Mica結(jié)合劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于使用特異性結(jié)合MICA的抗體、抗體片段及其衍生物治療由MICA表達(dá)細(xì)胞介導(dǎo)的障礙的方法。本發(fā)明還涉及抗體，產(chǎn)生此類抗體的細(xì)胞；制造此類抗體的方法；這些抗體的片段、變體以及衍生物；包括其的藥物組合物。
【專利說(shuō)明】MICA結(jié)合劑
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)要求于2012年2月7日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/595,902和于2012年 4月18日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/625, 841的權(quán)益；將其全部通過(guò)引用以其全文結(jié)合在 此，包括任何附圖。
[0003] 對(duì)序列表的引用
[0004] 本申請(qǐng)將與電子格式的序列表一起提交。將該序列表提供為標(biāo)題為"PCT Seq list MICA_ST25"、創(chuàng)建于2013年2月7日、大小為77KB的文件。電子格式的序列表中的 信息通過(guò)引用以其全文結(jié)合在此。 發(fā)明領(lǐng)域
[0005] 本發(fā)明提供了能夠與MICA多肽結(jié)合的抗原結(jié)合蛋白。這些抗原結(jié)合蛋白在由 MICA表達(dá)細(xì)胞--特別是腫瘤細(xì)胞--表征的障礙的治療方面具有增加的活性。
[0006] 背景
[0007] 免疫受體NKG2D正常表達(dá)于人類T細(xì)胞（例如⑶8+T細(xì)胞、Y S T細(xì)胞）和NK細(xì) 胞上。在預(yù)激活的⑶8+細(xì)胞上，NKG2D經(jīng)由DAPlO締合作為⑶28和TCR信號(hào)傳導(dǎo)的協(xié)同共 刺激物起作用，而在NK細(xì)胞中，它作為直接激活劑起作用。連接配體后，NKG2D因此經(jīng)由成 對(duì)的DAPlO銜接蛋白傳達(dá)直接激活或共刺激信號(hào)，由此提升癌癥和感染性疾病免疫力。
[0008] 已經(jīng)鑒定并表征了人類NKG2D (hNKG2D)的不同配體，包括主要組織相容性復(fù)合體 I類相關(guān)鏈A和B多肽（MICA和MICB)、UL16結(jié)合蛋白（ULBP)家族以及視黃酸早期轉(zhuǎn)錄 物I(RAETl)家族。MICA經(jīng)常與由微生物感染誘導(dǎo)的上皮腫瘤相關(guān)，并且異常表達(dá)于某些 自身免疫性疾病損害中。MICA的結(jié)構(gòu)類似于MHC I類的蛋白質(zhì)折疊，具有一個(gè)a Ia 2平 臺(tái)結(jié)構(gòu)域和一個(gè)近膜端（membrane-proximal) Ig樣a 3結(jié)構(gòu)域（Li (李）等人2001Nat. Immunol.(自然免疫學(xué)）2:443)。MICA及其近親MICB(還作為NKG2D的配體）兩者都 是多態(tài)的并且已經(jīng)顯示這種多態(tài)性影響對(duì)NKG2D的親和力（Steinle (施泰因勒）等人 2001Immunogenetics (免疫遺傳學(xué)）53:279)。
[0009] 在缺乏MHC I類鏈（MIC)基因的小鼠中，結(jié)構(gòu)上與ULBP相關(guān)的蛋白質(zhì)家族視黃酸 早期（RAE-I)分子作為NKG2D的配體起作用。已經(jīng)顯示RAE-I表達(dá)是由致癌物誘導(dǎo)的并且 刺激T細(xì)胞的抗腫瘤活性。然而，鼠類NKG2D識(shí)別人類MICA多肽（Wiemann (威曼尼）（2005) J. Immunol.(免疫學(xué)雜志）175:820-829)。
[0010] MICA在癌癥生物學(xué)中的作用由于以下事實(shí)復(fù)雜化，MICA作為可溶態(tài)從腫瘤 細(xì)胞的細(xì)胞表面（例如， #〇19等位基因）并且在外來(lái)體的表面0)8等位基因）上被釋 放（Ashiru(阿斯苑）等人（2010)Cancer Res?(癌癥研究）70(2) :481-489))。可溶性 MICA(sMICA)可以例如在罹患胃腸道惡性腫瘤的患者的血清中以高水平檢測(cè)到（Salih(薩 利赫）等人，2002J. Immunol.(免疫學(xué)雜志）169:4098)。已經(jīng)報(bào)道 MMPs ADAMlO 和 ADAM17 連同二硫化物異構(gòu)酶Erp5在MICA的裂解和脫落方面具有作用（Waldhauer (瓦爾德豪 爾）（2008) Cancer Research (癌癥研究）68 (15) 6368-76 ;Kaiser (凱澤）等人（2007) Nature (自然）；已經(jīng) Salih (薩利赫）（2002) J. Immunol (免疫學(xué)雜志）169:4098-4102)。已 經(jīng)報(bào)道膜結(jié)合MICA下調(diào)NKG2D在NK和/或T細(xì)胞上的表達(dá)（Von Lilienfeld-Toal (馮利 林菲爾德-托爾）等人（2010)Cancer Immunol. Immunother.(癌癥免疫學(xué)，免疫療法））。 值得注意地，Wiemann(威曼尼）（2005)(同上）檢查了 MICA Tg小鼠并且總結(jié)到表面NKG2D 在非轉(zhuǎn)基因脾細(xì)胞上的下調(diào)在與來(lái)自MICA轉(zhuǎn)基因小鼠的脾細(xì)胞體外共培養(yǎng)后是最明顯 的，并且在用來(lái)自H2Kb-MICA小鼠的血清處理后僅是少量的，然而分別用對(duì)照細(xì)胞和來(lái)自 nontgLM的血清溫育沒(méi)有影響并且總結(jié)到整體數(shù)據(jù)說(shuō)明在H2-K-MICA NK細(xì)胞上的減少的 表面NKG2D導(dǎo)致NKG2D功能異常并且總結(jié)到NKG2D下調(diào)主要由向細(xì)胞結(jié)合MICA的持續(xù)體 內(nèi)暴露導(dǎo)致。
[0011] 報(bào)道還透露NK細(xì)胞上的NKG2D被sMICA下調(diào)（Groh (格羅）等人（2002) Nature (自 然）；Arreygue_Garcia(阿萊伊格-加西亞）（2008)BMC;Jinushi (基納施）等人（2005) J. Hepatol.(肝病學(xué)雜志）），導(dǎo)致更小反應(yīng)性的NK細(xì)胞。因?yàn)橐呀?jīng)在其他蛋白質(zhì)家族（如 Ig樣和TNF超家族）中觀察到類似的系統(tǒng)，所以可以出現(xiàn)這一基本原理，其他蛋白質(zhì)家族已 經(jīng)顯示作為可溶態(tài)而被釋放并且這些分子的釋放通過(guò)減少配體密度影響細(xì)胞間相互作用 并且調(diào)節(jié)攜帶各自的受體的NK細(xì)胞（Salih (薩利赫）2002)。因此，用于產(chǎn)生抗MICA抗體 的嘗試已經(jīng)聚焦于抑制MICA脫落的抗體的研發(fā)。
[0012] 還已經(jīng)報(bào)道NKG2D配體MICA和MICB在健康細(xì)胞上的表達(dá)可以打破免疫激活與耐 受之間的平衡，并且觸發(fā)自身免疫。遺傳連鎖研究已經(jīng)顯示一些MICA等位基因與1型糖尿 病呈正相關(guān)，并且疾病在其胰島細(xì)胞上表達(dá)Rael的前糖尿病NOD小鼠中的發(fā)展可以通過(guò)用 NKG2D阻斷mAb進(jìn)行治療而被完全阻止，這些NKG2D阻斷mAb減少自身反應(yīng)性⑶8+T細(xì)胞的 膨脹和功能。MICA和MICB分子在RA滑膜細(xì)胞中還被顯著上調(diào)并且以一種NKG2D依賴性方 式激活T細(xì)胞。此外，已經(jīng)報(bào)道類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者在血清和發(fā)炎的關(guān)節(jié)中具有高水平的 IL-15和TNF-a，這誘導(dǎo)NKG2D在T細(xì)胞的⑶4+⑶28-亞群上的表達(dá)。在乳糜瀉中，已經(jīng)報(bào) 道上皮內(nèi)NKG2D+⑶8+cd T淋巴細(xì)胞大量浸潤(rùn)在腸中，并且MIC蛋白在罹患活動(dòng)性疾病的患 者中的上皮細(xì)胞的表面上變得強(qiáng)烈表達(dá)。在炎性腸障礙中，可以在腸道上皮細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)增 加水平的MIC表達(dá)，并且發(fā)現(xiàn)表達(dá)NKG2D的腸道上皮⑶4+T細(xì)胞的數(shù)目與腸道炎癥相關(guān)聯(lián)。
[0013] 迄今，基于NKG2D系統(tǒng)的用于治療炎癥的途徑已經(jīng)聚焦于NKG2D自身而非其 配體的阻斷（Ogasawara (小笠原）等人（2004) Immunity (免疫力）20 (6) : 757-767 ; Andersson (安德森）等人（2011) Arthritis. Rheum?(關(guān)節(jié)炎與風(fēng)濕?。?3(9) :2617-2629 ; Steigerwald (斯泰格沃德）等人（2009)MAbs 1 (2) : 115-127)。這一焦點(diǎn)在 NKG2D 而非其 配體上的一種可能性歸因于靶向NKG2D配體系統(tǒng)的感知到的難度，該配體系統(tǒng)包括多種配 體并且在一些情況下包括大量的等位基因。
[0014] 對(duì)于MICA和MICB而言，存在超過(guò)50個(gè)MICA等位基因以及至少13個(gè)識(shí)別的MICB 等位基因。跨越a I a 2結(jié)構(gòu)域（該結(jié)構(gòu)域被包含在NKG2D界面中）中的MIC多肽僅存在 43%氨基酸同一性，并且80%的氨基酸取代是非保守的（Steinle(施泰因勒）等人（2001) Immunogenetics (免疫遺傳學(xué)）53:279-287 ;Steinle (施泰因勒）等人（1998) Proc. Natl. Acad. Sci? U. S. A?(美國(guó)科學(xué)院院刊）95:12510-12515)，說(shuō)明獲得對(duì)一個(gè)群體中的大部分 個(gè)體而言有效的抗體將是不太可能的。另外，MICA中的位置129處的甲硫氨酸/纈氨酸雙 同態(tài)決定了 NKG2D結(jié)合方面的差異，并且盡管殘基129的側(cè)鏈被部分掩埋并且與谷氨酰胺 136、丙氨酸139以及甲硫氨酸140在第一 a 2螺旋延伸（helical stretch)中形成疏水相 互作用，但是與MICA的纈氨酸129形式相比，它可能與這一結(jié)構(gòu)域中的構(gòu)象方面的差異相 關(guān)（Steinle (施泰因勒）等人（2001) Immunogenetics (免疫遺傳學(xué)）53:279-287)。
[0015] 總之，對(duì)用治療劑靶向MICA的新途徑存在需要。
[0016] 發(fā)明概述
[0017] 在一個(gè)方面中，本發(fā)明尤其源自跨越人類MICA等位基因（以及在非人靈長(zhǎng)類MICA 上）發(fā)現(xiàn)具有高親和力的抗體。
[0018] 這些抗體值得注意地結(jié)合來(lái)自兩個(gè)主要MICA類群中每一個(gè)的一個(gè)或多個(gè)MICA等 位基因，這兩個(gè)主要MICA類群被確定代表MICA的主要家族：強(qiáng)烈結(jié)合NKG2D的類群1等 位基因（包括MICA #001、#002、#007、#012、#017以及 #018)和微弱結(jié)合NKG2D的類群2等位 基因（MICA*004、*006、*008、*009 以及 *019)。通過(guò)與存在于亞群 MICA*001、*004、*007 以及 #008或#001、#004、#007、 #008以及#019上的表位結(jié)合，這些抗體覆蓋存在于幾乎全部個(gè)體 中的兩個(gè)類群的等位基因。任選地，這些抗體對(duì)于與在其表面表達(dá) #〇〇1的細(xì)胞、與在其表 面表達(dá)#004的細(xì)胞、與在其表面表達(dá)#007的細(xì)胞以及與在其表面表達(dá) #008的細(xì)胞的結(jié)合 而言具有至多5 y g/ml，任選地至多3 y g/ml、至多2 y g/ml、至多I y g/ml或至多0. 5 y g/ ml 的 EC50。
[0019] 對(duì)于有效介導(dǎo)CDC和ADCC的抗體而言，高親和力結(jié)合是尤其有利的。本發(fā)明提供 了位于a 1和/或a 2結(jié)構(gòu)域內(nèi)的MICA上的表位，這些結(jié)構(gòu)域?qū)τ谡T導(dǎo)高ADCC和/或⑶C 活性而言是最佳抗體結(jié)合區(qū)，然而仍跨越主要MICA等位基因發(fā)現(xiàn)了這些表位。這些表位通 常在a 1和/或a 2結(jié)構(gòu)域的側(cè)面上并且整個(gè)在NKG2D結(jié)合表面外面或部分與NKG2D結(jié)合 表面重疊。另外，鑒定a 3表位展示出增強(qiáng)的ADCC/⑶C和多等位基因結(jié)合特征。
[0020] 還鑒定抗體的亞組阻斷MICA與NKG2D的相互作用。除了當(dāng)包括被Fe Y受體結(jié)合 的Fc結(jié)構(gòu)域誘導(dǎo)ADCC和CDC活性或當(dāng)包括基本不被Fe Y受體結(jié)合的Fc結(jié)構(gòu)域阻斷前炎 性活性之外，這些抗體由于其能夠阻斷sMICA誘導(dǎo)的NKG2D的下調(diào)的能力是有用的。
[0021] 還鑒定抗體的其他亞組不阻斷細(xì)胞（例如腫瘤細(xì)胞、轉(zhuǎn)染子）的表面上的MICA在 NKG2D表達(dá)免疫細(xì)胞中誘導(dǎo)NKG2D活性的能力，該免疫細(xì)胞在抗MICA抗體的存在下與所述 MICA表達(dá)細(xì)胞進(jìn)行接觸。除了誘導(dǎo)ADCC和⑶C活性以外，這些抗體由于其避免抑制NKG2D， 這樣使得NKG2D表達(dá)免疫效應(yīng)細(xì)胞仍能夠經(jīng)由NKG2D溶解靶細(xì)胞的能力是有用的（例如， 除了任何Fe Y受體介導(dǎo)的機(jī)制以外）。
[0022] 重組體和細(xì)胞表面結(jié)合MICA似乎能夠具有不同構(gòu)象并且結(jié)合細(xì)胞結(jié)合MICA 對(duì)MICA蛋白可以具有遠(yuǎn)程效應(yīng)。特別出人意料地，當(dāng)使用重組蛋白時(shí)，細(xì)胞（例如腫瘤 細(xì)胞、轉(zhuǎn)染子）的表面上的MICA通過(guò)NKG2D誘導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力的阻斷不經(jīng)常與阻斷 MICA-NKG2D相互作用的能力相關(guān)聯(lián)（Biacore studie)。還特別出人意料地，雖然發(fā)現(xiàn)全等 位基因抗體未完全位于a Ia 2結(jié)構(gòu)域的平臺(tái)（plateau)上的NKG2D結(jié)合區(qū)域內(nèi)，但是MICA 通過(guò)NKG2D阻斷細(xì)胞（例如腫瘤細(xì)胞、轉(zhuǎn)染子）的表面上的MICA誘導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力不與 結(jié)合表位的位置相關(guān)聯(lián)。一些遠(yuǎn)離NKG2D交互區(qū)的抗體能夠阻斷NKG2D活性的誘導(dǎo)，而一 些靠近NKG2D結(jié)合區(qū)或與其部分重疊的抗體不阻斷NKG2D活性的誘導(dǎo)。抗體此外在隨其表 位而變的介導(dǎo)CDC的能力方面存在不同。
[0023] MICA的類群1等位基因通常在殘基129處具有M，而類群2等位基因在殘基129 處具有V。在一個(gè)實(shí)施方式中，MICA類群的特征在于該MICA多肽的位置129處的甲硫氨酸 (M)或纈氨酸（V)殘基的存在，其中M與強(qiáng)烈結(jié)合NKG2D的MICA形式相關(guān)并且V與較低的 結(jié)合NKG2D相關(guān)。
[0024] 在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了以下抗體，這些抗體與在位置129處具有甲硫 氨酸的MICA等位基因和在位置129處具有纈氨酸的MICA等位基因交叉反應(yīng)。在一個(gè)方 面中，本發(fā)明提供了一種單克隆抗體，該單克隆抗體與在位置129處具有甲硫氨酸的人類 MICA多肽和在位置129處具有纈氨酸的人類MICA多肽特異性結(jié)合。任選地，這些抗體對(duì)于 與在其表面表達(dá)在位置129處具有甲硫氨酸的人類MICA多肽的細(xì)胞以及與在其表面表達(dá) 在位置129處具有纈氨酸的人類MICA多肽的細(xì)胞的結(jié)合而言具有至多5 ii g/ml，任選地至 多 3 y g/ml、至多 2 y g/ml、至多 I y g/ml 或至多 0? 5 y g/ml 的 EC50。
[0025] 在一個(gè)實(shí)施方式中，該抗體進(jìn)一步與在位置152處具有纈氨酸的MICB多肽結(jié)合 (例如，與SEQ ID NO:6的MICB多肽結(jié)合）。
[0026] 發(fā)現(xiàn)的這些結(jié)合區(qū)仍存在于糖基化的MICA上，值得注意地是由人類腫瘤細(xì)胞優(yōu) 先表達(dá)的具有糖基化作用的MICA。
[0027] 在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明尤其源自在阻斷MICA與NKG2D的相互作用的同時(shí)在體 外和體內(nèi)有效誘導(dǎo)MICA表達(dá)腫瘤細(xì)胞的效應(yīng)細(xì)胞（例如NK細(xì)胞和/或T細(xì)胞）溶解的抗 體的發(fā)現(xiàn)。阻斷NKG2D-MICA相互作用的抗體是有利的，因?yàn)榇祟惪贵w可以阻止sMICA誘導(dǎo) 的NKG2D的下調(diào)，如在此所示。此類阻斷抗體對(duì)于具有高水平的可溶性MICA(例如在循環(huán) 中）的患者的治療而言可以是特別有用的。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了以下抗體， 這些抗體在體外和體內(nèi)有效誘導(dǎo)MICA表達(dá)腫瘤細(xì)胞的效應(yīng)細(xì)胞（例如NK細(xì)胞和/或T細(xì) 胞）溶解并且抑制sMICA誘導(dǎo)的NKG2D在免疫效應(yīng)細(xì)胞的表面上的表達(dá)的下調(diào)而不實(shí)質(zhì)阻 斷MICA自MICA表達(dá)細(xì)胞（例如腫瘤細(xì)胞）脫落。此類抗體可以通過(guò)抑制MICA與NKG2D的 相互作用來(lái)抑制sMICA誘導(dǎo)的NKG2D表達(dá)的下調(diào)。任選地，該抗體包括9C10、19E9、12A10、 18E8、14B4或10F3的輕鏈和重鏈⑶R，任選地在⑶R中具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾。
[0028] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了以下抗體，這些抗體在體外和體內(nèi)有效誘導(dǎo) MICA表達(dá)腫瘤細(xì)胞的效應(yīng)細(xì)胞（例如NK細(xì)胞和/或T細(xì)胞）溶解而不實(shí)質(zhì)阻斷MICA自 MICA表達(dá)細(xì)胞（例如腫瘤細(xì)胞）脫落并且不實(shí)質(zhì)阻斷MICA與NKG2D的相互作用。任選地， 該抗體包括6E4、20C6、16A8、15F9、10A7或14B4的輕鏈和重鏈CDR，任選地在CDR中具有一 個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾。
[0029] 在一個(gè)實(shí)施方式中，提供了與a I a 2結(jié)構(gòu)域（該結(jié)構(gòu)域被包含在NKG2D界面中） 結(jié)合的抗體，這些抗體與多個(gè)MICA等位基因（例如在位置129處具有甲硫氨酸的MICA等 位基因和在位置129處具有纈氨酸的MICA等位基因；MICAsnOOI、#004、#007以及#008等位 基因）交叉反應(yīng)并且以高親和力與此類MICA等位基因結(jié)合（例如對(duì)于與在其表面表達(dá)人 類MICA多肽的所述等位基因的細(xì)胞的結(jié)合而言至多5 ii g/ml，任選地至多3 ii g/ml、至多 2 ii g/ml、至多I ii g/ml或至多0. 5 ii g/ml的EC50)。任選地，這些抗體結(jié)合至以下區(qū)域，這 些區(qū)域在a I a 2結(jié)構(gòu)域上，位于或部分位于NKG2D界面的外面，但是未完全在NKG2D界面 內(nèi)。
[0030] 可以根據(jù)在此的實(shí)施例3的方法，使用例如流式細(xì)胞術(shù)評(píng)價(jià)與MICA等位基因的結(jié) 合以及相關(guān)的EC50值。
[0031] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明源自以下抗體的發(fā)現(xiàn)，這些抗體結(jié)合MICA的a 1和/ 或a 2結(jié)構(gòu)域而不實(shí)質(zhì)阻斷MICA與NKG2D的相互作用（例如其中MICA和NKG2D被各自表 達(dá)在細(xì)胞的表面）。任選地此類抗體的特征可以在于不與hNKG2D競(jìng)爭(zhēng)與MICA的結(jié)合。任 選地，這些抗體不抑制MICA在NKG2D表達(dá)細(xì)胞中誘導(dǎo)NKG2D活性的能力。任選地此類抗體 的特征可以在于不降低或阻斷NKG2D表達(dá)效應(yīng)細(xì)胞（例如CD16負(fù)效應(yīng)細(xì)胞）溶解MICA表 達(dá)靶細(xì)胞的能力。這些抗體將任選地不實(shí)質(zhì)阻斷MICA自腫瘤細(xì)胞脫落。
[0032] 在一個(gè)實(shí)施方式中，非阻斷a Ia 2結(jié)構(gòu)域抗體結(jié)合在SEQ ID NO: 1的MICA多肽上 的表位，該表位包括一個(gè)或兩個(gè)選自由K81和D82組成的組的殘基，一個(gè)或兩個(gè)選自由Q83 和K84組成的組的殘基，一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)選自由H109、Ylll和Ll 16 (任選地殘基Dl 13)組 成的組的殘基，一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)選自由Q131、S132和Q136組成的組的殘基，一個(gè)、兩個(gè)或 三個(gè)選自由S133、R134和T137組成的組的殘基，和/或1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)或4個(gè)選自由M140、 N141、R143和N144組成的組的殘基（例如抗體20C6和10A7)。
[0033] 在一個(gè)實(shí)施方式中，非阻斷a I a 2結(jié)構(gòu)域抗體結(jié)合這樣的表位，該表位包括一個(gè) 或兩個(gè)選自由R6和N8組成的組的殘基，一個(gè)或兩個(gè)選自由E97和H99組成的組的殘基，一 個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)選自由E100、D101和N102組成的組的殘基，一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)選自由S103、 T104和R105 (任選地殘基E115)組成的組的殘基，和/或一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)選自由L178、 R179和R180組成的組的殘基（例如抗體15F9)。
[0034] 在一個(gè)實(shí)施方式中，非阻斷a I a 2結(jié)構(gòu)域抗體結(jié)合這樣的表位，該表位包括一個(gè) 或兩個(gè)選自由SEQ ID NO: 1的MICA多肽的Q48和W49組成的組的殘基和/或1個(gè)、2個(gè)、3 個(gè)或4個(gè)選自由SEQ ID NO: 1的MICA多肽的E51、D52、V53和L54組成的組的殘基（例如 抗體6E4)。
[0035] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明尤其源自以下抗體的發(fā)現(xiàn)，這些抗體結(jié)合MICA的 a 3結(jié)構(gòu)域，其中這些抗體不抑制MICA與NKG2D的相互作用（例如其中MICA和NKG2D被各 自表達(dá)在細(xì)胞的表面）。任選地，這些抗體不實(shí)質(zhì)阻斷MICA自腫瘤細(xì)胞脫落。任選地，這樣 的抗體的特征可以在于不與hNKG2D競(jìng)爭(zhēng)與MICA的結(jié)合。
[0036] 在一個(gè)實(shí)施方式中，非阻斷a 3結(jié)構(gòu)域抗體結(jié)合這樣的表位，該表位包括一個(gè)、兩 個(gè)或三個(gè)選自由S224、H225和D226組成的組的殘基，一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)選自由T227、Q228 和Q229組成的組的殘基，和/或一個(gè)或兩個(gè)選自由W230和D232組成的組的殘基（例如抗 體 16A8)。
[0037] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明源自以下抗體的發(fā)現(xiàn)，這些抗體結(jié)合MICA的a 1和 /或a 2結(jié)構(gòu)域并且抑制MICA與NKG2D的相互作用（例如其中MICA和NKG2D被各自表達(dá) 在細(xì)胞的表面）。任選地這樣的抗體的特征可以在于不與hNKG2D競(jìng)爭(zhēng)與MICA的結(jié)合。這 些抗體將任選地抑制sMICA誘導(dǎo)的NKG2D在免疫效應(yīng)細(xì)胞的表面上的表達(dá)的下調(diào)而不實(shí)質(zhì) 阻斷MICA自腫瘤細(xì)胞脫落。
[0038] 在一個(gè)實(shí)施方式中，阻斷a I a 2結(jié)構(gòu)域抗體結(jié)合這樣的表位，該表位包括一個(gè)、 兩個(gè)或三個(gè)選自由E100、D101和N102組成的組的殘基，一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)選自由S103、T104 和R105組成的組的殘基，一個(gè)或兩個(gè)選自由N121和E123組成的組的殘基，和/或一個(gè)或 兩個(gè)選自由T124和E126組成的組的殘基（例如抗體19E9、18E8以及10F3)。
[0039] 在一個(gè)實(shí)施方式中，阻斷a I a 2抗體結(jié)合這樣的表位，該表位包括1個(gè)、2個(gè)或3 個(gè)選自由SEQ ID NO: 1的MICA多肽的N56、K57和T58組成的組的殘基，和/或一個(gè)或兩個(gè) 選自由SEQ ID N0:1的MICA多肽的R61和R64組成的組的殘基（例如抗體9C10和12A10)。
[0040] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明尤其源自以下抗體的發(fā)現(xiàn)，這些抗體結(jié)合MICA的 a 3結(jié)構(gòu)域，其中這些抗體抑制MICA與NKG2D的相互作用（例如其中MICA和NKG2D被各自 表達(dá)在細(xì)胞的表面）。任選地，這些抗體不實(shí)質(zhì)阻斷MICA自腫瘤細(xì)胞脫落。任選地，這樣的 抗體可以任選地被表征為與hNKG2D競(jìng)爭(zhēng)與MICA的結(jié)合。這些抗體將任選地抑制sMICA誘 導(dǎo)的NKG2D在免疫效應(yīng)細(xì)胞的表面上的表達(dá)的下調(diào)。這些抗體可以實(shí)質(zhì)阻斷MICA自腫瘤 細(xì)胞脫落或可以任選地阻斷MICA自腫瘤細(xì)胞脫落。
[0041] 在一個(gè)實(shí)施方式中，阻斷a 3結(jié)構(gòu)域抗體結(jié)合這樣的表位，該表位包括一個(gè)、兩個(gè) 或三個(gè)選自由T227、Q228和Q229組成的組的殘基（抗體14B4)。
[0042] 不希望被理論束縛，相信盡管科學(xué)文獻(xiàn)假定在MICA(例如，sMICA或膜結(jié)合MICA) 和NKG2D下調(diào)與效應(yīng)細(xì)胞的損傷之間存在因果關(guān)系，但是腫瘤情形（tumor settings)中 的MICA自身不總是導(dǎo)致效應(yīng)細(xì)胞的實(shí)質(zhì)損傷。具體而言，雖然sMICA可以導(dǎo)致NKG2D的下 調(diào)，但是在許多情況下出現(xiàn)在體內(nèi)的sMICA的濃度太低以至于自身不能導(dǎo)致顯著的NKG2D 下調(diào)（參見(jiàn)實(shí)施例9)。此外，在腫瘤情形中（例如確立的疾病或晚期疾病），患者經(jīng)由多種 非MICA組分（例如TGF-P)通常處于免疫抑制狀態(tài)，這些組分在其他效應(yīng)之間具有導(dǎo)致 NKG2D的下調(diào)的潛力。因此，阻斷或不阻斷NKG2D-MICA相互作用并且不抑制MICA脫落的 試劑在癌癥的治療方面是有效的，只要它們能夠誘導(dǎo)CDC和/或ADCC。不阻斷NKG2D-MICA 相互作用的抗體是有利的，因?yàn)镸ICA表達(dá)腫瘤細(xì)胞具有保留可被存在的免疫活性效應(yīng)細(xì) 胞上的NKG2D識(shí)別的潛力（例如由于在治療過(guò)程中或隨后重建免疫活性，對(duì)于具有較長(zhǎng)持 續(xù)時(shí)間、重復(fù)給予或以高劑量給予的治療而言）。阻斷NKG2D-MICA相互作用的抗體是有利 的，因?yàn)榇祟惪贵w可以阻止MICA誘導(dǎo)的NKG2D的下調(diào)（參見(jiàn)實(shí)施例9)。此類阻斷抗體對(duì)于 具有高水平的可溶性MICA(例如在循環(huán)中）的患者的治療而言可以是特別有用的。
[0043] 在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了 MICA結(jié)合化合物，優(yōu)選與MICA多肽特異性結(jié)合 的抗體（抗MICA抗體），而不可檢測(cè)地減少M(fèi)ICA與NKG2D之間的結(jié)合（例如，腫瘤細(xì)胞上 的表面MICA與效應(yīng)細(xì)胞上的表面NKG2D的相互作用），例如，而不實(shí)質(zhì)阻斷MICA與NKG2D 的相互作用。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了 MICA結(jié)合化合物（例如MICA結(jié)合多肽）， 該化合物與MICA多肽結(jié)合而不實(shí)質(zhì)阻斷MICA自腫瘤細(xì)胞脫落。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā) 明提供了 MICA結(jié)合化合物，該化合物與MICA多肽結(jié)合而不實(shí)質(zhì)阻斷MICA與NKG2D的相互 作用并且不實(shí)質(zhì)阻斷MICA自腫瘤細(xì)胞脫落。
