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一種腫瘤特異性靶向給藥的藥物載體及其應用的制作方法

文檔序號:1307862閱讀:536來源:國知局
一種腫瘤特異性靶向給藥的藥物載體及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種腫瘤靶向性藥物遞送系統(tǒng),所述系統(tǒng)包括腫瘤靶向性藥物載體和腫瘤治療藥物,其中所述腫瘤靶向性藥物載體包含全重鏈人鐵蛋白。本發(fā)明還公開了所述腫瘤靶向性藥物遞送系統(tǒng)的制備方法,所述方法包括:使聚合的全重鏈人鐵蛋白解聚;向解聚的全重鏈人鐵蛋白加入所述腫瘤治療藥物以使所述解聚的全重鏈人鐵蛋白與所述腫瘤治療藥物結合;并且使結合有所述腫瘤治療藥物的所述解聚的全重鏈人鐵蛋白重新聚合成納米顆粒。
【專利說明】一種腫瘤特異性靶向給藥的藥物載體及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于納米技術、生物仿生、免疫學和生物醫(yī)藥的交叉領域。特別地,本發(fā)明公開了一種腫瘤靶向性藥物遞送系統(tǒng),所述系統(tǒng)包括腫瘤靶向性藥物載體和腫瘤治療藥物,其中所述腫瘤靶向性藥物載體包含全重鏈人鐵蛋白。本發(fā)明還公開了所述腫瘤靶向性藥物遞送系統(tǒng)的制備方法。
【背景技術】
[0002]癌癥已經成為日益常見且嚴重威脅人類生命和生活質量的主要疾病之一。由于老齡化人群持續(xù)增加,預計癌癥的發(fā)病率會繼續(xù)增長。目前治療癌癥的方法主要是手術、放療和化療三種。癌癥的治療方式的選擇,取決于癌癥的類型、位置和散布情況?;熓抢没瘜W藥物殺死腫瘤細胞、抑制腫瘤生長的一種治療方式,它是一種全身性治療手段,對原發(fā)灶、轉移灶和亞臨床轉移灶均有治療作用。對于不能進行手術和放療的癌癥,只能借助于化療。目前臨床上常用的化療抗癌藥物因為缺乏靶向性,存在嚴重的副作用。而這些副作用通常限制了化療藥物的應用并且導致了很多癌癥失去了治療選擇。比如,大部分蒽環(huán)類抗腫瘤藥物分子以及含鉬物質的非特異性毒性造成的嚴重的副作用,大大限制了這些化療藥物的使用。因此發(fā)展一種能夠特異性靶向腫瘤組織,降低化療藥物的毒副作用的藥物載體是目前癌癥的治療領域所亟需解決的一個難題。

【發(fā)明內容】

[0003]理想的腫瘤治療藥物載體應該具有以下特點:特異性的靶向腫瘤細胞或腫瘤組織;能夠裝 載高劑量的治療藥物,并能夠在腫瘤細胞中釋放藥物或將藥物作用于腫瘤細胞;在生理條件下穩(wěn)定,擁有良好的體內分布和代謝特征及優(yōu)秀的生物相容性。但是,把這些所有的特征都整合到一種納米材料上是非常具有挑戰(zhàn)性的。我們實驗室的前期工作表明,人H-鐵蛋白不用經過任何特異性配體的修飾或者標記,即可通過結合其受體轉鐵蛋白受體I (Transferrin Receptorl, TfRl)特異性革巴向肺癌、乳腺癌、前列腺癌、宮頸癌、結直腸癌、卵巢癌、食管癌、胃癌、胸腺癌等常見的人體實體瘤腫瘤組織,和T淋巴細胞白血病、紅細胞白血病等血液惡性癌變的細胞(Fan等,Nature Nanotech.2012 ;中國專利申請201110122433.0)。并且,H-鐵蛋白的外徑為12nm,粒徑均一,有很強的在腫瘤部位的滲透和滯留的效果(Dreher, M.R.等,JNatl Cancer I,2006),因此,主動靶向和被動靶向兼具,使得人H-鐵蛋白在體內對腫瘤的靶向性更佳。H-鐵蛋白納米顆粒具有直徑為Snm的空腔,可以通過使蛋白殼解聚-聚合來向其蛋白空腔內部裝載小分子藥物。研究人員發(fā)現(xiàn),H-鐵蛋白納米顆粒在與腫瘤細胞上的受體TfRl結合后被轉運入胞內體,最終進入溶酶體中。這使得利用H-鐵蛋白作為藥物載體時,能夠將藥物運輸到細胞內部,從而發(fā)揮對腫瘤細胞的殺傷作用。更重要的是,人H-鐵蛋白是天然存在于人體內的一種儲鐵蛋白質,因此其天然的生物相容性和低免疫反應性是其他合成類的材料所不能及的。除此之外,人H-鐵蛋白可以很方便的在大腸桿菌里面大批量的表達,而且可以很方便利用其耐高溫的特性(75°C )快速、方便的純化。從人H-鐵蛋白的這些特點來看,其本身作為一種藥物載體即是一種集各種優(yōu)點于一體的理想的生物納米材料。
[0004]本發(fā)明的目的是提供一種腫瘤特異性靶向的新型蛋白類化療藥物納米載體及其應用。
[0005]本發(fā)明所提供的藥物載體,由一種天然的存在于人體中的,能夠特異識別腫瘤組織及細胞,與受體結合后,能夠進入細胞內部溶酶體,將裝載在其內部的抗腫瘤活性藥物釋放的蛋白殼納米顆粒。
[0006]本發(fā)明所述蛋白殼可以是基因重組的或是天然的去鐵蛋白,去鐵蛋白由12個或是24個重鏈亞基和輕鏈亞基以任意比例自組裝而成,其中天然去鐵蛋白可以來源于真核生物、原核生物或哺乳動物。
[0007]本發(fā)明所述蛋白殼還可以是熱休克蛋白(Heat Shock Proteins, HSPs)、Dps蛋白IDNA protection during starvation)或是具有納米空腔結構的病毒蛋白殼。
[0008]本發(fā)明所述蛋白殼可以化學偶聯(lián)或基因融合抗體、多肽或核酸適配體等靶向分子或熒光、放射核素等信號分子。
[0009]本發(fā)明所述裝載在蛋白殼內部的抗腫瘤活性藥物可以選自化療藥物、放射性同位素、細胞因子、核酸、抗腫瘤或者抗炎癥藥物。
