神經(jīng)修復(fù)材料及其制備方法
【專利摘要】本申請公開了一種神經(jīng)修復(fù)材料及其制備方法，所述神經(jīng)修復(fù)材料包括：能夠促進(jìn)神經(jīng)生長的細(xì)胞因子的組合，以及所述細(xì)胞因子的控釋載體，其中所述載體主要由纖維蛋白原、纖粘連蛋白、肝素、纖維蛋白穩(wěn)定因子、凝血酶和氯化鈣形成，所述能夠促進(jìn)神經(jīng)生長的細(xì)胞因子的組合優(yōu)選選自神經(jīng)生長因子、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子中的至少兩種，所述能夠促進(jìn)神經(jīng)生長的細(xì)胞因子的組合包埋于所述載體中。本發(fā)明的神經(jīng)修復(fù)材料利用控釋載體的“智能釋放”，根據(jù)神經(jīng)修復(fù)的進(jìn)程調(diào)節(jié)釋放細(xì)胞因子的速度，從而循序漸進(jìn)地發(fā)揮細(xì)胞因子的功能；同時(shí)利用細(xì)胞因子的協(xié)同作用，進(jìn)一步促進(jìn)神經(jīng)的修復(fù)。
【專利說明】神經(jīng)修復(fù)材料及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本申請涉及一種神經(jīng)修復(fù)材料，特別涉及一種利用多種能夠促進(jìn)神經(jīng)生長的細(xì)胞因子的協(xié)同作用和緩釋系統(tǒng)的高效神經(jīng)修復(fù)材料。
【背景技術(shù)】
[0002]我國每年因各種創(chuàng)傷或外科手術(shù)(如腫瘤切除)而導(dǎo)致的周圍神經(jīng)損傷的病人超過100萬人。這些病人如得不到及時(shí)有效的修復(fù)治療，將造成相關(guān)部位神經(jīng)功能的永久性喪失。神經(jīng)損傷時(shí)神經(jīng)間隙處增生的瘢痕組織是外周神經(jīng)自我修復(fù)的主要障礙。間隙較大的外周神經(jīng)損傷，需要用自體神經(jīng)移植進(jìn)行修復(fù)；但自體神經(jīng)移植存在諸多缺點(diǎn)，如供區(qū)神經(jīng)障礙、供區(qū)神經(jīng)瘤形成、供區(qū)神經(jīng)有限、供區(qū)神經(jīng)與受區(qū)神經(jīng)難以匹配，等等。因此，尋找和研制促進(jìn)周圍神經(jīng)損傷后再生的橋梁系統(tǒng)是全世界醫(yī)學(xué)界普遍關(guān)注并投入巨資廣泛研究的重大難題。
[0003]目前有關(guān)神經(jīng)再生的理論主要?dú)w納為以下三點(diǎn):①神經(jīng)營養(yǎng)理論，也就是神經(jīng)遠(yuǎn)段雪旺細(xì)胞分泌營養(yǎng)因子誘導(dǎo)軸突再生，這個(gè)理論雖然已經(jīng)被許多實(shí)驗(yàn)所證實(shí)，然而似乎難以解釋有些實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象。例如在神經(jīng)缺損間隙有微小增加的情況下神經(jīng)軸突通過率大幅度下降，因?yàn)榫嚯x微小的增加不會(huì)引起營養(yǎng)因子濃度的急劇下降，因而不足以解釋神經(jīng)軸突通過率的驟降。而且，導(dǎo)管促進(jìn)神經(jīng)再生的能力卻由于加入有方向性基質(zhì)材料而增加(參見②)，這也是神經(jīng)營養(yǎng)理論不能解釋的。②接觸引導(dǎo)理論認(rèn)為，軸突的延伸需要接觸合適的基質(zhì)，有方向性的導(dǎo)管內(nèi)基質(zhì)構(gòu)型可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞和雪旺細(xì)胞增殖、遷移，進(jìn)而引導(dǎo)軸突延伸。③基膜管 理論認(rèn)為，周圍神經(jīng)節(jié)段缺損后成纖維細(xì)胞首先增殖遷移到神經(jīng)缺損間隙，形成纖維纜連接兩神經(jīng)斷端；雪旺細(xì)胞隨后沿著纖維纜形成柱狀基膜管，大約直徑10-20微米。軸突延伸長入基膜管后形成髓鞘。因此，利于雪旺細(xì)胞軸向遷移的導(dǎo)管構(gòu)型有助于引導(dǎo)有髓神經(jīng)纖維生長。
