一種紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架溶媒提取和干燥的改進(jìn)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架溶媒提取和干燥的改進(jìn)方法，步驟包括：無水乙醇提取2-3次、無水乙醇與乙醚提取2-3次、三氯甲烷提取2-3次(加甲醇離心)、無水乙醇提取1-2次、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥。提取在20～24℃條件下進(jìn)行、磁力攪拌7～18h。本發(fā)明有效去除了細(xì)胞壁中的脂類、色素、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，明顯縮短了干燥時(shí)間，更加確保了產(chǎn)品甲醇、三氯甲烷殘留符合要求。
【專利說明】一種紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架溶媒提取和干燥的改進(jìn)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物制藥【技術(shù)領(lǐng)域】中紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架溶媒提取和干燥的 方法，指經(jīng)酶解后的中間產(chǎn)品利用有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取、干燥，去除有機(jī)溶劑的工藝。

【背景技術(shù)】
[0002] 紅色諾卡氏菌（Nocardia rubra)是具有免疫活性的微生物，經(jīng)過細(xì)胞破碎、去除 細(xì)胞內(nèi)容物和蛋白質(zhì)及脂類等組份物質(zhì)，得到其細(xì)胞壁骨架。這是一種含諾卡氏霉菌酸、中 性多糖以及粘肽的活性物質(zhì)，可刺激細(xì)胞免疫功能，并促進(jìn)多種細(xì)胞因子分泌，參與抗腫瘤 免疫過程，用于多種腫瘤的治療或輔助治療。以該細(xì)胞壁骨架為原料的藥品已獲準(zhǔn)上市。
[0003] 目前國(guó)內(nèi)對(duì)于紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架的研究多為劑型及其治療用途的拓展。本 發(fā)明則從紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架溶媒提取和干燥工藝著手，對(duì)其工藝進(jìn)行了改進(jìn)與創(chuàng) 新。現(xiàn)有技術(shù)中，溶媒提取工藝為："分別以乙醇-乙醚、氯仿和氯仿-甲醇提取16小時(shí)"。此 工藝所用三氯甲烷、甲醇為有害有機(jī)溶劑，在制品中的殘留量將受到嚴(yán)格的控制（現(xiàn)行《中 國(guó)藥典》第三部溶劑測(cè)定法規(guī)定：甲醇?xì)埩舨桓哂讴? 3%，三氯甲烷殘留不高于0. 006% )。 該工藝具有殘留量不合格的風(fēng)險(xiǎn)。干燥工藝為："真空干燥箱抽真空干燥50小時(shí)"，該工藝 耗時(shí)長(zhǎng)、效率低。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題，是提供一種既能充分有效地萃取并分離雜質(zhì)、除去有 機(jī)溶劑和水分，能更加確保產(chǎn)品符合要求，又能節(jié)省時(shí)間、降低能耗的方法。
[0005] 本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)以上目的：
[0006] -種紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架溶媒提取和干燥的改進(jìn)方法，包括如下步驟：
[0007] (1)、將無水乙醇加入酶解后所得的紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架碎片，攪拌7-18小 時(shí)，無水乙醇與細(xì)胞壁骨架碎片的比例為6?8 :1，離心，棄上清液，留沉淀碎片；
[0008] ⑵、按（1)步驟繼續(xù)重復(fù)一遍；
[0009] (3)、將體積比1 :1的無水乙醇、無水乙醚加入沉淀碎片中攪拌7-18小時(shí)，無水乙 醇-乙醚混合液與細(xì)胞壁骨架碎片的比例為6?8 :1，離心，棄上清液，留沉淀碎片；
[0010] (4)、按（3)步驟繼續(xù)重復(fù)一遍；
[0011] (5)、將三氯甲烷加入沉淀碎片中攪拌7-18小時(shí)，三氯甲烷與沉淀碎片的比例為 3?4 :1，加入甲醇進(jìn)行離心，甲醇與碎片的比例為5?7 :1，棄上清液，留沉淀碎片；
[0012] (6)、按（5)步驟繼續(xù)重復(fù)一遍；
