專利名稱：重組靶向融合蛋白GnRH－TNFαm及其抗腫瘤用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因工程蛋白質(zhì)藥物領域，更具體地，本發(fā)明涉及編碼新型重組靶向抗腫瘤新藥融合蛋白GnRH-TNFαm的基因、包含所述基因的表達型重組體、包含所述表達型重組體的工程菌、由此工程菌表達和分離的靶向融合蛋白GnRH-TNFαm以及該靶向融合蛋白對一類惡性腫瘤細胞的特異殺傷作用。
背景技術：
盡管惡性腫瘤的早期診斷、手術與放化療等方面的技術和手段近年來都有了長足的發(fā)展和進步，對早期惡性腫瘤患者進行手術與放化療聯(lián)合應用也可取得很好的效果，但對那些無手術指征的晚期惡性腫瘤患者來說，他們不但要承受放化療所帶來的嚴重毒副作用，而且還要承擔目前的放化療措施無法治愈其所患惡性腫瘤的風險。實際上，導致全世界目前每年仍有一千萬以上的人因為惡性腫瘤而失去生命的根本原因，就在于缺乏真正有效的抗腫瘤藥物。
腺癌(adenocarcinoma)是臨床上最難治療的惡性腫瘤之一。據(jù)統(tǒng)計，發(fā)生于結(jié)腸、乳腺和肺的腺癌是臨床上常見的3種主要腫瘤，如果把源于卵巢、子宮內(nèi)膜、前列腺、胰腺、腎和肝等組織器官的腺癌也考慮在內(nèi)，那么，死于腺癌的人數(shù)將超過死于腫瘤的總?cè)藬?shù)的1/2。由此看來，對適于腺癌治療的新藥或其它治療手段的需求是迫切的。
促性腺激素釋放肽(gonadotropin-releasing hormone，GnRH)是一種主要由下丘腦合成和分泌的神經(jīng)多肽激素。它通過“下丘腦→垂體→性腺軸”來實現(xiàn)生殖生理調(diào)節(jié)的目的。研究發(fā)現(xiàn)，除垂體外，GnRH及其受體GnRHR還表達于腦、乳腺、卵巢、子宮內(nèi)膜、睪丸、腎上腺、前列腺和胎盤等組織以及源于乳腺、卵巢、子宮內(nèi)膜、前列腺、胰腺、結(jié)腸、肺、腎和肝等組織器官的腺癌。試驗證實，GnRH及其類似物對腫瘤細胞的增殖均有一定的抑制作用，所以，它們在婦科和腫瘤等領域已受到廣泛關注。臨床上常將GnRH及其類似物用于性腺機能低下、不育和促性腺激素依賴的腫瘤等疾病的治療。據(jù)此看來，GnRHR可作為有關腺癌特異藥物作用的標靶之一。
TNFα發(fā)現(xiàn)于1975年，由于其對包括神經(jīng)纖維瘤、肺癌、乳腺癌、肌肉瘤和淋巴瘤等在內(nèi)的多種腫瘤細胞系都具有明顯的殺傷作用，所以，美國政府早在1985年就批準了用TNFα來治療惡性腫瘤的臨床試驗申請。但TNFα因為其系統(tǒng)使用時的毒性太大而限制了應用。不過考慮到TNFα在已知細胞因子中的抗腫瘤活性最強的事實，人們一直在努力開發(fā)其應用潛力。比如，因為大量研究結(jié)果均證實，當采用肢體或器官隔離灌注或病灶內(nèi)直接注射等方法時，由于可以明顯提高TNFα的局部濃度而顯著改善其療效和減輕其毒副作用，所以，TNFα的肢體隔離灌注法在歐洲已被批準用于肢體的惡性惡黑素瘤和深部組織的軟組織瘤等的臨床治療了。
為提高某種毒素或細胞因子的局部濃度和改善療效，更為克服局部灌注或注射時操作上不方便的缺陷，人們常通過構(gòu)建靶向融合蛋白來實現(xiàn)這一目的。
因為GnRHR具有作為腺癌靶向治療標靶的潛力，所以，出現(xiàn)了由GnRH與微生物毒素(綠膿桿菌毒素PE)或植物毒素(美洲商陸抗病毒蛋白PAP)等共同構(gòu)成的靶向融合蛋白GnRH-PE66和GnRH-PAP。在細胞水平的研究中，GnRH-PE66不僅對許多具性激素反應性的腺癌細胞系有明顯的細胞毒性，對源于結(jié)腸、肺、肝和腎臟等器官的腺癌細胞也表現(xiàn)出很強的殺傷作用，而且對源于患者的腺癌原代培物也同樣有效。另一方面，只是因為由10個氨基酸組成的靶向域GnRH的存在，融合毒素GnRH-PE66就只殺傷那些源于患者癌變卵巢或結(jié)腸的原代培養(yǎng)物，而不影響源于同一患者的正常卵巢或結(jié)腸的細胞的生長。再者，GnRH-PE66在動物體內(nèi)可以明顯抑制腫瘤移植物的生長，且無明顯的毒副作用。所有這些結(jié)果都說明，以GnRH為靶向域的融合毒素具有很強的特異性。
在腫瘤研究領域，盡管人們構(gòu)建了大量的抗腫瘤靶向融合蛋白，但真正有可能用于臨床的卻極少。其關鍵在于這些抗腫瘤靶向融合蛋白的免疫原性。因為在這些抗腫瘤靶向融合蛋白中，其靶向域有許多都是源于異種動物的完整抗體或抗體的可變區(qū)，而且其抗腫瘤效應域多是一些源于動物、植物或微生物的毒素蛋白。因此，這些抗腫瘤靶向融合蛋白往往因為會刺激患者產(chǎn)生中和抗體而使重復使用無效。
綜上認為，(1)TNFα具有很好的開發(fā)應用潛力——是已知的抗腫瘤活性最強的細胞因子，但因為特異性差、毒副作用大而無法應用。(2)腺癌是很重要的目標疾病——患者群龐大，且極難治療。(3)GnRH受體是腺癌特異藥物攻擊的理想標靶——絕大多數(shù)腺癌細胞表面都有GnRH受體存在，并且GnRH本身對腺癌細胞的增殖就具有抑制作用。有鑒于此，我們構(gòu)建了一種完全由人體的正常組份GnRH和TNFα構(gòu)成的靶向融合蛋白GnRH-TNFαm，以期克服原型TNFα的毒副作用和為晚期惡性腫瘤患者尤其是腺癌患者提供一種高效、無毒或低毒的治療藥物。

發(fā)明內(nèi)容
