基于水解探針法的快速檢測地中海貧血泰國型缺失型的試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于水解探針法的快速檢測地中海 貧血泰國型缺失型的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 地中海貧血也稱珠蛋白合成障礙性貧血，簡稱地貧。地中海貧血是廣西地區(qū)最常 見的單基因遺傳疾病之一，常見的地貧種類有Cl-地貧和β-地貧。中國人群中，α-地貧 的基因型常見的為缺失型一SEA、-α3·7和-α 4·2。申請人在日常檢測中發(fā)現(xiàn)α地貧中的泰 國型缺失（--?ΑΙ)人群中有一定的分布幾率，而泰國型缺失等位基因并未在常規(guī)地貧檢測 試劑盒以內(nèi)。為了避免泰國型缺失的漏篩，需要建立一種可以快速診斷一ΤΗΑΙ等位基因的檢 測試劑盒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種基于水解探針法的快速檢測地中海貧血泰 國型缺失型的試劑盒。采用該試劑盒可以實現(xiàn)單管單次反應(yīng)完成一ΤΗΑΙ罕見缺失型地中海 貧血等位基因的檢測，且具有高度的靈敏性、穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性，以及較高的特異性。
[0004] 本發(fā)明所述的基于水解探針法的快速檢測地中海貧血泰國型缺失型的試劑盒，包 括擴增引物和熒光探針，其中：
[0005] 所述的擴增引物為：一對可以擴增α -珠蛋白基因簇中一ΤΗΑΙ等位基因的特征序 列的引物THAI-F和THAI-R，其中：
[0006] THAI-F :5'-AAGCGAGAGGAATCACATTC-3' ；
[0007] THAI-R :5'-CTTGGATCTGCACCTCTG-3' ；
[0008] 所述的熒光探針為特異性檢測THAI-F和THAI-R擴增產(chǎn)物的熒光探針T HAI-Prob，具體為：
[0009] THAI-Prob :5, -CY5-TGTACCAAGTGGGCTGAGCCCTTGA-BHQ-2-3, 〇
[0010] 上述試劑盒中的熒光探針中，CY5是指花青染料分子5,BHQ-2是指熒光淬滅基團。
[0011] 本發(fā)明所述的基于水解探針法的快速檢測地中海貧血泰國型缺失型的試劑盒還 包括一些現(xiàn)有試劑盒中常規(guī)且必須的組分，如緩沖液、酶液、MgCljP dNTP。具體地，酶液為 Taq聚合酶體系，包括可用于水解探針法的熱啟動酶體系等；所述緩沖液為常規(guī)的PCR緩沖 液；當(dāng)酶液選擇采用康為世紀(jì)所生產(chǎn)的GoldStar Taq DNA Polymerase時，緩沖液則優(yōu)選為 與 GoldStar Taq DNA Polymerase 配套的緩沖液。
[0012] 采用上述試劑盒快速檢測一THAI的方法包括以下步驟：
[0013] 1)抽提樣本基因組DNA，制備DNA模板； _4] 2)配制反應(yīng)體系，具體為：
[0015]將引物 THAI-F、THAI-R，熒光探針 THAI-Prob，以及 PCR 緩沖液、酶液、MgC12、dNTP、 水和DNA模板配制成反應(yīng)體系；
[0016] 3)樣本檢測：分別將配制的反應(yīng)體系進行PCR擴增，記錄每個PCR反應(yīng)管內(nèi)的熒 光信號到達設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)次數(shù)Cq(Cq值的大小可以反映所檢測模板數(shù)的多 少）；
[0017] 4)數(shù)據(jù)分析及結(jié)果判定：根據(jù)實時熒光定量PCR儀自帶的分析軟件分析判讀結(jié) 果；當(dāng)CY5通道有Cq值讀數(shù)時，則表示該樣本攜帶一THAI等位基因；當(dāng)CY5通道沒有Cq值 讀數(shù)時，則表示該樣本不攜帶一THAI等位基因。
[0018] 上述方法的步驟1)中，采用現(xiàn)有常規(guī)方法制備DNA模板。