[0004]目前雖然對(duì)各種神經(jīng)生長或營養(yǎng)因子有諸多研究，但是這種神經(jīng)生長或營養(yǎng)因子的實(shí)際應(yīng)用卻始終存在一個(gè)“瓶頸”問題:小分子在體內(nèi)快速降解，使得很多神經(jīng)生長或營養(yǎng)因子還沒來得及發(fā)揮作用就已經(jīng)降解或失活，從而大大降低了其有效性。此外，神經(jīng)修復(fù)機(jī)制復(fù)雜，神經(jīng)損傷后的微環(huán)境對(duì)神經(jīng)修復(fù)的影響多樣，因此雖有多種學(xué)說，目前尚無能夠完整解釋整個(gè)修復(fù)過程的理論，除自體移植之外，也沒有很好的神經(jīng)再生修復(fù)手段，而自體移植顯然存在著供體嚴(yán)重不足的缺陷，其應(yīng)用存在種種限制。由于以上種種原因，對(duì)于神經(jīng)修復(fù)的手段和神經(jīng)修復(fù)材料，仍然存在迫切的需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種能夠有效利用能夠促進(jìn)神經(jīng)生長的細(xì)胞因子的神經(jīng)修復(fù)材料，并且通過利用細(xì)胞因子間的協(xié)同作用，使其促進(jìn)神經(jīng)生長的效果最大化，從而達(dá)到修復(fù)神經(jīng)損傷的目的。
[0006]本發(fā)明提供了一種神經(jīng)修復(fù)材料，包括:能夠促進(jìn)神經(jīng)生長的細(xì)胞因子的組合，以及所述細(xì)胞因子的控釋載體，其中所述載體主要由纖維蛋白原、纖粘連蛋白、肝素、纖維蛋白穩(wěn)定因子、凝血酶和氯化鈣形成，所述能夠促進(jìn)神經(jīng)生長的細(xì)胞因子的組合優(yōu)選選自神經(jīng)生長因子、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子中的至少兩種，所述能夠促進(jìn)神經(jīng)生長的細(xì)胞因子的組合包埋于所述載體中。本發(fā)明的神經(jīng)修復(fù)材料利用控釋載體的“智能釋放”，根據(jù)神經(jīng)修復(fù)的進(jìn)程調(diào)節(jié)釋放細(xì)胞因子的速度，從而循序漸進(jìn)地發(fā)揮細(xì)胞因子的功能；同時(shí)利用細(xì)胞因子的協(xié)同作用，進(jìn)一步促進(jìn)神經(jīng)的修復(fù)。
[0007]神經(jīng)生長因子、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子和血管內(nèi)皮生長因子分別作用于不同神經(jīng)修復(fù)相關(guān)細(xì)胞，例如神經(jīng)生長因子(NGF)主要促進(jìn)感覺神經(jīng)元存活和軸突生長，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)主要支持運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活和軸突生長，堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)增強(qiáng)軸突再生和血管生成，血管內(nèi)皮生長因子促進(jìn)血管內(nèi)皮的生長和新血管的生成。本發(fā)明利用了各細(xì)胞因子分別對(duì)各種神經(jīng)細(xì)胞的生長促進(jìn)或營養(yǎng)作用，從而產(chǎn)生了優(yōu)于單種細(xì)胞修復(fù)之和的協(xié)同作用效果。
[0008]本發(fā)明所用載體系統(tǒng)曾用于骨生長因子的控釋，參見發(fā)明人早期專利CN200810065863.1。眾所周知，骨組織與神經(jīng)組織有著截然不同的組織結(jié)構(gòu)、微環(huán)境和修復(fù)機(jī)制。然而原本用于模擬骨組織修復(fù)早期的臨時(shí)基質(zhì)的載體系統(tǒng)，在本發(fā)明的神經(jīng)修復(fù)中也得到了意料不到的技術(shù)效果，發(fā)明人分析其原理為:緩釋各種神經(jīng)因子，從而延長了神經(jīng)因子發(fā)揮功能的時(shí)間，并促進(jìn)了神經(jīng)修復(fù)的進(jìn)行。
[0009]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，其中所述能夠促進(jìn)神經(jīng)生長的細(xì)胞因子的組合包括神經(jīng)生長因子和堿性成 纖維細(xì)胞生長因子。
[0010]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述載體中纖粘連蛋白與肝素的摩爾比在1:1至10:1范圍內(nèi)。在此范圍內(nèi)，能夠達(dá)到更優(yōu)的保護(hù)細(xì)胞因子的作用。
[0011]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述纖維蛋白原在所述載體中的含量為90wt%以上。此條件下的載體更加穩(wěn)定。
[0012]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述神經(jīng)修復(fù)材料中所述纖維蛋白穩(wěn)定因子與纖維蛋白原的比例關(guān)系為:每Img纖維蛋白原對(duì)應(yīng)0.3IU至1.2IU的纖維蛋白穩(wěn)定因子。
