一種組織工程界面修飾材料、其修飾方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種組織工程界面修飾材料以及使用該修飾材料修飾組織工程界面的方法。該修飾材料包含PEG、細(xì)菌或細(xì)菌感染響應(yīng)性肽和細(xì)胞粘附肽，其細(xì)胞粘附肽的端頭使其具有較強(qiáng)的促進(jìn)細(xì)胞粘附和生長能力，當(dāng)面對(duì)細(xì)菌感染時(shí)，其細(xì)菌或細(xì)菌感染響應(yīng)性肽對(duì)細(xì)菌產(chǎn)生響應(yīng)，從而抑制細(xì)菌在界面上形成生物膜。該組織工程界面修飾材料具有智能的雙響應(yīng)性，比現(xiàn)有的界面修飾材料更具多功能和智能化，具有廣泛的應(yīng)用前景。
【專利說明】一種組織工程界面修飾材料、其修飾方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域，尤其涉及一種雙響應(yīng)的組織工程界面修飾材料、其修飾方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 界面修飾材料在組織工程方面有著相當(dāng)廣泛的用途，在生物環(huán)境中，細(xì)胞和材料的相互作用實(shí)際上是細(xì)胞表面受體與細(xì)胞外生物材料所能提供的相應(yīng)配體之間的相互間分子識(shí)別，從而產(chǎn)生特異性相互作用。當(dāng)材料植入體內(nèi)，細(xì)胞膜表面的受體積極尋找與之接觸的材料表面所能提供的信號(hào)，以區(qū)別所接觸的材料為自體或異體。只有生物相容性適宜，植入材料才能被生物體認(rèn)同。表面修飾旨在抑制非特異性相互作用，引入特異性相互作用位點(diǎn)，使細(xì)胞在類似體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)中發(fā)揮其功能。
[0003]為了創(chuàng)造一個(gè)良好的人工ECM環(huán)境，達(dá)到細(xì)胞正常生長的需求，表面修飾后的生物材料應(yīng)達(dá)到如下要求:(1)良好的生物相容性；(2)良好的抗凝血性；(3)適宜的表面親水-疏水平衡；(4)較強(qiáng)的細(xì)胞特異性識(shí)別能力；(5)較強(qiáng)的消除非特異性識(shí)別能力。而植入物感染是組織工程材料在手術(shù)植入時(shí)最嚴(yán)重的并發(fā)癥，由于細(xì)菌易在界面形成生物膜，使得感染具有極強(qiáng)的耐藥性，形成難以根治的持續(xù)性慢性感染，只能將植入物去除，導(dǎo)致手術(shù)失敗。因此，作為界面修飾材料，不僅需要具有以上的生物相容性還需要具有良好的抗感染抗生物膜形成能力。
[0004]將多肽類用于組織工程界面修飾，可使界面具有非常好的特異性識(shí)別性能(如受體識(shí)別)以及生物相容性和可降解性能。與細(xì)胞表面受體真正起反應(yīng)的是細(xì)胞外基質(zhì)上3~20個(gè)氨基酸的多肽鏈。現(xiàn)有技術(shù)中，可在界面材料表面直接固定多肽，制成受體專門性材料，以促進(jìn)受體介導(dǎo)的細(xì)胞對(duì)界面材料表面的黏附，從而來提高其生物相容性。目前主要使用的細(xì)胞粘附肽是RGD，RGD可被固有黏附蛋白受體特異性組合，在生物材料表面自發(fā)形成分子層，為與受體介導(dǎo)的細(xì)胞反應(yīng)提供了位點(diǎn)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞黏附、伸展。同時(shí)，RGD還與球蛋白等生理活性物質(zhì)結(jié)合，也有很好的促細(xì)胞黏附能力。但是，若在界面材料表面直接固定多肽，難以達(dá)到抑菌效果，從而在手術(shù)植入時(shí)存在極大風(fēng)險(xiǎn)。