[0044] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了以下抗體，這些抗體結(jié)合人類MICA(特別是 在a 1和/或a 2結(jié)構(gòu)域中）、識(shí)別主要的MICA等位基因MICA*001、MICA*004、MICA*008并 且任選地進(jìn)一步識(shí)別MICA #007和/或MICAsnO 19。在一個(gè)實(shí)施方式中，這些抗體任選地進(jìn)一 步識(shí)別非人靈長(zhǎng)類物種（例如食蟹猴）的MICA。在一個(gè)實(shí)施方式中，這些抗體任選地進(jìn)一 步識(shí)別以下MICB多肽，該多肽包括SEQ ID NO 6的氨基酸序列。任選地，在另一個(gè)實(shí)施方 式中，這些抗體不進(jìn)一步識(shí)別MICB。任選地，這些抗體不實(shí)質(zhì)阻斷MICA自腫瘤細(xì)胞脫落。 任選地，這些抗體不實(shí)質(zhì)阻斷MICA與NKG2D的相互作用。
[0045] 在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種抗體，該抗體與由人類腫瘤細(xì)胞表達(dá)的糖 基化MICA多肽特異性結(jié)合。
[0046] 在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種抗體，該抗體與由非人靈長(zhǎng)類細(xì)胞表達(dá)的 MICA多肽特異性結(jié)合。
[0047] 在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種抗體，該抗體與MICA多肽特異性結(jié)合（抗 MICA抗體），其中該抗體結(jié)合SEQ ID NO 2的多肽（MICA*004)和/或SEQ ID NO 4的多肽 (MICA*008)。在一個(gè)實(shí)施方式中，該抗體進(jìn)一步結(jié)合SEQ ID NOl的多肽（MICA*001)。在一 個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種抗體，該抗體與MICA多肽特異性結(jié)合，其中該抗體結(jié)合 SEQ ID NO 5的多肽（MICA*019)。在一個(gè)實(shí)施方式中，該抗體進(jìn)一步結(jié)合SEQ ID NO 3的 多肽（MICA#007)。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種抗體，該抗體與MICA多肽特異性 結(jié)合，其中該抗體結(jié)合SEQ ID NO 2的多肽（MICA*004)、SEQ ID NO 4的多肽（MICA*008)以 及SEQ ID NO 5的多肽（MICA*019)。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種抗體，該抗體與 MICA多肽特異性結(jié)合，其中該抗體結(jié)合SEQ ID NO 1的多肽（MICA*001)、SEQ ID NO 2的多 肽（MICA*004)、SEQ ID NO 4 的多肽（MICA*008)以及 SEQ ID NO 5 的多肽（MICA*019)，任選 地進(jìn)一步其中該抗體結(jié)合SEQ ID NO 3的多肽（MICA*007)。通過(guò)與跨越MICA等位基因的 類群1和類群2兩者的等位基因MICA#001、- #004和#008結(jié)合（并且有利地進(jìn)一步#007和 #〇19)，幾乎整個(gè)人類群體都將適于用本發(fā)明的這樣的抗MICA劑的治療。在任一實(shí)施方式 中，SEQ ID NO 1-5的多肽可以包括0-聚糖（連接至絲氨酸或蘇氨酸的N-乙酰乳糖胺）。 在任一實(shí)施方式中，SEQ ID NO 1-5的多肽可以包括核心20-聚糖（包括連接至N-乙酰半 乳糖胺的N-乙酰葡糖胺分支的0-聚糖）和/或N聯(lián)聚糖。在一個(gè)實(shí)施方式中，該抗體與 MICA多肽結(jié)合而不實(shí)質(zhì)阻斷MICA與NKG2D的相互作用和/或不實(shí)質(zhì)阻斷MICA自腫瘤細(xì) 胞脫落。在一個(gè)實(shí)施方式中，該抗體結(jié)合MICA的a 1和/或a 2結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方式 中，該抗體結(jié)合MICA的a 3結(jié)構(gòu)域。
[0048] 優(yōu)選地，該化合物是一種抗體，任選地包括兩條Ig重鏈和兩條Ig輕鏈的四聚體抗 體。優(yōu)選地，針對(duì)人類MICA多肽，該抗體具有小于10_ 9M，優(yōu)選小于KTwM或優(yōu)選小于KT11M 的結(jié)合親和力（Kd)，任選地其中結(jié)合親和力是二價(jià)的。優(yōu)選地，該抗體是一種消耗性抗體， 任選地其中該抗體針對(duì)MICA表達(dá)腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)ADCC和/或⑶C。
[0049] 在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明提供了一種抗體，該抗體通過(guò)NK或T細(xì)胞介導(dǎo) MICA表達(dá)腫瘤細(xì)胞的消耗（例如在體外或在體內(nèi)）而不實(shí)質(zhì)抑制NKG2D介導(dǎo)的hNKG2D表 達(dá)NK或T細(xì)胞的細(xì)胞毒性。
[0050] 在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明的抗體不與hNKG2D競(jìng)爭(zhēng)與MICA的結(jié)合。
[0051] 在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，當(dāng)本發(fā)明的抗體結(jié)合至MICA表達(dá)細(xì)胞上的MICA時(shí)，該 MICA表達(dá)細(xì)胞經(jīng)由例如刺激hNKG2D的下調(diào)和/或內(nèi)化而在結(jié)合后不實(shí)質(zhì)減少細(xì)胞表面 hNKG2D的量，具有高親和力和緩慢的解離率，與食蟹猴和/或恒河猴MICA交叉反應(yīng)，并且具 有消耗性同種型（如例如人類IgGl)。
[0052] 在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了特異性結(jié)合MICA的抗體，其中該抗體具有以下特性 中的一個(gè)或多個(gè)（包括其任何組合，或全部特性）：
[0053] (a)針對(duì)與MICA多肽的結(jié)合而言，具有小于KT8M,優(yōu)選小于KT9M,或優(yōu)選小于 KTiciM的Kd ;
[0054] (b)與對(duì)應(yīng)于以下結(jié)構(gòu)域的殘基的區(qū)段中的至少一個(gè)殘基結(jié)合，該結(jié)構(gòu)域選自下 組，該組由以下各項(xiàng)組成：SEQ ID NO: 1的MICA多肽的1-88、89-181和182-274和/或與 如在此所描述的表位（MICA上的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基）結(jié)合；
[0055] (c)與MICA*001、*004、*007、*008以及*019多肽中的兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或五個(gè)結(jié)合， 分別包括SEQ ID NO: 1-5的序列；
[0056] (d)不實(shí)質(zhì)阻斷MICA自腫瘤細(xì)胞脫落；
[0057] (e)不實(shí)質(zhì)阻斷MICA與NKG2D的相互作用（例如，腫瘤細(xì)胞上的表面MICA與效應(yīng) 細(xì)胞上的表面NKG2D的相互作用）；
[0058] (f)不導(dǎo)致由效應(yīng)細(xì)胞（例如，NKG2D+⑶16-NK細(xì)胞）溶解的MICA表達(dá)細(xì)胞的實(shí) 質(zhì)降低；
[0059] (g)針對(duì)在其表面表達(dá)MICA的細(xì)胞，誘導(dǎo)補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性（CDC)和/或抗體 依賴性細(xì)胞毒性（ADCC);以及
[0060] (h)與抗體 6E4、20C6、16A8、15F9 以及 10A7 競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合 MICA 多肽。
[0061] 在本文實(shí)施方式的任一個(gè)中，本發(fā)明抗體的特征可以在于以上（a)-(h)中的任何 一個(gè)或多個(gè)特征。
[0062] 在一個(gè)實(shí)施方式中，提供了一種測(cè)試抗MICA抗體的方法，所述方法包括：（i)評(píng)價(jià) 該抗體是否阻斷MICA自MICA表達(dá)細(xì)胞脫落和/或（ii)評(píng)價(jià)該抗體是否阻斷MICA與NKG2D 的相互作用。步驟（i)可以任選地包括使結(jié)合MICA多肽的該抗體與表達(dá)MICA多肽的細(xì)胞 接觸。步驟（ii)可以任選地包括使結(jié)合MICA多肽的該抗體與MICA多肽（例如分離的多 肽或表達(dá)于細(xì)胞的表面上的多肽）在NKG2D多肽（例如分離的多肽或表達(dá)于細(xì)胞的表面上 的多肽）的存在下接觸。
[0063] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，提供了一種產(chǎn)生抗體的方法，該抗體結(jié)合哺乳動(dòng)物對(duì)象體 內(nèi)的MICA多肽，任選地用于癌癥的治療，所述方法包括以下步驟：a)提供多個(gè)抗體，任選地 用包括MICA多肽的免疫原免疫非人哺乳動(dòng)物；并且b)進(jìn)行一個(gè)選擇步驟以從該多個(gè)抗體 中選擇抗體，該步驟包括：
[0064] (i)測(cè)試抗體是否與人類MICA多肽結(jié)合，任選地SEQ ID NO 1-5的多肽中的一個(gè)、 兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或所有，并且如果該抗體與這一種或多種人類MICA多肽結(jié)合，則選擇該抗 體；和/或
[0065] (ii)測(cè)試抗體是否阻斷MICA自MICA表達(dá)細(xì)胞脫落，并且如果該抗體不阻斷脫落， 則選擇該抗體；和/或
[0066] (iii)測(cè)試抗體是否阻斷MICA (例如表面MICA)與NKG2D的相互作用，優(yōu)選地測(cè)試 其中該抗體是否導(dǎo)致由效應(yīng)細(xì)胞（例如，NKG2D+CD16-NK細(xì)胞）溶解的MICA表達(dá)細(xì)胞的實(shí) 質(zhì)降低，并且如果該抗體不阻斷MICA (例如表面MICA)與NKG2D的相互作用，優(yōu)選地其中該 抗體不導(dǎo)致MICA表達(dá)細(xì)胞的溶解的實(shí)質(zhì)降低，則選擇該抗體。
[0067] 在一個(gè)方面中，本發(fā)明尤其源自阻斷性抗MICA抗體的發(fā)現(xiàn)，這些抗體跨越來(lái)自兩 個(gè)主要類群的MICA等位基因的主要人類MICA非人靈長(zhǎng)類（以及在非人靈長(zhǎng)類MICA和MICB 上）具有高親和力。在一個(gè)實(shí)施方式中，MICA類群的特征在于該MICA多肽的位置129處 的甲硫氨酸（M)或纈氨酸（V)殘基的存在，其中M與強(qiáng)烈結(jié)合NKG2D的MICA形式相關(guān)并且 V與較低的結(jié)合NKG2D相關(guān)。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了以下阻斷抗體，這些阻斷抗 體與在位置129處具有甲硫氨酸的MICA等位基因和在位置129處具有纈氨酸的MICA等位 基因交叉反應(yīng)。在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了一種單克隆抗體，該單克隆抗體與在位置129 處具有甲硫氨酸的人類MICA多肽和在位置129處具有纈氨酸的人類MICA多肽特異性結(jié) 合，其中所述抗體抑制MICA介導(dǎo)的hNKG2D活性。在一個(gè)實(shí)施方式中，該抗體進(jìn)一步與在位 置152處具有纈氨酸的MICB多肽結(jié)合（例如，與SEQ ID NO: 1的MICB多肽結(jié)合）。優(yōu)選 地，所述抗體抑制MICB介導(dǎo)的hNKG2D活性。報(bào)道在位置152處具有纈氨酸的MICB多肽顯 示出與可溶性NKG2D的強(qiáng)烈結(jié)合。結(jié)合在位置152處具有纈氨酸的MICB多肽以及在位置 129處具有甲硫氨酸的MICA多肽的抗體在以下個(gè)體中可以是有利的，這些個(gè)體具有較大的 敏感性或由與NKG2D強(qiáng)烈結(jié)合的等位基因引起的嚴(yán)重疾病。
[0068] 本發(fā)明的阻斷性抗MICA抗體還與來(lái)自兩個(gè)主要MICA類群中的每一個(gè)的一個(gè)或多 個(gè)高普遍性等位基因交叉反應(yīng)（結(jié)合），這兩個(gè)主要MICA類群被確定代表MICA的主要家 族：強(qiáng)烈結(jié)合NKG2D的類群1等位基因（包括MICA*001、*002、*007、*012、*017以及*018)和 微弱結(jié)合NKG2D的類群2等位基因（MICA*004、*006、*008、*009以及*019)。通過(guò)與存在于 亞群MICAsnOOI、#004、#007、#008以及 #019上的表位結(jié)合，這些抗體覆蓋存在于幾乎全部個(gè)體 中的兩個(gè)類群的等位基因。MICA的類群1等位基因通常在殘基129處具有M，而類群2等 位基因在殘基129處具有V。
[0069] 在另一個(gè)方面中，本發(fā)明尤其源自以下發(fā)現(xiàn)，跨越MICA(以及在非人靈長(zhǎng)類MICA 和MICB上）針對(duì)某些表位的抗體在NKG2D阻斷方面比其他抗MICA抗體或抗NKG2D抗體顯 著更有效，并且還比由其結(jié)合MICA的能力預(yù)期的更有效地阻斷NKG2D介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。具 體而言，具有皮摩爾范圍內(nèi)的親和力的抗MICA抗體在抑制方面比具有2-log較少親和力 (Kd)的抗MICA抗體好4-log。
[0070] 本發(fā)明的阻斷性MICA抗體可以由阻止與NKG2D的任何競(jìng)爭(zhēng)、被其置換、或其殘留 結(jié)合的能力表征。其他高親和力NKG2D或MICA抗體可以通過(guò)其配體（例如分別為MICA/ ULPBs/RAETl或NKG2D)留下一些開(kāi)放的置換。而且，如由NKG2D-MICA相互作用的晶體結(jié) 構(gòu)所觀察到的，NKG2D作為同源二聚體起作用并且具有兩個(gè)對(duì)稱表面（每條NKG2D鏈上一 個(gè)），這些表面與MICAa I a 2平臺(tái)結(jié)構(gòu)域的頂部相互作用。這兩條NKG2D鏈通過(guò)結(jié)合至不 對(duì)稱MICA平臺(tái)結(jié)構(gòu)域的明顯不同的表面都有助于該相互作用（參見(jiàn)例如，Li(李）等人 (2001)Nature Immunol.(自然免疫學(xué)）2(5):443-450)。本發(fā)明的這些抗體因此可以任選 地完全阻斷MICA-NKG2D相互作用，例如通過(guò)阻斷（例如干擾、競(jìng)爭(zhēng)）NKG2D同源二聚體中的 兩個(gè)NKG2D單體與MICA多肽的結(jié)合。其他MICA抗體（或NKG2D抗體）可以僅完全阻斷兩 個(gè)NKG2D結(jié)合位點(diǎn)中的一個(gè)。
[0071] 除了當(dāng)被用作消耗性抗體（例如IgGl或IgG3同種型）其用于消耗MICA表達(dá)細(xì) 胞的用途以外，用本發(fā)明的阻斷性抗MICA抗體進(jìn)行治療為靶向相信由MICA和/或B介導(dǎo) 的NKG2D的激活驅(qū)動(dòng)的炎性病癥中的MICA(和MICB)提供了一種手段，而不減少引起不想 要的更寬的免疫系統(tǒng)抑制，通過(guò)減少可供與其他配體（例如ULBP)的結(jié)合使用的NKG2D受 體的數(shù)目以及隨后的激活。此類完全阻斷性抗MICA抗體的可能性還打開(kāi)了向炎癥位點(diǎn)局 部遞送抗MICA抗體的可能性（例如，遞送進(jìn)關(guān)節(jié)炎患者的炎癥的關(guān)節(jié)或其他位點(diǎn)），而不導(dǎo) 致由NKG2D抗體的給予引起的泛發(fā)性免疫抑制效應(yīng)。
[0072] 在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了以下抗體，這些抗體在體外和體內(nèi)抑制MICA表 達(dá)細(xì)胞的效應(yīng)細(xì)胞（例如NK細(xì)胞和/或T細(xì)胞）溶解方面是有效的并且實(shí)質(zhì)阻斷MICA與 NKG2D的相互作用。
[0073] 在一個(gè)實(shí)施方式中，特別是當(dāng)用于治療炎性障礙或自身免疫性障礙時(shí)，本發(fā)明的 抗體是一種非消耗性抗體，該非消耗性抗體實(shí)質(zhì)減少或抑制NKG2D激活、NKG2D信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、 NKG2D表達(dá)NK或T細(xì)胞的激活、或效應(yīng)細(xì)胞（例如，NKG2D+⑶16-NK細(xì)胞）對(duì)MICA表達(dá)細(xì) 胞的溶解。
[0074] 在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種MICA結(jié)合化合物，優(yōu)選與MICA多肽特異性 結(jié)合并且減少（例如基本消除）MICA與hNKG2D之間的結(jié)合（例如，細(xì)胞上的表面MICA與 效應(yīng)細(xì)胞的表面NKG2D的相互作用）的抗體（抗MICA抗體）。
[0075] 在一個(gè)實(shí)施方式中，抗MICA抗體或結(jié)合化合物進(jìn)一步與MICB多肽特異性結(jié)合并 且減少（例如基本消除）MICB與hNKG2D之間的結(jié)合。
[0076] 在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種抗體，該抗體與hNKG2D競(jìng)爭(zhēng)與MICA(以及 任選地MICB)結(jié)合并且阻止hNKG2D與MICA (以及任選地MICB)結(jié)合。
[0077] 在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種抗體，該抗體抑制或阻斷MICA(以及任選 地MICB)多肽與hNKG2D同源二聚體的兩條hNKG2D鏈的相互作用。任選地，該抗體阻斷 MICA多肽（以及任選地MICB多肽）的a 1結(jié)構(gòu)域和MICA多肽（以及任選地MICB多肽） 的a 1結(jié)構(gòu)域兩者與hNKG2D同源二聚體的相互作用（例如，該抗體抑制MICA a I a 2平臺(tái) 與hNKG2D同源二聚體的兩條hNKG2D鏈的相互作用）。
[0078] 在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體不實(shí)質(zhì)與HCMV、UL18、ULBP 1、ULBP2、ULBP 3、 ULBP 4、ULBP 5或ULBP 6多肽結(jié)合（參見(jiàn)Champsaur (沙姆普斯勞）等人（2010) Immunol. Rev.(免疫學(xué)評(píng)論）235:267-285)。
[0079] 在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種抗體，該抗體與在位置129處具有甲硫氨 酸的人類MICA多肽（例如天然存在的MICA等位基因）和在位置129處具有纈氨酸的人類 MICA多肽（例如天然存在的MICA等位基因）上的共同決定子特異性結(jié)合，任選地進(jìn)一步與 在位置152處具有纈氨酸的人類MICB多肽（例如天然存在的MICB等位基因）上的共同決 定子特異性結(jié)合，其中該抗體減少（例如基本消除）MICA與NKG2D之間（以及任選地MICB 與NKG2D之間）的結(jié)合。
[0080] 在另外的實(shí)施方式中，本發(fā)明尤其源自以下抗體的發(fā)現(xiàn)，這些抗體結(jié)合人類MICA， 優(yōu)選在a la2平臺(tái)結(jié)構(gòu)域（即a 1和/或ci2結(jié)構(gòu)域）中，并且識(shí)別主要的MICA等位基 因MICA*001、MICA*004、MICA*008并且任選地進(jìn)一步識(shí)別MICA*007和/或MICA*019,并且任 選地進(jìn)一步識(shí)別非人靈長(zhǎng)類物種（例如食蟹猴）的MICA，并且任選地進(jìn)一步識(shí)別MICB。在 一個(gè)實(shí)施方式中，這些抗體進(jìn)一步識(shí)別以下MICB多肽，該多肽包括SEQ ID NO 6的氨基酸 序列。任選地，這些抗體此外不實(shí)質(zhì)抑制MICA自腫瘤細(xì)胞脫落。
[0081] 在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種抗體，該抗體與MICA多肽特異性結(jié)合（抗 MICA抗體），其中該抗體減少（例如基本消除）MICA與NKG2D之間的結(jié)合并且該抗體結(jié)合 SEQ ID NO 2的多肽（MICA*004)和/或SEQ ID NO 4的多肽(MICA*008)。在一個(gè)實(shí)施方式中， 該抗體進(jìn)一步結(jié)合SEQ ID NO: 1的多肽（MICAsnOOI)。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一 種抗體，該抗體與MICA多肽特異性結(jié)合，其中該抗體結(jié)合SEQ ID NO: 5的多肽（MICA#019)。 在一個(gè)實(shí)施方式中，該抗體進(jìn)一步結(jié)合SSEQ ID N0:3的多肽（MICA#007)。在一個(gè)實(shí)施方式 中，本發(fā)明提供了一種抗體，該抗體與MICA多肽特異性結(jié)合，其中該抗體結(jié)合SEQ ID NO: 2 的多肽（11〇六*004)、5￡〇10勵(lì):4的多肽（]\0〇六*008)以及5￡〇10勵(lì):5的多肽（]\0〇六*019)。 在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種抗體，該抗體與MICA多肽特異性結(jié)合，其中該抗體 結(jié)合 SEQ ID N0:1 的多肽（MICA*001)、SEQ ID N0:2 的多肽（MICA*004)、SEQ ID N0:4 的 多肽（MICA*008)以及SEQ ID N0:5的多肽（MICA*019)，任選地進(jìn)一步其中該抗體結(jié)合SEQ ID NO: 3的多肽（MICA*007)。通過(guò)與跨越MICA等位基因的類群1和類群2兩者的等位基 因MICA#001、- #004和#008結(jié)合（并且有利地進(jìn)一步#007和#019)，幾乎整個(gè)人類群體都將 適于用本發(fā)明的這樣的抗MICA劑的治療。在一個(gè)實(shí)施方式中，該抗體結(jié)合MICA的a 1和 /或a 2結(jié)構(gòu)域。
[0082] 優(yōu)選地，該化合物是一種抗體，任選地包括兩條Ig重鏈和兩條Ig輕鏈的四聚體抗 體。
[0083] 優(yōu)選地，針對(duì)人類MICA和/或MICB多肽（例如在此述及的MICA和/或MICB等 位基因中的任何一個(gè)或多個(gè)或所有），該抗體具有小于KT 9M,優(yōu)選小于KTwM,優(yōu)選小于 KT11M,優(yōu)選小于KT12M,或優(yōu)選小于KT 13M的結(jié)合親和力（Kd)，任選地其中結(jié)合親和力是單 價(jià)的或二價(jià)的。優(yōu)選地，該抗體是包括兩條Ig重鏈和兩條Ig輕鏈的四聚體抗體并且K d是 二價(jià)的。任選地，對(duì)于與表達(dá)具體的MICA和/或MICB多肽（例如在此述及的MICA和/或 MICB等位基因中的任何一個(gè)或多個(gè)或所有）的細(xì)胞的結(jié)合而言,該抗體具有至多IOii g/ ml、5ii g/ml或Iii g/ml的EC50。適合的細(xì)胞的實(shí)例是ClR-MICA細(xì)胞。
[0084] 在一個(gè)實(shí)施方式中，特別是當(dāng)該抗體被用于治療或預(yù)防炎性疾病或自身免疫性疾 病時(shí)，該化合物是非消耗性抗體（不消耗結(jié)合至其上的細(xì)胞的抗體）。優(yōu)選地，該抗體是嵌 合抗體、人源化抗體或人類抗體。優(yōu)選地，該抗體不包括能夠被Fcy3A受體（CD16)結(jié)合的 恒定區(qū)，例如人類IgG4亞型的抗體或缺少Fc結(jié)構(gòu)域的抗體片段。優(yōu)選地，該抗體包括人類 IgG4同種型的重鏈恒定區(qū)。
[0085] 在一個(gè)實(shí)施方式中，該抗體與由非人靈長(zhǎng)類細(xì)胞表達(dá)的MICA多肽特異性結(jié)合。在 一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明的抗體對(duì)于結(jié)合人類MICA而言具有高親和力和緩慢的解離 率，并且與食蟹猴（cynomolgus，Macaca fascicularis)和/或恒河猴（稱猴）MICA交叉反 應(yīng)。
[0086] 在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了特異性結(jié)合MICA的抗體，其中該抗體具有以下特性 中的一個(gè)或多個(gè)（包括其任何組合，或全部特性）：
[0087] (a)對(duì)于與MICA多肽的結(jié)合而言，具有小于KT9M,優(yōu)選小于KTkiM,優(yōu)選小于 KT11M,優(yōu)選小于10_12M，或優(yōu)選小于KT13M的K D，優(yōu)選地其中針對(duì)每個(gè)MICA多肽等位基因 MICA#001、#004和#008,優(yōu)選地進(jìn)一步針對(duì)#007和/或 #019,該抗體具有所述Kd的親和力； [0088] (b)與對(duì)應(yīng)于以下結(jié)構(gòu)域的殘基的區(qū)段中的至少一個(gè)殘基結(jié)合，該結(jié)構(gòu)域選自下 組，該組由以下各項(xiàng)組成：SEQ ID NO: 1的MICA多肽的1-88或89-181，和/或與如在此所 描述的表位（MICA上的殘基）結(jié)合；
[0089] (c)與在位置129處具有甲硫氨酸的人類MICA多肽（例如天然存在的MICA等位 基因）和在位置129處具有纈氨酸的人類MICA多肽（例如天然存在的MICA等位基因）結(jié) 合，其中該抗體減少（例如基本消除）MICA與NKG2D之間的結(jié)合；和/或與在位置152處具 有纈氨酸的人類MICB多肽（例如天然存在的MICA等位基因）結(jié)合；
[0090] (d)與MICA*001、*004、*007、*008以及*019多肽中的兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或五個(gè)結(jié)合， 分別包括SEQ ID NO: 1-5的序列；
[0091] (e)不實(shí)質(zhì)阻斷MICA自腫瘤細(xì)胞脫落；
[0092] (f)抑制和/或?qū)嵸|(zhì)阻斷MICA與NKG2D的相互作用（例如，腫瘤細(xì)胞上的表面 MICA與效應(yīng)細(xì)胞上的表面NKG2D的相互作用），任選地其中這些抗體阻斷MICA與NKG2D同 源二聚體內(nèi)的兩條NKG2D鏈的相互作用；
[0093] (g)能夠減少或抑制MICA介導(dǎo)的NKG2D激活、NKG2D信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、NKG2D表達(dá)NK或 T細(xì)胞的激活、或效應(yīng)細(xì)胞（例如，NKG2D+⑶16-NK細(xì)胞）對(duì)MICA表達(dá)細(xì)胞的溶解；
[0094] (h)針對(duì)在其表面表達(dá)MICA的細(xì)胞，實(shí)質(zhì)誘導(dǎo)或不實(shí)質(zhì)誘導(dǎo)（例如，取決于該mAb 是否被CD16發(fā)現(xiàn)，取決于該抗體的Fc區(qū)的性質(zhì)）補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性（CDC)和/或抗體 依賴性細(xì)胞毒性（ADCC);
[0095] (i)能夠減少或抑制sMICA介導(dǎo)的NKG2D在NKG2D表達(dá)細(xì)胞（例如T細(xì)胞或NK細(xì) 胞）的表面上的表達(dá)的下調(diào)；
[0096] 以及
[0097] (j)與抗體 9C10、19E9、12A10、18E8 或 10F3 競(jìng)爭(zhēng)與 MICA 多肽的結(jié)合。
[0098] 在本文實(shí)施方式的任一個(gè)中，本發(fā)明抗體的特征可以在于以上（a)-(j)中的任何 一個(gè)或多個(gè)特征。
[0099] 在一個(gè)實(shí)施方式中，提供了一種測(cè)試抗MICA抗體的方法，所述方法包括：（i)評(píng)價(jià) 該抗體是否以商未和力與在殘基129處具有甲硫氣酸的MICA多膚和在殘基129處具有繳 氨酸的MICA多肽兩者（以及任選地進(jìn)一步，在殘基152處具有甲硫氨酸的MICB多肽）結(jié) 合，并且（ii)評(píng)價(jià)該抗體是否阻斷MICA (以及任選地MICB)與NKG2D的相互作用。在一個(gè) 實(shí)施方式中，提供了一種測(cè)試抗MICA抗體的方法，所述方法包括：⑴評(píng)價(jià)該抗體是否以高 親和力與MICA*001、*004、*007、*008以及*019多肽中的兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或五個(gè)結(jié)合，這些多 肽分別包括SEQ ID NO: 1-5的序列并且（ii)評(píng)價(jià)該抗體是否阻斷MICA與NKG2D的相互作 用。步驟（i)可以任選地包括使結(jié)合MICA多肽的該抗體與表達(dá)MICA多肽的細(xì)胞接觸。步 驟（ii)可以任選地包括使結(jié)合MICA多肽的該抗體與MICA多肽（例如分離的多肽或表達(dá) 于細(xì)胞的表面上的多肽）在NKG2D多肽（例如分離的多肽或表達(dá)于細(xì)胞的表面上的多肽） 的存在下接觸。在步驟（i)中結(jié)合所述MICA多肽并且在步驟（ii)中阻斷MICA與NKG2D 的相互作用的抗體可以被鑒定和/或選擇為用于炎性障礙或自身免疫性障礙的候選治療。