由于本發(fā)明的內(nèi)容主要涉及編碼新型的重組靶向融合蛋白GnRH-TNFαm的基因、包含所述基因的表達型重組體、包含所述表達型重組體的工程菌、由此工程菌表達和分離的靶向融合蛋白GnRH-TNFαm以及該靶向融合蛋白對惡性腫瘤細胞的特異殺傷作用等方面，因此，本發(fā)明的目的主要有以下幾個方面本發(fā)明最重要的目的在于提供一種抗腫瘤新藥靶向融合蛋白GnRH-TNFαm。該靶向融合蛋白是一種全新的分子，它由人GnRH和人TNFα衍生物共同組成，其具有SEQ ID NO2的氨基酸序列。在構(gòu)建該融合蛋白時，于其GnRH部分的第1位氨基酸之前增加了1個氨基酸(Met)，分別于其TNFα部分的第1位氨基酸之前后增加了6個(Glu Phe Pro Pro Pro Ala)和3個氨基酸(Arg Gly Pro)。由于GnRH的存在及其與GnRH受體之間的相互作用，該靶向融合蛋白被賦予了新的特征，即既具有原型TNFα樣活性，又具有相對特異性，更具有原型TNFα所不具備的活性(對原型TNFα本身耐受的腫瘤細胞的殺傷作用)。也就是說，與因為毒副作用過大而無法應用于腫瘤臨床治療的原型TNFα相比，本發(fā)明的重組靶向融合蛋白GnRH-TNFαm具有更好的應用前景。
本發(fā)明的第二個目的在于提供一種編碼抗腫瘤新藥靶向融合蛋白GnRH-TNFαm的基因GnRH-TNFαm，其具有SEQ ID NO1的核苷酸序列。
本發(fā)明的第三個目的在于提供兩種分別包含所述基因GnRH-TNFαm的表達型重組體pLEGTI和pLT30GTI。
本發(fā)明的第四個目的在于提供兩種分別包含所述表達型重組體的工程菌pLTEGTI/DH5α和pLT30GTI/BL21/DE3。
本發(fā)明的第五個目的在于提供靶向融合蛋白GnRH-TNFαm對惡性腫瘤細胞具有特異殺傷作用的試驗證據(jù)。


圖1示出了攜帶有人TNFαcDNA的重組體pLT9KGITNFαm圖2示出了測序載體pBluescript II SK圖3示出了攜帶有突變型TNFαcDNA(TNFm)的測序重組體pYYSKTNFαm圖4示出了攜帶有融合蛋白基因GnRH-TNFαm的測序重組體圖5示出了攜帶有融合蛋白基因GnRH-TNFαm的溫控型表達型重組體pLTEGTI圖6示出了攜帶有融合蛋白基因GnRH-TNFαm的IPTG誘導型表達型重組體pLT30GTI圖7示出了融合蛋白基因GnRH-TNFαm的溫控型表達型重組體pLTEGTI的表達結(jié)果，其中泳道1DH5空菌/誘導；泳道2蛋白Marker(自上而下97，66，43，31，20，14.4kD；但31kD帶不清楚)；泳道3pLTEGTI/DH5/不誘導；泳道4pLTEGTI/DH5/42℃誘導。
圖8示出了GnRH-TNFαm的IPTG誘導型表達型重組體pLT30GTI的表達結(jié)果，其中泳道1工程菌BL21(DE3)/pLT30GTI(5h)；泳道1工程菌BL21(DE3)/pLT30GTI(3h)；泳道3蛋白分子量標記(自上而下為97，66，43，31，20，14.4kD)圖9示出了融合蛋白GnRH-TNFαm和原型TNFα對L929細胞作用24h的結(jié)果圖10示出了GnRH-TNFαm與原型TNFα對Act D活化前后的L929細胞殺傷作用的比較圖11示出了融合蛋白GnRH-TNFαm和原型TNFα對肝癌細胞HepG2的作用結(jié)果圖12示出了融合蛋白GnRH-TNFαm和原型TNFα對乳腺癌細胞MCF-7的作用結(jié)果圖13示出了融合蛋白GnRH-TNFαm和原型TNFα對宮頸癌細胞HeLa的作用結(jié)果圖14示出了融合蛋白GnRH-TNFαm和原型TNFα對胰腺癌細胞SW1990的作用結(jié)果圖15示出了GnRH-TNFαm和TNFα分別與Act D聯(lián)合應用于肝癌細胞HepG2的結(jié)果圖16示出了GnRH-TNFαm和TNFα分別與Act D聯(lián)合應用于乳腺癌細胞MCF-7的結(jié)果圖17示出了融合蛋白GnRH-TNFαm與化療藥聯(lián)合應用于乳腺癌細胞MCF-7的結(jié)果圖18示出了GnRH-TNFαm和TNFα分別與Act D聯(lián)合應用于宮頸癌細胞HeLa的結(jié)果圖19示出了融合蛋白GnRH-TNFαm與化療藥聯(lián)合應用于宮頸癌細胞HeLa的結(jié)果圖20示出了GnRH-TNFαm和TNFα分別與Act D聯(lián)合應用于胰腺癌細胞SW1990的結(jié)果圖21示出了融合蛋白GnRH-TNFαm與化療藥聯(lián)合應用于胰腺癌細胞SW1990的結(jié)果具體實施方案本發(fā)明利用本實驗室克隆的人TNFα的cDNA為模板，對其進行2次PCR擴增，以實現(xiàn)對TNF cDNA的突變改造和與GnRH cDNA的融合，獲得編碼重組靶向融合蛋白GnRH-TNFαm的融合基因GnRH-TNFαm。經(jīng)DNA序列分析證明融合基因GnRH-TNFαm完全符合預期序列。
將融合基因GnRH-TNFαm分別克隆進大腸桿菌表達載體pCW111或pET-30a中，獲表達型重組體pLTEGTI和pLT30GTI。將表達型重組體分別轉(zhuǎn)化進大腸桿菌DH5α或BL21/DE3中，經(jīng)篩選獲高表達工程菌。在工程菌pLTEGTI/DH5α和pLT30GTI/BL21/DE3中，重組融合蛋白GnRH-TNFαm的表達量分別達細胞總蛋白的12％和30％左右。
對本發(fā)明的重組靶向融合蛋白GnRH-TNFαm進行了大量的體外細胞試驗研究，結(jié)果證實，與標準品TNFα相比，重組靶向融合蛋白GnRH-TNFαm在具有程度相當?shù)腡NFα樣活性的同時，對小鼠成纖維細胞的殺傷作用明顯降低，對耐受TNFα的腫瘤細胞具有顯著的殺傷作用，且與常用化療藥物之間的協(xié)同作用明顯提高。這些結(jié)果提示，與因為毒副作用過大而無法應用于腫瘤治療的原型TNFα相比，本發(fā)明提供的重組靶向融合蛋白GnRH-TNFαm在腫瘤的治療方面具有很好的應用前景。
以下將參照附圖和實施例詳細描述本發(fā)明。
