一種副溶血弧菌、美人魚發(fā)光桿菌和鰤諾卡氏菌的檢測引物組、檢測試劑盒和檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于水產(chǎn)養(yǎng)殖動物病原菌檢測領域，具體涉及一種副溶血弧菌、美人魚發(fā) 光桿菌和螄諾卡氏菌的檢測引物組、檢測試劑盒和檢測方法。
【背景技術】
[0002] 副溶血弧菌（Vibrio Parahaemolyticus)、美人魚發(fā)光桿菌（Photobacterium damsel)和螄諾卡氏菌（Nocardia seriolae)是三種常見的水產(chǎn)病原菌，其中副溶血弧菌 和美人魚發(fā)光桿菌屬于革蘭氏陰性菌，而螄諾卡氏菌屬于革蘭氏陽性菌，這三種菌在海洋 環(huán)境及水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中廣泛分布，可引起多種水產(chǎn)養(yǎng)殖動物大量死亡，造成嚴重的經(jīng)濟損 失。
[0003] 副溶血弧菌具有嗜鹽性，可經(jīng)糞-口途徑傳播。食用生鮮或未加工的海產(chǎn)食品，尤 其是牡蠣，非常容易患由副溶血弧菌引起的急性腸胃炎。副溶血弧菌的爆發(fā)往往集中在沿 海地區(qū)的夏季和初秋，因為這個時間段水溫較高進而細菌含量更高。我們最常食用的海鮮 包括烏賊、鯖魚、金槍魚、沙丁魚、蟹、蝦、牡蠣和蛤蚌等都容易攜帶副溶血弧菌。美人魚發(fā)光 桿菌具有嗜鹽性，其重要致病因子是胞外蛋白酶類、胞外溶血素和細胞溶素等，現(xiàn)已從多種 魚類、爬行動物、軟體動物和甲殼動物中分離到美人魚發(fā)光桿菌，此菌嚴重威脅水產(chǎn)養(yǎng)殖重 要經(jīng)濟品種。諾卡氏菌為屬兼性細胞內(nèi)病原，廣泛分布在土壤、活性污泥、水、動植物和人的 組織中，以腐生為主，可引發(fā)人、牛、貓、犬等哺乳動物及多種水產(chǎn)養(yǎng)殖動物疾病，已經(jīng)成為 一種引人注目的人-獸-魚共患病病原。
[0004] 凡納濱對蝦以其肉味鮮美，適應性強、生長迅速和抗病力強等優(yōu)點，成為當今世界 養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的對蝦養(yǎng)殖品種之一。2013年我國海水養(yǎng)殖蝦類產(chǎn)量約為108萬噸，其中南 美白對蝦產(chǎn)量約為81萬噸，占總產(chǎn)量75%。然而隨著養(yǎng)殖密度的增加及養(yǎng)殖環(huán)境的惡化， 對蝦病害日益嚴重。2014年對蝦肝胰腺壞死癥（AHPNS)席卷全球?qū)ξr產(chǎn)區(qū)，根據(jù)實驗表明， 每一尾病蝦會吸引57尾健康蝦的蠶食，疾病1傳57,致死率可達100%。研究發(fā)現(xiàn)AHPNS 并不是單一某種細菌造成的，而是由綜合細菌引起的，并且與副溶血弧菌、美人魚發(fā)光桿菌 和諾卡氏菌有著密切的關聯(lián)。目前養(yǎng)殖戶采用混養(yǎng)模式來預防AHPNS病害，通過凡納濱對 蝦與不同魚類混養(yǎng)的方式，利用它們在食物鏈中的不同作用，及時清理病蝦和死蝦，降低病 原傳播、減少病害發(fā)生，提高養(yǎng)殖成功率及產(chǎn)量。然而這種方法并沒有能從本質(zhì)上去判斷對 蝦是否患有AHPNS疾病，采用這種方法降低病原傳播的概率并不高，仍可能遺漏一些患病 的對蝦在水域中而未被魚類所清理，進而仍存在對其他健康對蝦的傳染性隱患，而且該方 法存在對蝦和魚交叉感染的概率，因此存在著一些不足。
[0005] PCR技術是一種通過體外酶促反應放大擴增特定的基因的技術，該技術能將微量 的DNA大幅增加，具有檢測靈敏度高的特點，而多重PCR方法是PCR技術的重要分支，可檢 測多種特異性基因片段。三重PCR在普通PCR的基礎上，在同一反應體系中加入三對引物， 進而同時特異性擴增出三種目的基因片段，這樣操作節(jié)省時間和成本。如何建立三重PCR 方法用于快速檢測副溶血弧菌、美人魚發(fā)光桿菌和螄諾卡氏菌具有重要的實際意義和應用 價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對現(xiàn)有技術存在的上述不足，本發(fā)明所要解決的技術問題是：如何提供一種副 溶血弧菌、美人魚發(fā)光桿菌和螄諾卡氏菌的檢測引物組，使其可用于三重PCR檢測方法中， 用以檢測樣品是否感染有副溶血弧菌、美人魚發(fā)光桿菌和螄諾卡氏菌。
[0007] 本發(fā)明所要解決的技術問題還有：如何提供一種檢測試劑盒和檢測方法，用以直 接檢測樣品是否感染有副溶血弧菌、美人魚發(fā)光桿菌和螄諾卡氏菌，且具有精確度高、檢測 方便的特點。
[0008] 為了解決上述技術問題，本發(fā)明采用如下技術方案：一種副溶血弧菌、美人魚發(fā)光 桿菌和螄諾卡氏菌的檢測引物組，包括引物對V.pa、引物對N. se和引物對P. da;其中，所述 引物對V. pa包括核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示的V. pa-F和核苷酸序列如SEQ ID NO. 2 所示的V. pa-R ;所述引物對N. se包括核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示的N. se-F和核苷酸 序列如SEQ ID NO. 4所示的N.se-R;所述引物對P. da包括核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所 示的P. da-F和核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示的P. da-F。