[0013] (7)、將無水乙醇加入沉淀碎片中攪勻，攪拌7-18小時(shí)，無水乙醇與細(xì)胞壁骨架碎 片的比例為6?8:1，離心，棄上清液，留沉淀碎片，然后再加入無水乙醇溶解進(jìn)行干燥，溶 解所用的無水乙醇與細(xì)胞壁骨架碎片的比例為2?3 :1。
[0014] (8)、將溶解后的碎片倒入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶并將旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀各管路連接好，水浴溫度可 設(shè)為：50?70°C，啟動(dòng)真空泵，打開冷凝管的飲用水開關(guān)，當(dāng)真空度彡0. 07MPa時(shí)，調(diào)節(jié)調(diào)速 開關(guān)，調(diào)速至60-80轉(zhuǎn)/分，蓋上防護(hù)罩，目視冷凝管不掛水滴時(shí)，計(jì)時(shí)2. 0?4. 0小時(shí)，至 目測(cè)產(chǎn)品干燥為止。
[0015] 其中，步驟⑴和⑵中的離心力，條件優(yōu)選為2304?3600g，4?10°C，15? 25min〇
[0016] 其中，步驟（3)和⑷中的離心力，條件優(yōu)選為2304?3600g，-10?-4Γ，15? 25min〇
[0017] 其中，步驟（5)、（6)和（7)中的離心力，條件優(yōu)選為2304?3600g，4?10°C，15? 25min〇
[0018] 其中，步驟（1)-(7)所述的攪拌溫度，條件優(yōu)選為20?24°C。
[0019] 其中，步驟⑶中的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥，條件優(yōu)選為水浴溫度：50?70°C，真空度 彡0. 07MPa，轉(zhuǎn)速：60-80轉(zhuǎn)/分。更優(yōu)選為水浴溫度60°C，轉(zhuǎn)速70轉(zhuǎn)/分。
[0020] 本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明改進(jìn)了現(xiàn)有乙醇-乙醚、氯仿和氯仿-甲醇提取方法， 本發(fā)明整個(gè)提取過程中采用兩次無水乙醇提取2-3次，無水乙醇與乙醚提取2-3次，三氯甲 烷提取2-3次（加甲醇離心），無水乙醇提取1-2次，可有效去除諾卡氏菌細(xì)胞壁中脂類、色 素和蛋白質(zhì)類等雜質(zhì)。并且，甲醇、氯仿等有機(jī)溶劑殘留低。整個(gè)干燥過程采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀， 利用真空泵使蒸發(fā)瓶處于負(fù)壓狀態(tài)，蒸發(fā)瓶在旋轉(zhuǎn)同時(shí)置于水浴鍋中恒溫加熱，瓶?jī)?nèi)溶液 在負(fù)壓下進(jìn)行加熱擴(kuò)散蒸發(fā)，熱蒸汽在冷凝管冷卻作用下迅速液化，加快蒸發(fā)速率，從而達(dá) 到干燥的效果。本發(fā)明提高了提取效率，降低有機(jī)溶劑殘留，有效去除了細(xì)胞壁中的脂類、 色素、蛋白質(zhì)類等成分，同時(shí)有效減低了有機(jī)溶劑殘留，其中甲醇?xì)埩舯痊F(xiàn)行《中國(guó)藥典》第 三部溶劑測(cè)定法標(biāo)準(zhǔn)低了 3倍以上，而三氯甲烷則更幾無檢出殘留。本發(fā)還極大地縮短了 干燥時(shí)間，從以往真空干燥箱抽真空干燥改為水浴恒溫旋轉(zhuǎn)真空干燥，將干燥從50小時(shí)縮 至4小時(shí)，縮短了 12倍以上，極大地提高了干燥效率。此法提高了產(chǎn)品用藥安全性，保證了 產(chǎn)品質(zhì)量。（現(xiàn)行《中國(guó)藥典》第三部溶劑測(cè)定法規(guī)定：甲醇?xì)埩舨桓哂讴? 3%，三氯甲烷殘 留不聞?dòng)?. 006% )。

【具體實(shí)施方式】
[0021 ] 實(shí)施例1至3酶解后所得的紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架碎片，其酶解按《中國(guó)生物制 品規(guī)程》2000年版的"紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架制劑制造及檢定規(guī)程"進(jìn)行。
[0022] 實(shí)施例1
[0023] 具體操作步驟：
[0024] 1.將無水乙醇加入酶解后所得的紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架碎片，至22°C恒溫下、 磁力攪拌15小時(shí)，離心：3136g，8°C，25min，棄上清液，留沉淀碎片。無水乙醇與紅色諾卡氏 菌細(xì)胞壁骨架碎片的比例為8 :1。