實施例1.編碼重組靶向融合蛋白的基因GnRH-TNFαm的獲得1.PCR引物及其序列pvt35’-TTAGAATTCCCGCCACCGGCCGTACCGGGTCCAAGATCA-3’EcoRIPvt45’-TATGGATCCTTATCACAGGGCAATGAT-3’BamHI Stop codonsPgt15’-AAACATATGCAGCACTGGTCCTATGGTCTGCGCCCTGGCGAATTCCCGCCACCG-3’NdeI EcoRIPgt25’-AAACATATGCAGCACTGGTCCCATGGTTGGTGTCCGGGCGAATTCCCGCCACCG-3’NdeI EcoRI2.突變型TNFαcDNA(TNFαm)的獲得利用PCR引物pvt3和pvt4對本實驗室構(gòu)建的重組質(zhì)粒pLT9KGITNFαm(圖1)中的TNFαcDNA進行特異擴增，獲突變型TNFα的cDNA(TNFαm)。其結(jié)果是在TNFαcDNA的5’端引入1個EcoRI位點(GAA TTC)和幾個額外氨基酸的密碼子GAA TTCCCG CCA CCG GCCGTACCG GGT CCAAGA TCA(其中帶下劃線的黑體字)。這段編碼序列對應的氨基酸序列為Glu Phe Pro ProPro AlaValArg Gly ProArg Ser。同時，還在其3’端引入2個終止密碼子(UAA UGA)和1個BamHI位點(GGA TCC)。為確證所獲DNA片段即為預期的TNFαm，將其進行EcoRI/BamHI雙酶切，并與經(jīng)同樣處理的測序載體pBluescript II SK(圖2)相連，獲測序重組體pYYSKTNFαm(圖3)。其酶切鑒定結(jié)果和序列分析結(jié)果均完全符合預期。
3.融合基因GnRH-TNFαm的獲得為獲得預期可與GnRH受體陽性的腫瘤細胞特異結(jié)合的靶向融合蛋白GnRH-TNFαmm，利用PCR引物“pgt1/pvt4”對模板pYYSKTNFαm中的TNFαm進行特異擴增。其結(jié)果是在TNFαm cDNA的5’端引入1個NdeI位點(CAT ATG)和GnRH的編碼區(qū)(CAGCACTGGTCCTATGGTCTGCG CCCTGGC)。TNFm cDNA的其它部分無變化，3’端仍為2個終止密碼子(UAA UGA)和1個BamHI位點(GGA TCC)。為確證所獲DNA片段即為預期的融合基因GnRH-TNFαm，將其進行BamHI單酶切(將其5’端當成平端)，并與經(jīng)XbaI(補平)/BamHI雙酶切的測序載體pBluescript II SK相連(XbaI恢復)，獲測序重組體pLTSKGTI(圖4)，其酶切圖譜鑒定結(jié)果和序列分析結(jié)果均符合預期。
實施例2.融合基因GnRH-TNFαm溫控型表達型重組體pLTEGTI的構(gòu)建為了能在E.coli中將融合基因GnRH-TNFαm表達成融合蛋白GnRH-TNFαm，將其克隆進本實驗室構(gòu)建的E.coli表達載體pCW111的NdeI/BamHI之間，從而將其表達置于溫控啟動子PRPL的控制之下。其構(gòu)建過程是對pLTSKGTI進行NdeI/BamHI雙酶切，回收融合基因GnRH-TNFαm片段，然后與經(jīng)同樣處理的表達載體pCW111相連，從而獲融合基因GnRH-TNFαm的溫控型表達型重組體pLTEGTI(圖5)。其酶切圖譜鑒定結(jié)果與預期相符。
實施例3.融合基因GnRH-TNFαm的IPTG誘導型表達載體pLT30GTI的構(gòu)建pLT30GTI的構(gòu)建過程是對pLTSKGTI進行NdeI/BamHI雙酶切，回收融合基因GnRH-TNFαm片段，然后與經(jīng)同樣處理的表達載體pET30相連，從而獲融合基因GnRH-TNFαm的IPTG誘導型表達型重組體pLT30GTI(圖6)。其酶切圖譜鑒定結(jié)果與預期相符。
實施例4.重組靶向融合蛋白GnRH-TNFαm的誘導表達1.重組靶向融合蛋白GnRH-TNFαm的溫控誘導表達在獲得了融合基因GnRH-TNFαm的溫控型表達型重組體pLTEGTI后，分別對其多個工程菌株pLTEGTI/DH5α進行了30～32℃活化擴增和42℃誘導表達。圖7是融合蛋白GnRH-TNFαm表達水平最高菌株的表達產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳結(jié)果。本膠經(jīng)激光掃描分析和積分計算，兩種融合蛋白的表達量與菌體總蛋白之比達12％以上。
2.重組靶向融合蛋白GnRH-TNFαm的IPTG誘導表達為提高目的蛋白的表達水平，又對工程菌pLT30GTI/BL21(DE3)進行了IPTG(IPTG的終濃度為1mM)誘導表達。圖8是融合蛋白GnRH-TNFαm表達水平最高菌株的表達產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳結(jié)果。本膠經(jīng)激光掃描分析和積分計算，兩種工程菌中表達水平最高者的融合蛋白均達到了菌體總蛋白的30％。
實施例5.重組靶向融合蛋白GnRH-TNFαm的搖瓶法表達和分離純化1.重組靶向蛋白GnRH-TNFαm的搖瓶法表達為獲得一定量的融合蛋白供活性研究用，對表達水平最高的工程菌pLT30GTI/BL21/DE3進行了搖瓶法培養(yǎng)和IPTG誘導表達。
(1)工程菌的活化挑單菌落接種于5ml LB培養(yǎng)液中(卡那霉素終濃度為50mg/L)，37℃200rpm培養(yǎng)8～12h。
(2)工程菌的擴增將活化的菌液轉(zhuǎn)接入20ml LB中，37℃200rpm培養(yǎng)8～12h。
(3)IPTG誘導將20ml菌液移入含卡那霉素的1000ml LB中，37℃200rpm 4h。加40％的葡萄糖水溶液25ml和IPTG(終濃度為1mM)，37℃200rpm誘導表達5h。然后離心收集菌體，。