[0013]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述載體和所述能夠促進(jìn)神經(jīng)生長的細(xì)胞因子的組合預(yù)裝于神經(jīng)導(dǎo)管的內(nèi)部，以便于固定其在組織中的位置，增強(qiáng)其修復(fù)作用的導(dǎo)向性、靶向性和針對(duì)性，并進(jìn)一步避免細(xì)胞因子在組織中的流失和浪費(fèi)。所述神經(jīng)導(dǎo)管可以是天然材料或人工材料制成，例如殼聚糖、聚乳酸、PLGA、明膠、膠原等或其組合。所述神經(jīng)導(dǎo)管可以是編織管、多通道管等各種組成結(jié)構(gòu)，優(yōu)選多通道神經(jīng)修復(fù)導(dǎo)管。最優(yōu)選將所述載體和所述能夠促進(jìn)神經(jīng)生長的細(xì)胞因子的組合預(yù)裝于所述神經(jīng)導(dǎo)管的內(nèi)部之后，再進(jìn)一步制備成多通道神經(jīng)修復(fù)導(dǎo)管。也就是說，所述載體和所述能夠促進(jìn)神經(jīng)生長的細(xì)胞因子的組合本身也通過凍干形成了多通道的形式。
[0014]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述多通道神經(jīng)修復(fù)導(dǎo)管由多種天然與人工材料管壁和具有軸向多通道的生物可降解填充基質(zhì)組成。所述生物可降解填充基質(zhì)包括纖維蛋白原、纖粘連蛋白、肝素、纖維蛋白穩(wěn)定因子、凝血酶和氯化鈣，以及上述能夠促進(jìn)神經(jīng)生長的細(xì)胞因子的組合。
[0015]本發(fā)明還提供了一種制備上述神經(jīng)修復(fù)材料的方法，包括如下步驟:[0016](I)將上述能夠促進(jìn)神經(jīng)生長的細(xì)胞因子的組合作為組分I，配制含有纖維蛋白原、纖粘連蛋白、肝素和纖維蛋白穩(wěn)定因子的溶液作為組分II，其中所述能夠促進(jìn)神經(jīng)生長的細(xì)胞因子的組合優(yōu)選選自神經(jīng)生長因子、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子中的至少兩種；
[0017](2)配制含有凝血酶和氯化鈣的溶液作為組分III ；
[0018](3)將組分II加入組分I，以溶解組分I ;和
[0019](4)將組分III加入組分II和I的混合溶液，以形成神經(jīng)修復(fù)因子緩釋系統(tǒng)，
[0020]優(yōu)選 地,進(jìn)一步包括步驟:
[0021](5)將所述神經(jīng)修復(fù)因子緩釋系統(tǒng)注入多通道神經(jīng)修復(fù)導(dǎo)管的通道中。
[0022]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，其中所述步驟(1)中的纖維蛋白原在組分II中的濃度可為4mg/ml至120mg/ml。所述步驟(2)中的凝血酶在組分III中的濃度可為40-800IU/ml，所述氯化鈣在組分III中的濃度可為35-45 μ mol/ml。所述組分II和組分III的pH值優(yōu)選為6.8至8。
[0023]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，在所述步驟(3)中將組分II加入組分I之后，可在33°C至37°C水浴中放置15至30分鐘。所述步驟(4)中將組分III加入到組分II和I的混合溶液之后，放入37°C溫箱孵育0.5至I小時(shí)。
[0024]本發(fā)明的神經(jīng)修復(fù)材料除了利用了細(xì)胞因子之間的協(xié)同作用之外，還利用了仿生學(xué)的載體緩釋系統(tǒng)，即纖維蛋白原和纖粘連蛋白溶液在凝血酶和纖維蛋白穩(wěn)定因子的作用下形成彼此共價(jià)交聯(lián)的凝膠體系；在同一反應(yīng)體系中能夠促進(jìn)神經(jīng)生長的細(xì)胞因子與肝素結(jié)合，而肝素因與纖粘連蛋白具有高親和力而連接到該凝膠體系，從而使得能夠促進(jìn)神經(jīng)生長的細(xì)胞因子能夠牢固地包埋在凝膠基質(zhì)中，形成緩釋系統(tǒng)。fXIII因子作為纖維蛋白穩(wěn)定因子是形成所述凝膠基質(zhì)所必需的，肝素不但把能夠促進(jìn)神經(jīng)生長的細(xì)胞因子組合包埋在凝膠基質(zhì)結(jié)構(gòu)中，還保護(hù)其免受抑制和降解，提升其生物學(xué)活性。
