專利名稱：白色諾卡氏菌的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及微生物技術領域，特別是涉及一種具有NO合成酶抑制作用的微生物。
背景技術：
研究表明，NO在神經(jīng)、免疫、心血管等多個系統(tǒng)中具有廣泛而復雜的生理和病理作用。它是不穩(wěn)定彌散性自由基通過大量的化學反應而發(fā)揮其生理作用，廣泛影響信息傳遞過程、能量代謝和DNA的合成。例如腦缺血，NO會大量增加。過量的NO反過來會抑制DNA的合成，損傷細胞。因此，抑制NO合成酶，是醫(yī)治神經(jīng)、免疫、心血管疾病的重要環(huán)節(jié)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種其發(fā)酵液具有抑制NO合成酶作用的微生物——白色諾卡氏菌。
本發(fā)明所述的白色諾卡氏菌命名為白色諾卡氏菌Nocardia alba YIM30243，保藏編號為CCTCC NOM203017。
本發(fā)明所述的白色諾卡氏菌系從我國云南河口采集的土壤樣品中分離得到。現(xiàn)保藏在國家知識產(chǎn)權局指定的保藏單位保藏，保藏單位名稱中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2003年2月14日，保藏編號為CCTCC NOM203017。
本發(fā)明所述的白色諾卡氏菌在大多數(shù)培養(yǎng)基上生長良好，氣生菌絲呈黃白至粉紅灰色，基內(nèi)菌絲黃白至黃褐色。氣生菌絲、基內(nèi)菌絲不規(guī)則斷裂。明膠液化、淀粉水解、硝酸還原呈陽性，牛奶凝固、胨化呈陰性，不產(chǎn)生硫化氫，不產(chǎn)生黑色素。能利用葡萄糖、甘露糖、木糖、核糖、肌醇、甘露醇、甘氨酸、組氨酸、甲硫氨酸。細胞壁含有meso-DAP，全細胞水解物含有半乳糖和阿拉伯糖。
培養(yǎng)條件(一)斜面培養(yǎng)條件培養(yǎng)基葡萄糖4g；酵母膏4g；麥芽膏5g；復合維生素3.75mg/L；瓊脂15g；蒸餾水水1000ml，pH7.2；培養(yǎng)溫度為28℃，培養(yǎng)時間為1周。
(二)種子培養(yǎng)條件從斜面挑取部分菌絲體接入種子液中，搖瓶培養(yǎng)36小時。種子培養(yǎng)基糊精120g；大豆粉40g；酵母膏2g；色氨酸0.5g；β-丙氨酸5g；硫酸鎂0.5g；磷酸銨0.2g；蒸餾水1000ml，pH7.2，培養(yǎng)溫度為28℃。
(三)發(fā)酵培養(yǎng)條件；按10％的接種量接到種子培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)6天。培養(yǎng)基大豆粉10g；葡萄糖10g；蛋白胨3g；氯化鈉2.5g；碳酸鈣2g；蒸餾水1000ml，pH7.2，培養(yǎng)溫度為28℃。得到發(fā)酵液。
本發(fā)酵液對NO合成酶抑制劑篩選活性結果報告1.實驗原理本法根據(jù)NOS在催化L-Arg氧化分解L-Cit和NO過程中同步引起NADPH氧化為NADP+而產(chǎn)生熒光變化。通過熒光檢測在反應液中NADPH的消耗(激發(fā)光340nm，發(fā)射光440nm)，從而推斷NOS的活性。
2.實驗方法取0.1mg/ml濃度發(fā)酵液樣品，10mM CaCl2，1mM L-Arg，0.5mM NADPH各10ul 加冷酶蛋白60ul(蛋白的制備取豬小腦勻漿，低溫離心，腦重∶緩沖液＝1∶5(g/V)，20000離心10分鐘取上清。Sephadex G25過濾脫鹽) 低溫快速短暫離心 立即340nm波長激發(fā)，440nm波長熒光值測定(反應溫度30℃。反應體系中熒光值的降低速率可以間接反映NOS的活性。測定前振蕩20s混合樣品，逐孔測定，每孔計數(shù)10次求平均值。完成1次整板測定約100秒；連續(xù)測定13次。根據(jù)每孔獲得的13個數(shù)據(jù)，計算熒光值變化斜率作為酶活性。)3.結果計算a)在96孔板中8孔作為對照，其中A1-D1用蒸餾水來代替樣品，反應酶的最大活性；E1-H1分別加入最大濃度NOS抑制劑L-Nω-nitro-arg(LNNA)0.5mM，以該濃度下對酶活性的抑制率100％；b)樣品的抑制率(樣品的斜率-最大酶活性斜率)/(陽性藥物斜率-最大酶活性斜率)×100％c)IC50計算復篩程序基本同上，每一個樣品稀釋成5個濃度，分別為10，2，0.4，0.08，0.016ug.ml-1。根據(jù)測定結果計算IC50。
本菌株具有抑制NO合成酶的作用，其發(fā)酵液對NO合成酶的抑制率達100％，而且藥效持久、穩(wěn)定、無毒，具有從中開發(fā)新型、高效、無毒的天然藥物的巨大潛力。
本發(fā)明所述的白色諾卡氏菌已于2003年2月14日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏單位簡稱CCTCC，保藏編號為M203017，保藏單位地址武漢，珞珈山，武漢大學內(nèi)，郵政編碼430072。


圖1為本發(fā)明所述的白色諾卡氏菌在酵母膏-麥芽膏培養(yǎng)基上的顯微鏡照片。