[0005]組織工程界面所需要的另一個(gè)重要性能是防污，也即防止細(xì)菌感染，防污性能主要是抑制細(xì)菌在界面形成生物膜，以求達(dá)到理想的細(xì)菌“零粘附”。目前較常用的材料有具有抗菌性能的無機(jī)類材料修飾(如Ag、Ti02、Zn02、Mg0、Cu0等金屬氧化物),具有抗菌性能的有機(jī)涂層(如氯己定、氯二甲酚)以及抗細(xì)菌粘附的高分子膜(如甲基丙酸烯、聚乙二醇)。但是，這些材料要想達(dá)到抑菌效果，需要其為“裸露”狀態(tài)。因此，當(dāng)將上述RGD肽連接于抗菌材料表面時(shí)，無法實(shí)現(xiàn)抗菌效果；而單純?cè)诮缑嫔闲揎椛鲜隹咕牧蠒r(shí)，又無法達(dá)到促進(jìn)細(xì)胞粘附、提高其生物相容性的效果。因此，迫切需要開發(fā)一種既能實(shí)現(xiàn)良好的生物相容性，又兼具防污性能的組織工程界面修飾材料。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]本發(fā)明的目的在于提出一種生物相容性與防污性能兼具的組織工程界面修飾材料，該組織工程界面修飾材料具有較強(qiáng)的促進(jìn)細(xì)胞粘附和生長能力，對(duì)細(xì)菌的響應(yīng)性以及響應(yīng)后抗細(xì)菌生物膜形成的能力。
[0007]為達(dá)此目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0008]第一方面，本發(fā)明提供了一種組織工程界面修飾材料，該組織工程界面修飾材料依次包含PEG、細(xì)菌或細(xì)菌感染響應(yīng)性肽和細(xì)胞粘附肽。
[0009]上述組織工程界面修飾材料中，作為優(yōu)選，所述PEG的重復(fù)序列為4~10個(gè)，優(yōu)選為6~8個(gè),更優(yōu)選為6個(gè)。
[0010]在具體的實(shí)施方案中，所述PEG的重復(fù)序列為4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、10
個(gè)。
[0011]優(yōu)選地,所述細(xì)菌或細(xì)菌感染響應(yīng)性肽為凝血酶響應(yīng)性肽、基質(zhì)金屬蛋白酶響應(yīng)性肽、脂肪酶響應(yīng)肽或者磷酸酶響應(yīng)肽中的任意一種或幾種的組合；
[0012]所述細(xì)菌或細(xì)菌感染響應(yīng)性肽為對(duì)細(xì)菌或細(xì)菌感染產(chǎn)生響應(yīng)比如產(chǎn)生響應(yīng)性酶切的肽，比如所述凝血酶響應(yīng)性肽對(duì)凝血酶產(chǎn)生響應(yīng)進(jìn)而發(fā)生酶切，所述基質(zhì)金屬蛋白酶響應(yīng)性肽對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶產(chǎn)生響應(yīng)進(jìn)而發(fā)生酶切，因此，所述凝血酶響應(yīng)性肽包含凝血酶的酶切位點(diǎn)，而基質(zhì)金屬蛋白酶響應(yīng)性肽包含基質(zhì)金屬蛋白酶的酶切位點(diǎn)。
[0013]進(jìn)一步優(yōu)選地，所述細(xì)菌或細(xì)菌感染響應(yīng)性肽為如SEQ ID N0.1~14任一項(xiàng)所示序列或幾種序列的組合:
[0014]SEQ ID N0.1:G (D) FPRGA ；
[0015]SEQ ID N0.2 =GAGRP(D) FG ；
[0016]SEQ ID N0.3 =GAGPR(D) FG ；
[0017]SEQ ID N0.4:G (D) FPRGG ；
[0018]SEQ ID N0.5:G (D) FPRGF ；
[0019]SEQ ID N0.6:G (D) FPRGP ；
[0020]SEQ ID N0.7:G (D) FPGRG ；
[0021]SEQ ID N0.8:GPLGV ；
[0022]SEQ ID N0.9:GPLGQ ；
[0023]SEQ ID N0.10:GPLGNLG ；
[0024]SEQ ID N0.11:GPLGLAG ；
[0025]SEQ ID N0.12:GPLGL ；
[0026]SEQ ID N0.13:GPIGNVG ；
[0027]SEQ ID N0.14 =GPAGQ0
[0028]上述序列中，SEQ ID N0.1~7為凝血酶響應(yīng)肽，SEQ ID N0.8~14為基質(zhì)金屬蛋白酶響應(yīng)肽；上述SEQ ID N0.1~7中，(D)代表著其后的氨基酸為D-氨基酸，例如SEQID N0.1:G (D) FPRGA中，第二個(gè)氨基酸F為D-氨基酸；因D-氨基酸在序列表中無法顯示而特別作此說明，關(guān)于SEQ ID N0.1~7的序列以上述解釋為準(zhǔn)。
[0029]優(yōu)選地，所述細(xì)胞粘附肽為RGD序列或GRGDS序列、RGDS序列或CRGD環(huán)肽中的任意一種或幾種的組合；