[0025]本發(fā)明的神經(jīng)修復(fù)材料具有如下技術(shù)效果:1、能夠通過主要由細(xì)胞介導(dǎo)的材料降解而產(chǎn)生主動(dòng)緩釋；2、其緩釋特征為微量、高效、平穩(wěn)，無初始爆發(fā)性釋放，僅需較少量能夠促進(jìn)神經(jīng)生長的細(xì)胞因子組合，就可以維持有效長期釋放，從而長期發(fā)揮作用；3、肝素有保護(hù)各種能夠促進(jìn)神經(jīng)生長的細(xì)胞因子的作用，阻止其滅活，有效提高其生物活性；4、能夠根據(jù)修復(fù)的過程“智能”釋放:酸性環(huán)境中，能夠促進(jìn)神經(jīng)生長的細(xì)胞因子組合以較高速率釋放；在中性和堿性環(huán)境下，釋放速度降低，這與損傷阻止修復(fù)過程的PH變化匹配:早期初損傷時(shí)，損傷部位的PH值較低，隨著組織修復(fù)的進(jìn)行，pH值逐漸恢復(fù)到正常的生理值，能夠促進(jìn)神經(jīng)生長的細(xì)胞因子組合的釋放速率會(huì)隨著損傷修復(fù)的進(jìn)行而由快到慢，以適應(yīng)損傷后不同時(shí)期神經(jīng)再生的需要；5、釋放速率可以通過改變緩釋系統(tǒng)載體的構(gòu)成參數(shù)進(jìn)行調(diào)節(jié)，以滿足不同移植位點(diǎn)的需要；6、神經(jīng)損傷初期的修復(fù)很重要，因此越快完成修復(fù)對(duì)于預(yù)后越好，本發(fā)明由于結(jié)合了多通道神經(jīng)修復(fù)導(dǎo)管，可以制備成成品出售，不需臨床應(yīng)用時(shí)現(xiàn)場制備，節(jié)省了時(shí)間，從而改善了修復(fù)效果，增加了良好預(yù)后的幾率。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1為根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式的神經(jīng)修復(fù)材料的成分構(gòu)成示意圖；
[0027]圖2為根據(jù)本發(fā)明示例性實(shí)施方式的三種構(gòu)型外壁的殼聚糖神經(jīng)導(dǎo)管的掃描電鏡照片(A至C)和光學(xué)照片(D至F)，其中A和D為旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法制備的殼聚糖神經(jīng)導(dǎo)管，B和E為冷凍干燥法制備的殼聚糖神經(jīng)導(dǎo)管；C和F為編織法制備的殼聚糖神經(jīng)導(dǎo)管；
[0028]圖3為根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式的一種多通道神經(jīng)導(dǎo)管結(jié)構(gòu)示意圖；
[0029]圖4為用模具制備的不同形狀的生長因子控釋凝膠塊；
[0030]圖5為用殼聚糖材料制備的神經(jīng)導(dǎo)管(A)和其中裝有本發(fā)明所述載體和所述能夠促進(jìn)神經(jīng)生長的細(xì)胞因子的組合的控釋體系的神經(jīng)導(dǎo)管(B)；
[0031]圖6為用ELISA方法檢測生長因子(bFGF，NGF)體內(nèi)釋放曲線。FG:纖維蛋白膠；Fn:纖粘連蛋白；Hep:肝素；bFGF:堿性成纖維細(xì)胞生長因子；NGF:神經(jīng)生長因子； [0032]圖7為用ELISA方法檢測生長因子(bFGF，NGF)體外釋放曲線。FG:纖維蛋白膠；Fn:纖粘連蛋白；Hep:肝素；bFGF:堿性成纖維細(xì)胞生長因子；NGF:神經(jīng)生長因子。
[0033]圖8為術(shù)后8周神經(jīng)吻合口中段神經(jīng)冰凍切片NF200和SlOO免疫熒光觀察(X200)。其中圖a、b、c分別為A組、B組、C組染色結(jié)果，圖d為正常大鼠坐骨神經(jīng)染色；原照片中綠色為NF-200，紅色為S100，因?qū)＠ㄒ髮D片轉(zhuǎn)為灰度之后，淺色為NF-200，深色為SlOO ；
[0034]圖9為術(shù)后8周各組標(biāo)本神經(jīng)吻合口中段新生神經(jīng)纖維髓鞘觀察(甲苯胺藍(lán)染色 X200)；
[0035]圖10為術(shù)后8周各組標(biāo)本神經(jīng)吻合口中段新生神經(jīng)纖維透射電鏡觀察神經(jīng)，其中圖a、b、c分別為A組、B組、C組，圖d為正常神經(jīng)(X 20000)。
【具體實(shí)施方式】
[0036]在本發(fā)明中，發(fā)明人將具有協(xié)同作用機(jī)制的能夠促進(jìn)神經(jīng)生長細(xì)胞因子組合，如神經(jīng)生長因子(NGF，主要促進(jìn)感覺神經(jīng)元存活和軸突生長)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF，主要支持運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活和軸突生長)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF，增強(qiáng)軸突再生和血管生成)和血管內(nèi)皮生長因子利用控釋載體系統(tǒng)制備成控釋體系。載體系統(tǒng)所用控釋基質(zhì)材料主要為纖維蛋白原(FG)、纖粘連蛋白(FN)、硫酸肝素(HS)等，三者在組織修復(fù)起始過程中起著重要作用(參見圖1)。發(fā)明人分析其原理可能在于:纖維蛋白原和纖粘連蛋白之間形成牢固的共價(jià)鍵，不易被組織液的PH所影響；而纖粘連蛋白和肝素之間、以及肝素和因子(bFGF)之間是由氫鍵連接，所以適于在損傷區(qū)隨著pH的變化，而調(diào)解因子的釋放速度，即根據(jù)修復(fù)的過程“智能”釋放:酸性環(huán)境中，能夠促進(jìn)神經(jīng)生長的細(xì)胞因子組合以較高速率釋放；在中性和堿性環(huán)境下，釋放速度降低，這與損傷阻止修復(fù)過程的pH變化匹配:早期初損傷時(shí)，損傷部位的PH值較低，隨著組織修復(fù)的進(jìn)行，pH值逐漸恢復(fù)到正常的生理值，能夠促進(jìn)神經(jīng)生長的細(xì)胞因子組合的釋放速率會(huì)隨著損傷修復(fù)的進(jìn)行而由快到慢，以適應(yīng)損傷后不同時(shí)期神經(jīng)再生的需要。