[0019] 上述方法的步驟2)中，反應(yīng)體系中各組分的濃度優(yōu)選為：待檢測DNA :1~3ng/ yL ;各引物：0· 3~0· 5ymol/L ;探針濃度為0· 3~0· 5ymol/L ;DNA模板：20~200ng ;鎂 離子：1. 5~I. 9mmol/L ;反應(yīng)體系的終體積優(yōu)選為20 μ L。
[0020] 上述方法的步驟3)中，PCR擴增條件為：95°C預(yù)變性8~12分鐘，然后95°C 15~ 30秒，60 °C退火50~70秒，39~49個循環(huán)，于60 °C退火步驟末采集熒光信號。
[0021] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的特點在于：
[0022] 1、本發(fā)明所述試劑盒可以實現(xiàn)單管單次反應(yīng)完成一THAI罕見缺失型地中海貧血等 位基因的檢測，且具有高度的靈敏性、穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性，以及較高的特異性。
[0023] 2、本發(fā)明所述試劑盒應(yīng)用于熒光水解探針法檢測一THAI罕見缺失型地中海貧血等 位基因時，無需開管操作，極大限度地降低了實驗室PCR產(chǎn)物污染的可能。
[0024] 3、采用熒光水解探針的實驗方案比現(xiàn)有其他方法所需時間少，對設(shè)備要求不高。
【附圖說明】
[0025] 圖1為本發(fā)明實施例1中1#樣本的擴增曲線；
[0026] 圖2為本發(fā)明實施例1中2#樣本的擴增曲線。
【具體實施方式】
[0027] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步的詳述，以更好地理解本發(fā)明的內(nèi)容，但 本發(fā)明并不限于以下實施例。
[0028] 實施例1 :采用本發(fā)明所述試劑盒在已知基因型樣本中的檢測結(jié)果
[0029] 1、試劑盒的組成：
[0030] 擴增α -珠蛋白基因簇中一THAI等位基因的特征序列的引物對THAI-F和THAI-R :
[0031] THAI-F :5'-AAGCGAGAGGAATCACATTC-3'（SEQ ID NO :1);
[0032] THAI-R :5'-CTTGGATCTGCACCTCTG-3'（SEQ ID NO :2);
[0033] 特異性檢測THAI-F和THAI-R擴增產(chǎn)物的熒光探針THAI-Prob為：
[0034] THAI-Prob :5'-CY5-TGTACCAAGTGGGCTGAGCCCTTGA-BHQ-2-3'（SEQ ID NO :3);
[0035] 其它組成成分：
[0036] GoldStar Taq DNA Polymerase、與GoldStar Taq DNA Polymerase配套的緩沖液 和dNTPs均購自康為世紀(jì)，MgCl2購自Life Technology。
[0037] 按下述表1配制PCR反應(yīng)體系：
[0038] 表1 : (mM 表不 mmol/L，μ M 表不 μ mol/L) CN 105176996 A 說明書 3/4 頁
[0040] 2、實施方法：
[0041] PCR反應(yīng)所用儀器為Bio-Rad實時熱循環(huán)儀CFX96。PCR反應(yīng)程序為：95°C預(yù)變性 8~12分鐘，然后95 °C 15~30秒，60 °C退火50~70秒，39~49個循環(huán)，于60°C退火步 驟末采集熒光信號。
[0042] 樣本處理：米用 Lab-Aid DNA mini extraction kid (Bio-V, Xiamen)試劑盒抽提 DNA，以雙蒸水稀釋至20~200ng/ μ L備用。DNA樣本也可采用其他常規(guī)DNA提取方法提 取。
[0043] 樣本檢測：將1份用常規(guī)方法檢測確定的已知基因型待檢樣本（簡稱1#樣本）， 以及1份正?；蛐停é?α / α α，Ν/Ν)樣本（簡稱2#樣本），根據(jù)上述反應(yīng)體系和反應(yīng)程 序，于熒光定量PCR儀上進行擴增檢測，記錄Cq值。
[0044] 3、樣本來源：所有樣本均來源自經(jīng)常規(guī)Gap-PCR技術(shù)確定基因型的DNA樣本。