[0100] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，提供了一種產(chǎn)生抗體的方法，該抗體結(jié)合哺乳動(dòng)物對(duì)象體 內(nèi)的MICA多肽，任選地用于癌癥的治療，所述方法包括以下步驟：a)提供多個(gè)抗體，任選地 用包括MICA多肽的免疫原免疫非人哺乳動(dòng)物或產(chǎn)生抗體的噬菌體展示文庫(kù)；并且b)進(jìn)行 一個(gè)選擇步驟以從所述多個(gè)抗體中選擇抗體，該步驟包括：
[0101] ⑴測(cè)試抗體是否以高親和力與人類MICA多肽，任選地MICA*001、*004、*007、*008 以及*019等位基因中的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或所有，例如分別包括SEQ ID NO: 1-5的序列的多 肽結(jié)合，并且如果抗體以高親和力與所述MICA多肽結(jié)合，則選擇該抗體；和/或
[0102] (ii)測(cè)試抗體是否阻斷MICA(例如，表面MICA，MICA*001、*004、*007、*008 #&*019 等位基因中的任何一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或所有）與hNKG2D的相互作用，和/或是否減少或抑制 NKG2D激活、NKG2D信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、NKG2D表達(dá)NK或T細(xì)胞的激活、或效應(yīng)細(xì)胞（例如，NKG2D+T 細(xì)胞、NKG2D+CD16+NK細(xì)胞、NKG2D+CD16-NK細(xì)胞）對(duì)MICA表達(dá)細(xì)胞的溶解，并且如果抗體 阻斷MICA與hNKG2D的相互作用，則選擇該抗體；和/或。
[0103] (iii)當(dāng)NKG2D表達(dá)細(xì)胞與可溶性MICA多肽在抗體的存在下進(jìn)行接觸時(shí)，測(cè)試該 抗體是否減少或抑制所述NKG2D表達(dá)細(xì)胞中的NKG2D下調(diào)（降低細(xì)胞表面表達(dá)），并且如果 抗體減少或抑制NKG2D下調(diào)，則選擇該抗體。
[0104] 該方法可以任選地包括選擇步驟（iv)，其包括測(cè)試抗體是否阻斷MICA自MICA表 達(dá)細(xì)胞脫落，并且如果該抗體不阻斷脫落，則選擇該抗體。
[0105] 在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體結(jié)合表位，該表位包括選自以下組的人類MICA 多肽的1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)或更多個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：R6、N8、 Q48、W49、E51、D52、V53、L54、N56、K57、T58、R61、R64、K81、D82、Q83、K84、E97、H99、E100、 D101、N102、S103、T104、R105、H109、Y111、D113、E115、L116、N121、E123、T124、E126、Q131、 S132、S133、R134、Q136、T137、M140、N141、R143、N144、L178、R179、R180、S224、H225、D226、 T227、Q228、Q229、W230 以及 D232(參照 SEQ ID NO 1-5 中的任一個(gè)的 MICA)。
[0106]在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了 MICA結(jié)合化合物（優(yōu)選抗MICA抗體），該化合 物至少部分地、或任選地完全地結(jié)合在MICA多肽的a 1和/或a 2結(jié)構(gòu)域內(nèi)。a 1和a 2 結(jié)構(gòu)域分別位于氨基酸殘基1至88 (任選地1-85)和89至181 (任選地86-181)內(nèi)，參照 SEQ ID NO 1的MICA多肽。任選地，在本文實(shí)施方式的任一個(gè)中，該抗體與在MICA多肽的 a 1結(jié)構(gòu)域內(nèi)的氨基酸殘基（SEQ ID NO 1的殘基氨基酸殘基1至88 (任選地1-85))結(jié)合。 任選地，在本文實(shí)施方式的任一個(gè)中，該抗體與在MICA多肽的a 2結(jié)構(gòu)域內(nèi)的氨基酸殘基 (SEQ ID NO 1的殘基氨基酸殘基89至181 (任選地86-181))結(jié)合。任選地，在本文實(shí)施方 式的任一個(gè)中，該抗體與MICA多肽的a 1和a 2結(jié)構(gòu)域內(nèi)的氨基酸殘基結(jié)合。
[0107] 在一個(gè)實(shí)施方式中，抗體結(jié)合表位，該表位包括一個(gè)或兩個(gè)選自由Q48和W49組成 的組的殘基，和/或1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)或4個(gè)選自由E51、D52、V53和L54組成的組的殘基（抗 體 6E4)。
[0108] 在一個(gè)實(shí)施方式中，抗體結(jié)合表位，該表位包括1個(gè)、2個(gè)或3個(gè)選自由N56、K57和 T58組成的組的殘基，和/或一個(gè)或兩個(gè)選自由R61和R64組成的組的殘基（抗體9C10和 12A10)。
[0109] 在一個(gè)實(shí)施方式中，抗體結(jié)合表位，該表位包括一個(gè)或兩個(gè)選自由K81和D82組成 的組的殘基，一個(gè)或兩個(gè)選自由Q83和K84組成的組的殘基，一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)選自由H109、 Ylll和L116 (任選地殘基D113)組成的組的殘基，一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)選自由S133、R134和 T137組成的組的殘基，和/或1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)或4個(gè)選自由M140、N141、R143和N144組成 的組的殘基（抗體20C6)。
[0110] 在一個(gè)實(shí)施方式中，抗體結(jié)合表位，該表位包括一個(gè)或兩個(gè)選自由K81和D82組成 的組的殘基，一個(gè)或兩個(gè)選自由Q83和K84組成的組的殘基，一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)選自由H109、 Ylll和L116(任選地殘基D113)組成的組的殘基，一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)選自由Q131、S132和 Q136組成的組的殘基，和/或1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)或4個(gè)選自由M140、N141、R143和N144組成 的組的殘基（抗體10A7)。
[0111] 在一個(gè)實(shí)施方式中，抗體結(jié)合表位，該表位包括一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)選自由E100、 DlOl和N102組成的組的殘基，一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)選自由S103、T104和R105組成的組的殘 基，一個(gè)或兩個(gè)選自由N121和E123組成的組的殘基，和/或一個(gè)或兩個(gè)選自由T124和E126 組成的組的殘基（抗體19E9和18E8)。
[0112] 在一個(gè)實(shí)施方式中，這些抗體結(jié)合表位，該表位包括一個(gè)或兩個(gè)選自由R6和N8 組成的組的殘基，一個(gè)或兩個(gè)選自由E97和H99組成的組的殘基，一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)選自由 E100、DlOl和N102組成的組的殘基，一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)選自由S103、T104和R105 (任選地 殘基E115)組成的組的殘基，和/或一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)選自由L178、R179和R180組成的組 的殘基（抗體15F9)。
[0113] 在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了 MICA結(jié)合化合物（優(yōu)選抗MICA抗體），該化合 物至少部分地結(jié)合在MICA多肽的a 3結(jié)構(gòu)域內(nèi)。a 3結(jié)構(gòu)域分別位于氨基酸殘基182至 274內(nèi)，參照SEQ ID NO 1的MICA多肽。在一個(gè)實(shí)施方式中，抗體結(jié)合表位，該表位包括一 個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)選自由T227、Q228和Q229組成的組的殘基（抗體14B4和16A8)。在一個(gè) 實(shí)施方式中，抗體結(jié)合表位，該表位包括一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)選自由S224、H225和D226組成的 組的殘基，一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)選自由T227、Q228和Q229組成的組的殘基，和/或一個(gè)或兩個(gè) 選自由W230和D232組成的組的殘基（抗體16A8)。
[0114] 任選地，與SEQIDNO: 1的野生型MICA多肽的結(jié)合相比，該抗體與在a1和/或 a2結(jié)構(gòu)域內(nèi)的上述殘基中的任一個(gè)處具有突變的MICA多肽的結(jié)合被實(shí)質(zhì)減少。
[0115] 本發(fā)明提供抗MICA抗體的使用對(duì)于例如人類對(duì)象的癌癥、炎性障礙以及自身免 疫性障礙的治療而言可以是有用的。
[0116] 在一個(gè)方面中，不抑制NKG2D與MICA之間的相互作用的抗體、或抑制NKG2D與 MICA之間的相互作用的抗體將是消耗性抗體。此類抗體在癌癥的治療方面是特別有用的， 但是也可以用于炎癥和自身免疫性障礙。抗體可以在或不在偶聯(lián)至毒劑或其他試劑的情況 下使用，取決于這些抗體的所希望的效果或用途。在一個(gè)實(shí)施方式中，該抗MICA抗體是"裸 抗體"并且未被偶聯(lián)至毒劑，任選地該裸抗體包括被修飾以增加與Fe Y受體（例如CD16) 的結(jié)合的Fc區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方式中，裸抗體或偶聯(lián)抗體包括重鏈，該重鏈包括結(jié)合Fcy受 體（例如⑶16)的人類Fc區(qū)（例如IgGl)。任選地，針對(duì)在其表面表達(dá)MICA的細(xì)胞，這樣 的抗體誘導(dǎo)補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性（CDC)和/或抗體依賴性細(xì)胞毒性（ADCC)。
[0117] 任選地，在任一實(shí)施方式中，該抗體（例如IgGU抗體片段等）進(jìn)一步包括對(duì)細(xì)胞 有毒的毒劑（例如化療劑）。
[0118] 在一個(gè)方面中，抑制MICA誘導(dǎo)的NKG2D在效應(yīng)細(xì)胞中的活性的抗體將是非消耗性 抗體（不消耗結(jié)合至其上的細(xì)胞的抗體）。在一個(gè)方面中，該抗體是嵌合抗體、人源化抗體 或人類抗體。在一個(gè)方面中，該抗體不包括能夠被Fcy3A受體（CD16)結(jié)合的恒定區(qū)，例如 人類IgG4亞型的抗體或缺少Fc結(jié)構(gòu)域的抗體片段。在一個(gè)實(shí)施方式中，該抗體包括IgG4 重鏈，根據(jù)EU索引（EU-index)，該重鏈在殘基228中包含絲氨酸至脯氨酸突變。優(yōu)選地，該 抗體包括人類IgG4同種型的重鏈恒定區(qū)。此類抗體在炎癥和自身免疫性障礙的治療方面 是特別有用的。
[0119] 本披露進(jìn)一步提供了特異性結(jié)合人類MICA的抗體、抗體片段以及衍生物。本發(fā)明 提供了此類抗體組合物，同樣提供了它們?cè)诒景l(fā)明的這些方法的任一個(gè)中治療、預(yù)防以及 診斷癌癥、炎性障礙以及自身免疫性障礙的用途。
[0120] 在一個(gè)實(shí)施方式中，針對(duì)人類MICA多肽（例如，SEQ ID NO 1-5的MICA*001、*004、 *007、*008以及*019等位基因中的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或所有的多肽，優(yōu)選地針對(duì)MICA*001、 #004以及#008中的每一個(gè)）而言，這些抗體具有小于10_8M，優(yōu)選小于10_ 9M，或優(yōu)選小于 KT10M的結(jié)合親和力（Kd)。
[0121] 在本發(fā)明的實(shí)施方式的任一個(gè)的一個(gè)方面中，該抗體可以具有重鏈和/或輕鏈， 該重鏈和/或輕鏈具有一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)選自下組的抗體的對(duì)應(yīng)的重鏈和/或輕鏈的 CDR,該組由以下各項(xiàng)組成：6E4、20C6、16A8、9C10、19E9、12A10、10A7、18E8、10F3、15F9 以及 14B4。
[0122] 在本發(fā)明的實(shí)施方式的任一個(gè)的一個(gè)方面中，該抗體與以下單克隆抗體中的任 一個(gè)或任何組合競(jìng)爭(zhēng)與MICA多肽的結(jié)合，這些單克隆抗體是6E4、20C6、16A8、9C10、19E9、 12A10、10A7、18E8、10F3、15F9以及14B4。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體與選自下組的 抗體競(jìng)爭(zhēng)與MICA多肽的結(jié)合，該組由以下各項(xiàng)組成：
[0123] (a)分別具有SEQ ID NO: 7和8的VH和VL區(qū)的抗體（6E4);
[0124] (b)分別具有SEQ ID NO: 20和21的VH和VL區(qū)的抗體（20C6);
[0125] (c)分別具有SEQ ID NO: 33和34的VH和VL區(qū)的抗體（16A8);
[0126] (d)分別具有SEQ ID NO:46和47的VH和VL區(qū)的抗體（19E9);
[0127] (e)分別具有SEQ ID NO: 57和58的VH和VL區(qū)的抗體（9C10);
[0128] (f)分別具有SEQ ID NO:68和69的VH和VL區(qū)的抗體（12A10);
[0129] (g)分別具有SEQ ID NO: 79和80的VH和VL區(qū)的抗體（10A7);
[0130] (h)分別具有SEQ ID NO:90和91的VH和VL區(qū)的抗體（18E8);
[0131] ⑴分別具有SEQ ID NO: 101和102的VH和VL區(qū)的抗體（10F3);
[0132] (j)分別具有SEQ ID NO: 112和113的VH和VL區(qū)的抗體（15F9);以及
[0133] (k)分別具有 SEQ ID NO: 123 和 124 的 VH 和 VL 區(qū)的抗體（14B4)。
[0134] 在一個(gè)實(shí)施方式中，該抗體是適合人類的。在一個(gè)實(shí)施方式中，該抗體是嵌合的， 例如包含非鼠類（優(yōu)選人類）恒定區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方式中，該抗體是人類的或人源化的。 在本發(fā)明的實(shí)施方式的任一個(gè)的一個(gè)方面中，該抗體的同種型是人類IgG，任選人類IgGU 1 862、1863或1864。在一個(gè)實(shí)施方式中，該抗體包括人類？(3結(jié)構(gòu)域或具有被？(：￥1?(例如 Fe YRIIIA)結(jié)合的同種型，例如IgGl或IgG3同種型的抗體。
[0135] 在本發(fā)明的實(shí)施方式的任一個(gè)的一個(gè)方面中，該抗體是選自以下各項(xiàng)的抗體片 段：Fab、Fab' 4&13'-3114(&13'）2、？1雙抗體、單鏈抗體片段、或包括多個(gè)不同抗體片段的多 特異性抗體。任選地，本發(fā)明的抗體此外是四聚體的（兩條重鏈和兩條輕鏈）并且因此是 二價(jià)的（例如IgG抗體）。
[0136] 在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的這些抗體進(jìn)一步包括毒劑。在一個(gè)實(shí)施方式中，這些 抗體包括能夠直接導(dǎo)致表達(dá)MICA的細(xì)胞死亡的毒劑。在一個(gè)實(shí)施方式中，例如在體外測(cè)定 中，這些抗體能夠直接誘導(dǎo)（例如不存在免疫效應(yīng)細(xì)胞時(shí)）至少20%、30%、40%或50% MICA表達(dá)細(xì)胞的細(xì)胞死亡。
[0137] 在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了使用本發(fā)明的抗MICA抗體進(jìn)行治療的方法。這些抗 體可以被用作預(yù)防性或治療性治療；在本文實(shí)施方式的任一個(gè)中，治療有效量的該抗體可 以與預(yù)防有效量的抗體交換。在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了一種治療罹患癌癥、自身免疫 性障礙或炎性障礙的患者的方法，該方法包括向該患者給予藥學(xué)有效量的根據(jù)本發(fā)明的與 MICA多肽特異性結(jié)合的抗原結(jié)合化合物。
[0138] 本發(fā)明的治療方法以及根據(jù)本發(fā)明的抗MICA抗體可以被用于與第二治療劑組合 治療個(gè)體，該第二治療劑包括當(dāng)用于治療癌癥時(shí)的抗癌劑（例如化療藥物、腫瘤疫苗、與腫 瘤細(xì)胞上的腫瘤特異性抗原結(jié)合的抗體、針對(duì)腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)ADCC的抗體、增強(qiáng)免疫應(yīng)答的 抗體等），或用于治療自身免疫或炎癥的試劑。在一個(gè)實(shí)施方式中，該第二治療劑是結(jié)合并 激活活化受體或結(jié)合并阻斷效應(yīng)細(xì)胞（例如NK細(xì)胞、T細(xì)胞）上的抑制性受體的試劑（例 如抗體）。在一個(gè)實(shí)施方式中，該第二治療劑是上調(diào)NKG2D配體在腫瘤細(xì)胞上的表達(dá)的試 劑（例如化療劑）。例如，可以使用組蛋白脫乙酰酶抑制劑。例如，丙戊酸鈉和肼酞嗪增加 MICA/B表達(dá)并且降低脫落。（Chavez-Bianco (查韋斯-布蘭科）2011Int J Oncol(國(guó)際腫 瘤學(xué)雜志）39 (6) : 1491-1499)。
[0139] 循環(huán)中增加水平的sMIC的存在與預(yù)后不良和/或MIC表達(dá)腫瘤相關(guān)。本發(fā)明進(jìn) 一步涉及用于選擇罹患對(duì)使用本發(fā)明的抗MICA劑（例如與MICA多肽結(jié)合的抗體）的治療 應(yīng)答的癌癥的對(duì)象的方法，該方法包括確定所述對(duì)象體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞是否放出（shed)MICA 多肽（例如，如通過(guò)循環(huán)中的sMIC的水平所評(píng)價(jià)的），MICA多肽自腫瘤細(xì)胞脫落的存在是 應(yīng)答對(duì)象的指征。
[0140] 本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種用于選擇摧患對(duì)使用本發(fā)明的抗MICA劑（例如與MICA多 肽結(jié)合的抗體）的治療應(yīng)答的障礙（例如，癌癥、自身免疫性障礙、炎性障礙）的對(duì)象的方 法，該方法包括確定所述對(duì)象體內(nèi)的細(xì)胞（例如腫瘤細(xì)胞、前炎性細(xì)胞等）是否表達(dá)MICA 多肽，MICA多肽的表達(dá)是應(yīng)答對(duì)象的指征。在一個(gè)實(shí)施方式中，該方法包括確定所述對(duì)象 體內(nèi)的細(xì)胞（例如腫瘤細(xì)胞、前炎性細(xì)胞等）是否表達(dá)選自由SEQ ID NO 1-5組成的組的 MICA多肽。在一個(gè)實(shí)施方式中，該方法包括確定所述對(duì)象體內(nèi)的細(xì)胞是否表達(dá)選自下組的 MICA多肽，該組由以下各項(xiàng)組成：MICA #001、#004、#007、#008以及#019多肽，這些多肽分別 包括SEQ ID NO: 1-5的序列，其中MICA多肽的表達(dá)是應(yīng)答對(duì)象的指征。在一個(gè)實(shí)施方式 中，確定所述對(duì)象體內(nèi)的細(xì)胞是否表達(dá)MICA多肽的步驟包括使來(lái)自該對(duì)象的生物樣品（例 如，通過(guò)進(jìn)行活檢和/或獲得癌細(xì)胞細(xì)胞、血液或任何組織樣品等）與本發(fā)明的抗MICA抗 體（例如與MICA*001、*004、*007、*008以及*019多肽中的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或所有結(jié) 合的抗體）接觸。在一個(gè)實(shí)施方式中，該方法包括確定所述對(duì)象是否包括脫落的MICA(例 如檢測(cè)循環(huán)中的sMICA或檢測(cè)外來(lái)體（例如，等位基因 #008)的表面上的MICA的存在）。
[0141] 任選地，在這些方法的任一個(gè)中，該方法進(jìn)一步包括向應(yīng)答對(duì)象給予與MICA多肽 結(jié)合的抗體（例如本發(fā)明的抗MICA抗體）。
[0142] 在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，使用MICA特異性配體確定MICA多肽在疾病相關(guān)細(xì)胞中 的表達(dá)。優(yōu)選地，該配體是抗體或其片段或衍生物。
[0143] 在另一個(gè)方面中，本發(fā)明包括一種方法（例如，一種進(jìn)行診斷測(cè)定、應(yīng)答測(cè)定等的 方法），該方法包括評(píng)價(jià)患者是否具有表達(dá)MICA多肽（例如被本發(fā)明的抗體結(jié)合的MICA多 肽（一個(gè)或多個(gè)MICA等位基因））的疾病相關(guān)細(xì)胞（例如，腫瘤細(xì)胞）。所述方法可以包括 例如從包括疾病相關(guān)細(xì)胞的患者獲得生物樣品，使所述疾病相關(guān)細(xì)胞與這樣抗體接觸并且 評(píng)價(jià)該抗體是否與疾病相關(guān)細(xì)胞結(jié)合。疾病相關(guān)細(xì)胞表達(dá)MICA的發(fā)現(xiàn)表明該患者罹患由 MICA表達(dá)細(xì)胞表征和/或適于用本發(fā)明的抗MICA抗體治療的病癥?？梢赃M(jìn)一步用適于由 MICA表達(dá)細(xì)胞表征的具體疾病的療法治療該患者。任選地，用該抗MICA抗體治療該患者。 在一個(gè)實(shí)施方式中，該方法用于選擇罹患癌癥的對(duì)象，并且這些疾病相關(guān)細(xì)胞是癌細(xì)胞。
[0144] 本發(fā)明還提供了一種治療患者的方法，該方法包括：
[0145] a)確定該患者是否具有致病的MICA表達(dá)細(xì)胞，并且
[0146] b)如果確定該患者具有致病的MICA表達(dá)細(xì)胞，則給予本發(fā)明的抗原結(jié)合化合物 (例如，抗體）。
[0147] 本發(fā)明還提供了一種治療患者的方法，該方法包括：
[0148] a)確定該患者體內(nèi)脫落的MICA的水平，并且
[0149] b)如果確定該患者具有升高水平的脫落的MICA，則給予本發(fā)明的抗原結(jié)合化合 物（例如，抗體），該化合物抑制sMICA導(dǎo)致NKG2D在免疫效應(yīng)細(xì)胞上的下調(diào)的能力。
[0150] 可以在別處進(jìn)一步描述本發(fā)明的這些以及另外的有利方面和特征。
[0151] 附圖簡(jiǎn)述
[0152] 圖IA和IB示出了獲得自第一、第二以及第三免疫系列的抗體與MICA表達(dá)CRl轉(zhuǎn) 染子細(xì)胞 C1R-MICA*001、C1R-MICA*004、C1R-MICA*007 以及 C1R-MICA*008 的結(jié)合，如通過(guò)流 式細(xì)胞術(shù)所分析。
[0153] 圖2A-2G示出了 MICA多肽的視圖，包括處于黑暗陰影中的突變的氨基酸殘基，這 些突變的氨基酸殘基導(dǎo)致（以不同組合）抗體結(jié)合的損失。NKG2D結(jié)合位點(diǎn)示于中等陰影 的MICA多肽的頂部（并且還在結(jié)合至MICA的帶狀圖（ribbon diagram)中）。
[0154] 圖3示出了疊合的傳感圖，示出了單獨(dú)在NKG2D-FC芯片上注射MICAWl-BirA或 與同種型對(duì)照或嵌合的抗MICA抗體一起預(yù)溫育。在注射結(jié)束時(shí)，將傳感圖在Y軸歸一化并 且在X軸對(duì)齊。傳感圖代表兩個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。
[0155] 圖4示出了針對(duì)MICA-NKG2A阻斷的功能測(cè)定的結(jié)果，示出了抗MICA抗體減少或 抑制NKG2D+CD16-NK92細(xì)胞介導(dǎo)的MICA*019轉(zhuǎn)染的BaF/3的殺傷的能力，如通過(guò)測(cè)量靶細(xì) 胞釋放的 51Cr所確定。
[0156]圖 5A、5B 和 5C 示出了疊合的傳感圖，示出了在 ULBP-l-Fc(Fcl)、MICB-Fc(Fc2)、 ULBP-2-Fc (Fc3)以及ULBP-3-Fc (Fc4)上注射抗MICA抗體。在注射開(kāi)始時(shí)，將傳感圖在X 軸對(duì)齊。
[0157] 圖6示出了抗MICA抗體與食蟹猴MICA的結(jié)合。
[0158] 圖7示出了在針對(duì)阻斷MICA脫落的能力的測(cè)定中，由抗a 3結(jié)構(gòu)域BAM03而非由 16A8介導(dǎo)的MICA脫落的抑制，如通過(guò)在將MICA表達(dá)細(xì)胞與抗MICA抗體溫育過(guò)夜后測(cè)量上 清液中可溶性MICA濃度所評(píng)價(jià)。
[0159] 圖8顯示NKG2D在增加劑量的重組體二價(jià)MICA#019 #Fc蛋白（R&D系統(tǒng)）的存在下 被下調(diào)了其初始水平的30%至40%，并且顯示在實(shí)施例5B的細(xì)胞毒性測(cè)定（表E)中阻斷 NKG2D-MICA相互作用的抗MICA抗體阻斷表達(dá)于NK細(xì)胞上的NKG2D與MICA*019-Fc的相互 作用，從而逆轉(zhuǎn)由MICA #019-Fc蛋白誘導(dǎo)的NKG2D下調(diào)。
[0160] 圖9示出了指示Raji-MICAWl細(xì)胞在人類補(bǔ)體的存在下的生活力。結(jié)果顯示抗 MICA(同種型匹配的）導(dǎo)致死細(xì)胞數(shù)目增加并且能夠以表位依賴性方式誘導(dǎo)CDC。
[0161] 圖IOA顯示與陰性對(duì)照（人類IgGl同種型對(duì)照抗體）相比，抗MICA各自通過(guò)人 類KHYG-Ih⑶16V NK細(xì)胞系誘導(dǎo)C1R-MICA*008細(xì)胞的特異性溶解，由此顯示這些抗體針對(duì) MICA#008表達(dá)靶細(xì)胞誘導(dǎo)ADCC。圖IOB示出了結(jié)合至細(xì)胞的抗體的水平。
[0162]圖11示出了在小鼠長(zhǎng)期RAJI-MICA#01腫瘤模型中的測(cè)試的結(jié)果。用嵌合的抗 MICA或 IC(300iig IP 2x/周，持續(xù)3 周）或PBS 處理植入 Raji-MICAOl Highl5M IV 的 Nod SCID小鼠的存活。本發(fā)明的抗MICA抗體增加存活。
[0163] 發(fā)明詳述
[0164] 介紹
[0165] 本發(fā)明的抗體能夠直接并特異性靶向MICA表達(dá)細(xì)胞，值得注意地是腫瘤細(xì)胞以 及在炎性或自身免疫過(guò)程中涉及的細(xì)胞。本發(fā)明提供了多種具有這樣的特性的抗體，這些 抗體結(jié)合類群1和類群2等位基因兩者并且此外跨越這些類群內(nèi)的主要人類MICA等位基 因。進(jìn)一步提供了用于具體途徑的不同抗體。一些抗體阻斷MICA-NKG2D相互作用并且阻 止可溶性MICA(sMICA)誘導(dǎo)的NKG2D表面表達(dá)的下調(diào)；這些抗體由此用于重建患者體內(nèi) 的NKG2D表達(dá)。此類抗體還可以由于其阻斷由被淋巴細(xì)胞上的NKG2D結(jié)合MICA而導(dǎo)致的 NKG2D激活的能力而被使用并且在炎癥和自身免疫性障礙的治療方面將是特別有利的。其 他抗體不與NKG2D競(jìng)爭(zhēng)與MICA的結(jié)合并且在其中希望維持NKG2D對(duì)效應(yīng)細(xì)胞的功能的情 況下的癌癥的治療方面將是有利的。任選地，這些抗體將不阻斷MICA自MICA表達(dá)腫瘤細(xì) 胞脫落。任選地，這些抗體結(jié)合MICA的a I a 2結(jié)構(gòu)域（由a 1結(jié)構(gòu)域和a 2結(jié)構(gòu)域形成 的MICA蛋白的部分）。進(jìn)一步提供了跨MICA等位基因存在的a Ia 2結(jié)構(gòu)域和a 3結(jié)構(gòu)域 上的表位并且可以被抗體以高結(jié)合親和力靶向。
[0166] MICA(PERB11. 1)是指MHC I 類多肽相關(guān)序列 A (參見(jiàn)例如，UniProtKB/Swiss-Prot Q29983)，其基因和cDNA及其基因產(chǎn)物，或其天然存在的變體。MICA基因和蛋白的命名 法連同參照不同等位基因的序列的登錄號(hào)描述于Frigoul (弗里洛爾）A.和Lefranc (勒 弗朗），M-P. Recent Res. Devel. Human Genet.(人類遺傳學(xué)的最新研究與進(jìn)展）， 3(2005) :95-145ISBN:81-7736-244-5中，將其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合在此。MICA基因和蛋 白質(zhì)序列（包括在蛋白質(zhì)和DNA水平的多態(tài)性）還可獲得自由巴赫拉姆博士（Dr. Bahram) 的實(shí)驗(yàn)室維護(hù)的 http://mhc_x. u-strasbg. fr/human. htm。