[0025] 2.將無水乙醇加入酶解后所得的紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架碎片，至22°C恒溫下、 磁力攪拌7小時(shí)，離心：3136g，8°C，25min，棄上清液，留沉淀碎片。無水乙醇與紅色諾卡氏 菌細(xì)胞壁骨架碎片的比例為8 :1。。
[0026] 3.將1 :1無水乙醇、無水乙醚加入沉淀碎片中攪勻，至22°C恒溫下、磁力攪拌15 小時(shí)，離心：3136g，-4°C，25min，棄上清液，留沉淀碎片。乙醇-乙醚混合溶液與紅色諾卡氏 菌細(xì)胞壁骨架碎片的比例為8 :1。
[0027] 4.將1 :1無水乙醇、無水乙醚加入沉淀碎片中攪勻，至22°C恒溫下、磁力攪拌7小 時(shí)，離心：3136g，-4°C，25min，棄上清液，留沉淀碎片。乙醇-乙醚混合溶液與紅色諾卡氏菌 細(xì)胞壁骨架碎片的比例為8 :1。
[0028] 5.將三氯甲烷加入沉淀碎片中攪勻，至22°C恒溫下、磁力攪拌15小時(shí)，三氯甲烷 與沉淀碎片的比例為4 :1，加入甲醇進(jìn)行離心：31368,81：，251^11，棄上清液，留沉淀碎片。 甲醇與沉淀碎片的比例為7:1。
[0029] 6.將三氯甲烷加入沉淀碎片中攪勻，至22°C恒溫下、磁力攪拌7小時(shí)，三氯甲烷與 沉淀碎片的比例為4 :1，加入甲醇進(jìn)行離心：3136g，8°C，25min，棄上清液，留沉淀碎片。甲 醇與沉淀碎片的比例為7 :1。
[0030] 7.將無水乙醇加入沉淀碎片中攪勻，至22°C恒溫下、磁力攪拌15小時(shí)，離心： 3136g，8°C，25min，棄上清液，留沉淀碎片，無水乙醇與細(xì)胞壁骨架碎片的比例為8 : 1，然后 再加入無水乙醇溶解進(jìn)行干燥。溶解用無水乙醇與細(xì)胞壁骨架碎片的比例為2 :1。
[0031] 8.將溶解后的碎片倒入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶并將旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀各管路連接好，水浴溫度設(shè) 為：60°C，啟動(dòng)真空泵，打開冷凝管的飲用水開關(guān)，當(dāng)真空度彡0.07MPa時(shí)，調(diào)節(jié)調(diào)速開關(guān)， 調(diào)速至70轉(zhuǎn)/分，蓋上防護(hù)罩，目視冷凝管不掛水滴時(shí)，計(jì)時(shí)3小時(shí)，至目測(cè)產(chǎn)品干燥為止。
[0032] 實(shí)施例2
[0033] 具體操作步驟：
[0034] 1.將無水乙醇加入酶解后所得的紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架碎片，至22°C恒溫下、 磁力攪拌17小時(shí)，離心：3136g，8°C，20min，棄上清液，留沉淀碎片。無水乙醇與紅色諾卡氏 菌細(xì)胞壁骨架碎片的比例為7 :1。
[0035] 2.將無水乙醇加入酶解后所得的紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架碎片，至22°C恒溫下、 磁力攪拌8小時(shí)，離心：3136 8,81：，2〇1^11，棄上清液，留沉淀碎片。無水乙醇與紅色諾卡氏 菌細(xì)胞壁骨架碎片的比例為7 :1。
[0036] 3.將1 :1無水乙醇、無水乙醚加入沉淀碎片中攪勻，至22°C恒溫下、磁力攪拌15 小時(shí)，離心：3136g，-4°C，20min，棄上清液，留沉淀碎片。乙醇-乙醚混合溶液與紅色諾卡氏 菌細(xì)胞壁骨架碎片的比例為7 :1。
[0037] 4.將1 :1無水乙醇、無水乙醚加入沉淀碎片中攪勻，至22°C恒溫下、磁力攪拌7小 時(shí)，離心：3136g，-4°C，20min，棄上清液，留沉淀碎片。乙醇-乙醚混合溶液與紅色諾卡氏菌 細(xì)胞壁骨架碎片的比例為7 :1。
[0038] 5.將1 :1無水乙醇、無水乙醚加入沉淀碎片中攪勻，至22°C恒溫下、磁力攪拌15 小時(shí)，離心：3136g，-4°C，20min，棄上清液，留沉淀碎片。乙醇-乙醚混合溶液與紅色諾卡氏 菌細(xì)胞壁骨架碎片的比例為7 :1。
[0039] 6.將三氯甲烷加入沉淀碎片中攪勻，至22°C恒溫下、磁力攪拌7小時(shí)，三氯甲烷與 沉淀碎片的比例為7 :2,加入甲醇進(jìn)行離心：3136g，8°C，20min，棄上清液，留沉淀碎片。甲 醇與沉淀碎片的比例為6 :1。
[0040] 7.將三氯甲烷加入沉淀碎片中攪勻，至22°C恒溫下、磁力攪拌15小時(shí)，三氯甲烷 與沉淀碎片的比例為7 :2,加入甲醇進(jìn)行離心：31368,81：，2〇1^11，棄上清液，留沉淀碎片。 甲醇與沉淀碎片的比例為6:1。