[0010]本發(fā)明所述的蛋白類靶向性納米藥物載體特別指的是重組的全重鏈人鐵蛋白(H-鐵蛋白)。這種鐵蛋白外殼能夠特異結合腫瘤細胞和腫瘤組織,無需抗體、多肽等靶向分子修飾,而且與其受體TfRl結合后,能夠進入腫瘤細胞之中。
[0011]本發(fā)明所述腫瘤靶向性蛋白類納米藥物載體的藥物裝載方式可以是兩種:抗腫瘤活性小分子藥物與金屬離子結合后,通過蛋白殼上的金屬離子通道進入蛋白殼內部;利用pH或者脲使蛋白殼解聚-聚合的方法,在蛋白殼聚合的過程中,加入抗腫瘤藥物,實現(xiàn)藥物在蛋白殼內的裝載。
[0012]本發(fā)明所述腫瘤靶向性蛋白類納米藥物載體所作用的腫瘤性疾病為人體的惡性腫瘤和癌癥,其中優(yōu)選的是結直腸癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤。尤其是人體實質性腫瘤(例如,肺、卵巢癌,乳腺、腸胃、結腸、胰腺、膀胱、腎、前列腺、腦等)以及各種造血系統(tǒng)癌(例如,Hodgkin氏疾病、非Hodgkin氏淋巴癌、白血病等)。
[0013]本發(fā)明所述腫瘤靶向性蛋白類納米藥物載體可以通過靜脈、皮下、動脈內給藥或者局部給藥的方式給予患惡性腫瘤的患者。
[0014]本發(fā)明的腫瘤靶向性蛋白類納米藥物載體及抗腫瘤應用具有巨大的社會效益和經濟效益,也具有良好的應用前景。
[0015]更具體地,本發(fā)明提供以下各項:
[0016]1.腫瘤靶向性藥物遞送系統(tǒng),所述系統(tǒng)包括腫瘤靶向性藥物載體和腫瘤治療藥物,其中所述腫瘤靶向性藥物載體包含全重鏈人鐵蛋白。
[0017]2.根據I所述的系統(tǒng),其中全重鏈人鐵蛋白聚合形成具有空腔的納米顆粒,所述腫瘤治療藥物裝載在所述空腔內。
[0018]3.根據2所述的系統(tǒng),其中所述系統(tǒng)是通過以下方式制備的:
[0019]使聚合的全重鏈人鐵蛋白解聚;
[0020]向解聚的全重鏈人鐵蛋白加入所述腫瘤治療藥物以使所述解聚的全重鏈人鐵蛋白與所述腫瘤治療藥物結合;并且
[0021]使結合有所述腫瘤治療藥物的所述解聚的全重鏈人鐵蛋白重新聚合成納米顆粒。
[0022]4.根據3所述的系統(tǒng),其中全重鏈人鐵蛋白在高濃度的脲條件下解聚,并且利用濃度遞降至零的脲梯度使解聚的全重鏈人鐵蛋白重新聚合。
[0023]5.根據1-4中任一項所述的系統(tǒng),其中所述腫瘤治療藥物用于治療人體的惡性腫瘤和癌癥,優(yōu)選地用于治療結直腸癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、胃癌、胰腺癌、膀胱癌、腎癌、前列腺癌、腦癌以及各種造血系統(tǒng)癌如Hodgkin氏疾病、非Hodgkin氏淋巴癌、白血病。
[0024]6.根據5所述的系統(tǒng),其中所述腫瘤治療藥物用于治療結直腸癌。
[0025]7.根據1-4中任一項所述的系統(tǒng),其中所述腫瘤治療藥物選自化療藥物、放射性同位素、細胞因子、核酸、抗腫瘤或抗炎藥物,例如是阿霉素。
[0026]8.根據1-4中任一項所述的系統(tǒng),其中所述系統(tǒng)通過靜脈、皮下、動脈內或局部給藥的方式施用于有此需要的患者。
[0027]9.一種制備腫瘤靶向性藥物遞送系統(tǒng)的方法,所述方法包括:
[0028]使聚 合的全重鏈人鐵蛋白解聚;
[0029]向解聚的全重鏈人鐵蛋白加入腫瘤治療藥物以使所述解聚的全重鏈人鐵蛋白與所述腫瘤治療藥物結合;并且
[0030]使結合有所述腫瘤治療藥物的所述解聚的全重鏈人鐵蛋白重新聚合成納米顆粒。
[0031]10.腫瘤靶向性藥物載體,所述載體包含全重鏈人鐵蛋白。
[0032]11.全重鏈人鐵蛋白用作腫瘤靶向性藥物載體的用途。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0033]圖1為腫瘤靶向性納米藥物載體的制備及表征。圖1a為腫瘤靶向性納米藥物載體H-鐵蛋白(H-Ferritin,HFn)裝載藥物阿霉素(Doxorubicin, Dox)的過程示意圖;圖1b為裝載藥物阿霉素前后,藥物載體的冷凍電鏡表征圖;圖1c為裝載藥物阿霉素前后,藥物載體的動態(tài)光散射表征粒徑分布圖。
[0034]圖2為裝載藥物的靶向性納米載體(HFn-Dox)的穩(wěn)定性研究。圖2a為在生理鹽水及正常小鼠血清條件下,裝載藥物后的納米載體(HFn-Dox)的穩(wěn)定性;圖2b為HFn-Dox在酸性條件下(pH = 5)和中性條件下(pH = 7.4)的藥物釋放。
[0035]圖3為裝載藥物后的靶向性納米載體HFn-Dox納米顆粒在體外、體內通過其受體TfRl實現(xiàn)對腫瘤細胞特異性靶向性的研究。圖3a為熒光標記的HFn蛋白和HFn-Dox與腫瘤細胞的特異性結合;圖3b顯示HFn蛋白與腫瘤細胞的特異性結合可以被HFn蛋白或者HFn-Dox特異性的競爭性抑制。而且抑制曲線基本上沒有區(qū)別;圖3c為抗TfRl的抗體可以特異性的阻斷HFn-Dox與腫瘤細胞的結合;圖3d為放射性標記的HFn-Dox納米顆粒在體內對腫瘤的特異性靶向成像。
[0036]圖4為激光共聚焦研究HFn-Dox進入細胞內部的過程。其中蛋白殼用Cy5.5標記;溶酶體的marker分子LAMP-1用Alexa-488標記;Dox則是觀察其本身的熒光信號。
[0037]圖5為HFn-Dox納米顆粒在體內的藥代動力學、組織分布及體內清除的研究。圖5a為HFn-Dox納米顆粒與Free Dox的藥物半衰期研究;圖5b和c為HFn-Dox納米顆粒與Free Dox藥物分別在腫瘤組織和心臟組織中積累量的研究;圖5d為HFn-Dox納米顆粒與Free Dox在體內清除的研究。