2.切膠法分離純化重組靶向蛋白GnRH-TNFαm(1)收集和洗滌菌體8000rpm 5分鐘收集細菌，稱菌體濕重。用含40ml 3％Triton X-100，50mM Tris-HCl和2mM EDTA的溶液(下列各洗滌緩沖液的用量均為30～50ml緩沖液/g濕菌體)洗滌菌體，攪拌器上攪勻10～30分鐘。8000rpm 5分鐘收集菌體。
(2)破碎菌體用裂解緩沖液(50mM Tris-HCl，pH8.5～9.0，2mM EDTA，100mM NaCl，5％Triton X-100，0.5mg/ml溶菌酶)將細胞懸浮。為保證溶菌酶的作用效果，裂解液的pH值宜高不宜低。用攪拌器室溫下攪拌半小時，使菌體與溶液完全混勻，再將其于37℃200rpm 4h，以使懸浮液因為溶菌酶的作用而粘稠。
(3)超聲處理和收集包涵體每次超聲10秒，間隔15秒，90～100次左右，直至菌液不再粘稠。然后8000rpm 7分鐘收集包涵體。
注超聲在冰水浴中進行，以防止蛋白炭化。超聲波功率不宜過大(一般75～150W即可)，否則也會導致蛋白炭化。超聲處理時的容器以玻璃燒杯為佳。超聲波探頭的以位于液面下3cm和燒杯底部以上2cm左右為好。
(4)洗滌包涵體用洗滌液(5％Triton X-100，50mM Tris-HCl，pH8.0，2mM EDTA，pH8.0)充分懸浮沉淀，充分攪拌后8000rpm 10分鐘收集包涵體。
(5)SDS-PAGE電泳分離和電洗脫將所得包涵體行SDS-PAGE電泳后，將凝膠放入1％KCl溶液中，室溫下染色15分鐘。切下目的蛋白所在部分，將凝膠搗碎，放入透析袋中，同時往透析袋中加5～10ml的Tris-甘氨酸溶液進行電洗脫(電泳緩沖液也為Tris-甘氨酸溶液)。10mA下8～10小時后，反相電壓電泳5分鐘。
(6)透析收集透析袋中的液體并離心，將上清液轉(zhuǎn)入另一透析袋，置蒸餾水中于4℃透析24小時以上。每4小時換蒸餾水一次。
(7)沉淀用PEG-10000對透析袋進行脫水(4℃4～5h)，至袋中液量為4～5ml(越少越好)。將透析袋中的液體倒入離心管中，加入酸性丙酮(樣品∶酸性丙酮＝1∶5)，混勻后于-20℃冷凍12小時。將凍存樣品震蕩后于12000rpm離心15分鐘。吸棄上清，再加10ml酸性丙酮，混勻后同樣條件再離心1次。吸棄上清，將沉淀所在的離心管置-20℃冷凍室凍干。
(8)冷凍干燥每支凍干產(chǎn)物中加適量蒸餾水溶解，將蛋白質(zhì)溶液分裝入Eppendorf管中(0.5ml/支)，于-70℃冷凍2小時以上，然后置入冷凍真空干燥器抽吸凍干。將凍干品置于-70℃保存?zhèn)溆谩?br> 2.包涵體洗滌法分離純化重組靶向蛋白GnRH-TNFαm在該方法中，“菌體的收集和洗滌”、“菌體的破碎”和“菌體的初步超聲處理”等同上述“切膠法”，故不贅述。
(1)包涵體的洗滌和再裂解用洗滌液(5％Triton X-100，50mMTris-HCl，pH8.0，2mM EDTA，pH8.0)充分懸浮和洗滌所獲包涵體(于4℃攪拌1～2h后8000rpm 10分鐘)2次后，待充分懸浮后再用超聲波處理50次(10秒/次)，最后8000rpm 10分鐘收集包涵體。
(2)包涵體的溶解和復性用變性緩沖液(6mol/L鹽酸胍，0.1mol/Ltris-HCl，PH8.6，1mmol/L EDTA，0.05mmol/L NaCl，10mmol/LDDT)在冰浴中溶解包涵體(盡量減小溶液的體積)。12000rpm 10分鐘離心包涵體溶液，將1體積上清加入100體積蛋白復性液(50mmol/L Tris-HCl，PH8.0，1mmol/L EDTA，0.25mol/L NaCl，0.25mol/L左旋精氨酸，5mmol/L DDT)中，于4℃輕輕攪拌48小時以使蛋白復性。
(6)透析將復性后的蛋白溶液移入透析袋，置蒸餾水中透析24小時。將透析后的蛋白溶液置-70℃冰箱冷凍，待凍實后行真空冷凍干燥，-70℃?zhèn)溆谩?br> 實施例6.重組靶向融合蛋白GnRH-TNFαm的TNFα樣活性的檢測為了解靶向融合蛋白GnRH-TNFαm是否還具有原型TNFα的相關活性及其活性的相對強度，就Act D致敏的小鼠成纖維(瘤)細胞L929(測定TNFα細胞毒活性的經(jīng)典細胞系)對靶向融合蛋白GnRH-TNFαm與標準品TNFα的反應性進行比較研究。
用不含小牛血清的RPMI 1640基本培養(yǎng)液(含有1mmol/L的氧化型谷胱甘肽和4mmol/L的還原型谷胱甘肽)溶解靶向融合蛋白GnRH-TNFαm，0.22μm的濾器過濾除菌后置4℃?zhèn)溆谩?br> 收集對數(shù)生長期的L929細胞，用含10％小牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)液將其稀釋成1×105cell/ml。按2×104cell/孔的量將L929細胞加入96孔板中，37℃5％CO2條件下培養(yǎng)過夜。
用RPMI1640完全培養(yǎng)液將樣品做適當稀釋將靶向融合蛋白GnRH-TNFαm按0.3∶1∶3∶10∶30∶100的比例分別分成6個劑量組，終濃度分別為0.045μg/ml、0.15μg/ml、0.45μg/ml、1.5μg/ml、4.5μg/ml和15μg/ml。將標準品TNFα按1∶3∶10∶30∶100∶300的比例也分為6個劑量組，最終濃度分別為1IU/ml、3IU/ml、10IU/ml、30IU/ml、100IU/ml和300IU/ml。另設1個共同的“0”劑量組。每個劑量組均設3個平行孔。
向上述含有樣品的培養(yǎng)液中加入Act D，使終濃度為1μg/ml。吸棄細胞培養(yǎng)孔中的舊培養(yǎng)液，按0.2ml/孔的量加入含樣品的新培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24小時。