[0167] MICA的氨基酸序列首先被描述于Bahram (巴赫拉姆）等人（1994) Proc. Nat. Acad. Sci.(科學(xué)院院刊）91:6259-6263 和 Bahram(巴赫拉姆）等人（1996) Immunogenetics (免疫遺傳學(xué)）44:80-81中，將其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合在此。MICA基因是 多態(tài)的，在其細(xì)胞外a 1、a 2以及a 3結(jié)構(gòu)域中展示出多種變體氨基酸的不尋常分布。為 了進(jìn)一步定義MICA的多態(tài)性，Petersdorf (彼得斯多夫）等人（1999)在275個(gè)具有常見(jiàn) 和稀有HLA基因型的個(gè)體之間檢查了其等位基因。人類MICA的細(xì)胞外a 1、a 2以及a 3 結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列示于SEQ ID NO 1-5中。完整的MICA序列進(jìn)一步包括具有23個(gè)氨 基酸的前導(dǎo)序列連同跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。所選的人類MICA等位基因的細(xì)胞外a 1、 a 2以及a 3結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列示于SEQ ID NO 1-5中。MICA*001的氨基酸序列示于SEQ ID NO 1中，對(duì)應(yīng)于Genbank登錄號(hào)AAB41060。人類MICA等位基因MICA*004的氨基酸序 列示于SEQ ID N02中，對(duì)應(yīng)于Genbank登錄號(hào)AAB41063。人類MICA等位基因MICA*007的 氨基酸序列示于SEQ ID NO 3中，對(duì)應(yīng)于Genbank登錄號(hào)AAB41066。人類MICA等位基因 MICA*008的氨基酸序列示于SEQ ID NO 4中，對(duì)應(yīng)于Genbank登錄號(hào)AAB41067。人類MICA 等位基因MICA*019的氨基酸序列示于SEQ ID NO 5中，對(duì)應(yīng)于Genbank登錄號(hào)AAD27008。 人類MICB的氨基酸序列示于SEQ ID NO 6中，對(duì)應(yīng)于Genbank登錄號(hào)CAI18747。
[0168] 該MICA基因編碼屬于MhcSF并且屬于IgSF的蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)是跨膜 MHC-I-a -樣（I-a -樣）鏈，該鏈包括三個(gè)細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域-兩個(gè)遠(yuǎn)端G-樣結(jié)構(gòu)域，G-a -樣 (也被稱為"D1"或" a 1"）和G-a 2-樣（也被稱為"D2"或" a 2"），以及臨近細(xì)胞膜的 C-樣-結(jié)構(gòu)域（也被稱為"D3"或" a 3"），以及三個(gè)區(qū)--連接區(qū)、跨膜區(qū)及胞質(zhì)區(qū)（標(biāo) 記是根據(jù)頂GT(國(guó)際免疫遺傳學(xué)信息系統(tǒng)? )的頂GT科學(xué)圖表，http://imgt. org以及 LeFranc (勒弗朗）等人In Silico Biology (電子生物學(xué)），2005;5:45-60)。包括前導(dǎo)區(qū)、 E⑶、TM以及CY結(jié)構(gòu)域的MICA成熟蛋白由360至366個(gè)氨基酸組成，差異是由跨膜區(qū)中的 微衛(wèi)星多態(tài)性引起的。可以根據(jù)任何適合的編號(hào)系統(tǒng)（例如，頂GT編號(hào)系統(tǒng)）定義a 1、 a 2以及a 3。在一個(gè)實(shí)施方式中，a 1結(jié)構(gòu)域包括SEQ ID NO 1的MICA多肽的殘基位置 1至88 ; a 2結(jié)構(gòu)域包括SEQ ID NO 1的MICA多肽的殘基位置89至181 ;并且a 3結(jié)構(gòu)域 包括SEQ ID NO 1的MICA多肽的殘基位置182至274。a 1和a 2結(jié)構(gòu)域各自包括A、B、C 和D鏈、AB、BC和⑶轉(zhuǎn)角以及螺旋。a 3結(jié)構(gòu)域包括A、B、C、D、E、F和G鏈、BC環(huán)、⑶鏈、 DE轉(zhuǎn)角以及FG環(huán)。MICA蛋白的八個(gè)潛在糖基化位點(diǎn)被高度糖基化，兩個(gè)在a 1中，一個(gè) 在a2中并且五個(gè)在a3結(jié)構(gòu)域中，包括0-聚糖（連接至絲氨酸或蘇氨酸的N-乙酰乳糖 胺）和/或N-聚糖。雖然MICA在某些細(xì)胞中組成性地表達(dá)，但是低水平的MICA表達(dá)通 常不引起宿主免疫細(xì)胞貼附。然而，MICA在迅速增殖的細(xì)胞（例如腫瘤細(xì)胞）中被上調(diào)。 MICA是所有NKG2D配體中被最高度表達(dá)的，并且已經(jīng)跨寬范圍的腫瘤類型被發(fā)現(xiàn)（例如 一般癌、膀胱癌、黑色素瘤、肺癌、肝細(xì)胞癌、惡性膠質(zhì)瘤、前列腺癌、一般血液惡性腫瘤、急 性髓系白血病、急性淋巴細(xì)胞白血病、慢性髓系白血病以及慢性淋巴細(xì)胞白血病）。最近， Tsuboi (坪井）等人（2011) (EMBO J: 1-13)報(bào)道0-聚糖分支酶核心2 P -1，6-N-乙酰葡糖 胺轉(zhuǎn)移酶（C2GnT)在MICA表達(dá)腫瘤細(xì)胞中是有活性的并且報(bào)道來(lái)自腫瘤細(xì)胞的MICA包含 核心20-聚糖（包括連接至N-乙酰半乳糖胺的N-乙酰葡糖胺分支的0-聚糖）。
[0169] Bauer(鮑爾）等人 Science(科學(xué)）285:727-729, 1999 提供了 MICA 作為 NKG2D 的應(yīng)激-可誘導(dǎo)的配體的作用。如在此使用，"MICA"是指任何MICA多肽，包括適用于其的 MICA基因或編碼的一種或多種蛋白質(zhì)任何變體、衍生物或同種型。MICA基因是多態(tài)的，在 其細(xì)胞外a 1、a 2以及a 3結(jié)構(gòu)域中展示出多種變體氨基酸的不尋常分布。已經(jīng)針對(duì)MICA 多肽（例如MICA)報(bào)道了不同等位基因變體，這些中的每一個(gè)都被對(duì)應(yīng)的術(shù)語(yǔ)涵蓋，包括例 如人類 MICA 多肽 MICA*001、MICA*002、MICA*004、MICA*005、MICA*006、MICA*007、MICA*008、 MICA*009,MICA*010,MICA*01UMICA*012,MICA*013,MICA*014,MICA*015,MICA*016,MICA*017, MICA*018,MICA*019,MICA*020,MICA*022,MICA*023,MICA*024,MICA*025,MICA*026,MICA*027, MICA*028、MICA*029、MICA*030、MICA*031、MICA*032、MICA*033、MICA*034、MICA*035、MICA*036、 MICA*037,MICA*038,MICA*039,MICA*040,MICA*04UMICA*042,MICA*043,MICA*044,MICA*045, MICA*046,MICA*047,MICA*048,MICA*049,MICA*050,MICA*05UMICA*052,MICA*053,MICA*054, MICA #055以及MICA#056。還涵蓋與野生型全長(zhǎng)MICA分別享有一種或多種生物學(xué)特性或功 能，并且享有至少70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的核苷酸或氨基酸 同一性的任何核酸或蛋白質(zhì)序列。
[0170] 如在此使用，除非另外說(shuō)明或與上下文矛盾，否則"hNKG2D"以及術(shù)語(yǔ)"NKG2D"、 "疆62-0"、"〇)314"、"01252489￡"、"此服1"、"殺傷細(xì)胞類凝集素受體亞家族1(，成員1"或 "KLRK1"是指一種人類殺傷細(xì)胞活化受體基因、其cDNA (例如，Genbank登錄號(hào)NM_007360) 及其基因產(chǎn)物（Genbank登錄號(hào)NP_031386)，或其天然存在的變體。在NK和T細(xì)胞中， hNKG2D可以與蛋白質(zhì)（例如DAPlO (Genbank登錄號(hào)AAG29425, AAD50293))形成異源二聚 體或高階復(fù)合物。在此歸于hNKG2D的任何活性（例如，細(xì)胞激活、抗體識(shí)別等）也可以歸 于處于異源二聚體（例如hNKG2D-DAP10)或具有這兩種（和/或其他）組分的高階復(fù)合物 形式的hNKG2D。
[0171] 已經(jīng)確定了與NKG2D復(fù)合的MICA的3D結(jié)構(gòu)（參見(jiàn)例如，Li(李）等人，Nat. Immunol.(自然免疫學(xué)）2001 ;2:443-451 ;code lhyr，以及在 MGT/3D 結(jié)構(gòu)-DB (Kaas (卡 斯）等人燦(：1.六(^(18 1^8.(核酸研究）2004;32:0208-0210)中）。當(dāng)]\〇〇六與疆620同源 二聚體復(fù)合時(shí)，MICAa 2的殘基63至73 (IGMT編號(hào)）被順序化，從而添加幾乎兩圈螺旋。 NKG2D的兩個(gè)單體同等地有助于與MICA的相互作用，并且每個(gè)NKG2D單體中的七個(gè)位置與 MICAa 1或a 2螺旋結(jié)構(gòu)域之一相互作用。
[0172] 本發(fā)明提供了使用本發(fā)明的抗原結(jié)合化合物的方法；例如，本發(fā)明提供了用于抑 制細(xì)胞增殖或活性，用于向細(xì)胞遞送分子（例如毒性分子、可檢測(cè)的標(biāo)記物等），用于靶向、 鑒定或純化細(xì)胞，用于消耗、殺死或消除細(xì)胞，用于減少細(xì)胞增殖的方法，該方法包括將細(xì) 胞（例如表達(dá)MICA多肽的腫瘤細(xì)胞）暴露于本發(fā)明的結(jié)合MICA多肽的抗原結(jié)合化合物。 將領(lǐng)會(huì)的是，出于本發(fā)明的目的，"細(xì)胞增殖"是指細(xì)胞的生長(zhǎng)或增殖的任何方面，例如細(xì)胞 生長(zhǎng)、細(xì)胞分裂、或細(xì)胞周期的任何方面。細(xì)胞可以在細(xì)胞培養(yǎng)物中（體外）或在哺乳動(dòng) 物中（體內(nèi)），例如罹患MICA表達(dá)病理學(xué)的哺乳動(dòng)物。本發(fā)明還提供了一種用于誘導(dǎo)表達(dá) MICA多肽的細(xì)胞死亡或抑制表達(dá)MICA多肽的細(xì)胞的增殖或活性的方法，該方法包括將該 細(xì)胞暴露于處于有效誘導(dǎo)該細(xì)胞死亡和/或抑制其增殖的量的抗原結(jié)合化合物，該抗原結(jié) 合化合物結(jié)合連接至毒劑的MICA多肽。因此，本發(fā)明提供了一種用于治療罹患增生性疾病 以及由表達(dá)MICA多肽的細(xì)胞的致病性擴(kuò)增表征的任何病癥的哺乳動(dòng)物的方法，該方法包 括向該哺乳動(dòng)物給予藥學(xué)有效量的在此披露的抗原結(jié)合化合物，例如用于癌癥的治療。
[0173] 定義
[0174] 如在本說(shuō)明書中所使用，"一個(gè)（種）（a或an)"可以意指一個(gè)（種）或多個(gè)（種）。 如在權(quán)利要求（書）中所使用，當(dāng)與單詞"包括"結(jié)合使用時(shí)，單詞"一個(gè)（種）（a或an)" 可以意指一個(gè)（種）或多個(gè)（種）而非一個(gè)（種）。如在此使用，"另一個(gè)（種）"可以意 指至少第二個(gè)（種）或更多。
[0175] 在使用"包括"的情況下，這可以優(yōu)選地被"主要由...組成"，更優(yōu)選地被 "由...組成"替換。
[0176] 無(wú)論何時(shí)在該整個(gè)說(shuō)明書內(nèi)，"增生性疾病的治療"或"腫瘤的治療"或"癌癥的治 療"等參照抗MICA結(jié)合劑（例如抗體）而提及，意指：(a)增生性疾病的治療方法，所述方 法包括向需要這樣的治療的溫血?jiǎng)游铮ㄓ绕涫侨耍┙o予（用于至少一個(gè)治療）抗MICA結(jié) 合劑（優(yōu)選在藥學(xué)上可接受的載體材料中），處于允許所述疾病的治療的劑量（治療有效 量），優(yōu)選處于如在上文和在下文指定為優(yōu)選的劑量（量）；(b)抗MICA結(jié)合劑用于治療增 生性疾病的用途，或抗MICA結(jié)合劑用于在所述治療（尤其在人中）使用；(c)抗MICA結(jié)合 劑用于生產(chǎn)治療增生性疾病的藥物制劑的用途，使用抗MICA結(jié)合劑用于生產(chǎn)治療增生性 疾病的藥物制劑的方法，該方法包括將抗MICA結(jié)合劑與藥學(xué)上可接受的載體或包括有效 劑量的適合治療增生性疾病的抗MICA結(jié)合劑的藥物制劑混合；或（d)根據(jù)可允許在該申請(qǐng) 提交的國(guó)家取得專利權(quán)的主題，a)、b)、和c)的任何組合。
[0177] 如在此使用，術(shù)語(yǔ)"癌癥"和"腫瘤"被定義為細(xì)胞或組織的新生長(zhǎng)，包括不受控制 的并且進(jìn)行性的增殖。在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，在自然病程中，癌癥是致命的。在具體定實(shí) 施方式中，癌癥是侵入性的、轉(zhuǎn)移性的、和/或退行發(fā)育的（損失了分化和定向至彼此以及 至它們的軸向框架）。
[0178] 如在此使用，術(shù)語(yǔ)"活檢"被定義為為了檢查的目的，例如為了建立診斷，從器官移 除組織?；顧z類型的實(shí)例包括通過(guò)應(yīng)用抽吸，例如通過(guò)附接至注射器的針；通過(guò)組織片段的 器械移除；通過(guò)用適當(dāng)器械借助內(nèi)窺鏡移除；通過(guò)手術(shù)切除，例如全病變的手術(shù)切除；等。
[0179] 如在此使用，術(shù)語(yǔ)"抗體"是指多克隆的和單克隆的抗體。取決于重鏈中恒定域的 類型，將抗體分為五個(gè)主要類別之一 ：IgA、IgD、IgE、IgG、和IgM。這些中的若干個(gè)被進(jìn)一 步分為多個(gè)小類或同種型，例如1861、1§62、1 §63、1§64、等。示例性免疫球蛋白（抗體）結(jié) 構(gòu)單元包括四聚體。每個(gè)四聚體由兩個(gè)相同對(duì)的多肽鏈組成，每個(gè)對(duì)具有一個(gè)"輕"鏈（約 25kDa)和一個(gè)"重"鏈（約50-70kDa)。每個(gè)鏈的N端限定了主要負(fù)責(zé)抗原識(shí)別的約100 至110個(gè)或更多個(gè)氨基酸的可變區(qū)。術(shù)語(yǔ)可變輕鏈（\)和可變重鏈（V h)分別是指這些輕 鏈和重鏈。對(duì)應(yīng)于不同類別的免疫球蛋白的重鏈恒定域分別被稱為" a "、" S "、" e "、" Y " 和" U "。不同類別的免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型是熟知的。IgG和/或IgM是本發(fā) 明中采用的優(yōu)選類別的抗體，其中IgG是特別優(yōu)選的，因?yàn)樗鼈兪巧韺W(xué)情況下最常見(jiàn)抗 體并且因?yàn)樗鼈冊(cè)趯?shí)驗(yàn)室環(huán)境下最容易制造。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體是單克隆抗體。特別 優(yōu)選的抗體是人源化抗體、嵌合抗體、人類抗體、或另外適合人類的抗體。"抗體"還包括任 何在此描述的抗體的片段或衍生物。
[0180] 術(shù)語(yǔ)"特異性結(jié)合"是指在競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定中，如使用重組形式的蛋白、其中的表 位、抑或在分離的靶細(xì)胞表面上存在的天然蛋白進(jìn)行評(píng)價(jià)，抗體可以優(yōu)選地結(jié)合至結(jié)合配 偶體，例如MICA。競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定和用于確定特異性結(jié)合的其他方法將在以下進(jìn)一步描述 并且是本領(lǐng)域熟知的。
[0181] 當(dāng)抗體被稱為與具體單克隆抗體（例如6E4、20C6或16A8)"競(jìng)爭(zhēng)"，這是指在使用 重組MICA分子或表面表達(dá)的MICA分子的結(jié)合測(cè)定中，抗體與單克隆抗體競(jìng)爭(zhēng)。例如，如果 在結(jié)合測(cè)定中，測(cè)試抗體減少了 6E4、20C6或16A8與MICA多肽或MICA表達(dá)細(xì)胞的結(jié)合，那 么該抗體被稱為分別與6E4、20C6或16A8 "競(jìng)爭(zhēng)"。
[0182] 如在此使用，術(shù)語(yǔ)"親和力"是指抗體與表位的結(jié)合的強(qiáng)度。由離解常量K d給出抗 體的親和力，定義為[Ab]x[Ag]/[Ab-Ag]，其中[Ab-Ag]是抗體-抗原復(fù)合物的摩爾濃度。 [Ab]是未結(jié)合抗體的摩爾濃度，并且[Ag]未結(jié)合抗原的摩爾濃度。由1/Kd定義親和力常 數(shù)1^。在 Harlow(哈洛）等人，Antibodies:A Laboratory Manual (抗體：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)）， Cold Spring Harbor Laboratory Press(冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社），Cold Spring Harbor(冷 泉港），N. Y?(紐約州），（1988) ,Coligan(科利根）等人編輯，Current Protocols in Immunology (免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)指南），Greene Publishing Assoc?(格林出版協(xié)會(huì)）和Wiley Interscience (威利國(guó)際科學(xué)），N. Y.(紐約州），（1992,1993)，和 Muller (穆勒），Meth. Enzymol?(酶學(xué)方法）92:589-601 (1983)中可以發(fā)現(xiàn)用于確定mAbs親和力的優(yōu)選方法，將 這些參考文獻(xiàn)通過(guò)引用完整結(jié)合在此。本領(lǐng)域熟知的用于確定mAbs親和力的一個(gè)優(yōu)選并 且標(biāo)準(zhǔn)的方法是使用表面等離子共振（SPR)篩選（例如通過(guò)用BIAcore? SPR分析裝置進(jìn) 行分析）。
[0183] 在本發(fā)明的上下文內(nèi)，"決定子"是指在多肽上相互作用或結(jié)合的位點(diǎn)。
[0184]術(shù)語(yǔ)"表位"是指抗原決定子，并且是抗原上結(jié)合抗體的區(qū)或區(qū)域。蛋白表位可以 包括在結(jié)合中直接涉及的氨基酸殘基連同由特異性抗原結(jié)合抗體或肽有效阻斷的氨基酸 殘基，即抗體的"足跡"內(nèi)的氨基酸殘基。它是可以與例如抗體或受體結(jié)合的復(fù)合抗原分子 上的最簡(jiǎn)單形式的或最小結(jié)構(gòu)的區(qū)。表位可以是線性的或構(gòu)象的/結(jié)構(gòu)的。術(shù)語(yǔ)"線性表 位"被定義為氨基酸的線性序列（一級(jí)結(jié)構(gòu)）上連續(xù)的氨基酸殘基組成的表位。術(shù)語(yǔ)"構(gòu) 象的或結(jié)構(gòu)的表位"被定義為由不是都連續(xù)的氨基酸殘基組成的表位，并且因此代表通過(guò) 分子折疊（二級(jí)、三級(jí)和/或四級(jí)結(jié)構(gòu)）而變得彼此接近的氨基酸線性序列的分開(kāi)的部分。 構(gòu)象表位取決于3維結(jié)構(gòu)。因此，術(shù)語(yǔ)'構(gòu)象的'通常與'結(jié)構(gòu)的'可互換地使用。
[0185] 關(guān)于MICA表達(dá)細(xì)胞，術(shù)語(yǔ)"消耗"是指可以殺死、消除、溶解或誘導(dǎo)磁力誒殺死、消 除或溶解，以便負(fù)面影響樣品或?qū)ο笾写嬖诘亩鄠€(gè)MICA表達(dá)細(xì)胞的過(guò)程、方法、或化合物。
[0186] 根據(jù)本發(fā)明的"劑"或"化合物"包括小分子、多肽、蛋白、抗體或抗體片段。在本 發(fā)明的上下文中，小分子在一個(gè)實(shí)施方式中是指具有小于1000道爾頓、特別是小于800道 爾頓、更特別是小于500道爾頓的分子量的化學(xué)制劑。術(shù)語(yǔ)"治療劑"是指具有生物活性的 齊U。術(shù)語(yǔ)"抗癌劑"是指具有針對(duì)癌細(xì)胞的生物活性的劑。
[0187]關(guān)于抗體，術(shù)語(yǔ)"適合人類的"是指用于例如在此所描述的治療方法，可以在人體 內(nèi)安全使用的任何抗體、衍生化抗體、或抗體片段。適合人類的抗體包括所有類型的人源化 抗體、嵌合抗體、或完全人類抗體、或其中抗體的至少一部分衍生自人類或另外被修飾的任 何抗體，以便避免當(dāng)使用天然非人類抗體時(shí)通常激起的免疫應(yīng)答。
[0188] 出于本發(fā)明的目的，"人源化抗體"或"人類抗體"是指其中一個(gè)或多個(gè)人類免疫球 蛋白的恒定或可變結(jié)構(gòu)區(qū)與結(jié)合區(qū)（例如動(dòng)物免疫球蛋白的CDR)融合的抗體。設(shè)計(jì)此類 抗體來(lái)維持從其衍生結(jié)合區(qū)的非人類抗體的結(jié)合特異性，而且用來(lái)避免針對(duì)非人類抗體的 免疫反應(yīng)?？梢詮囊呀?jīng)"工程化"用來(lái)響應(yīng)抗原激發(fā)產(chǎn)生特定人類抗體的轉(zhuǎn)基因小鼠或其他 動(dòng)物獲得此類抗體（參見(jiàn)例如Green (格林）等人（1994)Nature Genet (自然遺傳）7:13; Lonberg(倫貝格）等人（1"4)Nature(自然）368:856;Taylor(泰勒）等人（1"4) Int Imrnun(國(guó)際免疫學(xué)）6:579,將它們的完整教授內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合在此）。可以通過(guò)遺傳的 或染色體的轉(zhuǎn)染方法連同噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建完全人類抗體，所有這些都是本領(lǐng)域已知的 (參見(jiàn)例如McCafTerty (麥考夫迪）等人（1990)Nature (自然）348:552-553)。還可以通 過(guò)體外激活B細(xì)胞產(chǎn)生人類抗體（參見(jiàn)例如美國(guó)專利號(hào)5, 567, 610和5, 229, 275,將它們通 過(guò)引用以其全文結(jié)合在此）。
[0189] "嵌合抗體"是一種抗體分子，其中（a)恒定區(qū)或其一部分被改變、替換或交換，這 樣使得抗原結(jié)合位點(diǎn)（可變區(qū)）連接至不同的或改變的類別、效應(yīng)子功能和/或種類的恒 定區(qū)，或賦予嵌合抗體新特性的完全不同分子，例如酶、毒素、激素、生長(zhǎng)因子、藥物、等；或 (b)用具有不同的或改變的抗原特異性的可變區(qū)改變、替換或交換可變區(qū)或其一部分。
[0190]術(shù)語(yǔ)"Fc結(jié)構(gòu)域"、"Fc部分"、和"Fc區(qū)"是指抗體重鏈的C末端片段，例如從人 類Y (gamma)重鏈的約氨基酸（aa) 230至約aa450,或其他類型的抗體重鏈（例如對(duì)于 人類抗體是a、6、e和中的它的配對(duì)序列或其天然存在的同種異型。除非另外說(shuō) 明，貫穿本公開(kāi)內(nèi)容使用針對(duì)免疫球蛋白的普遍接受的Kabat(卡巴）氨基酸編號(hào)（參見(jiàn) Kabat(卡巴）等人（1991)Sequences of Protein of Immunological Interest(具有免疫 性興趣的蛋白序列），第5版，United States Public Health Service (美國(guó)公共衛(wèi)生署）， National Institute of Health(國(guó)立衛(wèi)生研究院），Bethesda(貝塞斯達(dá)），馬里蘭州，也 稱為 "Kabat (卡巴）EU"）。
[0191] 術(shù)語(yǔ)"抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性"或"ADCC"是本領(lǐng)域普遍理解的術(shù)語(yǔ)，并 且指細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)，其中表達(dá)Fc受體（FcR)的非特異性細(xì)胞毒性細(xì)胞識(shí)別靶細(xì)胞上的結(jié) 合抗體，并且隨后導(dǎo)致靶細(xì)胞溶解。介導(dǎo)ADCC的非特異性細(xì)胞毒性細(xì)胞包括自然殺傷（NK) 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜中性細(xì)胞、和嗜酸性細(xì)胞。
[0192] 術(shù)語(yǔ)"補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性"或"CDC"是本領(lǐng)域普遍理解的術(shù)語(yǔ)，并且指在補(bǔ)體存 在下，分子溶解靶的能力。通過(guò)補(bǔ)體系統(tǒng)的第一組分結(jié)合至與同源抗原復(fù)合的分子（例如 抗體）引發(fā)了補(bǔ)體激活通路。
[0193] 當(dāng)提及MICA時(shí)，術(shù)語(yǔ)"脫落"是指MICA的可溶性細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域（ECD)片段從表 達(dá)MICA的細(xì)胞的細(xì)胞表面釋放。細(xì)胞表面MICA的蛋白酶剪切（例如通過(guò)基質(zhì)金屬蛋白酶 (MMP)(例如ADAMlO和/或ADAM17)的作用），致使ECD片段從細(xì)胞表面釋放，可以導(dǎo)致此 類脫落，或者可溶性ECD或其片段可以由替代轉(zhuǎn)錄物編碼。
[0194] 術(shù)語(yǔ)"分離的"、"純化的"或"生物學(xué)純的"是指實(shí)質(zhì)上或基本上不含有在其天然 狀態(tài)發(fā)現(xiàn)時(shí)正常伴隨它的組分。典型地使用分析化學(xué)技術(shù)，例如聚丙烯酰胺凝膠電泳或高 效液相色譜法確定純度和同質(zhì)性。為制劑中存在的超優(yōu)勢(shì)種的蛋白是實(shí)質(zhì)上純化的。
[0195] 術(shù)語(yǔ)"多肽"、"肽"和"蛋白"在此可互換地使用，指氨基酸殘基的聚合物。該術(shù)語(yǔ) 應(yīng)用至其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是對(duì)應(yīng)的天然存在的氨基酸的人造化學(xué)模擬物的氨基 酸聚合物，連同應(yīng)用至天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。
[0196] 當(dāng)引用例如細(xì)胞、或核酸、蛋白、或載體使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)"重組"表明該細(xì)胞、核酸、蛋 白或載體已經(jīng)通過(guò)引入異源核酸或蛋白或改變天然核酸或蛋白進(jìn)行修飾，或該細(xì)胞衍生自 如此修飾的細(xì)胞。因此，例如重組細(xì)胞表達(dá)在天然（非重組）形式的細(xì)胞內(nèi)未發(fā)現(xiàn)的基因 或表達(dá)另外異常表達(dá)、低表達(dá)或根本不表達(dá)的天然基因。
[0197] 如在此使用，術(shù)語(yǔ)"NK細(xì)胞"是指在非常規(guī)免疫中涉及的淋巴細(xì)胞亞群。可以借助 某些特征和生物學(xué)特性，例如表達(dá)特異性表面抗原（包括針對(duì)人類NK細(xì)胞的⑶56和/或 ⑶16)、在細(xì)胞表面上不存在a / 0或Y / S TCR復(fù)合物、通過(guò)激活特定細(xì)胞溶解機(jī)構(gòu)而結(jié)合 并且殺死不能表達(dá)"自我"MHC/HLA抗原的細(xì)胞的能力、殺死腫瘤細(xì)胞或表達(dá)針對(duì)NK活化受 體的配體的患病細(xì)胞的能力、以及釋放稱為刺激或抑制免疫應(yīng)答的細(xì)胞因子的蛋白分子的 能力來(lái)鑒定NK細(xì)胞。使用本領(lǐng)域熟知的方法，任何這些特征和活性可以用于鑒定NK細(xì)胞。 術(shù)語(yǔ)NK細(xì)胞還將涵蓋NK細(xì)胞的任何亞群。在本發(fā)明的上下文內(nèi)，"活性"NK細(xì)胞是指生物 活性的NK細(xì)胞，包括具有溶解靶細(xì)胞或增強(qiáng)其他細(xì)胞的免疫功能的能力的NK細(xì)胞。例如， "活性"NK細(xì)胞可以能夠殺死表達(dá)針對(duì)活化NK受體的配體和/或不能表達(dá)NK細(xì)胞上的KIR 識(shí)別的MHC/HLA抗原的細(xì)胞。可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的不同技術(shù)，例如從血樣、細(xì)胞單采術(shù)、 組織或細(xì)胞收集進(jìn)行分離而獲得NK細(xì)胞。對(duì)于涉及NK細(xì)胞的測(cè)定有用的實(shí)驗(yàn)方案可以發(fā) 現(xiàn)于Natural Killer Cells Protocols (天然殺傷細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方案）（Campbell (坎貝爾）KS 和 Colonna (科隆納）M 編輯），Human Press (人類出版社），219-238 頁(yè)（2000)。
[0198] 如在此使用，"T細(xì)胞"是指在胸腺中成熟的，并且在其細(xì)胞表面上展示T細(xì)胞受體 等分子的淋巴細(xì)胞亞群?？梢越柚承┨卣骱蜕飳W(xué)特性，例如表達(dá)特異性表面抗原（包 括TCR、CD4或CD8)、某些T細(xì)胞殺死腫瘤細(xì)胞或感染細(xì)胞的能力、某些T細(xì)胞激活免疫系 統(tǒng)的其他細(xì)胞的能力、以及釋放稱為刺激或抑制免疫應(yīng)答的細(xì)胞因子的蛋白分子的能力來(lái) 鑒定T細(xì)胞。使用本領(lǐng)域熟知的方法，任何這些特征和活性可以用于鑒定T細(xì)胞。在本發(fā) 明的上下文內(nèi)，"活性"或"激活的" T細(xì)胞或NK細(xì)胞是指生物活性的T細(xì)胞或NK細(xì)胞，更 具體地，是指具有通過(guò)例如分泌細(xì)胞因子來(lái)溶解細(xì)胞或刺激免疫應(yīng)答的能力的T細(xì)胞或NK 細(xì)胞。可以按多種熟知方法，包括功能測(cè)定和基于表達(dá)的測(cè)定（例如表達(dá)細(xì)胞因子）中的 任一種檢測(cè)活性細(xì)胞。