[0038]圖6為裝載阿霉素的HFn-Dox納米顆粒對裸鼠結直腸癌的治療效果。圖6a為對腫瘤生長的抑制曲線;圖6b為對荷瘤小鼠的生存時間的統(tǒng)計結果;圖6c為給藥后,荷瘤小鼠的體重變化。
【具體實施方式】
[0039]下面用實施例來具體說明本發(fā)明的內容,這些實施例不應理解為任何意義上的對本發(fā)明的限制。本發(fā)明人經過廣泛而深入的研究,在本實驗室前期的工作(Fan等,NatureNanotech.2012)和中國發(fā)明專利申請201110122433.0的基礎上,將利用基因工程的方法重組表達的人H-鐵蛋白用于癌癥的診斷和治療。在此基礎上,完成了本項發(fā)明。
[0040]實施例1、腫瘤靶向性納米藥物載體HFn-Dox的制備及表征
[0041]作為一種藥物載體,首先要解決的是藥物的裝載問題。如上文所述,目前常用的方式是PH值控制下的蛋白殼解聚-聚合來向蛋白空腔內裝載藥物。而實際上,因為H-鐵蛋白的穩(wěn)定性,使得其在PH = 2的條件下才會解聚。在如此強烈的酸性條件下處理鐵蛋白蛋白殼,會使得鐵蛋白亞基在PH值恢復到中性條件下時,不能完全的重新組裝為原來的蛋白殼,而是會造成一些“缺口”(Kim, M.等,Biomacromolecules, 2011)。這會造成裝載藥物后,鐵蛋白納米顆粒不穩(wěn)定,包藥得率下降。而且蛋白殼的不完整性會影響其對腫瘤的靶向性。另一種向鐵蛋白內部裝載藥物的方法是,利用金屬離子作為藥物添加輔料,化療藥物與金屬離子結合后,利用鐵蛋白蛋白殼上的親水性通道進入蛋白殼內部。使用這種方法雖然會將藥物裝載在蛋白殼內部,但同時會引入金屬離子,大部分為重金屬元素。利用這種方法裝載藥物后,在進行腫瘤治療時,會加重代謝器官的負擔,造成重金屬中毒。為了解決裝載藥物的問題,本發(fā)明利用相對溫和的脲變性復性的方法,成功制備出載藥量高的H-鐵蛋白-阿霉素納米顆粒(HFn-Dox)。人H-鐵蛋白殼在高濃度脲(例如,大于6M)的條件下,蛋白殼實現(xiàn)解聚,同時向溶液中加入阿霉素(Dox)。然后用梯度脲透析的方法實現(xiàn)人H-鐵蛋白對 Dox 的裝載。因為 Dox 的 pKa 值為 8.2 (Yang, S.C.等,J Appl Polym Sci, 2000),因此,在將H-鐵蛋白殼解聚-聚合的過程中,依靠Dox分子與H-鐵蛋白殼內部表面的靜電吸附作用(Harrison, P.M.Mrosio, P.Biochim Biophys Acta, 1996),即可將 Dox 分子包裹在 H-鐵蛋白殼內部。通過冷凍電鏡,動態(tài)光散射等方法鑒定,裝載Dox前后,人H-鐵蛋白納米顆粒的結構沒有任何變化。具體實施例如下:
[0042] 首先,以高表達H-鐵蛋白的Hela細胞系的cDNA為模板,設計人H-鐵蛋白的全長引物,將人 H-鐵蛋白的 cDNA(ATGACGACCGCGTCCACCTCGCAGGTGCGCCAGAACTACCACCAGGACTCAGAGGCCGCCATCAACCGCCAGATCAACCTGGAGCTCTACGCCTCCTACGTTTACCTGTCCATGTCTTACTACTTTGACCGCGATGATGTGGCCTTGAAGAACTTTGCCAAATACTTTCTTCACCAATCTCATGAGGAGAGGGAACATGCTGAGAAACTGATGAAGCTGCAGAACCAACGAGGTGGCCGAATCTTCCTTCAGGATATCAAGAAACCAGACTGTGATGACTGGGAGAGCGGGCTGAATGCGATGGAGTGTGCATTACATTTGGAAAAAAATGTGAATCAGTCACTACTGGAACTGCACAAACTGGCCACTGACAAAAATGACCCCCATTTGTGTGACTTCATTGAGACACATTACC TGAATGAGCAGGTGAAAGCCATCAAAGAATTGGGTGACCACGTGACCAACTTGCGCAAGATGGGAGCGCCCGAATCCGGCTTGGCGGAATATCTCTTTGACAAGCACACCCTGGGAGACAGTGATAATGAAAGCTAG, 552bp)構建到表達載體 pET30a (Novagen)上;然后利用原核表達系統(tǒng),將HFn-pET30a轉化入表達菌株BL21 (DE3) (Novagen),利用IPTG誘導表達,之后對人HFn蛋白進行純化(關于人H-鐵蛋白的分子構建、表達和純化請參見 Fan 等,Nature Nanotech.2012 和中國發(fā)明專利申請 201110122433.0)。
[0043]然后,將人HFn蛋白加入到8mol/L的脲中至終濃度為lmg/mL。室溫反應30min,使HFn蛋白殼徹底解聚。然后加入阿霉素試劑,至終濃度為lmg/mL。避光反應10分鐘后,將反應液轉移到透析袋(截留分子量為3kDa)中,然后在避光,4度條件下,對反應液進行梯度脲(7-5-3-2-lmol/L,每個梯度4小時)透析復性。最后透析到生理鹽水中。反應完畢后,將得到的HFn-Dox納米顆粒經過Superdex20010/300GL分子篩純化,得到單分散的單體納米顆粒進行進一步分析。圖1a為利用脲的方法向靶向性藥物載體HFn蛋白中裝載藥物阿霉素的示意圖。