按終濃度為500μg/ml的劑量加入MTT(每孔加5mg/ml的MTT原液20μl)，37℃5％CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)(染色)4小時。
分別吸棄(盡)孔中的舊培養(yǎng)液，每孔加DMSO 180μl，室溫下緩慢搖動顯色15分鐘，用酶標儀測OD570nm。
根據(jù)公式計算細胞存活率＝試驗組OD值/陰對OD值×100％細胞殺傷率＝(1-細胞存活率)×100％結(jié)果從圖9中可以看出，在所用劑量范圍內(nèi)作用24h后，除最低劑量組外，其它各組的GnRH-TNFαm和標準品TNFα對經(jīng)Act D活化的L929細胞均具有顯著的殺傷作用(P＜0.05或P＜0.01)，二者的殺傷率分別為GnRH-TNFαm——7.3％、30.6％、69.5％、77.5％、78.7％和81.5％，標準品TNFα——18.6％、22.7％、47.8％、64.4％、76.0％和74.2％。說明重組靶向融合蛋白GnRH-TNFαm較好地保留了原型TNFα的活性。
實施例7.重組靶向融合蛋白GnRH-TNFαm與TNFα受體之間的親和力由于小鼠成纖維細胞L929表面具有大量的TNFα受體和對TNFα很敏感，因此該細胞的殺傷試驗常被用于檢測TNFα及其衍生物的生物學活性。我們借助于該試驗，對靶向融合蛋白GnRH-TNFαm和原型TNFα與TNFα受體之間的親和力進行了比較研究(劑量設置與“實施例6.”完全相同)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)(參見圖10)(1)對未經(jīng)Act D活化的L929細胞來說，在所用劑量范圍內(nèi)，TNFα各劑量組的殺傷作用強度均明顯高于對應的GnRH-TNFαm各組，二者的平均殺傷率分別為55.6％和25.8％。假設TNFα的細胞殺傷作用完全取決于與其存在于靶細胞表面的TNFα受體之間的相互作用，那么，GnRH-TNFαm與TNFα受體的親和力只有TNFα與TNFα受體之間的親和力的的46.4％。
(2)對于經(jīng)Act D活化的L929細胞來說，則是GnRH-TNFαm各劑量組的殺傷作用強度明顯高于對應的TNFα各組，二者的平均殺傷率分別為86.6％和77.8％。即GnRH-TNFαm的平均殺傷率是TNFα的111％。
(3)Act D可使GnRH-TNFαm對L929細胞的平均殺傷率提高60.8％(86.6％-25.8％)，而只可使TNFα對L929細胞的平均殺傷率提高22.2％(77.8％-55.6％)。也就是說，GnRH-TNFαm與Act D之間的協(xié)同作用強度是TNFα與Act D之間的2.74倍(60.8％/22.2％)。
以上結(jié)果說明了兩個方面的問題，即與原型TNFα相比，靶向域GnRH的引入，降低了融合蛋白GnRH-TNFαm與TNFα受體之間的親和力；靶向域GnRH的存在，增強了融合蛋白GnRH-TNFαm與化療藥物之間對腫瘤細胞的協(xié)同殺傷作用。
人們知道，導致TNFα毒性嚴重而無法用于臨床的主要原因在于TNFα受體的廣泛分布(組織細胞特異性低)和TNFα與其受體之間的高親和力。而我們引入靶向域GnRH后，既降低了GnRH-TNFαm與TNFα受體之間的親和力，又增強了GnRH-TNFαm與化療藥物之間協(xié)同作用。也就是說，不但靶向融合蛋白GnRH-TNFαm本身的毒副作用減輕了，而且還可以通過與化療藥物聯(lián)合應用的方式來進一步減輕其可能有的毒副作用。
實施例8.重組靶向融合蛋白GnRH-TNFαm對耐受TNFα的腫瘤細胞的殺傷作用雖然重組靶向融合蛋白GnRH-TNFαm較好地保留了原型TNFα的活性，但是，二者在組成方面畢竟不完全相同——在前者中引入了作為靶向域的GnRH。如前所述，我們之所以將GnRH作為TNFα發(fā)揮作用的靶向域，主要是因為(1)TNFα具有很好的開發(fā)應用前景——是已知的抗腫瘤活性最強的細胞因子，但因為其特異性差(由于TNFα受體分布的組織特異性差)、毒副作用大而無法應用。(2)腺癌是很重要的目標疾病——患者群龐大，且極難治療。(3)GnRH受體是腺癌特異藥物攻擊的理想標靶——絕大多數(shù)腺癌細胞表面都有GnRH受體存在，并且GnRH本身對腺癌細胞的增殖就具有抑制作用。其最終目的是為了獲得一種高效、無毒或低毒的腫瘤治療藥物。
為研究本身就對腫瘤細胞的增殖具有一定抑制作用的靶向域GnRH的存在對GnRH-TNFαm的活性究竟有無影響，或有什么影響，以及與原型TNFα相比，GnRH-TNFαm的腫瘤細胞殺傷活性的特點，本發(fā)明人就重組靶向融合蛋白GnRH-TNFαm對已知為原型TNFα抗性的肝癌細胞HepG2、乳腺癌細胞MCF-7、宮頸癌細胞HeLa以及胰腺癌細胞SW1990等的細胞殺傷活性進行了比較研究。
從下面將要述及的結(jié)果中可以看出，在所用劑量范圍內(nèi)(劑量設置與“實施例6.”完全相同)，雖然幾乎所有濃度的標準品TNFα在24h、48h和72h等3個作用時間對上述4種腫瘤細胞均無明顯的殺傷作用，但是，較高濃度的融合蛋白GnRH-TNFαm對這些腫瘤細胞的殺傷作用卻很明顯。
1.融合蛋白GnRH-TNFαm對肝癌細胞HepG2的殺傷作用結(jié)果如圖11所示，在37℃作用24h、48h和72h后，融合蛋白GnRH-TNFαm在15μg/ml時對肝癌細胞HepG2表現(xiàn)出了明顯的殺傷作用，殺傷率分別達56.4％、83.8％和82.2％(3個時間均為P＜0.001)。而標準品TNFα在3個作用時間和所有濃度條件下不但沒有殺傷作用，而且還有一定的促生長作用。