[0045] 4、數(shù)據(jù)分析及結(jié)果判定：根據(jù)實時熒光定量PCR儀自帶的分析軟件分析判讀結(jié) 果。當(dāng)CY5通道有Cq值讀數(shù)時，則表示該樣本攜帶一ΤΗΑΙ等位基因；當(dāng)CY5通道沒有Cq值 讀數(shù)時，則表示該樣本不攜帶一ΤΗΑΙ等位基因。
[0046] 經(jīng)檢測分析，1#樣本的CY5通道有Cq值讀數(shù)（擴增曲線如圖1所示，Cq值讀數(shù)由 表2所示），表示1#樣本攜帶一ΤΗΑΙ等位基因；2#樣本的CY5通道沒有Cq值（譜圖如圖2 所示，Cq值讀數(shù)由表3所示），表示2#樣本不攜帶一ΤΗΑΙ等位基因。
[0047] 表 2 :
[0051] 可見，采用本發(fā)明所述試劑盒進行一ΤΗΑΙ缺失型地中海貧血等位基因檢測時，結(jié)果 準(zhǔn)確；而且野生型樣本無非特異性Cq值，具有較高的特異性。
[0052] 實施例2 :本發(fā)明所述試劑盒在隨機基因型樣本中的檢測效果。
[0053] 1、試劑盒的組成：
[0054] 同實施例1。
[0055] 2、實施方法：
[0056] 同實施例1。
[0057] 3、樣本來源：
[0058] 樣本為14例隨機樣本（由欽州市婦幼保健院提供），以雙蒸水稀釋至20~200ng， 作為待檢樣本），以及經(jīng)Gap-PCR驗證的1例野生型樣本，1例泰國型陽性樣本。
[0059] 4、數(shù)據(jù)分析及結(jié)果判定：
[0060] 根據(jù)實時熒光定量PCR儀自帶的分析軟件分析判讀結(jié)果。若CY5通道有Cq值 讀數(shù)，則表示該樣本攜帶一THAI等位基因；若CY5通道沒有Cq值讀數(shù)，則表示該樣本不攜 帶一THAI等位基因。結(jié)果如下述表4所示。
[0061] 表 4 :
[0063] 注：樣本類型中Neg Ctrl =陰性對照，Pos Ctrl =陽性對照，Unkn =未知樣本類 型，檢測結(jié)果中，N/A=無 Cq值。
[0064] 結(jié)果顯示，野生型樣本與陽性樣本檢出Cq值與理論一致，隨機樣本中檢出一 例__??等位基因。
【主權(quán)項】
1. 基于水解探針法的快速檢測地中海貧血泰國型缺失型的試劑盒，包括擴增引物和熒 光探針，其特征在于： 所述的擴增引物為：一對可以擴增a-珠蛋白基因簇中--?AI等位基因的特征序列的 引物THAI-F和THAI-R，其中： THAI-F :5' -AAGCGAGAGGAATCACATTC-3'； THAI-R :5' -CTTGGATCTGCACCTCTG-3'； 所述的熒光探針為特異性檢測THAI-F和THAI-R擴增產(chǎn)物的熒光探針THAI-Prob，具體 為： THAI-Prob :5' -CY5-TGTACCAAGTGGGCTGAGCCCTTGA-BHQ-2-3'。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述的試劑盒還包括緩沖液、酶液、 MgCljP dNTP。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于水解探針法的快速檢測地中海貧血泰國型缺失型的試劑盒。該試劑盒包括一對可以擴增α-珠蛋白基因簇中--THAI等位基因的特征序列的引物THAI-F和THAI-R，其中：THAI-F：5’-AAGCGAGA？GGAATCACATTC-3’；THAI-R：5’-CTTGGATCTGCACCTCTG-3’；以及一條特異性檢測THAI-F和THAI-R擴增產(chǎn)物的熒光探針THAI-Prob：5’-CY5-TGTACCAAGTGGGCTGAGCCCTTGA-BHQ-2-3’。采用該試劑盒可以實現(xiàn)單管單次反應(yīng)完成--THAI罕見缺失型地貧等位基因的檢測，且靈敏性、穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性高。
【IPC分類】C12N15/11, C12Q1/68
【公開號】CN105176996
【申請?zhí)枴?br>【發(fā)明人】龍駒, 孫雷, 龐婉容, 翁勛錦, 葉學(xué)和
【申請人】欽州市婦幼保健院
【公開日】2015年12月23日
【申請日】2015年10月26日