[0030]進(jìn)一步優(yōu)選地，所述細(xì)胞粘附肽包括RGD肽；[0031]更進(jìn)一步優(yōu)選地，所述細(xì)胞粘附肽為RGD肽。
[0032]第二方面，本發(fā)明提供了一種組織工程界面的修飾方法，該修飾方法為:將第一方面所述的組織工程界面修飾材料偶聯(lián)到組織工程界面上。
[0033]優(yōu)選地，通過氨丙基三乙氧基硅烷(APS)將所述組織工程界面修飾材料偶聯(lián)到組織工程界面上。
[0034]在優(yōu)選的實(shí)施方案中，上述修飾方法包括如下步驟:
[0035](1)通過乙氧基-羥基縮合反應(yīng)，將氨丙基三乙氧基硅烷偶聯(lián)到表面帶羥基的組織工程界面；
[0036](2)通過羧基-氨基縮合反應(yīng),將重復(fù)序列為4~10個(gè)、優(yōu)選為6~8個(gè)、更優(yōu)選為6個(gè)的雙羧基PEG偶聯(lián)到步驟(1)所得組織工程界面上的氨丙基三乙氧基硅烷；
[0037](3)通過羧基-氨基縮合反應(yīng)，將包含所述細(xì)菌或細(xì)菌感染響應(yīng)性肽和細(xì)胞粘附肽的多肽偶聯(lián)到步驟(2)所得組織工程界面上的雙羧基PEG的另一個(gè)羧基上。
[0038]優(yōu)選地，步驟(1)中，在偶聯(lián)氨丙基三乙氧基硅烷前，先將組織工程界面進(jìn)行活化；
[0039]優(yōu)選地，步驟(1)所述縮合反應(yīng)的溶劑為乙醇或甲醇，所述縮合反應(yīng)時(shí)間為8~15小時(shí)、優(yōu)選為12小時(shí)。
[0040]優(yōu)選地，步驟(2 )中，將所述雙羧基PEG與相同數(shù)目重復(fù)序列的羧基甲基PEG兩者與組織工程界面上的氨丙基三乙氧基硅烷進(jìn)行羧基-氨基縮合反應(yīng)；
[0041]優(yōu)選地，所述雙羧基PEG與羧基甲基PEG兩者的投料量與組織工程界面上的氨丙基三乙氧基硅烷的摩爾比為(0.8~1):1，優(yōu)選為0.8:1 ;
[0042]進(jìn)一步優(yōu)選地，所述雙羧基PEG與羧基甲基PEG的投料摩爾比為(0.3~I):1、優(yōu)選為(0.4~0.5): 1、更優(yōu)選為(0.4~0.45):1 ；
[0043]在具體實(shí)施方案中，所述雙羧基PEG與羧基甲基PEG的比例為0.3:1、0.4: 1、
0.45:1、0.5:1、0.6:1、0.7:1、0.8:1、0.9:1、1:1。
[0044]進(jìn)一步優(yōu)選地，在步驟(2)所述羧基-氨基縮合反應(yīng)前，先將雙羧基PEG與羧基甲基PEG進(jìn)行活化。
[0045]優(yōu)選地，步驟(3)中，所述多肽的投料量為I~5mg/cm2組織工程界面；
[0046]在具體的實(shí)施方案中，步驟(3)中所述多肽的投料量為lmg/cm2、2mg/cm2、3mg/cm2、4mg/cm2、5mg/cm2組織工程界面。
[0047]優(yōu)選地，當(dāng)所述多肽的長度為6~15個(gè)氨基酸時(shí)，所述多肽與界面上的雙羧基PEG的摩爾比為(5~30):100、優(yōu)選為(10~20):100、更優(yōu)選為15:100 ；
[0048]優(yōu)選地，當(dāng)所述多肽的長度為8~10個(gè)氨基酸時(shí)，所述多肽與界面上的雙羧基PEG的摩爾比為(15~25): 100、優(yōu)選為20:100。
[0049]在具體實(shí)施方案中，當(dāng)所述多肽的長度為15、12、9、8、7或6個(gè)氨基酸時(shí)，對(duì)應(yīng)地，所述多肽與界面上的雙羧基PEG的摩爾比為5:100,10:100,15:100,20:100,25:100或30:100。
[0050]本發(fā)明的一個(gè)具體的實(shí)施方案，包括如下步驟:
[0051](I)采用等離子清洗儀將表面帶羥基的組織工程界面進(jìn)行活化，將活化的組織工程界面浸潰在氨丙基三乙氧基硅烷的乙醇溶液中室溫反應(yīng)12小時(shí)；[0052](2)用EDC/NHS活化具有6個(gè)重復(fù)序列的雙羧基PEG和羧基甲基PEG，然后將二者與界面上APS的氨基進(jìn)行縮合反應(yīng)；
[0053]所述雙羧基PEG與羧基甲基PEG的投料摩爾比為0.4:1 ;
[0054]所述雙羧基PEG與羧基甲基PEG兩者的投料量與組織工程界面上的氨丙基三乙氧基硅烷的摩爾比為0.8:1 ；