2.融合蛋白GnRH-TNFαm對乳腺癌細胞MCF-7的殺傷作用結(jié)果如圖12所示，在37℃作用24h后，只有15μg/ml的融合蛋白GnRH-TNFαm對乳腺癌細胞MCF-7表現(xiàn)出了強烈殺傷作用，殺傷率為47.7％(P＜0.001)。到48h時，1.5μg/ml、4.5μg/ml和15μg/ml組分別有11.0％(P＜0.05)、18.7％(P＜0.01)和66.1％(P＜0.001)的殺傷率。到72h時，4.5μg/ml和15μg/ml組分別有25.1％(P＜0.01)和64.3％(P＜0.001)的殺傷率。但是，標準品TNFα在3個作用時間和所有濃度條件下對該腫瘤細胞均無殺傷作用。
3.融合蛋白GnRH-TNFαm對宮頸癌細胞HeLa的殺傷作用結(jié)果如圖13所示，融合蛋白GnRH-TNFαm對宮頸癌細胞HeLa的殺傷作用相對較弱，在作用24h和48h后，只有15μg/ml組有19.1％(P＜0.01)和42.0％(P＜0.001)的殺傷率，到72h時，4.5μg/ml和15μg/ml組的殺傷率分別為11.0％(P＜0.01)和69.4％(P＜0.001)。而標準品TNFα只在24h時表現(xiàn)出了輕微的殺傷作用。
4.融合蛋白GnRH-TNFαm對胰腺癌細胞SW1990的殺傷作用結(jié)果如圖14所示，融合蛋白GnRH-TNFαm對胰腺癌細胞SW1990的殺傷作用相對較強，在作用24h后，4.5μg/ml和15μg/ml組分別有15.1％(P＜0.05)和48.6％(P＜0.01)的殺傷率。到48h和72h時，所有劑量組對該腫瘤細胞均表現(xiàn)出了顯著的殺傷作用，這兩個時間的最高殺傷率分別為63.3％(P＜0.001)和71.1％(P＜0.001)。
標準品TNFα對SW1990的作用結(jié)果是個例外，因為在所有的試驗組中，只有最低劑量組(1IU/ml)的標準品在48h和72h時對腫瘤細胞的殺傷率超過了10％，分別為11.8％和12.0％(P＜0.05)。
實施例9.重組靶向融合蛋白GnRH-TNFαm與腫瘤化療藥物之間的協(xié)同作用臨床上常因為抗腫瘤藥物的毒副作用而嚴重影響療效和患者的預后。假如靶向融合蛋白GnRH-TNFαm與常用化療藥物之間具有協(xié)同作用，則可通過減少彼此用量的方法來降低毒副作用。因此，我們在證實了重組靶向融合蛋白GnRH-TNFαm對已知為原型TNFα抗性的肝癌細胞HepG2及其它受試腫瘤細胞均具有明顯的殺傷作用后，又對該融合蛋白和原型TNFα與臨床上常用的化療藥物(如放線菌素D--Act D、順鉑--Cis、胺甲喋呤--MTX和5-氟尿嘧啶--5-FU)之間的協(xié)同作用進行了比較研究。
如果從該試驗能夠得出這樣的結(jié)論，即“與原型TNFα和化療藥物聯(lián)合應用時的結(jié)果相比，融合蛋白GnRH-TNFαm與化療藥物聯(lián)合應用時對腫瘤細胞具有更強的協(xié)同殺傷作用”，那么，在臨床應用過程中，就可以在減少融合蛋白GnRH-TNFαm和化療藥物的使用劑量和進一步降低其毒副作用的情況下，獲得更好的治療效果。
從以下結(jié)果可以看出，與原型TNFα相比，融合蛋白GnRH-TNFαm與所用化療藥物之間的確具有更強的協(xié)同作用效果。
1.融合蛋白GnRH-TNFαm與化療藥物聯(lián)合應用時對肝癌細胞HepG2的協(xié)同殺傷作用(1)融合蛋白GnRH-TNFαm與ActD聯(lián)合應用于HepG2的結(jié)果從圖15中可以看出，聯(lián)合應用24h后，Act D可使腫瘤細胞HepG2對融合蛋白GnRH-TNFαm和標準品TNFα的敏感性均明顯增強(P＜0.05或＜0.01)，亦即與二者聯(lián)合使用時均具有明顯的協(xié)同作用。
另一方面，與兩個劑量較高的標準品TNFα組相比，融合蛋白GnRH-TNFαm與Act D之間的協(xié)同作用更強，殺傷率更高，分別為76.2％vs 65.1％和88.2％vs 66.9％。
(2)融合蛋白GnRH-TNFαm與Cis、MTX或5-FU聯(lián)合應用于HepG2結(jié)果與融合蛋白GnRH-TNFαm單獨使用時的結(jié)果相比，融合蛋白GnRH-TNFαm與Cis、MTX或5-FU的聯(lián)合應用并未使肝癌細胞HepG2的死亡率明顯升高。提示，在所用劑量范圍內(nèi)，所用劑量的融合蛋白GnRH-TNFαm與這些化療藥物之間無明顯協(xié)同作用。
2.融合蛋白GnRH-TNFαm與化療藥物聯(lián)合應用時對乳腺癌細胞MCF-7的協(xié)同殺傷作用(1)融合蛋白GnRH-TNFαm與Act D聯(lián)合應用于MCF-7的結(jié)果從圖16中可以看出，聯(lián)合應用24h后，Act D可使腫瘤細胞MCF-7對融合蛋白GnRH-TNFαm和標準品TNFα的敏感性均明顯增強(P＜0.05或＜0.01)，亦即與二者聯(lián)合使用時均具有明顯的協(xié)同作用。
另一方面，與標準品TNFα相比，在劑量較高時，融合蛋白GnRH-TNFαm與Act D之間的協(xié)同作用更強，殺傷率更高(77.0％vs55.5％)。
(2)融合蛋白GnRH-TNFαm與Cis、MTX或5-FU聯(lián)合應用于MCF-7的結(jié)果從圖17可以看出，雖然融合蛋白GnRH-TNFαm單獨使用時對MCF-7就有明顯的(除最低劑量組外)殺傷作用(細胞死亡率最低7.5％，最高64.9％，平均25.5％)，但是，Cis與GnRH-TNFαm的聯(lián)合應用并未使MCF-7的死亡率(最低17.9％，最高64.9％，平均28.4％)明顯升高。該結(jié)果提示，在所用劑量范圍內(nèi)，彼此間無明顯協(xié)同作用。