[0199] 在本發(fā)明的上下文內(nèi)，術(shù)語(yǔ)"結(jié)合"多肽或表位的抗體是指具有特異性和/或親和 力來(lái)結(jié)合所述決定子的抗體。
[0200] 抗體
[0201] 本發(fā)明的抗體是結(jié)合跨越不同等位基因的人類MICA的抗體。在一個(gè)實(shí)施方式中， 抗體結(jié)合MICA多肽（抗MICA抗體），而不實(shí)質(zhì)阻斷MICA與NKG2D的相互作用（例如在腫 瘤細(xì)胞上表面MICA與效應(yīng)細(xì)胞上表面NKG2D的相互作用）。在另一個(gè)實(shí)施方式中，抗體結(jié) 合MICA多肽（抗MICA抗體）并且抑制MICA與NKG2D的相互作用；優(yōu)選地，抗體抑制免疫 細(xì)胞表面上由sMICA導(dǎo)致的NKG2D下調(diào)。在一個(gè)實(shí)施方式中，抗體結(jié)合細(xì)胞表面上的MICA 多肽而不實(shí)質(zhì)阻斷MICA從細(xì)胞表面（例如腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞表面）脫落。在一個(gè)實(shí)施方式 中，抗體結(jié)合MICA的a 1和/或a 2結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方式中，抗體結(jié)合MICA的a 3結(jié) 構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方式中，抗體具有針對(duì)人類MICA等位基因*001、*004和*008、任選地另 外*007和/或*019的親和力，任選地其特征在于小于1(T 9M、優(yōu)選小于KTiqM的KcL
[0202] 在一個(gè)實(shí)施方式中，對(duì)于結(jié)合MICA多肽，該抗體與抗體6E4、20C6、16A8、9C10、 19E9、12A10、10A7、18E8、10F3、15F9和14B4中的任意一個(gè)或多個(gè)競(jìng)爭(zhēng)。優(yōu)選地，對(duì)于MICA 多肽上實(shí)質(zhì)上或基本上相同的、或相同的表位或"表位位點(diǎn)"，抗體識(shí)別它、結(jié)合它、或?qū)ζ?具有免疫特異性。
[0203] 抗體表位
[0204] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，這些抗體結(jié)合與抗體6E4、20C6、16A8、9C10、19E9、12A10、 10A7、18E8、10F3、15F9和14B4實(shí)質(zhì)上相同的表位。在另一個(gè)實(shí)施方式中，這些抗體與以下 項(xiàng)至少部分重疊、或包括其中至少一個(gè)殘基：對(duì)應(yīng)于包括SEQ ID NO: 1至5的氨基酸序列的 MICA多肽的殘基1-88、殘基89-181、或殘基182-274的區(qū)段。在一個(gè)實(shí)施方式中，該表位的 所有關(guān)鍵殘基是在對(duì)應(yīng)于包括SEQ ID NO: 1至5的氨基酸序列的MICA多肽的殘基1-88、 殘基89-181、或殘基182-274的區(qū)段中。在一個(gè)實(shí)施方式中，抗體結(jié)合橫跨（a) a 1和/或 a 2結(jié)構(gòu)域以及（b) a 3結(jié)構(gòu)域的連接的表位，其中該表位的所有關(guān)鍵殘基在對(duì)應(yīng)于包括 SEQ ID NO: 1至5的氨基酸序列的MICA多肽的殘基1-181 (例如殘基1-88 (任選地1-85) 或89-181(任選地86-181))的區(qū)段中。在一個(gè)實(shí)施方式中，抗體結(jié)合包括區(qū)段中的1、2、 3、4、5、6、7個(gè)或更多個(gè)殘基的表位，該區(qū)段對(duì)應(yīng)于包括SEQ ID N0:1至5的氨基酸序列的 MICA多肽的殘基1-88 (任選地1-85)或殘基89-181 (任選地86-181)。優(yōu)選地，抗體結(jié)合 的殘基存在于MICA多肽的表面上，例如細(xì)胞表面上表達(dá)的MICA多肽中。
[0205] 在一個(gè)實(shí)施方式中，抗體結(jié)合表位，該表位包括選自下組的1、2、3、4、5、6、7個(gè)或 更多個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：R6、N8、Q48、W49、E51、D52、V53、L54、N56、K57、T58、R61、 R64、K81、D82、Q83、K84、E97、H99、E100、D101、N102、S103、T104、R105、H109、Ylll、D113、 E115、L116、N121、E123、T124、E126、Q131、S132、S133、R134、Q136、T137、M140、N141、R143、 N144、L178、R179、R180、S224、H225、D226、T227、Q228、Q229、W230 和 D23 (參照 SEQ ID NO 1-5中任一個(gè)的MICA)。
[0206] 在一個(gè)實(shí)施方式中，抗體結(jié)合表位，該表位包括：
[0207] (a)選自下組的一個(gè)或多個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：R6和N8;
[0208] (b)選自下組的一個(gè)或多個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：N56、K57、T58;
[0209] (c)選自下組的一個(gè)或多個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：R61和R64 ;
[0210] (d)選自下組的一個(gè)或多個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：K81、D82 ;
[0211] (e)選自下組的一個(gè)或多個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：Q83、K84 ;
[0212] (f)選自下組的一個(gè)或多個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：E97、H99 ;
[0213] (g)選自下組的一個(gè)或多個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：E100、D101、N102;
[0214] (h)選自下組的一個(gè)或多個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：S103、T104、R105;
[0215] (i)選自下組的一個(gè)或多個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：Dl 13、El 15 ;
[0216] (j)選自下組的一個(gè)或多個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：N12UE123;
[0217] (k)選自下組的一個(gè)或多個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：T124和E126;
[0218] (1)選自下組的一個(gè)或多個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：H109、YllULl 16;
[0219] (m)選自下組的一個(gè)或多個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：H109、YllULl 16;
[0220] (n)選自下組的一個(gè)或多個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：S133、R134、T137 ;或
[0221] (〇)選自下組的一個(gè)或多個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：M140、N141、R143和 N144 ；
[0222] (p)選自下組的一個(gè)或多個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：S224、H225和D226 ;
[0223] (q)選自下組的一個(gè)或多個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：T227、Q228和Q229;和/ 或
[0224] (r)選自下組的一個(gè)或多個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：W230和D232。
[0225] 在一個(gè)實(shí)施方式中，抗體結(jié)合表位，該表位包括（a)至（r)中2、3或4個(gè)的任何組 合。
[0226] 在一個(gè)實(shí)施方式中，抗體結(jié)合表位，該表位包括選自下組的1、2、3、4、5、或6個(gè)或 更多個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：Q48、W49、E51、D52、V53和L54。
[0227] 在一個(gè)實(shí)施方式中，抗體結(jié)合表位，該表位包括選自下組的1、2、3、4、5、或6個(gè)或 更多個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：N56、K57、T58、R61和R64。
[0228] 在一個(gè)實(shí)施方式中，抗體結(jié)合表位，該表位包括選自下組的1、2、3、4、5或6個(gè)或更 多個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：K81、D82、Q83、K84、H109、Ylll、D113、L116、S133、R134、 T137、M140、N141、R143 和 N144。
[0229] 在一個(gè)實(shí)施方式中，抗體結(jié)合表位，該表位包括選自下組的1、2、3、4、5或6個(gè)或更 多個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：K81、D82、Q83、K84、H109、Ylll、D113、L116、Q131、S132、 Q136、M140、N141、R143 和 N144。
[0230] 在一個(gè)實(shí)施方式中，抗體結(jié)合表位，該表位包括選自下組的1、2、3、4、5、或6個(gè)或 更多個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：￡100、0101川102、5103、1'104、1?105川1213123、1'124和 E126。
[0231] 在一個(gè)實(shí)施方式中，抗體結(jié)合表位，該表位包括選自下組的1、2、3、4、5、或6個(gè)或 更多個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：R6、N8、E97、H99、E100、D101、N102、S103、T104、R105、 E115、L178、R179 和 R180。
[0232] 在一個(gè)實(shí)施方式中，抗體結(jié)合表位，該表位包括選自下組的1、2、3、4、5、或6個(gè)或 更多個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：S224、H225、D226、T227、Q228、Q229、W230和D232。在 一個(gè)實(shí)施方式中，抗體結(jié)合表位，該表位包括選自下組的1、2、3、4、5、或6個(gè)或更多個(gè)殘基， 該組由以下各項(xiàng)組成：T227、Q228和Q229。
[0233] 在一個(gè)實(shí)施方式中，抗體結(jié)合表位，該表位包括：
[0234] (a)選自下組的1個(gè)或更多個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：K81、D82,和選自下組的 1個(gè)或更多個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：Q83、K84;
[0235] (b)選自下組的1、2、3、4個(gè)或更多個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：K81、D82、Q83、 K84,和選自下組的1、2、或3個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：H109、Y111、L116;
[0236] (c)殘基D113,和選自下組的1、2、3或4個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：K81、D82、 Q83、K84;
[0237] (d)選自下組的1、2、3、4個(gè)或更多個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：K81、D82、Q83、 K84,和選自下組的1、2、或3個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：Q131、S132、Q136;
[0238] (e)選自下組的1、2、3、4個(gè)或更多個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：K81、D82、Q83、 K84,和選自下組的1、2、或3個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：S133、R134、T137;
[0239] (f)選自下組的1、2、3、4個(gè)或更多個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：K81、D82、Q83、 K84,和選自下組的1、2、或3個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：M140、N141、R143和N144;
[0240] (g)選自下組的1、2、3、4個(gè)或更多個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：K81、D82、Q83、 K84,選自下組的1、2、或3個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：H109、Y111、L116 ;任選地D113 ;和 選自下組的1、2、或3個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：Q131、S132、Q136;
[0241] (h)選自下組的1、2、3、4個(gè)或更多個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：K81、D82、Q83、 K84,選自下組的1、2、或3個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：H109、Y111、L116 ;任選地D113 ;和 選自下組的1、2、或3個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：S133、R134、T137;
[0242] (i)選自下組的1、2、3、4個(gè)或更多個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：K81、D82、Q83、 K84,選自下組的1、2、或3個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：H109、Y111、L116;任選地D113;和 選自下組的1、2、3、4個(gè)或更多個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：M140、N141、R143和N144;
[0243] (j)選自下組的1、2、3、4個(gè)或更多個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：K81、D82、Q83、 K84,選自下組的1、2、或3個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：H109、Y111、L116;任選地D113;選 自下組的1、2或3個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：S133、R134、T137;和選自下組的1、2、3或 4個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：M140、N141、R143和N144;
[0244] (k)選自下組的1個(gè)或更多個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：R6、N8,和選自下組的1、 2、3、4個(gè)或更多個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：E100、D101、N102、S103、T104、R105;
[0245] (1)選自下組的1、2、3或4個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：N121、E123、T124和 E126,和選自下組的1、2、3、4個(gè)或更多個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：E100、D101、N102、 S103、T104、R105;或
[0246] (m)選自下組的1、2或3個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：S224、H225和D226;選自 下組的1、2或3個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：T227、Q228和Q229,和選自下組的一個(gè)或兩 個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：W230和D232。
[0247] 任選地，本發(fā)明的抗體的表位可以完全地在MICA的a 1和/或a 2結(jié)構(gòu)域內(nèi)。任 選地，另外，這些抗體可以特征為實(shí)質(zhì)上結(jié)合MICA脫落所需的a 3結(jié)構(gòu)域區(qū)。
[0248] 在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體結(jié)合MICA多肽等位基因*001、*004和*008(以 及任選的另外的*007和*019)的表面上存在的一個(gè)或多個(gè)氨基酸。
[0249] 可以測(cè)量抗MICA抗體結(jié)合至MICA突變體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，并且將其與抗MICA抗體結(jié) 合野生型MICA多肽（例如SEQ ID NO: 1至5中的任何一個(gè)或多個(gè)）的能力進(jìn)行比較?？?MICA抗體和突變體MICA多肽之間結(jié)合的減少意味著存在結(jié)合親和力的減少（例如，如通過(guò) 已知方法，例如表達(dá)具體突變體的細(xì)胞的FACS測(cè)試，或通過(guò)結(jié)合突變體多肽的Biacore測(cè) 試進(jìn)行測(cè)量），和/或抗MICA抗體的總結(jié)合能力減少（例如，如通過(guò)抗MICA抗體濃度對(duì)比 多肽濃度的圖中的Bmax降低證實(shí)）。結(jié)合的顯著減少表明當(dāng)抗MICA抗體結(jié)合MICA時(shí)，突 變殘基直接涉及結(jié)合抗MICA抗體或非常接近結(jié)合蛋白。
[0250] 在一些實(shí)施方式中，結(jié)合的顯著減少意味著相對(duì)于抗體和野生型MICA多肽之間 的結(jié)合，抗MICA抗體和突變體MICA多肽之間的結(jié)合親和力和/或能力減少了大于40%、大 于50%、大于55%、大于60%、大于65%、大于70%、大于75%、大于80%、大于85%、大于 90%或大于95%。在某些實(shí)施方式中，結(jié)合減少到低于可檢測(cè)極限。在一些實(shí)施方式中，當(dāng) 抗MICA抗體結(jié)合突變體MICA多肽小于抗MICA抗體和野生型MICA多肽之間觀察到的結(jié)合 的50% (例如小于45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%或10%)時(shí)，證實(shí)結(jié)合顯著減 少。
[0251] 在一些實(shí)施方式中，提供了抗MICA抗體，其展示了對(duì)突變體MICA多肽的顯著更低 的結(jié)合，在該突變體MICA多肽中，對(duì)應(yīng)于野生型MICA多肽（例如包括SEQ ID N0:1至5中 的序列）中的殘基1-88 (任選地1-85)、殘基89-181 (任選地86-181)、或殘基182-274 (或 其子序列）的區(qū)段中的殘基被取代為不同的氨基酸。在一些實(shí)施方式中，提供了抗MICA抗 體，其展示了對(duì)突變體MICA多肽的顯著更低的結(jié)合，在該突變體MICA多肽中，對(duì)應(yīng)于野生 型MICA多肽（例如包括SEQ ID NO: 1至5中的序列）中的殘基1-88 (任選地1-85)、殘基 89-181 (任選地86-181)、或殘基182-274(或其子序列）的區(qū)段中的殘基被取代為不同的 氨基酸。
[0252] 在一些實(shí)施方式中，提供了抗MICA抗體，其展示了對(duì)突變體MICA多肽的顯著更低 的結(jié)合，在該突變體MICA多肽中，與野生型MICA多肽相比，選自下組的殘基被取代為不同 的氨基酸，該組由以下各項(xiàng)組成：R6、N8、Q48、W49、E51、D52、V53、L54、N56、K57、T58、R61、 R64、K81、D82、Q83、K84、E97、H99、E100、D101、N102、S103、T104、R105、H109、Ylll、D113、 E115、L116、N121、E123、T124、E126、Q131、S132、S133、R134、Q136、T137、M140、N141、R143、 N144、L178、R179、R180、S224、H225、D226、T227、Q228、Q229、W230 和 D232。
[0253] 在一些實(shí)施方式中，提供了抗MICA抗體，其展示了對(duì)突變體MICA多肽的顯著更低 的結(jié)合，在該突變體MICA多肽中：
[0254] (a)選自下組的1、2、3、4個(gè)或更多個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：Q48、W49、E51、 D52、V53 和 L54 ;
[0255] (b)選自下組的1、2、3、4個(gè)或更多個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：N56、K57、T58、 R61 和 R64 ;
[0256] (c)選自下組的1、2、3、4個(gè)或更多個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：K81、D82、Q83、 K84、H109、Y111、D113、L116、S133、R134、T137、M140、N141、R143 和 N144 ;
[0257] (d)選自下組的1、2、3、4個(gè)或更多個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：K81、D82、Q83、 K84、H109、Y111、D113、L116、Q131、S132、Q136、M140、N141、R143 和 N144 ;
[0258] (e)選自下組的1、2、3、4個(gè)或更多個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：E100、D101、 附02、5103、！104、1?105、附21、￡123、1'124和￡126;
[0259] (f)選自下組的1、2、3、4個(gè)或更多個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：R6、N8、E97、H99、 E100、D101、N102、S103、T104、R105、E115、L178、R179 和 R180 ;或
[0260] (g)選自下組的1、2、3、4個(gè)或更多個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：S224、H225、 D226、T227、Q228、Q229、W230 和D232 ;
[0261] 與野生型MICA多肽相比，被取代為不同的氨基酸。
[0262] 在一些實(shí)施方式中，提供了抗MICA抗體，其展示了對(duì)突變體MICA多肽的顯著更低 的結(jié)合，在該突變體MICA多肽中 ：
[0263] (a)選自下組的殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：R6和N8 ;
[0264] (b)選自下組的殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：N56、K57、T58 ;
[0265] (c)選自下組的殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：R61和R64 ;
[0266] ⑷選自下組的殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：K81、D82 ;
[0267] (e)選自下組的殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：Q83、K84 ;
[0268] (f)選自下組的殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：E97、H99 ;
[0269] (g)選自下組的殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：E100、D101、N102 ;
[0270] (h)選自下組的殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：S103、T104、R105 ;
[0271] ⑴選自下組的殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：D113、E115 ;
[0272] (j)選自下組的殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：N121、E123 ;
[0273] (k)選自下組的殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：T124和E126 ;
[0274] (1)選自下組的殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：H109、Y111、L116 ;
[0275] (m)選自下組的殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：Q131、S132、Q136 ;
[0276] (n)選自下組的殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：S133、R134、T137 ;
[0277] (〇)選自下組的殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：M140、N141、R143和N144 ;
[0278] (p)選自下組的殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：S224、H225和D226 ;
[0279] (q)選自下組的殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：T227、Q228和Q229 ;和/或
[0280] (r)選自下組的殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：W230和D232，
[0281] 與野生型MICA多肽相比，被取代為不同的氨基酸。
[0282] 在任一實(shí)施方式中，R6、N8、Q48、W49、E51、D52、V53、L54、N56、K57、T58、R61、R64、 K81、D82、Q83、K84、E97、H99、E100、D101、N102、S103、T104、R105、H109、Y111、D113、E115、 L116、N121、E123、T124、E126、Q131、S132、S133、R134、Q136、T137、M140、N141、R143、N144、 L178、R179、R180、S194、E195、N197、S224、H225、D226、T227、Q228、Q229、W230 或 D232 取 代可以被規(guī)定為分別是 R6A、N8A、W14A、Q48A、W49S、E51S、D52A、V53S、L54A、N56A、K57S、 T58A、R61A、R64A、K81A、D82A、Q83A、K84A、E85A、E97A、H99A、E100A、D101S、N102A、S103A、 T104S、R105A、H109A、Y111A、D113A、E115A、L116A、N121A、E123S、T124A、E126A、Q131A、 S132A、S133A、R134S、Q136S、T137A、M140S、N141A、R143S、N144A、L178A、R179S、R180A、 S224A、H225S、D226A、T227A、Q228S、Q229A、W230A 或 D232A 取代。
[0283] 在一些實(shí)施方式中，抗MICA抗體特征在于與野生型MICA多肽（除了如實(shí)施例4 中所示的具體抗MICA抗體對(duì)其具有顯著更低的結(jié)合的一個(gè)或多個(gè)突變體或殘基）相比，對(duì) 突變體MICA多肽（例如表D的突變體1-61中的任何一個(gè)的突變體）或?qū)哂斜鞤的突變 體1-61中任一個(gè)的突變殘基的多肽不展示顯著更低的結(jié)合。
[0284] 產(chǎn)生抗MICA抗體