[0055](3)將包含細(xì)菌或細(xì)菌感染響應(yīng)性肽和細(xì)胞粘附肽的多肽以2mg/cm2組織工程界面的投料量，通過羧基-氨基縮合反應(yīng)偶聯(lián)在PEG的游離端，形成界面修飾；
[0056]所述多肽的長度為8~10個(gè)氨基酸，所述多肽與界面上的雙羧基PEG的摩爾比為(15 ~25):100ο
[0057]第三方面，本發(fā)明提供了第一方面所述的組織工程界面修飾材料所修飾的組織工程界面；或者，通過第二方面所述的組織工程界面的修飾方法所修飾的組織工程界面。
[0058]第四方面，本發(fā)明提供了如第三方面所述的組織工程界面在制備用于促進(jìn)愈合的體內(nèi)植入物中的應(yīng)用。
[0059]本發(fā)明所提供的組織工程界面修飾材料，其細(xì)胞粘附肽的端頭使其具有較強(qiáng)的促進(jìn)細(xì)胞粘附和生長能力，從而可以促進(jìn)正常組織細(xì)胞在組織工程界面的粘附生長；當(dāng)細(xì)菌感染時(shí)，其細(xì)菌或細(xì)菌感染響應(yīng)性肽對(duì)細(xì)菌感染做出響應(yīng)，從而抑制細(xì)菌生物膜形成，減少細(xì)菌粘附。本發(fā)明的 組織工程界面修飾材料的工作原理如附圖1所示，該組織工程界面修飾材料具有智能的雙響應(yīng)性，比現(xiàn)有的界面修飾材料更具多功能和智能化，具有廣泛的應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0060]圖1是本發(fā)明的組織工程界面修飾材料的工作原理示意圖。
[0061]圖2顯示了實(shí)施例1、2中的界面修飾路線和對(duì)相應(yīng)酶的響應(yīng)。
[0062]圖3是實(shí)施例1中所述界面細(xì)胞粘附伸展的掃面電鏡照片。
[0063]圖4是實(shí)施例1中所述界面抗細(xì)菌生物膜形成的熒光共聚焦照片；其中，陰性對(duì)照是指對(duì)修飾界面無響應(yīng)的細(xì)菌生物膜形成，陽性對(duì)照是指對(duì)修飾界面產(chǎn)生響應(yīng)的細(xì)菌生物膜形成。
[0064]圖5是實(shí)施例1中所述界面修飾過的體內(nèi)植入材料的體內(nèi)組織粘合照片。
[0065]圖6是實(shí)施例1中所述界面修飾過的體內(nèi)植入材料在體內(nèi)的組織切片。
[0066]圖7是實(shí)施例2中所述界面細(xì)胞粘附伸展的掃面電鏡照片。
[0067]圖8是實(shí)施例2中所述界面抗細(xì)菌生物膜形成的熒光共聚焦照片；其中，陰性對(duì)照是指對(duì)修飾界面無響應(yīng)的細(xì)菌生物膜形成，陽性對(duì)照是指對(duì)修飾界面產(chǎn)生響應(yīng)的細(xì)菌生物膜形成。
【具體實(shí)施方式】
[0068]下面通過【具體實(shí)施方式】來進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，其不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0069]實(shí)施例1、實(shí)施例2的組織工程界面修飾路線以及對(duì)相應(yīng)酶的響應(yīng)如圖2所示。
[0070]實(shí)施例1本發(fā)明的組織工程界面修飾及其細(xì)胞粘附、抗菌性能檢測[0071]使用包含凝血酶響應(yīng)肽的組織工程界面修飾材料進(jìn)行修飾，其具體步驟為:
[0072](I)多肽(G ⑶ FPRGA+RGD)的合成
[0073]采用Fmoc固相合成法合成多肽:合成選用0.35mM修飾密度的Wang樹脂，其中第一個(gè)氨基酸(天冬氨酸)C端被固定于樹脂上，N端被Fmoc保護(hù)。用20% (v/v)的六氫吡啶的DMF溶液脫去Fmoc保護(hù)，然后用茚三酮測試法測試去保護(hù)結(jié)果。然后將下一個(gè)氨基酸的羧基用0.4M的4-甲基嗎啉和0.4M的苯并三氮唑-N，N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯的DMF溶液活化，并加入到脫去保護(hù)的樹脂中反應(yīng)2小時(shí)。重復(fù)上述步驟完成所有序列氨基酸的反應(yīng)后，用含有2.5%水和2.5%三異丙基硅烷的三氟乙酸溶液將合成好的多肽從樹脂上脫除，同時(shí)脫除氨基酸的側(cè)鏈保護(hù)。將三氟乙酸用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法去除，然后多肽的粗產(chǎn)物用無水乙醚沉淀，洗滌并干燥。最后選用反相液相制備色譜，將多肽純化。純化過程的條件是:流動(dòng)相是含有0.1%三氟乙酸的乙腈和含有0.1%三氟乙酸的雙蒸水；參數(shù)是梯度洗脫從5%乙腈/95%水到60%乙腈/40%水，流速為10ml/min，處理時(shí)間為30min ;檢測器為紫外檢測器，檢測波段為220nm。 [0074](2)雙響應(yīng)界面的修飾方法