[0037]在控釋載體中，進(jìn)一步包括凝血酶和纖維蛋白穩(wěn)定因子例如XIII因子(fXIII)。發(fā)明人分析其原理可能在于，組織損傷后凝血酶裂解纖維蛋白原，形成纖維蛋白單體，單體聚合形成凝膠網(wǎng)絡(luò)。同時(shí)還裂解XIII因子，產(chǎn)生活化的XIII因子?；罨腦III因子催化纖維蛋白單體間以及纖維蛋白單體和FN間發(fā)生共價(jià)交聯(lián)。FN廣泛地介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用，在細(xì)胞黏附、遷移、生長和分化中起重要作用。它除了通過整合素結(jié)合到細(xì)胞表面外，還結(jié)合肝素和纖維蛋白。肝素可以結(jié)合和調(diào)節(jié)許多蛋白的活動(dòng)，例如FN、bFGF、BDNF 和 NGF 等。
[0038]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述能夠促進(jìn)神經(jīng)生長的細(xì)胞因子的組合選自神經(jīng)生長因子、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子中的至少兩種，所述能夠促進(jìn)神經(jīng)生長的細(xì)胞因子的組合包埋于所述載體中。神經(jīng)生長因子、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子和血管內(nèi)皮生長因子分別作用于不同神經(jīng)修復(fù)相關(guān)細(xì)胞，例如神經(jīng)生長因子(NGF)主要促進(jìn)感覺神經(jīng)元存活和軸突生長，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)主要支持運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活和軸突生長，堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)增強(qiáng)軸突再生和血管生成，血管內(nèi)皮生長因子促進(jìn)血管內(nèi)皮的生長和新血管的生成。在本發(fā)明中，具有不同功能的細(xì)胞因子協(xié)同作用，起到了優(yōu)于單獨(dú)細(xì)胞因子之和的修復(fù)效果。
[0039]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述能夠促進(jìn)神經(jīng)生長的細(xì)胞因子組合包括神經(jīng)生長因子和堿性成纖維細(xì)胞生長因子。
[0040]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，將此能夠促進(jìn)神經(jīng)生長的細(xì)胞因子組合控釋凝膠體系注入殼聚糖導(dǎo)管內(nèi)，模擬正常神經(jīng)的束膜管和基膜管結(jié)構(gòu)，殼聚糖導(dǎo)管的結(jié)構(gòu)及制備參見圖2，其中A和D為旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法制備的殼聚糖神經(jīng)導(dǎo)管，B和E為冷凍干燥法制備的殼聚糖神經(jīng)導(dǎo)管；(:和F為編織法制備的殼聚糖神經(jīng)導(dǎo)管。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，采用新型模具和熱致相分離技術(shù)，在該含有該控釋凝膠體系的殼聚糖導(dǎo)管內(nèi)部制備出具有智能型生物活性仿生微結(jié)構(gòu)的神經(jīng)組織工程修復(fù)導(dǎo)管，例如具有多通道結(jié)構(gòu)的導(dǎo)管，其結(jié)構(gòu)示意圖參見圖3。導(dǎo)管內(nèi)的生物活性因子“智能”型釋放主要體現(xiàn)在:在酸性環(huán)境中，活性因子以較高的速率釋放；在中性和堿性的環(huán)境下，釋放速度較低。由于損傷組織PH值降低，隨著組織的修復(fù)PH值逐漸恢復(fù)到正常的生理值，活性因子的釋放速率就會(huì)由快到慢，以適應(yīng)損傷后不同時(shí)期神經(jīng)再生的需要。通過對(duì)殼聚糖材料分子量和脫乙酰度的調(diào)節(jié)可得到不同的降解速度和力學(xué)強(qiáng)度，適合不同類型神經(jīng)損傷修復(fù)的需要。用此智能生物活性仿生微結(jié)構(gòu)神經(jīng)修復(fù)導(dǎo)管橋接神經(jīng)缺損斷 端，導(dǎo)管內(nèi)部定向微結(jié)構(gòu)引導(dǎo)雪旺細(xì)胞和軸突延伸，導(dǎo)管外壁阻擋纖維結(jié)締組織侵入，內(nèi)部基質(zhì)中多種生物活性因子“智能”型釋放，為周圍神經(jīng)再生提供理想的微環(huán)境，有望改善較長距離周圍神經(jīng)缺損的修復(fù)效果。
