘蔗渣或棉籽殼等基質(zhì)上，2(T30 0C培養(yǎng)15~30 d，采集得到的子實(shí)體。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的猴頭菌糖蛋白的制備方法，其特征在于:猴頭菌深層發(fā)酵菌絲體制備方法如下:將菌種保藏中心保藏的猴頭菌種如中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心保藏菌株猴頭菌ACCC 50011活化，將菌種斜面切割成小塊接種到液體種子培養(yǎng)基中25 0C條件下培養(yǎng)7 d后收集種子液，接種于發(fā)酵罐中25 0C, 100 r/min進(jìn)行發(fā)酵7天，8000 r/min離心后獲得猴頭菌絲體。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的猴頭菌絲體制備方法，其特征在于:所述的種子培養(yǎng)液組成為:玉米粉 30.85 g/L，酵母膏 2.81 g/L,玉米衆(zhòng) 16.9 mL/L，葡萄糖 10 g/L, KH2PO4 I g/L，MgSO4.7Η20 0.5 g/L，其余為水，pH自然；發(fā)酵液體培養(yǎng)基的組成為(/L):玉米粉30-50g，酵母膏 10 g，葡萄糖 ΙΟ g，KH2PO4 0.2~I g，MgSO4.7Η20，0.1~? g，其余為水，pH 自然。
【文檔編號(hào)】A61K38/16GK104072593SQ201410314788
【公開日】2014年10月1日 申請(qǐng)日期:2014年7月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月3日
【發(fā)明者】崔鳳杰, 李云虹, 昝新藝, 孫文敬, 錢靜亞, 張志才, 許寧 申請(qǐng)人:江蘇大學(xué)