[0075]采用等離子清洗儀將界面進(jìn)行清洗活化，將界面浸入氨丙基三乙氧基硅烷的乙醇溶液中室溫過夜反應(yīng)，將界面轉(zhuǎn)入EDC/NHS活化后的6個(gè)重復(fù)單元的雙羧基PEG和羧基甲基PEG的水溶液中(雙羧基PEG與羧基甲基PEG的摩爾比為0.4:1 )，從而將雙羧基PEG與羧甲基PEG修飾于界面上；隨后將步驟(1)合成的響應(yīng)性多肽(長度為9個(gè)氨基酸)以2mg/cm2界面的投料量偶聯(lián)在PEG端頭，形成界面修飾；所述響應(yīng)性多肽與界面上的雙羧基PEG的摩爾比為15:100。
[0076]由上述步驟所得修飾界面的細(xì)胞粘附及抗菌性能檢測如下，以下檢測中，均以未經(jīng)界面修飾的空白界面為陰性對(duì)照:
[0077](I)細(xì)胞粘附生長實(shí)驗(yàn)
[0078]細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)是將3T3成纖維細(xì)胞以4.5 X IO5細(xì)胞/cm2的密度，置于含有上述界面修飾蓋玻片的6孔板中，并加入2mL無血清DMEM培養(yǎng)基，細(xì)胞在37°C，5%C02培養(yǎng)lh，隨后用PBS洗滌沒有粘附的細(xì)胞，并對(duì)界面粘附的細(xì)胞用顯微鏡觀察計(jì)數(shù)。
[0079]觀察結(jié)果顯示:本發(fā)明的修飾界面粘附的細(xì)胞數(shù)量與投入數(shù)量相當(dāng)；而空白對(duì)照界面的細(xì)胞粘附數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于修飾界面，單位面積數(shù)量低約一個(gè)數(shù)量級(jí)。該結(jié)果表明:本發(fā)明的修飾界面可以很好的粘附細(xì)胞。
[0080]細(xì)胞生長實(shí)驗(yàn)是將3T3成纖維細(xì)胞以6 X IO4細(xì)胞/cm2的密度，置于含有上述界面修飾蓋玻片的6孔板中，并加入2mL含血清DMEM培養(yǎng)基，細(xì)胞在37°C，5%C02培養(yǎng)6天，隨后用PBS洗滌界面，并對(duì)界面生長的細(xì)胞用顯微鏡觀察計(jì)數(shù)。
[0081]結(jié)果顯示:本發(fā)明的修飾界面可以很好的促進(jìn)細(xì)胞的貼壁生長，生長曲線與Corning培養(yǎng)皿中的生長曲線基本一致，而空白對(duì)照組細(xì)胞基本停滯生長，大部分已經(jīng)死亡。
[0082]細(xì)胞在上述界面上粘附伸展的掃面電鏡照片如圖3所示。由圖3可見，3T3成纖維細(xì)胞可在本發(fā)明修飾界面上粘附伸展，而在未經(jīng)本發(fā)明修飾的空白界面上則不能。
[0083](2)抗細(xì)菌生物膜形成實(shí)驗(yàn)
[0084]將細(xì)菌涂布在肉湯培養(yǎng)基瓊脂培養(yǎng)皿中，37°C培養(yǎng)24小時(shí)，將單菌落轉(zhuǎn)移至含有2.5%葡萄糖的TSB液體培養(yǎng)基中，37°C震蕩(200rpm)培養(yǎng)過夜，然后將105CFU/mL細(xì)菌置于2.5mL含有2.5%葡萄糖的TSB液體培養(yǎng)基中，并將上述細(xì)菌溶液加入含有上述界面修飾蓋玻片的6孔板中，37°C靜置培養(yǎng)20小時(shí)，用PBS清洗游離的細(xì)菌。隨后將生物膜以及粘附的細(xì)菌用活/死細(xì)胞染色劑染色15min，用熒光共聚焦顯微鏡觀察界面的生物膜以及細(xì)菌。其結(jié)果如圖4所示，圖4中顯示了不同細(xì)菌種屬對(duì)本發(fā)明修飾界面的響應(yīng)情況，陰性對(duì)照是指對(duì)修飾界面無響應(yīng)的細(xì)菌的生物膜形成情況，陽性對(duì)照是指對(duì)修飾界面產(chǎn)生響應(yīng)的細(xì)菌的生物膜形成情況。