[0285] 可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的大量技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明的抗體。典型地，通過(guò)用包含MICA多 肽（優(yōu)選是人類MICA多肽）的免疫原免疫非人類動(dòng)物（優(yōu)選是小鼠）來(lái)產(chǎn)生它們。MICA 多肽可以包括人類MICA多肽的全長(zhǎng)序列，或其片段或衍生物，典型地免疫原片段，即包括 表達(dá)MICA多肽的細(xì)胞的表面上暴露的表位的多肽的一部分，優(yōu)選地，由6E4、20C6、16A8、 9C10、19E9、12A10、10A7、18E8、10F3、15F9或14B4抗體識(shí)別該表位。此類片段典型地包含 成熟多肽序列的至少約7個(gè)連續(xù)氨基酸，甚至更優(yōu)選地，包含它的至少約10個(gè)連續(xù)氨基酸。 片段典型地基本上衍生自受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，免疫原包含脂膜 中的、典型地在細(xì)胞表面上的野生型人MICA多肽。在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，免疫原包含完 整細(xì)胞，特別是完整人類細(xì)胞，這些細(xì)胞任選地被處理或溶解。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中， 該多肽是重組MICA多肽。在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，免疫原包含完整腫瘤細(xì)胞。
[0286] 可以按本領(lǐng)域熟知的用于刺激小鼠中抗體產(chǎn)生的任何方式進(jìn)行用抗原免疫非 人類哺乳動(dòng)物的步驟（參見(jiàn)例如E. Harlow(哈洛）和D. Lane (萊恩），Antibodies:A Laboratory Manual (抗體：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)），Cold Spring Harbor Laboratory Press (冷泉 港實(shí)驗(yàn)室出版社），Cold Spring Harbor (冷泉港），N. Y.(紐約州），（1988)，將其完整公開(kāi) 內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合在此）。將免疫原懸浮或溶解在緩沖劑中，任選地用佐劑，例如完全或不 完全弗氏佐劑。用于確定免疫原的量、緩沖劑類型和佐劑的量的方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人 員熟知的并且不以任何方式限制本發(fā)明。對(duì)于不同免疫原這些參數(shù)可能是不同的，但是都 是容易解釋的。
[0287] 類似地，足以刺激產(chǎn)生抗體的免疫位置和頻率也是本領(lǐng)域熟知的。在典型的免疫 實(shí)驗(yàn)方案中，在第一天用抗原腹膜內(nèi)注射非人類動(dòng)物，并且約一周后再注射一次。隨后大約 在第20天進(jìn)行抗原回憶注射，任選地用佐劑，例如不完全弗氏佐劑。靜脈內(nèi)進(jìn)行這些回憶 注射，并且可以重復(fù)進(jìn)行，持續(xù)若干個(gè)連續(xù)天。隨后在第40天進(jìn)行加強(qiáng)注射，靜脈內(nèi)注射抑 或腹膜內(nèi)注射，典型地不用佐劑。該實(shí)驗(yàn)方案導(dǎo)致在約40天后，抗原特異性抗體產(chǎn)生B細(xì) 胞的產(chǎn)生。還可以使用其他實(shí)驗(yàn)方案，只要它們導(dǎo)致表達(dá)針對(duì)免疫中使用的抗原的抗體的 B細(xì)胞的產(chǎn)生。
[0288] 對(duì)于多克隆抗體制劑，血清獲得自免疫的非人類動(dòng)物，并且通過(guò)熟知的技術(shù)分離 其中存在的抗體?？梢允褂眠B接至固相支撐體的上述任何免疫原對(duì)血清進(jìn)行親和力純化， 以便獲得與MICA多肽反應(yīng)的抗體。
[0289] 在一個(gè)替代實(shí)施方式中，分離來(lái)自非免疫的非人類哺乳動(dòng)物的淋巴細(xì)胞，在體外 生長(zhǎng)，并且然后暴露于細(xì)胞培養(yǎng)物中的免疫原。然后收獲淋巴細(xì)胞，并且進(jìn)行以下描述的融 合步驟。
[0290] 對(duì)于優(yōu)選的單克隆抗體，下一步是從免疫的非人類哺乳動(dòng)物分離脾細(xì)胞，并且隨 后那些脾細(xì)胞與無(wú)限增殖化細(xì)胞融合，以形成產(chǎn)生抗體的雜交瘤。從非人類哺乳動(dòng)物分離 脾細(xì)胞是本領(lǐng)域熟知的，并且典型地涉及從麻醉的非人類哺乳動(dòng)物移除脾臟，將它切成小 塊并且通過(guò)細(xì)胞篩的尼龍網(wǎng)將來(lái)自脾被膜的脾細(xì)胞擠入適當(dāng)緩沖劑中，以便產(chǎn)生單細(xì)胞懸 浮液。洗滌這些細(xì)胞，離心并且重新懸浮在溶解任何紅細(xì)胞的緩沖劑中。將該溶液再次離 心，并且最終將團(tuán)塊中的剩余淋巴細(xì)胞重新懸浮在新鮮緩沖劑中。
[0291] 一旦分離并且存在于單細(xì)胞懸浮液中，可以將淋巴細(xì)胞融合進(jìn)無(wú)限增殖細(xì)胞系。 這典型地是小鼠骨髓瘤細(xì)胞系，雖然對(duì)于產(chǎn)生雜交瘤而言有用的許多其他無(wú)限增殖細(xì)胞系 也是本領(lǐng)域已知的。優(yōu)選的鼠類骨髓瘤系包括但不局限于衍生自M0PC-21和MPC-Il小鼠 腫瘤的那些（可得自Salk Institute Cell Distribution Center (索爾克研究所細(xì)胞分 配中心），San Diego (圣迭戈），美國(guó)）和X63Ag8653和SP-2細(xì)胞（可得自American Type Culture Collection (美國(guó)典型微生物保藏中心），Rockville (羅克維爾），Maryland (馬 里蘭州），美國(guó)）。使用聚乙二醇等造成該融合。然后在包含抑制未融合親本骨髓瘤細(xì)胞的 生長(zhǎng)或存活的一種或多種物質(zhì)的選擇性培養(yǎng)基中生長(zhǎng)生成的雜交瘤。例如，如果親本骨髓 瘤細(xì)胞缺少次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT或HPRT)，則用于雜交瘤的培養(yǎng)基典型 地將包含次黃嘌呤、氨喋呤、和胸苷（HAT培養(yǎng)基），這些物質(zhì)防止HGPRT缺陷型細(xì)胞的生長(zhǎng)。
[0292] 典型地在巨噬細(xì)胞的飼養(yǎng)層上生長(zhǎng)雜交瘤。在平鋪雜交瘤之前，巨噬細(xì)胞優(yōu) 選地來(lái)自用于分離脾細(xì)胞的非人類哺乳動(dòng)物的同窩出生仔畜并且典型地用不完全弗 氏佐劑等致敏這些巨噬細(xì)胞若干天。融合方法描述于Goding(戈?。?Monoclonal Antibodies:Principles and Practice (單克隆抗體：原理和實(shí)踐）"，59_103 頁(yè)（Academic Press (學(xué)術(shù)出版社），1986)，將其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合在此。
[0293] 允許這些細(xì)胞在選擇培養(yǎng)基中生長(zhǎng)足夠的時(shí)間，以便集落形成和抗體產(chǎn)生。這通 常在約7天和約14天之間。
[0294] 然后針對(duì)特異性結(jié)合MICA多肽基因產(chǎn)物的抗體的產(chǎn)生測(cè)定雜交瘤集落，任選地 由抗體 6E4、20C6、16A8、9C10、19E9、12A10、10A7、18E8、10F3、15F9 或 14B4 特異性識(shí)別該表 位。該測(cè)定典型地是比色ELISA型測(cè)定，雖然可以采用能適合生長(zhǎng)雜交瘤的孔的任何測(cè)定。 其他測(cè)定包括放射免疫測(cè)定或熒光激活細(xì)胞分選術(shù)。檢查對(duì)于希望的抗體產(chǎn)生呈陽(yáng)性的 孔，以確定是否存在一個(gè)或多個(gè)明顯的集落。如果存在多于一個(gè)集落，則這些細(xì)胞可以重新 克隆并且生長(zhǎng)，以確保只有單個(gè)細(xì)胞已經(jīng)引起產(chǎn)生希望的抗體的集落。
[0295] 可以在適當(dāng)培養(yǎng)基，例如DMEM或RPMI-1640中，按更大量逐漸形成確認(rèn)為產(chǎn)生本 發(fā)明的單克隆抗體的雜交瘤。可選地，雜交瘤細(xì)胞可以在體內(nèi)生長(zhǎng)為動(dòng)物中的腹水瘤。
[0296] 在用來(lái)產(chǎn)生希望的單克隆抗體的充分生長(zhǎng)后，從這些細(xì)胞分離走包含單克隆抗 體（或腹水）的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，并且純化其中存在的單克隆抗體。典型地通過(guò)使用蛋白A或 蛋白G瓊脂糖（Sepharose)或連接至固相載體（例如瓊脂糖（agarose或Sepharose)珠 粒）的抗小鼠Ig的凝膠電泳、透析、色譜法實(shí)現(xiàn)純化（所有這些都描述于例如Antibody Purification Handbook^ 抗體純化手冊(cè)），Biosciences (生物科學(xué)），出版號(hào) 18-1037-46, AC版中，將其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合在此）。典型地通過(guò)使用具有含抗體部分的直接中和 作用的低PH緩沖劑（pH 3.0或更小的甘氨酸或乙酸緩沖劑），從蛋白A/G柱洗脫結(jié)合的抗 體。按需要，收集、透析并且濃縮這些部分。
[0297] 典型地重新克隆具有單個(gè)明顯集落的陽(yáng)性孔，并且重新測(cè)定以確保檢測(cè)到并且產(chǎn) 生唯--種單克隆抗體。
[0298] 還可以通過(guò)選擇免疫球蛋白組合文庫(kù)來(lái)產(chǎn)生抗體，如例如披露于（Ward (瓦爾德） 等人，Nature (自然），341 (1989) 544頁(yè)，將其完整公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合在此）。
[0299]結(jié)合 MICA，特別是結(jié)合與單克隆抗體 6E4、20C6、16A8、9C10、19E9、12A10、10A7、 18E8、10F3、15F9或14B4實(shí)質(zhì)上或基本上相同的表位的一種或多種抗體的鑒定會(huì)是使用其 中可以評(píng)價(jià)抗體競(jìng)爭(zhēng)的大量免疫篩選測(cè)定中的任意一種容易地確定的。許多此類測(cè)定是常 規(guī)實(shí)踐的并且是本領(lǐng)域熟知的（參見(jiàn)例如美國(guó)專利號(hào)5, 660, 827,1997年8月26日發(fā)布， 將其通過(guò)引用確切地結(jié)合在此）。將理解，鑒定結(jié)合與在此所述的單克隆抗體相同或?qū)嵸|(zhì)上 相同的表位的抗體不以任何方式需要實(shí)際確定在此所述的抗體結(jié)合的表位。
[0300] 例如，當(dāng)待檢查的抗體獲得自不同來(lái)源動(dòng)物，或甚至具有不同Ig同種型時(shí)，可以 采用簡(jiǎn)單的競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定，其中對(duì)照抗體（例如6E4、20C6、16A8、9C10、19E9、12A10、10A7、18E8、 10F3、15F9或14B4)和測(cè)試抗體經(jīng)過(guò)混合（或預(yù)吸收）并且應(yīng)用至含MICA多肽樣品?；?蛋白質(zhì)印跡法和BIAC0RE分析的使用的實(shí)驗(yàn)方案是適合用于此類競(jìng)爭(zhēng)研究的。
[0301] 在某些實(shí)施方式中，在應(yīng)用至MICA抗原樣品之前，將對(duì)照抗體（例如6E4、20C6或 16A8)與不同量的測(cè)試抗體預(yù)混合（例如約1:10或約1:100) -個(gè)時(shí)段。在其他實(shí)施方 式中，可以在暴露于MICA抗原樣品期間，將對(duì)照抗體與不同量的測(cè)試抗體簡(jiǎn)單混合。只要 可以區(qū)別來(lái)自游離抗體的結(jié)合（例如通過(guò)使用分離或洗滌技術(shù)以消除未結(jié)合抗體）和來(lái) 自測(cè)試抗體的6E4、20C6或16A8 (例如通過(guò)使用物種特異性或同種型特異性二抗或通過(guò)用 可檢測(cè)標(biāo)記特異性標(biāo)記6E4、20C6或16A8)，就可以確定測(cè)試抗體是否減少了 6E4、20C6或 16A8與抗原的結(jié)合，指示測(cè)試抗體識(shí)別與6E4、20C6或16A8實(shí)質(zhì)上相同的表位。在不存在 完全無(wú)關(guān)的抗體的情況下，（標(biāo)記的）對(duì)照抗體的結(jié)合可以用作對(duì)照高值?？梢酝ㄟ^(guò)將標(biāo) 記的（6E4、20C6或16A8)抗體與嚴(yán)格相同類型的未標(biāo)記抗體（6E4、20C6或16A8) -起溫 育而獲得對(duì)照低值，其中將發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)并且減少標(biāo)記抗體的結(jié)合。在測(cè)試測(cè)定中，在測(cè)試抗 體存在下，標(biāo)記抗體反應(yīng)性的顯著減少是識(shí)別實(shí)質(zhì)上相同的表位的測(cè)試抗體（即與標(biāo)記的 (6E4、20C6或16A8)抗體"交叉反應(yīng)"或競(jìng)爭(zhēng)的測(cè)試抗體）的指征。減少6E4、20C6或16A8 與MICA抗原的結(jié)合至少約50% (例如至少約60%、或更優(yōu)選至少約80%或90% (例如約 65% -100% ))的、處于約1:10和約1:100之間的6E4、20C6或16A8 :測(cè)試抗體的任何比 率的任何測(cè)試抗體被認(rèn)為是結(jié)合與6E4、20C6或16A8實(shí)質(zhì)上相同的表位或決定子的抗體。 優(yōu)選地，此類測(cè)試抗體將減少6E4、20C6或16A8與MICA抗原的結(jié)合至少約90% (例如約 95% ) 〇
[0302] 還可以通過(guò)例如流式細(xì)胞術(shù)測(cè)試評(píng)價(jià)競(jìng)爭(zhēng)。在這樣的測(cè)試中，例如可以首先將攜 帶給定MICA多肽的細(xì)胞與6E4、20C6或16A8 -起溫育，并且然后與用熒光染料或生物素標(biāo) 記的測(cè)試抗體一起溫育。如果當(dāng)與飽和量的6E4、20C6或16A8預(yù)溫育時(shí)獲得的結(jié)合是用不 與6E4、20C6或16A8 -起預(yù)溫育的抗體所獲得的結(jié)合（如借助熒光測(cè)量）的約80%、優(yōu)選 約50%、約40%或更少（例如約30%、20%或10% )，則該抗體被稱為與6E4、20C6或16A8 競(jìng)爭(zhēng)?？蛇x地，如果用與飽和量的測(cè)試抗體一起預(yù)溫育的細(xì)胞上的標(biāo)記的6E4、20C6或16A8 抗體所獲得的結(jié)合是不與測(cè)試抗體預(yù)溫育所獲得的結(jié)合的約80%、優(yōu)選約50%、約40%、 或更少（例如約30%、20%、或10%)，則抗體被稱為與6￡4、2006或1648競(jìng)爭(zhēng)。
[0303] 還可以采用其中測(cè)試抗體被預(yù)吸收并且以飽和濃度被應(yīng)用至其上固定MICA抗原 的表面上的簡(jiǎn)單的競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定。簡(jiǎn)單的競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定中的表面優(yōu)選是BIACORE芯片（或適合表面 等離子共振分析的其他介質(zhì)）。然后以MICA飽和濃度使對(duì)照抗體（例如6E4、20C6或16A8) 與該表面接觸，并且測(cè)量對(duì)照抗體的MICA和表面的結(jié)合。將對(duì)照抗體的結(jié)合與不存在測(cè) 試抗體時(shí)對(duì)照抗體與含MICA表面的結(jié)合進(jìn)行比較。在測(cè)試測(cè)定中，在存在測(cè)試抗體時(shí)，用 對(duì)照抗體的含MICA表面的結(jié)合的顯著減少指示測(cè)試抗體識(shí)別與對(duì)照抗體實(shí)質(zhì)上相同的表 位，這樣使得測(cè)試抗體與對(duì)照抗體"交叉反應(yīng)"。減少對(duì)照抗體（例如6E4、20C6或16A8)與 MICA抗原的結(jié)合至少約30%或更多、優(yōu)選約40%的任何測(cè)試抗體可以被認(rèn)為是結(jié)合與對(duì) 照抗體（例如6E4、20C6或16A8)實(shí)質(zhì)上相同的表位或決定子的抗體。優(yōu)選地，這樣的測(cè)試 抗體將減少對(duì)照抗體（例如6E4、20C6或16A8)與MICA抗原的結(jié)合至少約50% (例如至少 約60%、至少約70%、或更多）。將理解，在競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定中，對(duì)照抗體和測(cè)試抗體的順序可以顛 倒：即對(duì)照抗體可以首先結(jié)合該表面并且此后使測(cè)試抗體與該表面接觸。優(yōu)選地，對(duì)MICA 抗原具有更高親和力的抗體首先結(jié)合該表面，因?yàn)閷㈩A(yù)期對(duì)第二抗體所見(jiàn)的結(jié)合下降（假 定這些抗體是交叉反應(yīng)的）將具有更大幅值。在例如Saunal (薩納爾）（1995) J. Immunol. Meth〇ds(免疫方法期刊）183:33-41中提供了此類測(cè)定的另外實(shí)例，將其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引 用結(jié)合在此。
[0304] 優(yōu)選地，識(shí)別MICA表位的單克隆抗體將與按相當(dāng)大的百分比的或甚至所有的相 關(guān)MICA等位基因上存在的表位反應(yīng)。在一個(gè)方面，本發(fā)明的抗MICA抗體結(jié)合MICA*004和 *008,任選地另外的 MICA*001、*007 和 / 或 *0019。
[0305] 在優(yōu)選實(shí)施方式中，抗體將結(jié)合來(lái)自患有特征在于MICA陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)的疾病 的一個(gè)或多個(gè)的個(gè)體（即是使用本發(fā)明的抗MICA抗體用在此所述的方法之一治療的候選 人的個(gè)體）的MICA表達(dá)細(xì)胞。因此，一旦獲得特異性識(shí)別細(xì)胞上的MICA的抗體，可以測(cè)試 它結(jié)合MICA陽(yáng)性細(xì)胞（例如癌細(xì)胞）的能力。具體地，在用本發(fā)明的抗體之一治療患者之 前，測(cè)試該抗體結(jié)合取自患者的惡性細(xì)胞（例如在血樣或腫瘤活檢中）的能力將是有益的， 以最大化在患者中將是有益的治療的可能性。
[0306] 在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體是在用來(lái)測(cè)試它們結(jié)合MICA表達(dá)細(xì)胞（例如惡 性細(xì)胞）的能力的免疫測(cè)定中驗(yàn)證的。例如，進(jìn)行腫瘤活檢并且收集腫瘤細(xì)胞。然后使用 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法評(píng)價(jià)給定抗體結(jié)合細(xì)胞的能力。發(fā)現(xiàn)結(jié)合來(lái)自顯著百 分比的個(gè)體或患者（例如5%、10%、20%、30%、40%、50%或更多）的相當(dāng)大的部分（例 如20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或更多）的已知表達(dá)[04的細(xì)胞（例如腫瘤細(xì) 胞）的抗體適合用于本發(fā)明，都出于診斷目的，以確定患者中惡性細(xì)胞的存在或水平，或適 合用于在此所述的治療方法，例如適合用于增加或減少惡性細(xì)胞個(gè)數(shù)或活性。為了評(píng)價(jià)抗 體與細(xì)胞的結(jié)合，直接抑或間接標(biāo)記這些抗體。當(dāng)間接標(biāo)記時(shí)，典型地添加第二標(biāo)記抗體。
[0307] 可以按本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方式進(jìn)行抗體結(jié)合是否在表位區(qū)內(nèi)的測(cè)定。作 為此類作圖/表征方法的一個(gè)實(shí)例，可以通過(guò)使用MICA蛋白中暴露的氨基/羧基的化學(xué) 修飾的表位"足跡法"確定抗MICA抗體的表位區(qū)。這種足跡法技術(shù)的一個(gè)具體實(shí)例是使 用HXMS (通過(guò)質(zhì)譜法檢測(cè)氫-氘交換），其中發(fā)生受體和配體蛋白酰胺部分的氫/氘交換、 結(jié)合、和回交換，其中參與蛋白結(jié)合的主鏈酰胺基團(tuán)被保護(hù)免受回交換并且因此將保留氘 化。可以通過(guò)消化性蛋白水解、快速微內(nèi)徑高效液相色譜分離、和/或電噴霧離子化質(zhì)譜 法在這一點(diǎn)上鑒定相關(guān)區(qū)。參見(jiàn)例如Ehring(埃林）H，分析生物化學(xué)，卷267 (2) 252-259 頁(yè)（1999)￡叩611(恩金），]\1?和3111；[1:11(史密斯），0丄.（2001)六仙1.016111.(分析化學(xué)）73, 256A-265A。適合的表位鑒定技術(shù)的另一個(gè)實(shí)例是核磁共振表位作圖（NMR)，其中 典型地，對(duì)在游離抗原和與抗原結(jié)合肽（例如抗體）復(fù)合的抗原的二維NMR圖譜中的信號(hào) 的位置進(jìn)行比較。典型地用15N選擇性地同位素標(biāo)記抗原，這樣使得在NMR圖譜中只看見(jiàn) 對(duì)應(yīng)于抗原的信號(hào)并且沒(méi)有來(lái)自抗原結(jié)合肽的信號(hào)。與游離抗原的圖譜相比，源自與抗 原結(jié)合肽相互作用所涉及氨基酸的抗原信號(hào)典型地在復(fù)合物的圖譜中移位，并且可以按 此方式鑒定結(jié)合所涉及的氨基酸。參見(jiàn)例如Ernst Schering Res Found Workshop(厄 恩斯特先靈德雅研究基金會(huì)研討會(huì)）2004 ; (44) :149-67 ;Huang(黃）等人，Journal of Molecular Biology (分子生物學(xué)雜志），卷 281 (1)61-67 頁(yè)（1988);以及 Saito (齊藤）和 Patterson (帕特森），Methods (方法），1996 年 6 月；9 (3) : 516-24。
[0308]還可以使用質(zhì)譜法方法進(jìn)行表位作圖/表征。參見(jiàn)例如Downard(道爾德），J Mass Spectrom(質(zhì)譜法雜志）2000 年 4 月；35 (4) : 493-503 以及Kiselar (奎萊爾）和 Downard (道 爾德），Anal Chem.(分析化學(xué)1999年5月1 ;1 ;71 (9) : 1792-1801。在表位作圖和鑒定的 背景下，蛋白酶消化技術(shù)也會(huì)是有用的?？梢酝ㄟ^(guò)蛋白酶消化，例如通過(guò)在PH 7-8使用按 與MICA約1:50的比率使用胰蛋白酶或o/n消化，隨后是用于肽鑒定的質(zhì)譜法（MS)分析， 確定抗原決定子相關(guān)區(qū)/序列。可以隨后通過(guò)比較經(jīng)受胰蛋白酶消化的樣品和與抗體一起 溫育并且然后經(jīng)受例如胰蛋白酶消化的樣品，鑒定受抗MICA結(jié)合劑保護(hù)免受胰蛋白酶切 割的肽（由此揭示該結(jié)合劑的足跡）。而且或可選地，其他酶，像胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶等 可以用于類似表位表征方法。此外，酶消化可以提供用于分析潛在抗原決定子序列是否在 未表面暴露的并且因此在免疫原性/抗原性方面最可能不相關(guān)的MICA多肽的一個(gè)區(qū)內(nèi)的 快速方法。
[0309] 定點(diǎn)誘變是對(duì)解釋結(jié)合表位有用的另一技術(shù)。例如，在"丙氨酸掃描"中，蛋白 區(qū)段內(nèi)的每個(gè)殘基都被替換為丙氨酸殘基，并且測(cè)量結(jié)合親和力的結(jié)果。如果突變導(dǎo)致 結(jié)合親和力顯著減少，則它最可能涉及結(jié)合。特異性針對(duì)結(jié)構(gòu)表位的單克隆抗體（即并 不結(jié)合未折疊蛋白的抗體）可以用于驗(yàn)證丙氨酸替換并不影響蛋白的整體折疊。參見(jiàn)例 如 Clackson(克拉克森）和 Wells(韋爾斯），Science(科學(xué)）1995 ;267:383-386 ;以及 Wells (韋爾斯），Proc Natl Acad Sci USA (美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊）1996;93:1-6。
[0310] 電子顯微鏡還可以用于表位"足跡法"。例如，Wang(王）等人，Nature (自然）1992 ; 355:275-278使用冷凍電子顯微鏡術(shù)、三維圖象重構(gòu)、和X射線結(jié)晶學(xué)的配合應(yīng)用來(lái)確定在 天然豇豆花葉病毒的衣殼表面上的Fab片段的物理足跡。
[0311] 用于表位評(píng)估的其他形式的"無(wú)標(biāo)記"測(cè)定包括表面細(xì)胞質(zhì)基因組反響（SPR， BIAC0RE)和反射干涉頻譜法（RifS)。參見(jiàn)例如Fagcrstam(法格爾斯塔姆）等人， Journal Of Molecular Recognition(分子識(shí)別雜志）1990 ;3:208_14;Nice(耐斯）等 人，J.Chroma-togr.(色譜法雜志）1993;646:159-168 ;Leipert (萊佩特）等人，Angew. Chem. Int. Ed. (Angewandte Chemie International Edition (應(yīng)用化學(xué)國(guó)際版）1998 ; 37:33〇8_3311 ;K丨'6ger (克羅格爾）等人，Biosensors and Bioelectronics(生物傳感器 和生物電子學(xué)）2002;17:937-944。
[0312] 還應(yīng)注意到，可以在本文所述的一種或多種示例性競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定鑒定結(jié)合與本發(fā)明的 抗體相同的或?qū)嵸|(zhì)上相同的表位的抗體。
[0313] 在脊椎動(dòng)物或細(xì)胞中免疫接種并且產(chǎn)生抗體時(shí)，可以進(jìn)行具體的選擇步驟來(lái)分離 要求保護(hù)的抗體。在此方面，在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明還涉及產(chǎn)生此類抗體的方法， 該方法包括：(a)用包含MICA多肽的免疫原免疫非人類哺乳動(dòng)物；以及（b)制備來(lái)自所述 免疫動(dòng)物的抗體；以及（c)選擇能夠結(jié)合MICA的來(lái)自步驟（b)的抗體。
[0314] 典型地，由本發(fā)明提供的抗MICA抗體具有在約IO4至約IO 11ITi (例如約IO8至約 IOkT1)的范圍中的對(duì)MICA多肽的親和力。例如，在一個(gè)具體方面中，如通過(guò)例如表面細(xì)胞 質(zhì)基因組反響（SPR)篩選（例如通過(guò)用BIAcore? SPR分析裝置進(jìn)行分析）所確定，本發(fā)明 提供了具有關(guān)于MICA的小于lx KT9M的平均解離常數(shù)（Kd)的抗MICA抗體。在一個(gè)更具 體的示例性方面中，本發(fā)明提供了具有對(duì)MICA的約lx KT8M至約lxKTkiI^或約lx KT9M 至約lx KT11M的KD的抗MICA抗體。
[0315] 例如可以用不大于約（即親和力好于）100、60、10、5、或1納摩爾，優(yōu)選亞納摩爾或 任選地不大于約500、200、100或10皮摩爾的平均KD表征抗體。例如可以通過(guò)在芯片表面 上固定重組產(chǎn)生的人類MICA蛋白，隨后應(yīng)用溶液中的待測(cè)試抗體，確定KD。在一個(gè)實(shí)施方 式中，該方法進(jìn)一步包括步驟（d)，選擇對(duì)于結(jié)合MICA，能夠與抗體6E4、20C6、16A8、9C10、 19￡9、12八10、1(^7、18￡8、1(^3、15?9或1484競(jìng)爭(zhēng)的來(lái)自〇3)的抗體。
[0316] 在任何實(shí)施方式的一個(gè)方面中，根據(jù)本發(fā)明的方法制備的抗體是單克隆抗體。 在另一個(gè)方面中，用于產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的方法的抗體的非人類動(dòng)物是哺乳動(dòng)物，例如嚙 齒動(dòng)物、牛、豬、禽類、馬、兔、山羊、或綿羊。本發(fā)明的抗體涵蓋6E4、20C6、16A8、9C10、 19E9、12A10、10A7、18E8、10F3、15F9或14B4。額外地，本發(fā)明的抗體可以任選地被指定 為除了在Salih(薩利赫）等人（2003) (Blood(血液）102(4) :1389-1396)中描述的抗體 BAMOl 或 BAM03,在 Groh(格羅）等人（1996)Proc. Natl. Acad. Sci USA(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院 院刊）93:12445-12450、Groh (格羅）等人（1998) Science (科學(xué)）279:1737-1740 或 WO 2008/131406中描述的抗體2C10、3H5、6D4或6G6(這些參考文獻(xiàn)中的每一個(gè)的公開(kāi)內(nèi)容通 過(guò)引用結(jié)合在此），或以上內(nèi)容的衍生物，例如完整或部分地包括這些CDR或抗原結(jié)合區(qū)的 衍生物中的任一種的抗體。
[0317] 根據(jù)本發(fā)明的替代實(shí)施方式，從本發(fā)明的雜交瘤中分離編碼結(jié)合存在于MICA多 肽上的表位的抗體的DNA，并且將其放入用于轉(zhuǎn)染進(jìn)適當(dāng)宿主的適當(dāng)表達(dá)載體中。然后將宿 主用于重組產(chǎn)生抗體、或其變體，例如單克隆抗體的人源化版本、抗體的活性片段、包含抗 體的抗原識(shí)別部分的嵌合抗體、或包含可檢測(cè)部分的版本。