[0044]為對裝載藥物的HFn納米顆粒進行冷凍電鏡表征,相同濃度的HFn蛋白和HFn-Dox(20 μ L, 0.25mg/mL)樣品用 FEI Vitrobot Mark VI (FEI, Oregon)包埋后,用裝備有 Gatan UltraScan4000 (model895) 16-兆像素的 CCD 鏡頭的冷凍電鏡 FEI300_kV TitanKrios (FEI, Oregon)對樣品進行表征。HFn蛋白和HFn-Dox納米顆粒均在放大96,000倍的條件下成像,每個視野的電子束約為20 e'/Ao圖1b為裝載藥物前后的HFn蛋白的冷凍電鏡表征圖。結果發(fā)現(xiàn),HFn-Dox的構象與裝載藥物前的HFn蛋白基本上沒有任何區(qū)別。
[0045]對裝 載藥物前后的HFn蛋白的動態(tài)光散射表征是在帶溫控的DynaProTitan(ffyatt Technology)完成的。等量的HFn蛋白和HFn-Dox在25°C條件下完成測定。圖1c為動態(tài)光散射的方法對裝載藥物前后的HFn蛋白進行表征。發(fā)現(xiàn)裝載藥物后,HFn-Dox的分散性好,粒徑均一。與HFn蛋白基本上沒有區(qū)別。
[0046]實施例2、裝載藥物的納米藥物載體HFn-Dox體外釋放及穩(wěn)定性研究
[0047](I)為研究裝載藥物后的靶向性藥物載體HFn-Dox的穩(wěn)定性,我們將HFn-Dox納米顆粒(500ymol/L,以Dox量計,500 μ L)放入透析管D-tube (截留分子量6~8kDa,Novagen)中,然后放入生理鹽水或者正常小鼠血清中37°C進行孵育。分別在孵育時間0、1、
2、4、8、12、24、36、48、60小時取樣,利用即^:方法進行阿霉素的量的測定。測定結果以解離百分率表示。藥品保留百分率=100% -解離百分率。
[0048]結果如圖2a所示,穩(wěn)定性試驗結果表明,HFn-Dox藥物載體系統(tǒng)在37°C條件下,小鼠血清中非常穩(wěn)定。60小時后解離了不足10%。這表明HFn-Dox在通過尾靜脈給小鼠之后,可以穩(wěn)定的存在于小鼠血清之中。
[0049](2)為研究HFn-Dox的藥物釋放行為,我們用ρΗ7.4的PBS模擬生理條件,用ρΗ5.0的醋酸緩沖液模擬細胞內溶酶體環(huán)境,將HFn-Dox納米顆粒(500μπιΟ1/1,以Dox量計,500 μ L)放入透析管D-tube (截留分子量6~8kDa, Novagen)中,在37°C條件下分別孵育在PBS和醋酸緩沖液中,分別在孵育時間0、1、2、4、8、12、24、36、48、60小時取樣,利用HPLC
方法進行阿霉素的量的測定。測定結果以藥品解離百分率表示。
[0050]結果如圖2b所示,pH5.0的條件下孵育60小時后,所有裝載在HFn蛋白殼中的阿霉素都釋放出來。而生理條件下,基本上沒有釋放。因此,裝載藥物的載體HFn-Dox的藥物釋放形式是依賴于PH值條件的。
[0051]實施例3、裝載化療藥物的納米藥物載體HFn-Dox對腫瘤細胞的體外和體內的靶向性研究
[0052]為了研究裝載化療藥物阿霉素前后,藥物載體HFn蛋白殼在體外和體內對腫瘤細胞的靶向性是否受到影響,選取常見的人結直腸癌細胞HT-29(ATCC:HTB-38)進行研究。在體外,HT-29腫瘤細胞與熒光分子標記的仿生鐵蛋白進行孵育,應用細胞流式及激光共聚焦的方法檢測仿生鐵蛋白與腫瘤細胞的結合情況。在體內,使用放射性125I標記的HFn-Dox納米顆粒,對荷瘤小鼠進行尾靜脈注射給藥。進一步研究放射性標記的HFn-Dox在體內對HT-29移植瘤的靶向性是否收到影響。
[0053]實驗方法如下:按照說明書提供的標記方法,將NHS活化的Cy5.5 (Cy5.5-NHS,購自GE Healthcare)標記到空HFn蛋白殼和裝載藥物后的HFn-Dox蛋白殼上。培養(yǎng)HT-29細胞至I X IO5左右,胰酶消化,0.3%的BSA/PBS洗細胞三次,加入50 μ g/ml的Cy5.5標記的HFn蛋白顆粒及HFn-Dox納米蛋白顆粒,4°C孵育45分鐘。然后再用0.3%的BSA/PBS洗細胞三次,最后重懸于PBS中,流式檢測樣品熒光。結果如圖3a所示,裝載阿霉素后的HFn-Dox對腫瘤細胞HT-29的結合與裝載藥物前的HFn蛋白殼沒有區(qū)別。即,經過脲變性復性對HFn裝載阿霉素的操作沒有影響HFn蛋白殼對腫瘤細胞的結合。
[0054]為定量的研究HFn-Dox與HFn蛋白與腫瘤細胞的結合能力,選擇合適濃度的FITC標記的HFn,作競爭結合抑制實驗。同樣當細胞至I X IO5左右,胰酶消化,緩沖液清洗后,同時加入一定濃度的FITC標記HFn和過量的未標記HFn以及未標記的裝載阿霉素藥物的HFn-Dox,4°C孵育45分鐘,洗細胞三次,最后重懸于PBS中,流式檢測樣品熒光。結果如圖3b所示,標記HFn和細胞的結合,大部分能夠被過量的未標記HFn蛋白和HFn-Dox給競爭下來,而且競爭性抑制曲線是幾乎一樣的。進一步說明HFn-Dox與癌細胞的結合是特異的,而且HFn蛋白與HFn-Dox對腫瘤細胞的結合能力沒有區(qū)別。
[0055]文獻(Li等,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA.2010)報道人H鐵蛋白的受體是TfRl0為證實TfRl介導HFn-Dox與癌細胞的相互作用,我們用過量的抗TfRl的抗體與FITC標記的HFn-Dox競爭細胞表面受體。具體實驗方法如下:腫瘤細胞HT-29爬片(BDBiosciences),置于六孔板中培養(yǎng)至密度為60%左右時,開始實驗。共同加入過量的鼠抗人TfRl的抗體CD71 (購自BDPharmingen)和FITC標記的HFn-Dox或者單獨加入FITC標記的HFn-Dox,37°C孵育45分鐘,用0.3%的BSA/PBS洗細胞三次,最后用4%多聚甲醛固定,PBS洗三次后,DAPI (Roche Applied Science)室溫染核10分鐘。PBS再次洗三次后,防熒光淬滅封片劑封片。激光共聚焦(Olympus FluoView FV-1000, Tokyo, Japan)觀察。結果見圖3c,F(xiàn)ITC標記的HFn-Dox與腫瘤細胞HT-29的大部分結合可以被抗TfRl的抗體特異性的競爭下來,說明TfRl介導HFn-Dox與癌細胞的相互作用。