[0085]圖4結(jié)果表明:本發(fā)明的組織工程界面修飾大大抑制了響應(yīng)性細(xì)菌在界面的生物膜形成，減少了細(xì)菌粘附。
[0086]另外，經(jīng)上述界面修飾的體內(nèi)植入材料的體內(nèi)組織粘合照片見圖5，其在體內(nèi)的組織切片見圖6。
[0087]由圖5、圖6可見，與空白界面相對(duì)比，本發(fā)明的修飾界面可以很好的促進(jìn)植入物與組織的粘附，加快傷口界面纖維化，降低機(jī)體炎性反應(yīng)，促進(jìn)傷口愈合。
[0088]實(shí)施例2本發(fā)明的組織工程界面修飾及其細(xì)胞粘附、抗菌性能檢測
[0089]使用包含基質(zhì)蛋白酶響應(yīng)肽的組織工程界面修飾材料進(jìn)行修飾，其具體步驟為:
[0090](I)多肽(GPLGM+RGD )的合成
[0091]采用Fmoc固相合成法合成多肽:合成選用0.35mM修飾密度的Wang樹脂,其中第一個(gè)氨基酸(天冬氨酸)C端被固定于樹脂上，N端被Fmoc保護(hù)。用20% (v/v)的六氫吡啶的DMF溶液脫去Fmoc保護(hù)，然后用茚三酮測試法測試去保護(hù)結(jié)果。然后將下一個(gè)氨基酸的羧基用0.4M的4-甲基嗎啉和0.4M的苯并三氮唑-N，N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯的DMF溶液活化，并加入到脫去保護(hù)的`樹脂中反應(yīng)2小時(shí)。重復(fù)上述步驟完成所有序列氨基酸的反應(yīng)后，用含有2.5%水和2.5%三異丙基硅烷的三氟乙酸溶液將合成好的多肽從樹脂上脫除，同時(shí)脫除氨基酸的側(cè)鏈保護(hù)。將三氟乙酸用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法去除，然后多肽的粗產(chǎn)物用無水乙醚沉淀，洗滌并干燥。最后選用反相液相制備色譜，將多肽純化。純化過程的條件是:流動(dòng)相是含有0.1%三氟乙酸的乙腈和含有0.1%三氟乙酸的雙蒸水；參數(shù)是梯度洗脫從5%乙腈/95%水到60%乙腈/40%水，流速為10ml/min，處理時(shí)間為30min ;檢測器為紫外檢測器，檢測波段為220nm。
[0092](2)雙響應(yīng)界面的修飾方法
[0093]采用等離子清洗儀將界面進(jìn)行清洗活化，將界面浸入氨丙基三乙氧基硅烷的乙醇溶液中室溫過夜反應(yīng)，將界面轉(zhuǎn)入EDC/NHS活化后的6個(gè)重復(fù)單元的雙羧基PEG和羧基甲基PEG的水溶液中(雙羧基PEG與羧基甲基PEG的摩爾比為0.4:1 )，從而將雙羧基PEG與羧甲基PEG修飾于界面上，隨后將步驟(1)所得響應(yīng)性多肽(長度為8個(gè)氨基酸)以2mg/cm2界面的投料量，通過羧基-氨基縮合反應(yīng)偶聯(lián)在PEG的游離端形成界面修飾；所述響應(yīng)性多肽與界面上的雙羧基PEG的摩爾比為21:100。
[0094]由上述步驟所得修飾界面的細(xì)胞粘附及抗菌性能檢測如下，以下檢測中，均以未經(jīng)界面修飾的空白界面為陰性對(duì)照:
[0095](I)細(xì)胞粘附生長實(shí)驗(yàn)
[0096]細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)是將3T3成纖維細(xì)胞以4.5 X IO5細(xì)胞/cm2的密度，置于含有上述界面修飾蓋玻片的6孔板中，并加入2mL無血清DMEM培養(yǎng)基，細(xì)胞在37°C，5%C02培養(yǎng)lh，隨后用PBS洗滌沒有粘附的細(xì)胞，并對(duì)界面粘附的細(xì)胞用顯微鏡觀察計(jì)數(shù)。
[0097]觀察結(jié)果顯示:本發(fā)明的修飾界面可以很好的粘附細(xì)胞，粘附的細(xì)胞數(shù)量與投入數(shù)量相當(dāng)，而空白對(duì)照界面的細(xì)胞粘附數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于修飾界面，單位面積數(shù)量低約一個(gè)數(shù)量級(jí)。該結(jié)果表明:本發(fā)明的修飾界面可以很好的粘附細(xì)胞。
[0098]細(xì)胞生長實(shí)驗(yàn)是將3T3成纖維細(xì)胞以6 X IO4細(xì)胞/cm2的密度，置于含有上述界面修飾蓋玻片的6孔板中，并加入2mL含血清DMEM培養(yǎng)基，細(xì)胞在37°C，5%C02培養(yǎng)6天，隨后用PBS洗滌界面，并對(duì)界面生長的細(xì)胞用顯微鏡觀察計(jì)數(shù)。