[0318] 可任意容易地分離編碼本發(fā)明的單克隆抗體，例如抗體6E4、20C6、16A8、9C10、 19E9、12A10、10A7、18E8、10F3、15F9或14B4的DNA，并且使用常規(guī)程序（例如通過(guò)使用能夠 特異性結(jié)合編碼鼠抗體的重鏈和輕鏈的寡核苷酸探針）對(duì)其進(jìn)行測(cè)序。一旦分離，可以將 DNA放入表達(dá)載體，然后將這些表達(dá)載體轉(zhuǎn)染進(jìn)不另外產(chǎn)生免疫球蛋白的宿主細(xì)胞，例如大 腸桿菌細(xì)胞、猴COS細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（CHO)細(xì)胞、或骨髓瘤細(xì)胞，以獲得重組宿主細(xì)胞中 單克隆抗體的合成。如在本說(shuō)明書的其他地方所述，此類DNA序列可以被修飾用于大量目 的中的任一個(gè)，例如用于人源化抗體，產(chǎn)生片段或衍生物，或用于修飾抗體序列（例如在抗 原結(jié)合位點(diǎn)中），以優(yōu)化抗體的結(jié)合特異性。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明包括編碼抗體（例 如 6E4、20C6、16A8、9C10、19E9、12A10、10A7、18E8、10F3、15F9 或 14B4)的輕鏈和 / 或重鏈的 分離的核酸序列，連同包含此類核酸（例如在其基因組中）的重組宿主細(xì)胞。
[0319] 編碼抗體的DNA的細(xì)菌中重組表達(dá)是本領(lǐng)域熟知的（參見(jiàn)例如Skerra(斯凱拉） 等人，Curr. Opinion in Immunol.(免疫學(xué)當(dāng)前觀點(diǎn)），5, 256 頁(yè)（1993);以及Pluckthun (普 呂克通），Immunol.(免疫學(xué)）13〇, I5I 頁(yè)（I"2)。
[0320] 評(píng)價(jià)活性
[0321] 一旦獲得抗原結(jié)合化合物，將通常評(píng)價(jià)它阻斷NKG2D和MICA (例如sMICA或膜結(jié) 合MICA)之間的相互作用、阻斷MICA從細(xì)胞脫落、抑制sMICA誘導(dǎo)的NKG2D下調(diào)、導(dǎo)致MICA 表達(dá)細(xì)胞的死亡、誘導(dǎo)ADCC或CDC指向、和/或抑制MICA表達(dá)靶細(xì)胞的增殖和/或?qū)е滤?們的消除的能力。
[0322] 可以在本方法的任何適合的階段進(jìn)行抗原結(jié)合化合物的減少M(fèi)ICA和NKG2D之間 的結(jié)合或阻斷它們之間的相互作用的能力的評(píng)價(jià)，例如，如在此提供的實(shí)例中。例如，可以 使在它們的表面上表達(dá)MICA的腫瘤細(xì)胞與在它們的表面上表達(dá)NKG2D的細(xì)胞（例如效應(yīng) 細(xì)胞）接觸，其中添加或不添加候選抗MICA抗體?？梢栽u(píng)價(jià)MICA表達(dá)細(xì)胞和NKG2D表達(dá) 細(xì)胞之間的結(jié)合，并且選擇并不減少結(jié)合的抗體。另一種可能性涉及使分離的MICA多肽 與分離的NKG2D多肽接觸，或與在其表面上表達(dá)NKG2D多肽的細(xì)胞接觸，并且評(píng)價(jià)MICA和 NKG2D多肽或表達(dá)NKG2D的細(xì)胞之間的結(jié)合。另一種可能性涉及使分離的NKG2D多肽與在 其表面上表達(dá)MICA多肽的細(xì)胞接觸，并且評(píng)價(jià)MICA多肽或表達(dá)MICA的細(xì)胞之間的結(jié)合。
[0323] 例如，為了確定一種劑是否阻斷MICA與NKG2D的相互作用，進(jìn)行以下測(cè)試：在增 加濃度的測(cè)試抗MICA mAb存在或不存在下，將用MICA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系ClR或RMA與可溶性 NKG2D-FC融合蛋白一起溫育。洗滌這些細(xì)胞，然后與識(shí)別NKG2D-FC融合蛋白的Fc部分的 二抗一起溫育，再次洗漆，并且在流式細(xì)胞儀（FACScalibur，Beckton Dickinson公司）上 用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行分析。當(dāng)不存在抗MICA mAb時(shí)，NKG2D-FC蛋白很好地結(jié)合ClR或RMA細(xì) 胞。在阻斷MICA與NKG2D結(jié)合的抗MICA mAb存在時(shí)，存在NKG2D-FC與細(xì)胞的結(jié)合的減少。
[0324] 優(yōu)選地，還可以通過(guò)評(píng)價(jià)抗MICA抗體對(duì)NKG2D表達(dá)細(xì)胞（例如NK或T細(xì)胞）的 功能的影響，進(jìn)行抗原結(jié)合化合物的減少M(fèi)ICA和NKG2D之間的結(jié)合或阻斷它們之間的相互 作用的能力的評(píng)價(jià)。優(yōu)選地，使用表達(dá)NKG2D而不表達(dá)CD16的NK細(xì)胞或T細(xì)胞，以便避 免⑶16介導(dǎo)的ADCC作用的任何貢獻(xiàn)。如果抗MICA抗體減少或阻斷了 MICA-NKG2D相互作 用，則它將被預(yù)期用于抑制NKG2D介導(dǎo)的NK細(xì)胞或T細(xì)胞的激活。因此，并不減少M(fèi)ICA和 NKG2D之間的結(jié)合或阻斷它們之間的相互作用的抗體將不實(shí)質(zhì)上減少或阻斷NKG2D介導(dǎo)的 NK細(xì)胞或T細(xì)胞的激活。可以通過(guò)典型的細(xì)胞毒性測(cè)定對(duì)此進(jìn)行評(píng)估，本文描述了它的實(shí) 例?？梢允褂枚喾N基于細(xì)胞的測(cè)定中的任一種來(lái)評(píng)價(jià)NKG2D活性，這些測(cè)定包括基于基因 表達(dá)的測(cè)定，基于細(xì)胞毒性的測(cè)定，以及增殖測(cè)定。在一個(gè)方面中，體外測(cè)定將使用來(lái)自人 類患者的NK細(xì)胞或T細(xì)胞，例如用NKG2D編碼轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)染的T細(xì)胞系，只要受體的表達(dá)以 可檢測(cè)方式改變細(xì)胞活性，例如使它們被NKG2D配體可激活。反映NKG2D活性的任何適合 的生理學(xué)變化可以用于評(píng)價(jià)測(cè)試化合物或抗體的功用。例如，可以測(cè)量大量作用，例如基 因表達(dá)、細(xì)胞因子產(chǎn)生、細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞增殖、pH、細(xì)胞內(nèi)第二信使（例如Ca2+、IP3、cGMP、 或cAMP)、活性（例如細(xì)胞毒性活性）或激活其他T細(xì)胞的能力中的變化。在一個(gè)實(shí)施方 式中，可以通過(guò)檢測(cè)疆620響應(yīng)基因（例如^25、正^￥、或1即-〇)的表達(dá)來(lái)評(píng)價(jià)受體 的活性（參見(jiàn)例如Groh(格羅）等人（2003)PNAS(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊）100:9452-9457 ; Andr6 (安德烈）等人（2004) Eur. J. Immunol (歐洲免疫學(xué)雜志）34:1-11)。在一個(gè)實(shí)施方 式中，通過(guò)在MICA表達(dá)細(xì)胞和抗MICA抗體存在下溫育NKG2D+T細(xì)胞或NK細(xì)胞評(píng)價(jià)NKG2D 活性，并且評(píng)價(jià)化合物或測(cè)試抗體抑制由T細(xì)胞或NK細(xì)胞釋放TNF- a或IFN- Y的能力。
[0325] 在本文的實(shí)施例中也描述了示例性細(xì)胞毒測(cè)定，其中評(píng)價(jià)了 NKG2D介導(dǎo)的靶細(xì)胞 的殺滅。在此，通過(guò)測(cè)量51Cr的靶細(xì)胞釋放，抗MICA抗體減少或抑制NKG2D+CD16-NK92 細(xì)胞的能力被用于評(píng)價(jià)NK細(xì)胞介導(dǎo)的MICA*019轉(zhuǎn)染的BaF/3的殺滅。通過(guò)本領(lǐng)域熟 知的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行體外細(xì)胞毒性測(cè)定，例如，如在Coligan(科利根）等人編輯，Current Protocols in Immunology (免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)指南），Greene Publishing Assoc.(格林出版協(xié) 會(huì)）和Wiley Interscience (威利國(guó)際科學(xué)），N. Y.(紐約州），（1992,1993)中所述。在添 加NK細(xì)胞之前用51Cr標(biāo)記MICA表達(dá)靶細(xì)胞，然后殺滅被估計(jì)為與由于殺滅的結(jié)果的從細(xì) 胞至培養(yǎng)基的 51Cr的釋放成比例。減少M(fèi)ICA和NKG2D之間的結(jié)合或阻斷它們之間的相互 作用的劑的添加導(dǎo)致防止了經(jīng)由NKG2D的活化信號(hào)傳遞的引發(fā)和蔓延。因此，此類劑的添 加導(dǎo)致靶細(xì)胞的NK介導(dǎo)的殺滅減少。
[0326] 不減少或阻斷通過(guò)NKG2D的細(xì)胞激活（例如細(xì)胞因子產(chǎn)生、細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞增殖、 pH、細(xì)胞內(nèi)第二信使、NK介導(dǎo)的MICA表達(dá)細(xì)胞的殺滅）的抗原結(jié)合化合物（例如不減少或 減少小于5%、10%、20%或30%)被稱為"非阻斷"11^13。減少或阻斷通過(guò)^?20的細(xì)胞激 活的抗原結(jié)合化合物被稱為"阻斷" mAb。
[0327] 可以在本方法的任何適合的階段進(jìn)行抗原結(jié)合化合物的阻斷MICA從MICA表達(dá) 細(xì)胞的脫落的能力的評(píng)價(jià)，例如，如在此提供的實(shí)例中。在一個(gè)實(shí)例中，提供了細(xì)胞樣品并 且使用ELISA方法檢測(cè)可溶性細(xì)胞外MICA。在一個(gè)實(shí)例中，將本發(fā)明的抗原結(jié)合化合物 給予哺乳動(dòng)物，并且測(cè)量循環(huán)sMICA的存在或不存在或其水平。體外檢測(cè)的實(shí)例描述于 Nolting(諾爾廷）等人（2010)Virology(病毒學(xué)）406(1) : 12-20中。簡(jiǎn)要地，可以使用可 商購(gòu)的MICAELISA藥盒（Bamomab，慕尼黑，德國(guó)）。用PBS中的按2iig/ml的捕獲抗MICA mAb BAM0-1將平板涂覆過(guò)夜，然后通過(guò)添加100 ill的15% BSA在37°C封閉2h并且洗滌。 添加標(biāo)準(zhǔn)物和樣品并且將平板在37°C溫育2h。洗滌平板并且添加在7. 5% BSA-PBS中的按 5 y g/ml的檢測(cè)mAb BAM0-3,在37°C持續(xù)2h。然后洗滌平板并且添加抗小鼠IgG2a-HRP (在 7. 5% BSA-PBS中1:8000)，在37°C持續(xù)lh。然后洗滌平板并且使用過(guò)氧化物酶底物系統(tǒng) (KPL公司，Gaithersburg (蓋瑟斯堡），馬里蘭州）進(jìn)行顯影。在450nm測(cè)量吸光度。
[0328] 可以在本方法的任何適合的階段進(jìn)行抗原結(jié)合化合物誘導(dǎo)ADCC、CDC或另外（例 如通過(guò)遞送毒劑）導(dǎo)致MICC表達(dá)靶細(xì)胞的活性的消除或抑制的能力的評(píng)價(jià)，例如，如本文 提供的實(shí)施例中。這一評(píng)價(jià)在為了治療用途涉及的抗體（或其他化合物）的鑒定、產(chǎn)生和 /或開(kāi)發(fā)中涉及的不同步驟中的一個(gè)或多個(gè)上會(huì)是有用的。例如，可以在用來(lái)鑒定候選抗 原結(jié)合化合物的篩選方法的背景下，或者在其中將抗原結(jié)合化合物選擇并制造為適合人類 (例如在抗體的情況下制成嵌合抗體或人源化抗體）的方法中評(píng)價(jià)活性，其中已經(jīng)獲得表 達(dá)抗原結(jié)合化合物的細(xì)胞（例如表達(dá)重組抗原結(jié)合化合物的宿主細(xì)胞），并且評(píng)價(jià)它產(chǎn)生 功能抗體（或其他化合物）的能力，和/或其中已經(jīng)產(chǎn)生一些抗原結(jié)合化合物，并且要評(píng)價(jià) 其活性（例如至測(cè)試批次或大量產(chǎn)品）。通常將已知抗原結(jié)合化合物特異性結(jié)合MICA多 肽。該步驟可以涉及測(cè)試多個(gè)（例如使用高通量篩選方法的非常大量的或更小量的）抗原 結(jié)合化合物。
[0329] 可以通過(guò)包括本文的實(shí)驗(yàn)實(shí)施例中所述的那些的不同測(cè)定來(lái)確定可以進(jìn)行CDC 和ADCC的測(cè)試。典型地，測(cè)試ADCC涉及評(píng)價(jià)細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性，其中由效應(yīng)細(xì)胞（例如 攜帶Fc受體的白細(xì)胞）識(shí)別具有結(jié)合的抗MICA抗體的MICA表達(dá)靶細(xì)胞（例如癌細(xì)胞或 其他MICA表達(dá)細(xì)胞），而不涉及補(bǔ)體。任選地可以使用不表達(dá)MICA抗原的細(xì)胞作為對(duì)照。 通過(guò)測(cè)量細(xì)胞因子產(chǎn)生（例如IFN-Y產(chǎn)生）或細(xì)胞毒性標(biāo)記物（例如CD107轉(zhuǎn)移）中的 增加來(lái)評(píng)價(jià)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性的激活。優(yōu)選地，與對(duì)照抗體（例如不結(jié)合MICA的抗體、具 有鼠恒定區(qū)的MICA抗體）相比，在靶細(xì)胞（例如MICA表達(dá)細(xì)胞）存在下，本發(fā)明的抗體 將誘導(dǎo)至少20 %、50 %、80 %、100 %、200 %或500 %的細(xì)胞因子產(chǎn)生、細(xì)胞毒性標(biāo)記物的表 達(dá)、或靶細(xì)胞溶解中的增加。在另一個(gè)實(shí)例中，例如在鉻釋放測(cè)定中，檢測(cè)到靶細(xì)胞溶解，優(yōu) 選地，本發(fā)明的抗體將誘導(dǎo)至少10 %、20 %、30 %、40 %或50 %的靶細(xì)胞的溶解。
[0330] 抗體CDR序列
[0331]抗體 6E4
[0332] 抗體6E4的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列被列出為SEQ ID NO: 7,輕鏈可變區(qū)的氨基酸 序列被列出為SEQ ID N0:8。融合進(jìn)人類鏈恒定區(qū)（分別是重鏈和輕鏈）的抗體6E4的重 鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列分別被列出為SEQ ID N0:9和10。在一個(gè)具體實(shí)施 方式中，本發(fā)明提供了結(jié)合與單克隆抗體6E4基本上相同的表位或決定子的抗體，任選地 該抗體包括抗體6E4的抗原結(jié)合區(qū)。在本文的任何實(shí)施方式中，抗體6E4可以特征在于它 的氨基酸序列和/或編碼它的核酸序列。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，該單克隆抗體包括6E4 的Fab或F(ab'） 2部分。還提供了包括6E4的重鏈可變區(qū)的單克隆抗體。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方 式，該單克隆抗體包括6E4的重鏈可變區(qū)的三個(gè)⑶R。還提供了一種單克隆抗體，該單克隆 抗體進(jìn)一步包括6E4的可變輕鏈可變區(qū)，或6E4的輕鏈可變區(qū)的CDR中的一個(gè)、兩個(gè)或三 個(gè)。任選地，所述輕鏈或重鏈⑶R中的任何一個(gè)或多個(gè)可以包含一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或五 個(gè)或更多個(gè)氨基酸修飾（例如取代、插入或缺失）。任選地，提供的是：其中輕鏈可變區(qū)和 /或重鏈可變區(qū)中的任一個(gè)包括抗體6E4的抗原結(jié)合區(qū)的一部分或全部的抗體被融合進(jìn)人 類IgG型的免疫球蛋白恒定區(qū)，任選地是人類恒定區(qū)，任選地是人類IgGl或IgG3同種型。
[0333] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了編碼抗體的純化的多肽，其中該抗體包括：HCDRl 區(qū)，該HCDRl區(qū)包括如在SEQ ID NO: 11-13中列出的氨基酸序列SYYAMS、GFTFSY或 GFTFSYYAMS，或它們的至少4、5、6、7、8、9或10個(gè)連續(xù)氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的 一個(gè)或多個(gè)可以被取代為不同的氨基酸；HCDR2區(qū)，該HCDR2區(qū)包括如在SEQ ID NO: 14-15 中列出的氨基酸序列TISRGGNYIYYIDSVKG或TISRGGNYIY，或它們的至少4、5、6、7、8、9或 10個(gè)連續(xù)氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的一個(gè)或多個(gè)可以被取代為不同的氨基酸； HCDR3區(qū)，該HCDR3區(qū)包括如在SEQ ID NO: 16中列出的氨基酸序列ISDYDGAWLAY，或它的 至少4、5、6、7、8、9或10個(gè)連續(xù)氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的一個(gè)或多個(gè)可以被取 代為不同的氨基酸；IXDRl區(qū)，該IXDRl區(qū)包括如在SEQ ID NO: 17中列出的氨基酸序列 RSSQSIIHTNGNTYLE，或它的至少4、5、6、7、8、9或10個(gè)連續(xù)氨基酸的序列，其中這些氨基酸 中的一個(gè)或多個(gè)可以被取代為不同的氨基酸；IXDR2區(qū)，該IXDR2區(qū)包括如在SEQ ID NO: 18 列出的氨基酸序列KISNRFS，或它的至少4、5、6、7、8、9或10個(gè)連續(xù)氨基酸的序列，其中這 些氨基酸中的一個(gè)或多個(gè)可以被取代為不同的氨基酸；LCDR3區(qū)，該LCDR3區(qū)包括如在SEQ ID NO: 19中列出的氨基酸序列FQGSHVPWT，或它的至少4、5、6、7、8、9或10個(gè)連續(xù)氨基酸的 序列，其中這些氨基酸中的一個(gè)或多個(gè)可以被缺失或取代為不同的氨基酸。
[0334] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了結(jié)合人類MICA的抗體，該抗體包括：
[0335] (a) SEQ ID NO: 7的重鏈可變區(qū)，其中一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取代 為不同的氨基酸；和/或
[0336] (b)SEQ ID N0:8的輕鏈可變區(qū)，其中一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取代 為不同的氨基酸；和/或
[0337] (c)SEQ ID N0:7的重鏈可變區(qū)，其中這些氨基酸中的一個(gè)或多個(gè)可以被取代為不 同的氨基酸；以及SEQ ID N0:8的輕鏈可變區(qū)，其中一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被 取代為不同的氨基酸；和/或
[0338] (d)如 SEQ ID NO: 11 至 16 中所示的重鏈 CDR 1、2 和 3(HCDR1、HCDR2)氨基酸序 列，其中CDR中的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取代為不同的氨基酸；和/或
[0339] (6)如5已0 10勵(lì)：17、18和19中所示的輕鏈〇)1?1、2和3(1〇)1?1、1〇)1?2、1〇)1?3)氨 基酸序列，其中CDR中的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取代為不同的氨基酸；和/ 或
[0340] (f)如 SEQ ID NO: 11 至 16 中所示的重鏈 CDR1、2 和 3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基 酸序列，其中CDR中的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取代為不同的氨基酸；以及 如SEQ ID N0:17、18和19中所示的輕鏈CDR1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列，其 中CDR中的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取代為不同的氨基酸；和/或
[0341] (g)與具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的可變區(qū)至少60%、70%、80%、85%、90% 或95%相同的重鏈可變區(qū)，其中CDR中的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取代為不 同的氨基酸；和/或
[0342] (h)與具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的可變區(qū)至少60%、70%、80%、85%、90% 或95%相同的輕鏈可變區(qū)，其中CDR中的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取代為不 同的氨基酸。
[0343] 在本文的任何實(shí)施方式的另一個(gè)方面，重鏈和輕鏈的⑶R 1、2和3中的任一個(gè)可 以特征在于它的至少4、5、6、7、8、9或10個(gè)連續(xù)氨基酸的序列，和/或特征為具有與對(duì)應(yīng) SEQ ID NO中列出的具體CDR或CDR組共享至少50%、60%、70%、80%、85%、90%或95% 序列同一性的氨基酸序列。
[0344] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了對(duì)于MICA結(jié)合，與以上（a)至（h)的單克隆抗體競(jìng) 爭(zhēng)的抗體。
[0345] 抗體 20C6
[0346] 抗體20C6的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列被列出為SEQ ID NO: 20,輕鏈可變區(qū)的氨基 酸序列被列出為SEQ ID N0:21。融合進(jìn)重鏈恒定區(qū)（分別是重鏈和輕鏈）的抗體20C6的 重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列分別被列出為SEQ ID N0:22和23。在一個(gè)具體實(shí) 施方式中，本發(fā)明提供了結(jié)合與單克隆抗體20C6基本上相同的表位或決定子的抗體，任選 地該抗體包括抗體20C6的抗原結(jié)合區(qū)。在本文的任何實(shí)施方式中，抗體20C6可以特征在 于它的氨基酸序列和/或編碼它的核酸序列。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，該單克隆抗體包括 20C6的Fab或F(ab'） 2部分。還提供了包括20C6的重鏈可變區(qū)的單克隆抗體。根據(jù)一個(gè) 實(shí)施方式，該單克隆抗體包括20C6的重鏈可變區(qū)的三個(gè)⑶R。還提供了一種單克隆抗體，該 單克隆抗體進(jìn)一步包括20C6的可變輕鏈可變區(qū)，或20C6的輕鏈可變區(qū)的CDR中的一個(gè)、兩 個(gè)或三個(gè)。任選地，所述輕鏈或重鏈⑶R中的任何一個(gè)或多個(gè)可以包含一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四 個(gè)或五個(gè)或更多個(gè)氨基酸修飾（例如取代、插入或缺失）。任選地，提供的是：其中輕鏈可 變區(qū)和/或重鏈可變區(qū)中的任一個(gè)包括抗體16A8的抗原結(jié)合區(qū)的一部分或全部的抗體被 融合進(jìn)IgG型的免疫球蛋白恒定區(qū)，任選地是人類恒定區(qū)，任選地是IgGl或IgG3同種型。
[0347] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了編碼抗體的純化的多肽，其中該抗體包括：HCDRl 區(qū)，該HCDRl區(qū)包括如在SEQ ID N0:24-26中列出的氨基酸序列TSGMGVG、GFSLSTSG或 GFSLSTSGMGVG，或它們的至少4、5、6、7、8、9或10個(gè)連續(xù)氨基酸的序列，其中這些氨基 酸中的一個(gè)或多個(gè)可以被取代為不同的氨基酸；HCDR2區(qū)，該HCDR2區(qū)包括如在SEQ ID NO: 27-28中列出的氨基酸序列HIffffDDDKYYNPSLK或HIWWDDDK，或它們的至少4、5、6、7、8、9 或10個(gè)連續(xù)氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的一個(gè)或多個(gè)可以被取代為不同的氨基酸； HCDR3區(qū)，該HCDR3區(qū)包括如在SEQ ID NO: 29中列出的氨基酸序列RTQGYFDY，或它的至少4、 5、6、7、8、9或10個(gè)連續(xù)氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的一個(gè)或多個(gè)可以被取代為不同 的氨基酸；LCDRl區(qū)，該LCDRl區(qū)包括如在SEQ ID N0:30中列出的氨基酸序列RASQSISDYLH， 或它的至少4、5、6、7、8、9或10個(gè)連續(xù)氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的一個(gè)或多個(gè)可以 被取代為不同的氨基酸；LCDR2區(qū)，該LCDR2區(qū)包括如在SEQ ID N0:31列出的氨基酸序列 YASQSIS，或它的至少4、5、6、7、8、9或10個(gè)連續(xù)氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的一個(gè)或 多個(gè)可以被取代為不同的氨基酸；IXDR3區(qū)，該IXDR3區(qū)包括如在SEQ ID NO:32中列出的 氨基酸序列QNGHSFPWT，或它的至少4、5、6、7、8、9或10個(gè)連續(xù)氨基酸的序列，其中這些氨基 酸中的一個(gè)或多個(gè)可以被缺失或取代為不同的氨基酸，或其中該序列可以包括一個(gè)或多個(gè) 氨基酸的插入。
[0348] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了結(jié)合人類MICA的抗體，該抗體包括：
[0349] (a) SEQ ID NO: 20的重鏈可變區(qū)，其中⑶R中的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可 以被取代為不同的氨基酸；和/或
[0350] (b)SEQIDNO: 21的輕鏈可變區(qū)，其中⑶R中的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可 以被取代為不同的氨基酸；和/或
[0351] (c)SEQIDN0:20的重鏈可變區(qū)，其中一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)可以被取代為不 同的氨基酸；以及SEQIDN0:21的輕鏈可變區(qū)，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸可以被取代為不同 的氨基酸；和/或
[0352] (d)如 SEQ ID N0:24-29 中所示的重鏈 CDR 1、2 和 3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基 酸序列，其中CDR中的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取代為不同的氨基酸；和/或
[0353] (e)如 SEQ ID N0:30、31 和 32 中所示的輕鏈 CDR1、2 和 3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨 基酸序列，其中CDR中的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取代為不同的氨基酸；和/ 或
[0354] (f)如 SEQ ID N0:24 至 29 中所示的重鏈 CDR1、2 和 3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基 酸序列，其中CDR中的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取代為不同的氨基酸；以及 如SEQ ID N0:30、31和32中所示的輕鏈CDR1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列，其 中CDR中的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取代為不同的氨基酸；和/或
[0355] (g)與具有SEQIDN0:20的氨基酸序列的可變區(qū)至少60%、70%、80%、85%、 90%或95%相同的重鏈可變區(qū),其中一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取代為不同的 氨基酸；和/或
[0356] (h)與具有SEQIDN0:21的氨基酸序列的可變區(qū)至少60%、70%、80%、85%、 90%或95%相同的輕鏈可變區(qū)，其中一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取代為不同的 氨基酸。
[0357] 在本文的任何實(shí)施方式的另一個(gè)方面，重鏈和輕鏈的⑶R 1、2和3中的任一個(gè)可 以特征在于它的至少4、5、6、7、8、9或10個(gè)連續(xù)氨基酸的序列，和/或特征為具有與對(duì)應(yīng) SEQ ID NO中列出的具體CDR或CDR組共享至少50%、60%、70%、80%、85%、90%或95% 序列同一性的氨基酸序列。
[0358] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了對(duì)于MICA結(jié)合，與以上（a)至（h)的單克隆抗體競(jìng) 爭(zhēng)的抗體。
[0359]抗體16A8