[0041]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，促進(jìn)神經(jīng)生長的細(xì)胞因子緩釋系統(tǒng)可預(yù)裝于各種天然或人工材料神經(jīng)導(dǎo)管內(nèi)部，然后通過模具和冷凍干燥法進(jìn)一步可以制成多通道神經(jīng)修復(fù)導(dǎo)管，其結(jié)構(gòu)示意圖參見圖3。多通道結(jié)構(gòu)對(duì)于神經(jīng)的再生可以起到導(dǎo)向和支撐等作用，進(jìn)一步促進(jìn)了神經(jīng)的修復(fù)。
[0042]根據(jù)需要，上述能夠促進(jìn)神經(jīng)生長的細(xì)胞因子的組合的控釋體系凝膠可以制備成各種所需的形狀，參見圖4。所述需要可以是損傷大小、位置等參數(shù)。
[0043]在本發(fā)明中，對(duì)于上述能夠促進(jìn)神經(jīng)生長的細(xì)胞因子的組合的控釋體系凝膠來說，更加優(yōu)選的方式是裝入導(dǎo)管中。除了在組織中的支撐作用和定型外，裝入導(dǎo)管中還有一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是能夠制備成成品，方便其在臨床中的應(yīng)用，節(jié)省了手術(shù)的時(shí)間。對(duì)于寸秒寸金的神經(jīng)外科手術(shù)來說，節(jié)省時(shí)間就增加了修復(fù)成功的幾率，大大優(yōu)于需要手術(shù)時(shí)現(xiàn)用現(xiàn)配的復(fù)雜材料。參見圖5，其中列出了用殼聚糖材料制備的神經(jīng)修復(fù)導(dǎo)管中裝入本發(fā)明的細(xì)胞因子組合緩釋體系成品的照片。
[0044]用殼聚糖材料制備的神經(jīng)導(dǎo)管外壁降解時(shí)間達(dá)到了國家標(biāo)準(zhǔn)要求的1-1.5年(A)，本發(fā)明的纖維蛋白原、纖粘連蛋白以及硫酸肝素等材料構(gòu)成的控釋體系降解時(shí)間為4-8周(B)，因此殼聚糖導(dǎo)管足以在釋放完成之前保護(hù)凝膠不受周圍組織的壓迫，以避免外力的破壞。
[0045]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明，應(yīng)理解的是，下述實(shí)施例僅為示例性實(shí)施例，不用于限定本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
[0046]實(shí)施例1
[0047]神經(jīng)生長因子/堿性成纖維細(xì)胞生長因子/載體緩釋系統(tǒng)的制備
[0048](I)將神經(jīng)生長因子和堿性成纖維細(xì)胞生長因子的組合作為組分I，配制含有纖維蛋白原、纖粘連蛋白、肝素和纖維蛋白穩(wěn)定因子的溶液作為組分II;
[0049](2)配制含有凝血酶和氯化鈣的溶液作為組分III ；
[0050](3)將組分II加入組分I，以溶解組分I ;
[0051](4)將組分III加入組分II和I的混合溶液，以形成神經(jīng)生長因子/堿性成纖維細(xì)胞生長因子/載體緩釋系統(tǒng)
[0052](5)上述步驟(1)中的纖維蛋白原在組分II中的濃度可為4mg/ml。所述步驟
(2)中的凝血酶在組分III中的濃度可為40IU/ml，所述氯化鈣在組分III中的濃度可為35 μ mol/ml O所述組分II和組分III的pH值優(yōu)選為6.8。
[0053](6)在上述步驟⑶中將組分II加入組分I之后，可在33°C水浴中放置30分鐘。所述步驟(4)中將組分III加入到組分II和I的混合溶液之后，放入培養(yǎng)箱(37°C溫箱)孵育0.5小時(shí)。神經(jīng)生長因子在最終體系中濃度為I μ g/ml，堿性成纖維細(xì)胞生長因子在最終體系中濃度為50ng/ml。
[0054]實(shí)施例2
[0055]包含神經(jīng)生長因子/血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子/載體緩釋系統(tǒng)的多通道神經(jīng)修復(fù)導(dǎo)管的制備