圖2為本發(fā)明所述的白色諾卡氏菌在酵母膏-麥芽膏培養(yǎng)基上的電鏡照片。
圖3為本發(fā)明所述的白色諾卡氏菌的培養(yǎng)特征。
圖4為本發(fā)明所述的白色諾卡氏菌的生理生化特征。
圖5為本發(fā)明所述的白色諾卡氏菌的碳氮源利用情況。
圖6為本發(fā)明所述的白色諾卡氏菌和部分相關菌在GenBank數(shù)據(jù)庫的16SrDNA序列及登錄號。
圖7為本發(fā)明所述的白色諾卡氏菌及部分相關菌株依據(jù)16S rDNA序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹。
具體實施例方式
實施例從我國云南河口采集的土壤樣品，在實驗室中按下列條件培養(yǎng)，即可獲得本發(fā)明所述的白色諾卡氏菌。
(一)菌株培養(yǎng)條件1.斜面培養(yǎng)條件培養(yǎng)基葡萄糖4g；酵母膏4g；麥芽膏5g；復合維生素3.75mg/L；瓊脂15g；蒸餾水水1000ml，pH7.2；培養(yǎng)溫度為28℃，培養(yǎng)時間為1周。
2.種子培養(yǎng)條件從斜面挑取部分菌絲體接入種子液中，搖瓶培養(yǎng)36小時。種子培養(yǎng)基糊精120g；大豆粉40g；酵母膏2g；色氨酸0.5g；β-丙氨酸5g；硫酸鎂0.5g；磷酸銨0.2g；蒸餾水1000ml，pH7.2，培養(yǎng)溫度為28℃。
按以下發(fā)酵培養(yǎng)條件培養(yǎng)，即可獲得發(fā)酵液按10％的接種量接到種子培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)6天。培養(yǎng)基大豆粉10g；葡萄糖10g；蛋白胨3g；氯化鈉2.5g；碳酸鈣2g；蒸餾水1000ml，pH7.2，培養(yǎng)溫度為28℃。
本發(fā)明所述的白色諾卡氏菌的16S rDNA部分序列如下CGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGGTAAGGCCCTTCGGGGTACACGAGCGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTGATCTGCCCTGTACTTCGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATATGACCANGGAATGCATGTTCTGTGGTGGAAAGATTTATCGGTACAGGATGGGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAACGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGACCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCCAGCGACG
CCGCGTGGGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCCCTTTCGACAGGGACGAAGCGCAAGTGACGGTACCTGTAGAAGAAGCACCGGCCAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTGTCCGGAATTACTGGGCGTAAAGAGCTTGTAGGCGGTCTGTCGCGTCTTCTGTGAAAACTTGGGGCTCAACCTTAAGCTTGCAGGGGATACGGGCAGACTAGAGTACTTCAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGGTCTCTGGGAAGTAACTGACGCTGAGAAGCGAAAGCATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGGTGGGTACTAGGTGTGGGTTTCCTTCCACGGGATCCGTGCCGTAGCTAACGCATTAAGTACCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGTTTGACATACACCGGAAACCTGCAGAGATGTAGGCCCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCTTATGTTGCCAGCGCGTAATGGCGGGGACTCGTGAGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCCAGGGCTTCACACATGCTACAATGGCCGGTACAGAGGGCTGCGATACCGTGAGGTGGAGCGAATCCCTTAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATCGGGGTCTGCAACTCGACCCCGTGAAGTTGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCATGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCTAACCCTTGTGGAGGGAGCCGTCGAAGGTGGGATCGGCGATTGGGACGAAGTCGTAACAAGGTAGCC