[0056]為研究體內HFn-Dox對移植瘤HT-29的革巴向性,首先用1do-gen法125I標記HFn。標記溶液經ro-ΙΟ柱純化后測定放射化學純度。1251-HFn標記率為~78.1 %,純化后放射化學純度>98.0%。然后對HT-29荷瘤小鼠經尾靜脈注射100 μ L(400 μ Ci,約含18.5 μ g蛋白)1251-HFn-Dox生理鹽水稀釋液,分別于注射后1、2、4和24h用單光子發(fā)射計算機斷層顯像儀器(SPECT)進行平面Y顯像。結果如圖3d所示,放射性125I標記的HFn-Dox納米顆粒迅速的聚集在腫瘤部位,注射后Ih腫瘤就能清晰被顯像。而其他器官的非特異性聚集則在24小時內迅速的通過體內代謝清除掉。這表明HFn-Dox納米顆粒,在小鼠體內不僅能夠非常特異性的靶向腫瘤組織,而且在其他器官中的非特異性結合會很快通過代謝排出體外。也就是說,我們新發(fā)展的這種H-鐵蛋白納米藥物載體能夠將裝載的藥物在體內特異性的輸送到腫瘤部位;同時,在健康的器官中能夠內有效的得到清除,從而避免了對健康器官的毒性副作用
[0057]實施例4、納米藥物載體HFn-Dox殺傷腫瘤細胞的機理研究
[0058]化療藥物阿霉素分子殺傷腫瘤的原理是阿霉素分子進入細胞核后,嵌在DNA雙螺旋中,抑制DNA的復制和轉錄,從而誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡。即,阿霉素要發(fā)揮殺傷腫瘤的效果,前提是要能夠進入腫瘤細胞的細胞核。為研究,HFn-Dox進入細胞的過程和進入細胞后,能否將裝載在其內部的阿霉素釋放出來,進入細胞核,我們利用熒光標記的HFn-Dox和激光共聚焦的手段,進行觀察。
[0059]具體實施例如下:首先對HFn-Dox納米顆粒進行Cy5.5修飾。HT-29細胞爬片培養(yǎng)12小時后,分別用I μ M Cy5.5-HFn-Dox于培養(yǎng)箱中孵育I分鐘,24小時,48小時和72小時。PBS洗三次后用4%多聚甲醛固定5分鐘。然后用0.1 % Triton X-100對細胞進行通透處理。PBS再次洗后,細胞用5%羊血清室溫封閉30分鐘。然后在37°C孵育Alexa-488標記的溶酶體標志分子Lampl抗體(1:200,clone H4A3 ;Invitrogen) 一個小時。最后用DAPI (I μ g/mL, Roche Applied Science)室溫染核10分鐘。最后,用激光共聚焦顯微鏡(Olympus FluoView FV-1000, Tokyo, Japan)觀察。結果如圖 4 KTJ^HFn-Dox 納米顆粒中的蛋白殼用Cy5.5標記,溶酶體的marker分子LAMP-1用Alexa-488標記;Dox則是觀察其本身的熒光信號。通過觀察HFn在細胞內的行為,我們發(fā)現(xiàn),HFn與膜蛋白上的受體結合后,由受體介導內吞,被轉入胞內體,最終進入溶酶體。這個與文獻報道是一致的(Li,L.等,PiocNatl Acad Sci USA, 2010)。HFn-Dox納米顆粒在與腫瘤細胞上的受體TfRl結合后,與HFn相同,都是被轉運入胞內體,最終進入溶酶體中。然后HFn-Dox納米顆粒降解,HFn蛋白外殼降解為氨基酸片段,而釋放出來的Dox,則游離出溶酶體,最終進入細胞核中,發(fā)揮對腫瘤細胞的殺傷作用。
[0060]實施例5、腫瘤靶向性納米藥物載體HFn-Dox的體內藥代動力學研究
[0061]為研究HFn-Dox在體內的藥物代謝動力學,并與游離阿霉素進行比較,我們將等量阿霉素(10mg/kg小鼠體重)的游離阿霉素和HFn-Dox納米顆粒通過尾靜脈注射到雌性BALB/c小鼠中(每組6只)。然后,在給藥后5分鐘、30分鐘、I小時、2小時、4小時、8小時、10小時和24小時,通過靜脈取血的方式取10~15 μ L小鼠的血樣并立即加入含有肝素(1000U/mL)的PBS緩沖液中。接下來,我們利用酸性異丙醇萃取法,對血樣中阿霉素含量的測定。將血樣與酸性異丙醇混勻后,置于-20°C,避光、萃取過夜。然后徹底震蕩萃取液,離心后,取上清置于不透光96孔板(Corning)中。然后在突光讀數儀器(VarioskanFlashSpectral Scanning Multimode Reader, ThermoFisher Scientific),使用激發(fā)波長485nm,發(fā)射波長590nm來測定血樣中阿霉素的特異性熒光讀數。通過與標準阿霉素樣品的熒光值曲線來測量出血樣中阿霉素的含量。結果如圖5a所示,對HFn-Dox納米顆粒在小鼠體內的藥代動力學研究發(fā)現(xiàn),在注射同等劑量的Dox條件下,HFn-Dox納米顆粒注射組中,由人H-鐵蛋白包裹的Dox的血液半衰期是游離阿霉素注射組的12.2倍。血液半衰期濃度-時間的曲線下面積(AUC) ,HFn-Dox組是游離阿霉素組的209倍。這顯著增加的血液半衰期和更高的曲線下面積說明HFn-Dox納米顆粒在系統(tǒng)循環(huán)中,有更長的藥物滯留時間。這也使得藥物可以持續(xù)的在腫瘤部位得到聚集。[0062]實施例6、腫瘤革巴向性納米藥物載體HFn-Dox的體內分布研究