[0056](I)將神經(jīng)生長因子和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子的組合作為組分I，配制含有纖維蛋白原、纖粘連蛋白、肝素和纖維蛋白穩(wěn)定因子的溶液作為組分II ;
[0057](2)配制含有凝血酶和氯化鈣的溶液作為組分III ；
[0058](3)將組分II加入組分I，以溶解組分I ;
[0059](4)將組分III加入組分II和I的混合溶液，以形成神經(jīng)生長因子/血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子/載體緩釋系統(tǒng)；
[0060](5)將所述神經(jīng)生長因子/血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子/載體緩釋系統(tǒng)注入殼聚糖神經(jīng)導(dǎo)管中，用模具和冷凍干燥技術(shù)制備成多通道神經(jīng)導(dǎo)管；
[0061](6)上述步驟⑴中的纖維蛋白原在組分II中的濃度可為120mg/ml。所述步驟
(2)中的凝血酶在組分III中的濃度可為800IU/ml，所述氯化鈣在組分III中的濃度可為45 μ mol/ml ο所述組分II和組分III的pH值優(yōu)選為8。
[0062](7)在上述步驟(3)中將組分II加入組分I之后，可在37°C水浴中放置15分鐘。所述步驟(4)中將組分III加入到組分II和I的混合溶液之后，放入培養(yǎng)箱(37°C溫箱)孵育I小時(shí)。神經(jīng)生長因子在最終體系中濃度為I μ g/ml，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子在最終體系中濃度為100ng/ml。
[0063]評(píng)價(jià)例I
[0064]體內(nèi)、體外緩釋曲線及其分析[0065]分別在體內(nèi)和體外條件下檢測本發(fā)明的細(xì)胞因子控釋凝膠體系中細(xì)胞因子的釋放曲線，結(jié)果見圖6和圖7。
[0066]圖6為用ELISA方法檢測生長因子(bFGF，NGF)體內(nèi)釋放曲線。FG:纖維蛋白膠；Fn:纖粘連蛋白；Hep:肝素；bFGF:堿性成纖維細(xì)胞生長因子；NGF:神經(jīng)生長因子。由圖6可見，生長因子緩釋系統(tǒng)FG/Fn/!fep/-bFGF和FG/Fn/!fep/-bFGF在體內(nèi)接近線性釋放，而生長因子與FG簡單的物理混合凝膠在體內(nèi)植入后3天內(nèi)出現(xiàn)爆釋。
[0067]圖7為用ELISA方法檢測生長因子(bFGF，NGF)體外釋放曲線。FG:纖維蛋白膠；Fn:纖粘連蛋白；Hep:肝素；bFGF:堿性成纖維細(xì)胞生長因子；NGF:神經(jīng)生長因子。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，生長因子緩釋系統(tǒng)FG/Fn/!fep/-bFGF和FG/Fn/!fep/-bFGF在體外緩沖鹽溶液中釋放非常緩慢，在第20天的時(shí)候加入纖維蛋白溶解酶(plasmin)，出現(xiàn)生長因子的爆釋；而生長因子與FG簡單的物理混合凝膠在體外緩沖鹽溶液中釋放很快，浸泡10天已經(jīng)釋放90%。
[0068]綜上可知，本發(fā)明的控釋(緩釋)系統(tǒng)有效地達(dá)到了對(duì)其中加入的細(xì)胞因子的緩釋作用，避免了爆釋現(xiàn)象 ，相應(yīng)延長了細(xì)胞因子釋放的時(shí)間，從而能夠持續(xù)地促進(jìn)神經(jīng)的修復(fù)。
[0069]評(píng)價(jià)例2
[0070]神經(jīng)修復(fù)結(jié)果檢測
[0071]利用結(jié)合有生長因子NGF、bFGF的控釋凝膠修復(fù)了大鼠坐骨神經(jīng)離斷傷，具體實(shí)驗(yàn)方法和實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
[0072]方法:
[0073]SD大鼠27只隨機(jī)分為A、B、C三組，每組9只。建立大鼠坐骨神經(jīng)橫斷模型:A組:以含有神經(jīng)生長因子(NGF)與堿性成纖維生長因子(bFGF)控釋凝膠的神經(jīng)導(dǎo)管橋接神經(jīng)遠(yuǎn)近端(間隙3mm) ；B組:以含有生理鹽水的神經(jīng)導(dǎo)管橋接神經(jīng)遠(yuǎn)近端(間隙3mm):C組:采用神經(jīng)遠(yuǎn)近端直接縫合。術(shù)后8周進(jìn)行坐骨神經(jīng)指數(shù)(SFI)、神經(jīng)電生理、肌肉濕重比檢查以及組織學(xué)和免疫組化觀察。
[0074]結(jié)果:
[0075]從數(shù)據(jù)上看，A組在SF1、神經(jīng)傳導(dǎo)速度、肌肉濕重比、再生神經(jīng)纖維密度及髓鞘化等方面均高于B組和C組，但三組的SF1、肌肉濕重比及新生軸突直徑和髓鞘厚度均無顯著性差異(P>0.05)。A組與B組的神經(jīng)傳導(dǎo)速度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，兩組均明顯高于C組(P〈0.05)。至于再生神經(jīng)纖維密度，三組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0.05)(參見表I)。