[0099]結(jié)果顯示:本發(fā)明的修飾界面可以很好的促進(jìn)細(xì)胞的貼壁生長，生長曲線與Corning培養(yǎng)皿中的生長曲線基本一致，而空白對(duì)照組細(xì)胞基本停滯生長，大部分已經(jīng)死亡。
[0100]細(xì)胞在上述界面上粘附伸展的掃面電鏡照片如圖7所示；由圖7可見，3T3成纖維細(xì)胞可在本發(fā)明修飾的界面上粘附伸展。
[0101](2)抗細(xì)菌生物膜形成實(shí)驗(yàn)
[0102]將細(xì)菌涂布在肉湯培養(yǎng)基瓊脂培養(yǎng)皿中，37°C培養(yǎng)24小時(shí)，將單菌落轉(zhuǎn)移至含有2.5%葡萄糖的TSB液體培養(yǎng)基中，37°C震蕩(200rpm)培養(yǎng)過夜，然后將105CFU/mL細(xì)菌置于
2.5mL含有2.5%葡萄糖的TSB液體培養(yǎng)基中，并將上述細(xì)菌溶液加入含有上述界面修飾蓋玻片的6孔板中，37°C靜置培養(yǎng)20小時(shí)，用PBS清洗游離的細(xì)菌。隨后將生物膜以及粘附的細(xì)菌用活/死細(xì)胞染色劑染色15min，用熒光共聚焦顯微鏡觀察界面的生物膜以及細(xì)菌。其結(jié)果如圖8所示，圖8中顯示了不同細(xì)菌種屬對(duì)本發(fā)明修飾界面的響應(yīng)情況，陰性對(duì)照是指對(duì)修飾界面無響應(yīng)的細(xì)菌的生`物膜形成情況，陽性對(duì)照是指對(duì)修飾界面產(chǎn)生響應(yīng)的細(xì)菌的生物膜形成情況。
[0103]圖8結(jié)果表明:本發(fā)明的組織工程界面修飾大大抑制了響應(yīng)性細(xì)菌在界面的生物膜形成，減少了細(xì)菌粘附。
[0104] 申請(qǐng)人:聲明，本發(fā)明通過上述實(shí)施例來說明本發(fā)明的技術(shù)方案，但本發(fā)明并不局限于上述實(shí)施例，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述實(shí)施例才能實(shí)施。所屬【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對(duì)本發(fā)明的任何改進(jìn)，對(duì)本發(fā)明所選用原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍和公開范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種組織工程界面修飾材料，其特征在于，依次包含PEG、細(xì)菌或細(xì)菌感染響應(yīng)性肽和細(xì)胞粘附肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織工程界面修飾材料，其特征在于，所述PEG的重復(fù)序列為4~10個(gè),優(yōu)選為6~8個(gè),更優(yōu)選為6個(gè)。 優(yōu)選地，所述細(xì)菌或細(xì)菌感染響應(yīng)性肽為凝血酶響應(yīng)性肽、基質(zhì)金屬蛋白酶響應(yīng)性肽、脂肪酶響應(yīng)肽或者磷酸酶響應(yīng)肽中的任意一種或幾種的組合； 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述細(xì)菌或細(xì)菌感染響應(yīng)性肽為如SEQ ID N0.1~14任一項(xiàng)所示序列或幾種序列的組合； 優(yōu)選地，所述細(xì)胞粘附肽為RGD序列或GRGDS序列、RGDS序列或CRGD環(huán)肽中的任意一種或幾種的組合； 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述細(xì)胞粘附肽包括RGD肽； 更進(jìn)一步優(yōu)選地，所述細(xì)胞粘附肽為RGD肽。