[0063]體外和體內藥代動力學結果表明,HFn-Dox能夠在體外有效地殺死腫瘤細胞并具有良好的體內代謝行為。那么HFn-Dox在體內能否特異性的聚集在腫瘤部位?為進一步研究這個問題,我們進行了 HFn-Dox的體內分布研究。
[0064]具體實施例如下:24只荷HT-29移植瘤的BALB/c裸鼠隨機分成兩組(游離阿霉素處理組和HFn-Dox給藥組)。待腫瘤體積(體積=0.5X長X寬X寬)達到300立方毫米時,開始進行試驗。給兩組小鼠注射等量阿霉素的游離阿霉素和HFn-Dox (10mg/kg小鼠體重)。然后在給藥后的I小時、4小時和24小時(每個時間點4只小鼠)處死小鼠,取腫瘤、血樣和主要的組織器官。血樣中的阿霉素含量用酸性異丙醇萃取法測量。對腫瘤和組織中的阿霉素含量的測量,則采用如下處理。首先,對腫瘤或者器官組織進行稱重,然后用勻漿。所以的操作在冰上,并避光的環(huán)境下完成。然后取100 μ L勻漿液進行酸性異丙醇萃取處理。阿霉素濃度測定的方法與體內藥代動力學部分一樣。結果如圖5b,5c所示,在對HT-29移植瘤小鼠注射等劑量的Dox前提下,HFn-Dox納米顆粒給藥組與游離的Dox給藥組在小鼠體內器官和腫瘤組織內的Dox累積量的差異非常大。HFn-Dox給藥組給藥后,在腫瘤中Dox的含量是游離Dox給藥組的十倍以上。在以H-鐵蛋白為藥物載體裝載阿霉素后,在腫瘤部位明顯的增多的Dox的含量,是HFn-Dox納米顆粒長的血液半衰期,主動的腫瘤靶向和受體介導的內吞綜合因素的影響的結果。同等重要的是,H-鐵蛋白殼裝載阿霉素后,HFn-Dox納米顆粒顯著的降低了 Dox在健康器官中的積累量。特別的是,將Dox封裝在H-鐵蛋白內部,大大降低了 Dox在心臟器官中的濃度,相比游離的Dox,大約降低了 7.8倍,從而降低了 Dox藥物對心臟的嚴重毒性?;熕幬顳ox在腫瘤部位的富集和在健康器官中分布的減少充分表明H-鐵蛋白是一個非常有效的Dox藥物載體。
[0065]從圖3d可以看出,沒有靶向到腫瘤部分的納米顆粒很快的從體內清除。為研究清楚HFn-Dox通過何種途徑排出體外,進行了藥物在小鼠體內的消除實驗。具體實施例如下:10只健康的BALB/c小鼠隨機的分為兩組。所有小鼠均在代謝籠中飼養(yǎng)。給兩組小鼠尾靜脈注射相同劑量的游離阿霉素和HFn-Dox (10mg/kg小鼠體重)。在飼養(yǎng)過程中,收集小鼠的尿液和糞便。培養(yǎng)24小時后,處死小鼠,取小鼠的主要組織器官。用酸性異丙醇萃取法測所有排泄物和小鼠主要組織器官中阿霉素的含量。結果如圖5d所示,HFn-Dox納米顆粒在健康小鼠中的代謝的進一步的研究發(fā)現(xiàn),大部分的藥物通過糞便和尿液排出體外,滯留在體內的很少。這也進一步的確認了 HFn-Dox納米顆??梢杂行У谋惑w內的健康器官排出體外,從而避免了對健康器官的毒副作用。
[0066]實施例7、腫瘤靶向性納米藥物載體HFn-Dox抗腫瘤的藥效學研究
[0067] 作為一種腫瘤靶向性納米藥物載體,最直接的檢驗效果就是看對腫瘤的殺傷和抑制作用。具體實施例如下:40只移植HT-29腫瘤的雌性BALB/c裸鼠隨機分為五組。在移植瘤體積到100立方毫米左右的時候,所有的荷瘤小鼠通過尾靜脈注射藥物。其中對照組為PBS、HFn蛋白組。給藥組為游離阿霉素、HFn-Dox組和臨床用的脂質體阿霉素藥物Doxil組。小鼠對游離阿霉素的最大耐受劑量為5mg/kg小鼠體重,因此游離阿霉素組給藥劑量為5mg/kg小鼠體重。HFn-Dox給藥量為20mg/kg小鼠體重。為定量對比研究Doxil的副作用與HFn-Dox的副作用,Doxil注射劑量同為20mg/kg小鼠體重。小鼠的體重和腫瘤的測量為每周三次。在治療過程中,如果小鼠的體重下降超過15%或者腫瘤體積超過1000立方毫米,則將處死。
[0068]實驗結果如圖6所示。在對癌癥病人的治療中,給藥的劑量及給藥次數是很重要的。但是限于化療藥物的毒副作用,往往會使癌癥的治療變?yōu)樯倭慷啻谓o藥。然而少量多次給藥往往不能有效的殺傷腫瘤細胞。因此,如果能增強機體對化療藥物的耐受劑量,即降低化療藥物的毒副作用,也是藥物載體的一個發(fā)展方向。研究人員通過實驗發(fā)現(xiàn),對健康小鼠來說,在單次給藥的前提下,小鼠對HFn-Dox的最大耐受劑量為Dox等量的20mg/kg,而對游離阿霉素的最大耐受劑量為5mg/kg。這表明,H-鐵蛋白作為藥物載體,不僅僅具有靶向性,降低器官的毒副作用,而且可以將小鼠對Dox的耐受劑量提高4倍。
[0069]如圖6a所示,游離阿霉素給藥組、PBS組及H-鐵蛋白殼組的腫瘤增長的非??欤诘?8天的時候,平均腫瘤體積就已經超過1000mm3 了。而HFn-Dox納米顆粒以最大耐受劑量(Dox等量20mg/kg)給藥組治療的小鼠,腫瘤的生長,在觀察期內得到了非常明顯的抑制。臨床化療藥物脂質體阿霉素Doxil在與HFn-Dox同等劑量的條件下,對小鼠的毒副作用非常大。如圖6b,c所示,一次性給Doxil之后,小鼠的體重出現(xiàn)明顯的下降。而且隨著時間增加,體重下降更多。與對照組相比,Doxil隨表現(xiàn)出明顯的抑瘤效果,但是因為其副作用,使得其生存時間仍舊沒有明顯改善。PBS、游離Dox及H-鐵蛋白殼給藥組的荷瘤小鼠,平均存活時間分別為17、18、18天。而Doxil處理組則是23天。以小鼠對游離阿霉素的最大耐受劑量5mg/kg單次給藥治療,幾乎對腫瘤的生長沒有抑制作用。相反的,在40天的實驗窗口內,最大耐受劑量單次給藥的HFn-Dox納米顆粒明顯抑制了腫瘤的生長。因此,以H-鐵蛋白作為化療藥物Dox的藥物載體,僅僅靠單次給藥,就能夠有著非常明顯的抑瘤效果。