[0041] 8.將無水乙醇加入酶解后所得的紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架碎片，至22°C恒溫下、 磁力攪拌8小時(shí)，離心：3136g，8 °C，20min，棄上清液，留沉淀碎片。無水乙醇與紅色諾卡氏 菌細(xì)胞壁骨架碎片的比例為7 :1。
[0042] 9.將無水乙醇加入沉淀碎片中攪勻，至22°C恒溫下、磁力攪拌16小時(shí)，離心： 3136 8,81：，2〇1^11，棄上清液，留沉淀碎片，無水乙醇與細(xì)胞壁骨架碎片的比例為7:1，然后 再加入無水乙醇溶解進(jìn)行干燥。溶解用無水乙醇與細(xì)胞壁骨架碎片的比例為5 :2。
[0043] 10.將溶解后的碎片倒入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶并將旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀各管路連接好，水浴溫度設(shè) 為：60°C，啟動(dòng)真空泵，打開冷凝管的飲用水開關(guān)，當(dāng)真空度彡0.07MPa時(shí)，調(diào)節(jié)調(diào)速開關(guān)， 調(diào)速至70轉(zhuǎn)/分，蓋上防護(hù)罩，目視冷凝管不掛水滴時(shí)，計(jì)時(shí)3. 5小時(shí)，至目測(cè)產(chǎn)品干燥為 止。
[0044] 實(shí)施例3
[0045] 具體操作步驟：
[0046] 1.將無水乙醇加入酶解后所得的紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架碎片，至22°C恒溫下、 磁力攪拌18小時(shí)，離心：3136 8,81：，151^11，棄上清液，留沉淀碎片。無水乙醇與紅色諾卡氏 菌細(xì)胞壁骨架碎片的比例為6 :1。
[0047] 2.將無水乙醇加入酶解后所得的紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架碎片，至22°C恒溫下、 磁力攪拌7小時(shí)，離心：3136 8,81：，151^11，棄上清液，留沉淀碎片。無水乙醇與紅色諾卡氏 菌細(xì)胞壁骨架碎片的比例為6 :1。
[0048] 3.將1 :1無水乙醇、無水乙醚加入沉淀碎片中攪勻，至22°C恒溫下、磁力攪拌16 小時(shí)，離心：3136g，-4°C，15min，棄上清液，留沉淀碎片。乙醇-乙醚混合溶液與紅色諾卡氏 菌細(xì)胞壁骨架碎片的比例為6 :1。
[0049] 4.將1 :1無水乙醇、無水乙醚加入沉淀碎片中攪勻，至22°C恒溫下、磁力攪拌7小 時(shí)，離心：3136g，-4°C，15min，棄上清液，留沉淀碎片。乙醇-乙醚混合溶液與紅色諾卡氏菌 細(xì)胞壁骨架碎片的比例為6 :1。
[0050] 5.將1 :1無水乙醇、無水乙醚加入沉淀碎片中攪勻，至22°C恒溫下、磁力攪拌16 小時(shí)，離心：3136g，-4°C，15min，棄上清液，留沉淀碎片。乙醇-乙醚混合溶液與紅色諾卡氏 菌細(xì)胞壁骨架碎片的比例為6 :1。
[0051] 6.將三氯甲烷加入沉淀碎片中攪勻，至22°C恒溫下、磁力攪拌7小時(shí)，三氯甲烷與 沉淀碎片的比例為3 :1，加入甲醇進(jìn)行離心：3136g，8°C，15min，棄上清液，留沉淀碎片。甲 醇與沉淀碎片的比例為5 :1。
[0052] 7.將三氯甲烷加入沉淀碎片中攪勻，至22°C恒溫下、磁力攪拌16小時(shí)，三氯甲烷 與沉淀碎片的比例為3 :1，加入甲醇進(jìn)行離心：31368,81：，151^11，棄上清液，留沉淀碎片。 甲醇與沉淀碎片的比例為5:1。
[0053] 8.將三氯甲烷加入沉淀碎片中攪勻，至22°C恒溫下、磁力攪拌7小時(shí)，三氯甲烷與 沉淀碎片的比例為3 :1，加入甲醇進(jìn)行離心：31368,8°〇，151^11，棄上清液，留沉淀碎片。甲 醇與沉淀碎片的比例為5 :1。
[0054] 9.將無水乙醇加入沉淀碎片中攪勻，至22°C恒溫下、磁力攪拌16小時(shí)，離心： 3136 8,81：，151^11，棄上清液，留沉淀碎片，無水乙醇與細(xì)胞壁骨架碎片的比例為6:1，然后 再加入無水乙醇溶解進(jìn)行干燥。溶解用無水乙醇與細(xì)胞壁骨架碎片的比例為3 :1。
[0055] 10.將溶解后的碎片倒入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶并將旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀各管路連接好，水浴溫度設(shè)
【權(quán)利要求】