3.—種組織工程界面的修飾方法，其特征在于，將權(quán)利要求1或2所述的組織工程界面修飾材料偶聯(lián)到組織工程界面上； 優(yōu)選地，通過氨丙基三乙氧基硅烷將所述組織工程界面修飾材料偶聯(lián)到組織工程界面上。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的修飾方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)通過乙氧基-羥基縮合反應(yīng)`，將氨丙基三乙氧基硅烷偶聯(lián)到表面帶羥基的組織工程界面； (2)通過羧基-氨基縮合反應(yīng)，將重復(fù)序列為4~10個(gè)、優(yōu)選為6~8個(gè)、更優(yōu)選為6個(gè)的雙羧基PEG偶聯(lián)到步驟(1)所得組織工程界面上的氨丙基三乙氧基硅烷； (3)通過羧基-氨基縮合反應(yīng)，將包含所述細(xì)菌或細(xì)菌感染響應(yīng)性肽和細(xì)胞粘附肽的多肽偶聯(lián)到步驟(2)所得組織工程界面上的雙羧基PEG的另一個(gè)羧基上。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的修飾方法，其特征在于，步驟(1)中，在偶聯(lián)氨丙基三乙氧基硅烷，先將組織工程界面進(jìn)行活化； 優(yōu)選地，所述縮合反應(yīng)的溶劑為乙醇或甲醇； 優(yōu)選地，所述反應(yīng)時(shí)間為8~15小時(shí)、優(yōu)選為12小時(shí)。
6.根據(jù)權(quán)利要求3-5任一項(xiàng)所述的修飾方法，其特征在于，步驟(2)中，將所述雙羧基PEG與相同數(shù)目重復(fù)序列的羧基甲基PEG兩者與組織工程界面上的氨丙基三乙氧基硅烷進(jìn)行羧基-氨基縮合反應(yīng)； 優(yōu)選地，所述雙羧基PEG與羧基甲基PEG兩者的投料量與組織工程界面上的氨丙基三乙氧基硅烷的摩爾比為(0.8~I):1，優(yōu)選為0.8:1 ; 優(yōu)選地，所述雙羧基PEG與羧基甲基PEG的投料摩爾比為(0.3~I):1、優(yōu)選為(0.4~0.5): 1、更優(yōu)選為(0.4 ~0.45):1 ； 優(yōu)選地，在所述羧基-氨基縮合反應(yīng)前，先將雙羧基PEG與羧基甲基PEG進(jìn)行活化。
7.根據(jù)權(quán)利要求3-6任一項(xiàng)所述的修飾方法，其特征在于，步驟(3)中，所述多肽的投料量為I~5mg/cm2組織工程界面； 優(yōu)選地，所述多肽的長度為6~15個(gè)氨基酸，所述多肽與界面上的雙羧基PEG的摩爾比為(5~30):100、優(yōu)選為(10~20): 100、更優(yōu)選為15:100 ；優(yōu)選地，所述多肽的長度為8~10個(gè)氨基酸，所述多肽與界面上的雙羧基PEG的摩爾比為(15~25): 100、優(yōu)選為20:100。
8.根據(jù)權(quán)利要求3-7任一項(xiàng)所述的修飾方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)采用等離子清洗儀將表面帶羥基的組織工程界面進(jìn)行活化，將活化的組織工程界面浸潰在氨丙基三乙氧基硅烷的乙醇溶液中室溫反應(yīng)12小時(shí)； (2)用EDC/NHS活化具有6個(gè)重復(fù)序列的雙羧基PEG和羧基甲基PEG，然后將二者與界面上APS的氨基進(jìn)行縮合反應(yīng)； 所述雙羧基PEG與羧基甲基PEG的投料摩爾比為0.4:1 ; 所述雙羧基PEG與羧基甲基PEG兩者的投料量與組織工程界面上的氨丙基三乙氧基硅烷的摩爾比為0.8:1 ; (3)將包含細(xì)菌或細(xì)菌感染響應(yīng)性肽和細(xì)胞粘附肽的多肽以2mg/cm2組織工程界面的投料量，通過羧基-氨基縮合反應(yīng)偶聯(lián)在PEG的游離端，形成界面修飾； 所述多肽的長度為8~10個(gè)氨基酸，所述多肽與界面上的雙羧基PEG的摩爾比為(15 ~25):100ο
9.由權(quán)利要求1或2所述的組織工程界面修飾材料所修飾的組織工程界面；或者，通過權(quán)利要求3-8任一項(xiàng)所述的組織工程界面的修飾方法所修飾的組織工程界面。
10.如權(quán) 利要求9所述的組織工程界面在制備用于促進(jìn)愈合的體內(nèi)植入物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61L27/54GK103845759SQ201410095314
【公開日】2014年6月11日 申請(qǐng)日期:2014年3月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月14日
【發(fā)明者】王浩, 李莉莉, 齊國斌 申請(qǐng)人:國家納米科學(xué)中心