[0076]結(jié)論:小間隙吻合結(jié)合控釋生長因子對(duì)神經(jīng)再生有明顯的促進(jìn)作用。
[0077]表1術(shù)后8周各組神經(jīng)吻合口中段新生神經(jīng)纖維參數(shù)(X土 S，N = 9)
【權(quán)利要求】
1.一種神經(jīng)修復(fù)材料，包括: 能夠促進(jìn)神經(jīng)生長的細(xì)胞因子的組合，以及所述細(xì)胞因子的控釋載體， 其中所述載體主要由纖維蛋白原、纖粘連蛋白、肝素、纖維蛋白穩(wěn)定因子、凝血酶和氯化鈣形成， 所述能夠促進(jìn)神經(jīng)生長的細(xì)胞因子的組合優(yōu)選選自神經(jīng)生長因子、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子生的至少兩種， 所述能夠促進(jìn)神經(jīng)生長的細(xì)胞因子的組合包埋于所述載體中。
2.如權(quán)利要求1所述的神經(jīng)修復(fù)材料，其中所述能夠促進(jìn)神經(jīng)生長的細(xì)胞因子的組合為神經(jīng)生長因子和堿性成纖維細(xì)胞生長因子的組合。
3.如權(quán)利要求1所述的神經(jīng)修復(fù)材料，其中所述載體中纖粘連蛋白與肝素的摩爾比在1:1至10:1范圍內(nèi)。
4.如權(quán)利要求1所述的神經(jīng)修復(fù)材料，其中所述纖維蛋白原在所述載體中的含量為90wt%以上。
5.如權(quán)利要求1所述的神經(jīng)修復(fù)材料，其中所述纖維蛋白穩(wěn)定因子與纖維蛋白原的比例關(guān)系為:每Img纖維蛋白原對(duì)應(yīng)0.3IU至1.2IU的纖維蛋白穩(wěn)定因子。
6.如權(quán)利要求1所述的神經(jīng)修復(fù)材料，其中所述載體和所述能夠促進(jìn)神經(jīng)生長的細(xì)胞因子的組合預(yù)裝于天然材料或人工材料形成的神經(jīng)修復(fù)導(dǎo)管內(nèi)部，優(yōu)選進(jìn)一步制成多通道神經(jīng)修復(fù)導(dǎo)管。
7.一種制備如權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的神經(jīng)修復(fù)材料的方法，包括如下步驟: (1)將能夠促進(jìn)神經(jīng)生長的細(xì)胞因子的組合作為組分I，配制含有纖維蛋白原、纖粘連蛋白、肝素和纖維蛋白穩(wěn)定因子的溶液作為組分II，其中所述能夠促進(jìn)神經(jīng)生長的細(xì)胞因子的組合優(yōu)選選自神經(jīng)生長因子、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子生的至少兩種； (2)配制含有凝血酶和氯化鈣的溶液作為組分III； (3)將組分II加入組分I，以溶解組分I;和 (4)將組分III加入組分II和I的混合溶液，以形成神經(jīng)修復(fù)因子緩釋系統(tǒng)，優(yōu)選進(jìn)一步包括步驟: (5)將所述神經(jīng)修復(fù)因子緩釋系統(tǒng)注入神經(jīng)修復(fù)導(dǎo)管中。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述步驟(1)中的纖維蛋白原在組分II中的濃度為4mg/ml 至 120mg/mlo
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述步驟(2)中的凝血酶在組分III中的濃度為40至800IU/ml，所述氯化鈣在組分III中的濃度為35至45 μ mol/ml。
10.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述組分II和組分III的pH值為6.8至8。
11.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述步驟(3)中將組分II加入組分I之后，在33°C至37 °C水浴中放置15至30分鐘。
12.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述步驟(4)中將組分III加入到組分II和I的混合溶液之后，放入37°C的溫箱孵育0.5至I小時(shí)。
【文檔編號(hào)】A61K47/04GK103933619SQ201410177248
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月29日
【發(fā)明者】敖強(qiáng), 劉偉強(qiáng), 王臻 申請人:深圳清華大學(xué)研究院