權利要求
1.一種白色諾卡氏菌，其特征在于命名為白色諾卡氏菌Nocardiaalba YIM 30243，現(xiàn)在國家知識產(chǎn)權局指定的保藏單位保藏，保藏日期為2003年2月14日，保藏單位名稱中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號CCTCC NOM203017。
2.根據(jù)權利要求1所述的諾卡氏菌，其特征在于該菌種的16SrDNA部分序列如下GGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGGTAAGGCCCTTCGGGGTACACGAGCGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTGATCTGCCCTGTACTTCGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATATGACCANGGAATGCATGTTCTGTGGTGGAAAGATTTATCGGTACAGGATGGGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAACGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGACCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGGGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCCCTTTCGACAGGGACGAAGCGCAAGTGACGGTACCTGTAGAAGAAGCACCGGCCAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTGTCCGGAATTACTGGGCGTAAAGAGCTTGTAGGCGGTCTGTCGCGTCTTCTGTGAAAACTTGGGGCTCAACCTTAAGCTTGCAGGGGATACGGGCAGACTAGAGTACTTCAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGGTCTCTGGGAAGTAACTGACGCTGAGAAGCGAAAGCATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGGTGGGTACTAGGTGTGGGTTTCCTTCCACGGGATCCGTGCCGTAGCTAACGCATTAAGTACCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGATTAATTCGATGCAACGGCGAAGAACCTTACCTGGGTTTGACATACACCGGAAACCTGCAGAGATGTAGGCCCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCTTATGTTGCCAGCGCGTAATGGCGGGGACTCGTGAGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCCAGGGCTTCACACATGCTACAATGGCCGGTACAGAGGGCTGCGATACCGTGAGGTGGAGCGAATCCCTTAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATCGGGGTCTGCAACTCGACCCCGTGAAGTTGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCATGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCTAACCCTTGTGGAGGGAGCCGTCGAAGGTGGGATCGGCGATTGGGACGAAGTCGTAACAAGGTAGCC
全文摘要
本發(fā)明涉及微生物領域，特別是涉及一種具有NO(一氧化氮)合成酶抑制作用的微生物，本發(fā)明特征在于命名為白色諾卡氏菌Nocardia alba YIM 30243，現(xiàn)保存在國家知識產(chǎn)權局指定的保藏單位保藏，保藏日期為2003年2月14日，保藏單位名稱中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號CCTCC NOM203017。本發(fā)明具有抑制NO合成酶的活性，其發(fā)酵液對NO合成酶的抑制率在100％，效果穩(wěn)定而持久，具有從中開發(fā)出新型、高效、無毒天然藥物的巨大潛力。
文檔編號C12N15/31GK1542126SQ0312407
公開日2004年11月3日 申請日期2003年4月29日 優(yōu)先權日2003年4月29日
發(fā)明者李文均, 姜怡, 文孟良, 李銘剛, 徐麗華, 姜成林 申請人:云南省微生物研究所