GnRH-TNFαm與MTX的合用時，則有部分劑量組細胞的死亡率(最低25.7％，最高67.6％，平均36.9％)明顯升高(P＜0.05或＜0.01)。提示，在所用劑量范圍內(nèi)，彼此間有一定的協(xié)同作用。
GnRH-TNFαm與5-FU聯(lián)合應用時，除最低劑量組(細胞死亡率9.9％)外，其它各試驗組的細胞毒作用均明顯增強(P＜0.05或＜0.01)，細胞死亡率在30.2％～70.0％之間，平均38.5％。提示，在所用劑量范圍內(nèi)，二者間有明顯的協(xié)同作用。
與“GnRH-TNFαm/Cis”組的結(jié)果相比，除兩個低劑量組外，“GnRH-TNFαm/5-FU”組的細胞殺傷效應更增(P＜0.05或＜0.01)。
與“GnRH-TNFαm/MTX”組相比，“GnRH-TNFαm/5-FU”組的兩個較高劑量組的作用也更強(P＜0.05或＜0.01)。
該結(jié)果提示，在所用劑量范圍內(nèi)，在以乳腺癌細胞MCF-7為基礎的細胞毒性試驗中，5-FU與GnRH-TNFαm聯(lián)合應用時的協(xié)同作用最強。
3.融合蛋白GnRH-TNFαm與化療藥物聯(lián)合應用時對宮頸癌細胞HeLa的協(xié)同殺傷作用(1)融合蛋白GnRH-TNFαm與Act D聯(lián)合應用于HeLa的結(jié)果從圖18中可以看出，聯(lián)合應用24h后，Act D可使腫瘤細胞HeLa對融合蛋白GnRH-TNFαm和標準品TNFα的敏感性均明顯增強(P＜0.05或＜0.01)，亦即與二者聯(lián)合使用時均具有明顯的協(xié)同作用。
另一方面，在高劑量時，融合蛋白GnRH-TNFαm與Act D之間的協(xié)同作用更強，殺傷率更高(72.6％vs.41.7％，)。
(2)融合蛋白GnRH-TNFαm與Cis、MTX或5-FU聯(lián)合應用于HeLa結(jié)果從圖19可以看出，在Cis與融合蛋白GnRH-TNFαm聯(lián)合應用時，只有最高劑量組的殺傷率明顯升高(36.7％，P＜0.05)。提示彼此間有一定的協(xié)同作用GnRH-TNFαm與MTX聯(lián)合應用時，各試驗組的細胞毒作用明顯增強(P＜0.05或＜0.01)，殺傷率范圍在8.0％～26.9％之間。提示二者間有協(xié)同作用。
GnRH-TNFαm與5-FU聯(lián)合應用時，各試驗組的細胞毒作用均明顯增強(P＜0.05或＜0.01)殺傷率范圍在19.3％～58.7％之間。提示二者間有明顯的協(xié)同作用。
比較而言，在所用劑量范圍內(nèi)，對HeLa細胞來說，5-FU與GnRH-TNFαm聯(lián)合應用時的協(xié)同作用最強。
4.融合蛋白GnRH-TNFαm與化療藥物聯(lián)合應用時對胰腺癌細胞SW1990的協(xié)同殺傷作用(1)融合蛋白GnRH-TNFαm與Act D聯(lián)合應用于SW1990的結(jié)果從圖20中可以看出，聯(lián)合應用24h后，Act D可使腫瘤細胞SW1990對融合蛋白GnRH-TNFαm和標準品TNFα的敏感性均明顯增強(P＜0.05或＜0.01)，亦即與二者聯(lián)合使用時均具有明顯的協(xié)同作用。
另一方面，在較高劑量時，融合蛋白GnRH-TNFαm與Act D之間的協(xié)同作用相對較強，殺傷率更高(71.3％vs.55.9％)。
(2)融合蛋白GnRH-TNFαm與Cis、MTX或5-FU聯(lián)合應用于SW1990結(jié)果從圖21可以看出，在Cis與融合蛋白GnRH-TNFαm聯(lián)合應用時，各試驗組的細胞殺傷率與GnRH-TNFαm單獨使用時相比無明顯變化。提示彼此間無明顯協(xié)同作用除劑量最高的1個組外，GnRH-TNFαm與MTX聯(lián)合應用時的細胞毒作用明顯增強(P＜0.05)，殺傷率范圍在24.2％～40.3％之間。提示二者間有一定的協(xié)同作用。
GnRH-TNFαm與5-FU聯(lián)合應用時，各試驗組的細胞毒作用均明顯增強(P＜0.05)，殺傷率范圍在18.9％～53.3％之間。提示二者間有很強的協(xié)同作用。
比較而言，在所用劑量范圍內(nèi)，對HeLa細胞來說，5-FU與GnRH-TNFαm聯(lián)合應用于SW1990時的協(xié)同作用最強。
序列表<110>中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所<120>重組靶向融合蛋白GnRH-TNFαm及其抗腫瘤用途<130>I20031302CB<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>531<212>DNA<213>人工序列<400>1atgcagcact ggtcctatgg tctgcgccct ggcgaattcc cgccaccggc cgtacgcggt60ccaagatcat cttctaaaac cccgagtgac aagcctgtag cccatgttgt agcaaaccct120caagctgagg ggcagctcca gtggctgaac cgccgggcca atgccctcct ggccaatggc180gtggagctga gagataacca gctggtggtg ccatcagagg gcctgtacct catctactcc240caggtcctct tcaagggcca aggctgcccc tccacccatg tgctcctcac ccacaccatc300agccgcatcg ccgtctccta ccagaccaag gtcaacctcc tctctgccat caagagcccc360tgccagaggg agaccccaga gggggctgag gccaagccct