[0070]在癌癥的治療過程中,精確的將藥物輸送到病灶部位并降低化療藥物的毒副作用將會提聞癌癥的治療療效。本發(fā)明證實,擁有內徑為8nm空腔的天然人H-鐵蛋白納米顆??梢詫⒏邉┝康幕熕幬顳ox特異性的輸送到腫瘤部位,僅單次給藥,就能夠顯著的抑制腫瘤的生長。這中天然的納米藥物載體表現(xiàn)出了理想的理化性質和高特異性的腫瘤靶向性,能夠在降低化療藥物Dox毒副作用的同時,通過增加在腫瘤部位藥物的積累量來改善抗腫瘤效果。[0071]與已經被廣泛用于臨床治療的納米藥物輸送載體(Jain,K.K.Bmc Med,2010),脂質體類(Doxil)或者聚合物類納米顆粒相比,本發(fā)明所描述的人H-鐵蛋白納米載體擁有以下的幾點優(yōu)勢:⑴主動祀向性:天然的H-鐵蛋白納米顆粒,無需任何配體功能化的修飾,即可通過與高表達在腫瘤細胞表面的受體TfRl特異性的結合,通過受體介導的內吞途徑,將Dox送達腫瘤細胞。與很多臨床上常用的聚合物類或者脂質體藥物輸送載體相比,這種主動靶向腫瘤的特性和受體介導的內吞機制使得藥物特異性的在腫瘤部位滯留和被吸收,從而使得在腫瘤內部具有高濃度的藥物分布,并能夠有效地抑制腫瘤的生長(圖6a)。傳統(tǒng)的納米藥物載體大多是靠被動的EPR(enhanced permeability and retention effect,增強的滯留和滲透)效應來實現(xiàn)將治療性藥物輸送到腫瘤部位。這種被動靶向治療策略往往呈現(xiàn)出有限的治療效果并能夠導致藥物的滲漏和誘導藥物抗性的產生(Barenholz,Y.J ControlReleasej 2012 ;Wang, R.B.et al.,J Nanomater, 2013 ;KieIer-Fergusonj Η.M.etal.Wires Nanomed Nanobij 2013)。(2)良好的藥代動力學特征和安全性:HFn_Dox納米顆粒與游離的阿霉素相比,表現(xiàn)出了更長的血液半衰期和更高的AUC積累,更高的腫瘤藥物積累以及更低的健康器官的藥物分布,并能最終從健康組織中排出體外。這些特征使得HFn-Dox納米顆粒在治療腫瘤時,在降低藥物的毒副作用的同時,可以極大的改善腫瘤的治療效果。更重要的是,H-鐵蛋白是天然存在于人體內的一種蛋白質,不含任何潛在的毒性成分,因而不會激起集體的炎癥或者是免疫反應,并展現(xiàn)出優(yōu)異的生物相容性。(3)極好的的抗腫瘤活性:HFn-Dox納米顆粒僅僅靠單次注射治療,就能夠抑制住腫瘤的生長。這種治療效果要比臨床上常用的聚合物類或者脂質體類藥物載體高效的多。傳統(tǒng)的納米藥物載體往往需要多次劑量的治療才能夠達到抑制腫瘤生長的目的(Tang,N.等,JNatlCancer Inst, 2007 ;Kaminskas, L.Μ.等,Mol Pharmaceut, 2012 ;Hrkach, J.等,Sci TranslMed, 2012) 0 (4)易于大批量生產和純化:天然的H-鐵蛋白納米載體完全是由基因重組,大腸桿菌表達出來的蛋白質,表達量高,易于純化(Fan, K.等,Nat Nanotechnol, 2012)。其主動靶向腫瘤的特性使得無須任何配體的修飾或者理化性質的調整,從而避免了復雜的往往是高成本、低產出、和重復性差等特點的人工修飾過程。除此之外,Dox裝載到H-鐵蛋白納米籠里面可以通過簡單的使鐵蛋白殼解聚-聚合操作來實現(xiàn)。本發(fā)明的HFn-Dox納米顆粒的合成過程很容易實現(xiàn)在臨床層次的應用時需要的標準藥物生產條件。我們相信,正是這些得天獨厚的特性使得本發(fā)明的H-鐵蛋白納米顆粒成為一種理想的腫瘤靶向藥物輸送載體。
[0072]參考文獻
[0073]1.Fan, K.等,Magnetoferritin nanoparticles for targeting and visualizingtumour tissues.Nat Nanotechnol7, 459-464 (2012).[0074]2.Dreher, M.R.等,Tumor vascular permeability,accumulation,andpenetration of macromolecular drug carriers.JNatl Cancer 198,335-344 (2006).[0075]3.Kimj M.等,pH-depende nt structures of ferritin and apoferritin insolution:disassembly and reassembly.Biomacromolecules12, 1629-1640(2011).[0076]4.Yang, S.C.,Ge,Η.X.,Huj Y.,Jiang, X.Q.&Yang,C.Z.Doxorubicin-loadedpoly(butylcyanoacrylate)nanoparticles produced by emulsifier-free emulsionpolymerization.J Appl Polym Sci78,517-526 (2000).[0077]5.Harrison, P.M.Mrosio, P.The ferritins: mo I ecu Iar properties, ironstorage function and cellular regulation.Biochim Biophys Actal275,161-203 (1996).[0078]6.Li, L.