1. 一種紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架溶媒提取和干燥的改進(jìn)方法，包括如下步驟： (1) 將無水乙醇加入酶解后所得的紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架碎片，攪拌7-18小時(shí)，無 水乙醇與細(xì)胞壁骨架碎片的比例為6?8 :1，離心，棄上清液，留沉淀碎片； (2) 按（1)步驟繼續(xù)重復(fù)1-2遍； (3) 將體積比1 :1的無水乙醇、無水乙醚加入沉淀碎片中攪拌7-18小時(shí)，無水乙醇-乙 醚混合液與細(xì)胞壁骨架碎片的比例為6?8 :1，離心，棄上清液，留沉淀碎片； (4) 按（3)步驟繼續(xù)重復(fù)1-2遍； (5) 將三氯甲烷加入沉淀碎片中攪拌7-18小時(shí)，三氯甲烷與沉淀碎片的比例為3?4 : 1，加入甲醇進(jìn)行離心，甲醇與碎片的比例為5?7 :1，棄上清液，留沉淀碎片； (6) 按（5)步驟繼續(xù)重復(fù)1-2遍； (7) 將無水乙醇加入沉淀碎片中攪勻，攪拌7-18小時(shí)，無水乙醇與細(xì)胞壁骨架碎片的 比例為6?8 :1，離心，棄上清液，留沉淀碎片，然后再加入無水乙醇溶解進(jìn)行干燥，溶解所 用的無水乙醇與細(xì)胞壁骨架碎片的比例為2?3 :1 ; (8) 將溶解后的碎片倒入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶，并將旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀各管路連接好，水浴溫度設(shè) 為：50?70°C，啟動(dòng)真空泵，打開冷凝管的飲用水開關(guān)，當(dāng)真空度彡0. 07MPa時(shí)，調(diào)節(jié)調(diào)速開 關(guān)，調(diào)速至60-80轉(zhuǎn)/分，蓋上防護(hù)罩，目視冷凝管不掛水滴時(shí)，計(jì)時(shí)2. 0?4. 0小時(shí)，至目 測(cè)產(chǎn)品干燥為止。
2. 如權(quán)利要求1所述的一種紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架溶媒提取和干燥的改進(jìn)方法，其 特征在于：步驟（1)和（2)中的離心，離心力2304?3600g，4?10°C，15?25min。
3. 如權(quán)利要求1所述的一種紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架的溶媒提取和干燥的改進(jìn)方法， 其特征在于：步驟（3)和（4)中的離心，離心力2304?3600g，-10°C?_4°C，15?25min。
4. 如權(quán)利要求1所述的一種紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架溶媒提取和干燥的改進(jìn)方法，其 特征在于：步驟（5)、（6)和（7)中的離心，離心力2304?3600g，4?10°C，15?25min。
5. 如權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的一種紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架溶媒提取和干燥的改 進(jìn)方法，其特征在于： 步驟⑴-⑵所述的攪拌，溫度為：20?24°C。
6. 如權(quán)利要求5所述的一種紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架的溶媒提取和干燥的改進(jìn)方法， 其特征在于：步驟（1)-(7)所述的攪拌，溫度為22°C。
7. 如權(quán)利要求1所述的一種紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架的溶媒提取和干燥的改進(jìn)方法， 其特征在于：步驟（8)中的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥，條件為水浴溫度：50?70°C，真空度彡0. 07MPa， 轉(zhuǎn)速：60-80轉(zhuǎn)/分。
8. 如權(quán)利要求7所述的一種紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架的溶媒提取和干燥的改進(jìn)方法， 其特征在于：步驟（8)中的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥，條件為水浴溫度：60°C，真空度<0.07MPa，轉(zhuǎn)速： 70轉(zhuǎn)/分。
【文檔編號(hào)】A61P37/04GK104107195SQ201410275364
【公開日】2014年10月22日 申請(qǐng)日期:2014年6月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月19日
【發(fā)明者】徐鏡, 林曉光, 查貝貝, 謝必峰, 黃春玉, 邵恩文 申請(qǐng)人:福建省山河藥業(yè)有限公司