ggtatgagcc catctatctg420ggaggggtct tccagctgga gaagggtgac cgactcagcg ctgagatcaa tcggcccgac480tatctcgact ttgccgagtc tgggcaggtc tactttggga tcattgccct g 531<210>2<211>177<212>PRT<213>人工序列<400>2Met Gln His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Glu Phe Pro Pro Pro1 5 10 15Ala Val Arg Gly Pro Arg Ser Ser Ser Lys Thr Pro Ser Asp Lys Pro20 25 30Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp35 40 45Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg50 55 60Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser65 70 75 80
Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu85 90 95Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn100 105 110Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly115 120 125Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe130 135 140Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp145 150 155 160Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala165 170 175Leu
權利要求
1.一種重組融合蛋白GnRH-TNFαm，其由人促性腺激素釋放肽(GnRH)和人腫瘤壞死因子α(TNFα)組成，其具有SEQ ID NO2的氨基酸序列。
2.編碼重組靶向融合蛋白GnRH-TNFαm的融合基因GnRH-TNFαm，其具有SEQ ID NO1的DNA序列。
3.包含有權利要求2所述的融合基因的表達型重組體。
4.如權利要求3所述的表達型重組體，其為溫度誘導型表達重組體，所述融合基因GnRH-TNFαm的表達基于溫度誘導來實現(xiàn)。
5.如權利要求4所述的表達型重組體，其為pLTEGTI，圖譜見圖5。
6.如權利要求3所述的表達型重組體，其為IPTG誘導型表達重組體，所述融合基因GnRH-TNFαm的表達基于IPTG誘導來實現(xiàn)。
7.如權利要求6所述的表達型重組體，其為pLT30GTI，圖譜見圖6。
8.由權利要求3-7任一項的表達型重組體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導獲得的工程菌。
9.如權利要求8的工程菌，其為工程菌pLTEGTI/DH5α，其特征在于，它是由權利要求5所述的表達型重組體pLTEGTI轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α所得。
10.如權利要求8的工程菌，其為工程菌pLT30GTI/BL21/DE3，其特征在于，它是由權利要求7所述的表達型重組體pLT30GTI轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21/DE3所得。
11.一種生產(chǎn)重組靶向融合蛋白GnRH-TNFαm的方法，包括在合適表達的條件下培養(yǎng)權利要求8-10任一項的工程菌，并且分離和純化所述融合蛋白。
12.權利要求1的重組靶向融合蛋白GnRH-TNFαm在制備殺傷，肝癌細胞HepG2、乳腺癌細胞MCF-7、宮頸癌細胞HeLa和胰腺癌細胞SW1990等惡性腫瘤細胞的藥物中的應用。
13.權利要求1的重組靶向融合蛋白GnRH-TNFαm在制備治療GnRH受體陽性的惡性腫瘤的藥物中的應用，所述惡性腫瘤選自發(fā)生于結(jié)腸、乳腺、肺、卵巢、子宮內(nèi)膜、前列腺、胰腺、腎和肝中的腺癌。
14.一種藥物組合物，其包含權利要求1的重組靶向融合蛋白GnRH-TNFαm和選自放線菌素D、順鉑、胺甲喋呤或5-氟尿嘧啶的腫瘤化療藥物。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種由人促性腺激素釋放肽(GnRH)和人腫瘤壞死因子α(TNFα)衍生物共同組成的全新的重組靶向融合蛋白GnRH－TNFαm。由于GnRH的存在，該靶向融合蛋白被賦予了新的特征，即既具有原型TNFα的活性，又具有原型TNFα所不具備的活性，即對原型TNFα本身耐受的腫瘤細胞的殺傷作用，還具有更強的與常用化療藥物之間的協(xié)同作用。亦即，與因為毒副作用過大而無法應用于腫瘤治療的原型TNFα相比，本發(fā)明的重組靶向融合蛋白GnRH－TNFαm在腫瘤的治療方面具有很好的應用前景。本發(fā)明還提供了該重組靶向融合蛋白的DNA序列和其表達型重組體等。
文檔編號C12P21/00GK1566156SQ0312394
公開日2005年1月19日 申請日期2003年6月11日 優(yōu)先權日2003年6月11日
發(fā)明者盧圣棟, 李濤 申請人:中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所