等,Binding and uptake of H-ferritin are mediated by humantransferrin receptor-1.Proc Natl Acad Sci U S A107,3505-3510 (2010).[0079]7.Jain, Κ.K.Advances in the field of nanooncology.Bmc Med8 (2010).[0080]8.Barenholzj Y.Doxil (R) -The first FDA-approved nano-drug:Lessons learned.Journal of Controlled Releasel60,117-134(2012).[0081]9.Wang, R.B.,Bi I lone,P.S.&Mullett,W.M.Nanomedicine in Action: An Overviewof Cancer Nanomedicine on the Market and in Clinical Trials.J Nanomater (2013).[0082]10.Kieler-Fergusonj H.M.,F(xiàn)rechetj J.M.J.&Szoka, F.C.Clinical developmentsof chemotherapeutic nanomedicines: polymers and liposomes for delivery ofcamptothecins and platinum(II) drugs.Wires Nanomed Nanobi5,130-138 (2013).[0083]11.Tang, N.等,Improving penetration in tumors with nanoassemblies ofphospholipids and doxorubicin.J Natl Cancer Inst99,1004-1015 (2007).[0084]12.Kaminskasj L.M.等,Doxorubicin-Conjugated PEGylated DendrimersShow Similar Tumoricidal Activity but Lower Systemic Toxicity When Compared toPEGylated Liposome and Solution Formulations in Mouse and Rat Tumor Models.MolPharmaceut9, 422-432(2012).[0085]13.Hrkachj J.等,Preclinical development and clinical translation ofa PSMA—targeted docetaxel nanoparticle with a differentiated pharmacologicalprofile. Sci Transl Med4,128ral39 (2012).
【權利要求】
1.腫瘤靶向性藥物遞送系統(tǒng),所述系統(tǒng)包括腫瘤靶向性藥物載體和腫瘤治療藥物,其中所述腫瘤靶向性藥物載體包含全重鏈人鐵蛋白。
2.根據權利要求1所述的系統(tǒng),其中全重鏈人鐵蛋白聚合形成具有空腔的納米顆粒,所述腫瘤治療藥物裝載在所述空腔內。
3.根據權利要求2所述的系統(tǒng),其中所述系統(tǒng)是通過以下方式制備的: 使聚合的全重鏈人鐵蛋白解聚; 向解聚的全重鏈人鐵蛋白加入所述腫瘤治療藥物以使所述解聚的全重鏈人鐵蛋白與所述腫瘤治療藥物結合;并且 使結合有所述腫瘤治療藥物的所述解聚的全重鏈人鐵蛋白重新聚合成納米顆粒。
4.根據權利要求3所述的系統(tǒng),其中全重鏈人鐵蛋白在高濃度的脲條件下解聚,并且利用濃度遞降至零的脲梯度使解聚的全重鏈人鐵蛋白重新聚合。
5.根據權利要求1-4中任一項所述的系統(tǒng),其中所述腫瘤治療藥物用于治療人體的惡性腫瘤和癌癥,優(yōu)選地用于治療結直腸癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、胃癌、胰腺癌、膀胱癌、腎癌、前列腺癌、腦癌以及各種造血系統(tǒng)癌如Hodgkin氏疾病、非Hodgkin氏淋巴癌、白血病。
6.根據權利要求5所述的系統(tǒng),其中所述腫瘤治療藥物用于治療結直腸癌。
7.根據權利要求 1-4中任一項所述的系統(tǒng),其中所述腫瘤治療藥物選自化療藥物、放射性同位素、細胞因子、核酸、抗腫瘤或抗炎藥物,例如是阿霉素。
8.根據權利要求1-4中任一項所述的系統(tǒng),其中所述系統(tǒng)通過靜脈、皮下、動脈內或局部給藥的方式施用于有此需要的患者。
9.一種制備腫瘤靶向性藥物遞送系統(tǒng)的方法,所述方法包括: 使聚合的全重鏈人鐵蛋白解聚; 向解聚的全重鏈人鐵蛋白加入腫瘤治療藥物以使所述解聚的全重鏈人鐵蛋白與所述腫瘤治療藥物結合;并且 使結合有所述腫瘤治療藥物的所述解聚的全重鏈人鐵蛋白重新聚合成納米顆粒。
10.腫瘤靶向性藥物載體,所述載體包含全重鏈人鐵蛋白。
【文檔編號】A61K9/51GK104013599SQ201410230829
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年5月28日 優(yōu)先權日:2014年5月28日
【發(fā)明者】閻錫蘊, 范克龍, 梁敏敏, 鄭繼燕, 馮靜, 楊東玲 申請人:中國科學院生物物理研究所
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