[0009] 一種副溶血弧菌、美人魚發(fā)光桿菌和螄諾卡氏菌的檢測試劑盒，包括上述檢測引 物組。
[0010] 采用上述檢測試劑盒進行檢測的方法，包括如下步驟：
[0011] 1)取待檢測樣品50~IOOmg并加入500~550 μ L的TE緩沖液，用玻璃勻漿器充 分勾楽后，于12000r/min離心10min ;
[0012] 2)步驟1)離心后去除沉淀，取上清備用；
[0013] 3)向步驟2)上清溶液中加入30 μ L質(zhì)量濃度為10%的SDS溶液和15 μ L 20mg/ mL的蛋白酶K，并于37°C溫育lh;
[0014] 4)向步驟3)溫育后的溶液中加入100 μ L 5mol/L的NaCl溶液，充分混勻后再加 入 80 μ LCTAB 的 NaCl 溶液，65°C 溫育 20min ;
[0015] 5)向步驟4)溫育后的溶液中加入與溫育后的溶液等體積的酚-氯仿-異戊醇混 合溶液混勾，12000g/min離心4~5min ;
[0016] 6)將步驟5)離心后的上清轉(zhuǎn)入一只新管中，加入上清液0. 6~0. 8倍體積的異丙 醇，12000g/min 離心 4 ~5min ;
[0017] 7)步驟6)離心后去上清，沉淀用ImL的體積濃度為70%的乙醇洗滌后，12000g/ min離心4~5min ;
[0018] 8)步驟7)離心后去上清，沉淀常溫干燥5~10min，重溶于30~50 μ L TE緩沖 液，即為樣品DNA模板；
[0019] 9)樣品組三重？0?反應體系包括：12.5 41^2\卩0?〇8]\^、0.8 41^引物￥.?&4、 〇· 8 μ L 引物 V. pa-R、1. 2 μ L 引物 N. se-F、1. 2 μ L 引物 N. se-R、1. 6 μ L 引物 P. da-F、1. 6 μ L 引物P. da-R、3 μ L步驟8)得到的樣品DNA模板和2. 3 μ L無菌水；
[0020] 10)陽性對照組三重PCR反應體系包括：12.5yL 2XPCR DsMix、0.8yL引物 V. pa-F、0. 8 yL 引物 V. pa-R、l. 2 yL引物 Ν· se-F、l. 2 yL 引物 Ν· se-R、l. 6 yL引物 Ρ· da-F、 I. 6 μ L引物P. da-R、3 μ L陽性對照品和2. 3 μ L無菌水；
[0021] 11)將步驟9)制得的樣品組和步驟10)制得的陽性對照組分別混勻后12000g/ min離心10s，置于PCR儀中，分別于94°C預變性5min，94°C變性30s、55°C退火30s、72°C延 伸lmin，35個循環(huán)，72°C延伸lOmin，進行PCR反應；
[0022] 12)對步驟11)PCR反應結(jié)果進行電泳檢測，分別設置樣品孔、陽性對照孔和參比 孔；所述樣品孔取步驟11)樣品組PCR反應產(chǎn)物5 μ L與6 X Loading Bufferl μ L混合，加 入到1 %瓊脂糖凝膠點樣孔中；所述陽性對照孔取步驟11)陽性對照組PCR反應產(chǎn)物5 μ L 與6XLoading Buffer IyL混合，加入到1%瓊脂糖凝膠點樣孔中；所述參比孔取5yL DL2000DNA Marker加入到1%瓊脂糖凝膠點樣孔中；以140V電壓分別對所述樣品孔、所述 陽性對照孔和所述參比孔進行電泳20min后，于凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果；若樣品孔電泳 條帶出現(xiàn)與陽性對照孔相同大小的條帶，則說明待測樣品中含有相對應的細菌。
[0023] 相比現(xiàn)有技術，本發(fā)明具有如下有益效果：
[0024] 1、本發(fā)明引物組具有高特異性，可以根據(jù)是否擴增就能判斷目標基因的存在與 否，從而能夠確定樣品是否含有副溶血弧菌、美人魚發(fā)光桿菌或螄諾卡氏菌，能夠?qū)崿F(xiàn)對副 溶血弧菌、美人魚發(fā)光桿菌和螄諾卡氏菌進行檢測。
[0025] 2、采用本發(fā)明檢測試劑盒可以同時對三種病原菌進行檢測，即進行一次實驗就可 以得到三種病原菌的檢測結(jié)果，并且在5個小時左右完成檢測。相比傳統(tǒng)檢測方法，不僅節(jié) 約了成本和時間，也減少了勞動力的支出。
[0026] 3、本發(fā)明的副溶血弧菌、美人魚發(fā)光桿菌和螄諾卡氏菌三重PCR檢測方法，不但 使得南美白對蝦養(yǎng)殖水體病原檢測更加快速，而且可用于南美白對蝦混養(yǎng)過程中各時期跟 蹤檢測中，可以對病害的爆發(fā)進行及時預警，避免病原菌傳播流行，減少對蝦和魚交叉感染 的概率，降低對蝦及其混養(yǎng)魚類疾病爆發(fā)的風險，提高科學管理效率，具有很高的實用價 值，有利于增加養(yǎng)殖效益。
[0027] 4、本發(fā)明的檢測操作簡單，不需要使用復雜儀器，也不需要特殊試劑，只需常規(guī) PCR儀即可，對檢測人員的技術素質(zhì)要求較低，只需進行簡單培訓即可。
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