[0360] 抗體16A8的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列被列出為SEQ ID NO: 33,輕鏈可變區(qū)的氨基 酸序列被列出為SEQ ID NO:34。融合進(jìn)重鏈恒定區(qū)（分別是重鏈和輕鏈）的抗體16A8的 重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列分別被列出為SEQ ID NO:35和36。在一個(gè)具體實(shí) 施方式中，本發(fā)明提供了結(jié)合與單克隆抗體16A8基本上相同的表位或決定子的抗體；任選 地該抗體包括抗體16A8的抗原結(jié)合區(qū)。在本文的任何實(shí)施方式中，抗體16A8可以特征在 于它的氨基酸序列和/或編碼它的核酸序列。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，該單克隆抗體包括 16A8的Fab或F(ab'） 2部分。還提供了包括16A8的重鏈可變區(qū)的單克隆抗體。根據(jù)一個(gè) 實(shí)施方式，該單克隆抗體包括16A8的重鏈可變區(qū)的三個(gè)⑶R。還提供了一種單克隆抗體，該 單克隆抗體進(jìn)一步包括16A8的可變輕鏈可變區(qū)，或16A8的輕鏈可變區(qū)的CDR中的一個(gè)、兩 個(gè)或三個(gè)。任選地，所述輕鏈或重鏈⑶R中的任何一個(gè)或多個(gè)可以包含一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四 個(gè)或五個(gè)或更多個(gè)氨基酸修飾（例如取代、插入或缺失）。任選地，提供的是：其中輕鏈可 變區(qū)和/或重鏈可變區(qū)中的任一個(gè)包括抗體16A8的抗原結(jié)合區(qū)的一部分或全部的抗體被 融合進(jìn)IgG型的免疫球蛋白恒定區(qū)，任選地是人類恒定區(qū)，任選地是IgGl或IgG3同種型。
[0361] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了編碼抗體的純化的多肽，其中該抗體包括：HCDRl 區(qū)，該HCDRl區(qū)包括如在SEQ ID NO: 37-39中列出的氨基酸序列RYAMS、GFTFSR或 GFTFSRYAMS，或它們的至少4、5、6、7、8、9或10個(gè)連續(xù)氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的 一個(gè)或多個(gè)可以被取代為不同的氨基酸；HCDR2區(qū)，該HCDR2區(qū)包括如在SEQ ID NO:40-41 中列出的氨基酸序列TIFSGGSYTYYPDSV或TIFSGGSY，或它們的至少4、5、6、7、8、9或10個(gè)連 續(xù)氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的一個(gè)或多個(gè)可以被取代為不同的氨基酸；HCDR3區(qū)， 該HCDR3區(qū)包括如在SEQ ID N0:42中列出的氨基酸序列PNWERTFDY，或它的至少4、5、6、7、 8、9或10個(gè)連續(xù)氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的一個(gè)或多個(gè)可以被取代為不同的氨基 酸；LCDRl區(qū)，該LCDRl區(qū)包括如在SEQ ID N0:43中列出的氨基酸序列KSSQSLLNSSNQKNYL， 或它的至少4、5、6、7、8、9或10個(gè)連續(xù)氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的一個(gè)或多個(gè)可以 被取代為不同的氨基酸；LCDR2區(qū)，該LCDR2區(qū)包括如在SEQ ID NO:44列出的氨基酸序列 FASTRES，或它的至少4、5、6、7、8、9或10個(gè)連續(xù)氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的一個(gè)或 多個(gè)可以被取代為不同的氨基酸；IXDR3區(qū)，該IXDR3區(qū)包括如在SEQ ID N0:45中列出的 氨基酸序列QQHYSTPPT，或它的至少4、5、6、7、8、9或10個(gè)連續(xù)氨基酸的序列，其中這些氨基 酸中的一個(gè)或多個(gè)可以被缺失或取代為不同的氨基酸，或其中該序列可以包括一個(gè)或多個(gè) 氨基酸的插入。
[0362] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了結(jié)合人類MICA的抗體，該抗體包括：
[0363] (a) SEQ ID NO: 33的重鏈可變區(qū)，其中一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取 代為不同的氨基酸；和/或
[0364] (b) SEQ ID NO: 34的輕鏈可變區(qū)，其中一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取 代為不同的氨基酸；和/或
[0365] (c)SEQIDN0:33的重鏈可變區(qū)，其中一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)可以被取代為不 同的氨基酸；以及SEQIDN0:34的輕鏈可變區(qū)，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸可以被取代為不同 的氨基酸；和/或
[0366] (d)如 SEQ ID N0:37-42 中所示的重鏈 CDR 1、2 和 3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基 酸序列，其中CDR中的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取代為不同的氨基酸；和/或
[0367] (6)如5￡〇10勵(lì):43、44和45中所示的輕鏈0?1、2和3(10)1?1、10)1?2、10)1?3)氨 基酸序列，其中CDR中的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取代為不同的氨基酸；和/ 或
[0368] (f)如 SEQ ID N0:37-42 中所示的重鏈 CDR1、2 和 3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸 序列，其中CDR中的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取代為不同的氨基酸；以及如 5已〇10勵(lì):43、44和45中所示的輕鏈0?1、2和3仏0)1?1、^：01?2、^：01?3)氨基酸序列，其 中CDR中的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取代為不同的氨基酸；和/或
[0369] (g)與具有SEQIDN0:33的氨基酸序列的可變區(qū)至少60%、70%、80%、85%、 90%或95%相同的重鏈可變區(qū),其中一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取代為不同的 氨基酸；和/或
[0370] (h)與具有SEQIDN0:34的氨基酸序列的可變區(qū)至少60%、70%、80%、85%、 90%或95%相同的輕鏈可變區(qū)，其中一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取代為不同的 氨基酸。
[0371] 在本文的任何實(shí)施方式的另一個(gè)方面，重鏈和輕鏈的CDR1、2和3中的任一個(gè)可以 特征在于它的至少4、5、6、7、8、9或10個(gè)連續(xù)氨基酸的序列，和/或特征為具有與對(duì)應(yīng)SEQ ID NO中列出的具體CDR或CDR組共享至少50%、60%、70%、80%、85%、90%或95%序列 同一性的氨基酸序列。
[0372] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了對(duì)于MICA結(jié)合，與以上（a)至（h)的單克隆抗體競(jìng) 爭(zhēng)的抗體。
[0373]抗體19E9
[0374] 抗體19E9的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列被列出為SEQIDNO: 46,輕鏈可變區(qū)的氨基 酸序列被列出為SEQIDNO:47。
[0375] 在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明提供了結(jié)合與單克隆抗體19E9基本上相同的表 位或決定子的抗體；任選地該抗體包括抗體19E9的抗原結(jié)合區(qū)。在本文的任何實(shí)施方式 中，抗體19E9可以特征在于它的氨基酸序列和/或編碼它的核酸序列。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方 式中，該單克隆抗體包括19E9的Fab或F(ab'） 2部分。還提供了包括19E9的重鏈可變區(qū) 的單克隆抗體。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，該單克隆抗體包括19E9的重鏈可變區(qū)的三個(gè)⑶R。還 提供了一種單克隆抗體，該單克隆抗體進(jìn)一步包括19E9的可變輕鏈可變區(qū)，或19E9的輕鏈 可變區(qū)的⑶R中的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)。任選地，所述輕鏈或重鏈⑶R中的任何一個(gè)或多個(gè)可 以包含一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或五個(gè)或更多個(gè)氨基酸修飾（例如取代、插入或缺失）。任選 地，提供的是：其中輕鏈可變區(qū)和/或重鏈可變區(qū)中的任一個(gè)包括抗體19E9的抗原結(jié)合區(qū) 的一部分或全部的抗體被融合進(jìn)人類IgG型的免疫球蛋白恒定區(qū)，任選地是人類恒定區(qū)， 任選地是人類IgGl或IgG3同種型。
[0376] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了編碼抗體的純化的多肽，其中該抗體包括：HCDRl 區(qū)，該HCDRl區(qū)包括如在SEQ ID NO: 48-50中列出的氨基酸序列SDYAWN、GYSITSD或 GYSITSDYAWN，或它們的至少4、5、6、7、8、9或10個(gè)連續(xù)氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的 一個(gè)或多個(gè)可以被取代為不同的氨基酸；HCDR2區(qū)，該HCDR2區(qū)包括如在SEQ ID N0:51-52 中列出的氨基酸序列FVSYSGTTKYNPSLKS或FVSYSGTTK，或它們的至少4、5、6、7、8、9或10 個(gè)連續(xù)氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的一個(gè)或多個(gè)可以被取代為不同的氨基酸；HCDR3 區(qū)，該HCDR3區(qū)包括如在SEQ ID N0:53中列出的氨基酸序列GYGFDY，或它的至少4、5、6、7、 8、9或10個(gè)連續(xù)氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的一個(gè)或多個(gè)可以被取代為不同的氨基 酸；IXDRl區(qū)，該IXDRl區(qū)包括如在SEQ ID NO: 54中列出的氨基酸序列SATSSISSIYH1，或 它的至少4、5、6、7、8、9或10個(gè)連續(xù)氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的一個(gè)或多個(gè)可以 被取代為不同的氨基酸；LCDR2區(qū)，該LCDR2區(qū)包括如在SEQ ID NO:55列出的氨基酸序列 RTSNLAS，或它的至少4、5、6、7、8、9或10個(gè)連續(xù)氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的一個(gè)或 多個(gè)可以被取代為不同的氨基酸；IXDR3區(qū)，該IXDR3區(qū)包括如在SEQ ID N0:56中列出的 氨基酸序列QQGTTIPFT，或它的至少4、5、6、7、8、9或10個(gè)連續(xù)氨基酸的序列，其中這些氨基 酸中的一個(gè)或多個(gè)可以被缺失或取代為不同的氨基酸。
[0377] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了結(jié)合人類MICA的抗體，該抗體包括：
[0378] (a)SEQIDN0:46的重鏈可變區(qū)，其中一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取 代為不同的氨基酸；和/或
[0379] (b)SEQIDN0:47的輕鏈可變區(qū)，其中一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取 代為不同的氨基酸；和/或
[0380] (c)如 SEQ ID N0:48-53 中所示的重鏈 CDR 1、2 和 3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基 酸序列，其中CDR中的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取代為不同的氨基酸；和/或
[0381] (d)如 SEQ ID N0S:54、55 和 56 中所示的輕鏈 CDR 1、2 和 3(LCDR1、LCDR2、LCDR3) 氨基酸序列，其中CDR中的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取代為不同的氨基酸； 和/或
[0382] (e)如 SEQ ID N0:48-53 中所示的重鏈CDR 1、2 和 3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸 序列，其中CDR中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸可以被取代為不同的氨基酸；以及如SEQ ID N0:54、 55和56中所示的輕鏈⑶R 1、2和3(IXDR1、IXDR2、IXDR3)氨基酸序列，其中⑶R中的一個(gè)、 兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取代為不同的氨基酸；和/或
[0383] (f)與具有SEQ ID N0:46的氨基酸序列的可變區(qū)至少60%、70%、80%、85%、 90%或95%相同的重鏈可變區(qū),其中一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取代為不同的 氨基酸；和/或
[0384] (g)與具有SEQ ID N0:47的氨基酸序列的可變區(qū)至少60%、70%、80%、85%、 90%或95%相同的輕鏈可變區(qū)，其中一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取代為不同的 氨基酸。
[0385] 在本文的任何實(shí)施方式的另一個(gè)方面，重鏈和輕鏈的⑶R 1、2和3中的任一個(gè)可 以特征在于它的至少4、5、6、7、8、9或10個(gè)連續(xù)氨基酸的序列，和/或特征為具有與對(duì)應(yīng) SEQ ID NO中列出的具體CDR或CDR組共享至少50%、60%、70%、80%、85%、90%或95% 序列同一性的氨基酸序列。
[0386] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了對(duì)于MICA結(jié)合，與以上（a)至（g)的單克隆抗體競(jìng) 爭(zhēng)的抗體。
[0387]抗體 9C10
[0388] 抗體9C10的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列被列出為SEQ ID N0:57,輕鏈可變區(qū)的氨 基酸序列被列出為SEQ ID N0:58。在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明提供了結(jié)合與單克隆抗 體9C10基本上相同的表位或決定子的抗體；任選地該抗體包括抗體9C10的抗原結(jié)合區(qū)。 在本文的任何實(shí)施方式中，抗體9C10可以特征在于它的氨基酸序列和/或編碼它的核酸序 列。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，該單克隆抗體包括9C10的Fab或F(ab'） 2部分。還提供了包 括9C10的重鏈可變區(qū)的單克隆抗體。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，該單克隆抗體包括9C10的重鏈 可變區(qū)的三個(gè)CDR。還提供了一種單克隆抗體，該單克隆抗體進(jìn)一步包括9C10的可變輕鏈 可變區(qū)，或9C10的輕鏈可變區(qū)的⑶R中的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)。任選地，所述輕鏈或重鏈⑶R 中的任何一個(gè)或多個(gè)可以包含一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或五個(gè)或更多個(gè)氨基酸修飾（例如取 代、插入或缺失）。任選地，提供的是：其中輕鏈可變區(qū)和/或重鏈可變區(qū)中的任一個(gè)包括 抗體9C10的抗原結(jié)合區(qū)的一部分或全部的抗體被融合進(jìn)人類IgG型的免疫球蛋白恒定區(qū)， 任選地是人類恒定區(qū)，任選地是人類IgGl或IgG3同種型。
[0389] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了編碼抗體的純化的多肽，其中該抗體包括：HCDRl 區(qū)，該HCDRl區(qū)包括如在SEQ ID NO: 59-61中列出的氨基酸序列RYWMN、GYSFTR或 GYSFTRYWMN，或它們的至少4、5、6、7、8、9或10個(gè)連續(xù)氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的 一個(gè)或多個(gè)可以被取代為不同的氨基酸；HCDR2區(qū)，該HCDR2區(qū)包括如在SEQ ID N0:62-63 中列出的氨基酸序列MIHPSDSETRLNQKFKD或MIHPSDSETR，或它們的至少4、5、6、7、8、9或10 個(gè)連續(xù)氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的一個(gè)或多個(gè)可以被取代為不同的氨基酸；HCDR3 區(qū)，該HCDR3區(qū)包括如在SEQ ID N0:64中列出的氨基酸序列GNFFYVMDY，或它的至少4、5、 6、7、8、9或10個(gè)連續(xù)氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的一個(gè)或多個(gè)可以被取代為不同的 氨基酸；LCDRl區(qū)，該LCDRl區(qū)包括如在SEQ ID N0:65中列出的氨基酸序列RASQSIGTSIH， 或它的至少4、5、6、7、8、9或10個(gè)連續(xù)氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的一個(gè)或多個(gè)可以 被取代為不同的氨基酸；LCDR2區(qū)，該LCDR2區(qū)包括如在SEQ ID NO:66列出的氨基酸序列 ASESISG，或它的至少4、5、6、7、8、9或10個(gè)連續(xù)氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的一個(gè)或 多個(gè)可以被取代為不同的氨基酸；IXDR3區(qū)，該IXDR3區(qū)包括如在SEQ ID N0:67中列出的 氨基酸序列QQSNFWPFT，或它的至少4、5、6、7、8、9或10個(gè)連續(xù)氨基酸的序列，其中這些氨基 酸中的一個(gè)或多個(gè)可以被缺失或取代為不同的氨基酸。
[0390] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了結(jié)合人類MICA的抗體，該抗體包括：
[0391] (a)SEQIDN0:67的重鏈可變區(qū)，其中一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取 代為不同的氨基酸；和/或
[0392] (b)SEQIDN0:68的輕鏈可變區(qū)，其中一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取 代為不同的氨基酸；和/或
[0393] (c)如 SEQ ID N0:59-64 中所示的重鏈 CDR 1、2 和 3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基 酸序列，其中CDR中的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取代為不同的氨基酸；和/或
[0394] (d)如 SEQ ID N0S:65、66 和 67 中所示的輕鏈 CDR 1、2 和 3(LCDR1、LCDR2、LCDR3) 氨基酸序列，其中CDR中的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取代為不同的氨基酸； 和/或
[0395] (e)如 SEQ ID N0:59-64 中所示的重鏈 CDR 1、2 和 3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸 序列，其中CDR中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸可以被取代為不同的氨基酸；以及如SEQ ID N0:65、 66和67中所示的輕鏈⑶R 1、2和3(IXDR1、IXDR2、IXDR3)氨基酸序列，其中⑶R中的一個(gè)、 兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取代為不同的氨基酸；和/或
[0396] (f)與具有SEQIDN0:57的氨基酸序列的可變區(qū)至少60%、70%、80%、85%、 90%或95%相同的重鏈可變區(qū),其中一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取代為不同的 氨基酸；和/或
[0397] (g)與具有SEQIDN0:58的氨基酸序列的可變區(qū)至少60%、70%、80%、85%、 90%或95%相同的輕鏈可變區(qū)，其中一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取代為不同的 氨基酸。
[0398] 在本文的任何實(shí)施方式的另一個(gè)方面，重鏈和輕鏈的CDR1、2和3中的任一個(gè)可以 特征在于它的至少4、5、6、7、8、9或10個(gè)連續(xù)氨基酸的序列，和/或特征為具有與對(duì)應(yīng)SEQ ID NO中列出的具體CDR或CDR組共享至少50%、60%、70%、80%、85%、90%或95%序列 同一性的氨基酸序列。
[0399] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了對(duì)于MICA結(jié)合，與以上（a)至（g)的單克隆抗體競(jìng) 爭(zhēng)的抗體。
[0400]抗體 12A10
[0401] 抗體12A10的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列被列出為SEQ ID N0:68,輕鏈可變區(qū)的氨 基酸序列被列出為SEQ ID N0:69。在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明提供了結(jié)合與單克隆抗 體12A10基本上相同的表位或決定子的抗體；任選地該抗體包括抗體12A10的抗原結(jié)合區(qū)。 在本文的任何實(shí)施方式中，抗體12A10可以特征在于它的氨基酸序列和/或編碼它的核酸 序列。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，該單克隆抗體包括12A10的Fab或F(ab'） 2部分。還提供了 包括12A10的重鏈可變區(qū)的單克隆抗體。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，該單克隆抗體包括12A10的 重鏈可變區(qū)的三個(gè)⑶R。還提供了一種單克隆抗體，該單克隆抗體進(jìn)一步包括12A10的可 變輕鏈可變區(qū)，或12A10的輕鏈可變區(qū)的CDR中的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)。任選地，所述輕鏈或 重鏈CDR中的任何一個(gè)或多個(gè)可以包含一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或五個(gè)或更多個(gè)氨基酸修飾 (例如取代、插入或缺失）。任選地，提供的是：其中輕鏈可變區(qū)和/或重鏈可變區(qū)中的任一 個(gè)包括抗體12A10的抗原結(jié)合區(qū)的一部分或全部的抗體被融合進(jìn)人類IgG型的免疫球蛋白 恒定區(qū)，任選地是人類恒定區(qū)，任選地是人類IgGl或IgG3同種型。
[0402] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了編碼抗體的純化的多肽，其中該抗體包括：HCDRl 區(qū)，該HCDRl區(qū)包括如在SEQ ID NO: 70-72中列出的氨基酸序列NYWMN、GYSFTN或 GYSFTNYWMN，或它們的至少4、5、6、7、8、9或10個(gè)連續(xù)氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的 一個(gè)或多個(gè)可以被取代為不同的氨基酸；HCDR2區(qū)，該HCDR2區(qū)包括如在SEQ ID NO:73-74 中列出的氨基酸序列MIHPSDSETRLNQKFKD或MIHPSDSETR，或它們的至少4、5、6、7、8、9或10 個(gè)連續(xù)氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的一個(gè)或多個(gè)可以被取代為不同的氨基酸；HCDR3 區(qū)，該HCDR3區(qū)包括如在SEQ ID NO:75中列出的氨基酸序列DDFFTMDY，或它的至少4、5、6、 7、8、9或10個(gè)連續(xù)氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的一個(gè)或多個(gè)可以被取代為不同的氨 基酸；LCDRl區(qū)，該LCDRl區(qū)包括如在SEQ ID NO:76中列出的氨基酸序列RASQNIVTSIH，或 它的至少4、5、6、7、8、9或10個(gè)連續(xù)氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的一個(gè)或多個(gè)可以 被取代為不同的氨基酸；LCDR2區(qū)，該LCDR2區(qū)包括如在SEQ ID NO:77列出的氨基酸序列 YASESIS，或它的至少4、5、6、7、8、9或10個(gè)連續(xù)氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的一個(gè)或 多個(gè)可以被取代為不同的氨基酸；IXDR3區(qū)，該IXDR3區(qū)包括如在SEQ ID N0:78中列出的 氨基酸序列QQSNIWPLT，或它的至少4、5、6、7、8、9或10個(gè)連續(xù)氨基酸的序列，其中這些氨基 酸中的一個(gè)或多個(gè)可以被缺失或取代為不同的氨基酸。
[0403] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了結(jié)合人類MICA的抗體，該抗體包括：
[0404] (a)SEQ ID N0:68的重鏈可變區(qū)，其中一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取 代為不同的氨基酸；和/或
[0405] (b)SEQIDN0:69的輕鏈可變區(qū)，其中一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取 代為不同的氨基酸；和/或
[0406] (c)如 SEQ ID N0:70-75 中所示的重鏈 CDR 1、2 和 3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基 酸序列，其中CDR中的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取代為不同的氨基酸；和/或
[0407] (d)如 SEQ ID N0S:76、77 和 78 中所示的輕鏈 CDR 1、2 和 3(LCDR1、LCDR2、LCDR3) 氨基酸序列，其中CDR中的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取代為不同的氨基酸； 和/或
[0408] (e)如 SEQ ID N0:70-75 中所示的重鏈 CDR 1、2 和 3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸 序列，其中CDR中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸可以被取代為不同的氨基酸；以及如SEQ ID N0:76、 77和78中所示的輕鏈⑶R 1、2和3(IXDR1、IXDR2、IXDR3)氨基酸序列，其中⑶R中的一個(gè)、 兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取代為不同的氨基酸；和/或
[0409] (f)與具有SEQIDN0:68的氨基酸序列的可變區(qū)至少60%、70%、80%、85%、 90%或95%相同的重鏈可變區(qū),其中一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取代為不同的 氨基酸；和/或
[0410] (g)與具有SEQ ID N0:69的氨基酸序列的可變區(qū)至少60%、70%、80%、85%、 90%或95%相同的輕鏈可變區(qū)，其中一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取代為不同的 氨基酸。
[0411] 在本文的任何實(shí)施方式的另一個(gè)方面，重鏈和輕鏈的⑶R 1、2和3中的任一個(gè)可 以特征在于它的至少4、5、6、7、8、9或10個(gè)連續(xù)氨基酸的序列，和/或特征為具有與對(duì)應(yīng) SEQ ID NO中列出的具體CDR或CDR組共享至少50%、60%、70%、80%、85%、90%或95% 序列同一性的氨基酸序列。
[0412] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了對(duì)于MICA結(jié)合，與以上（a)至（g)的單克隆抗體競(jìng) 爭(zhēng)的抗體。
[0413]抗體 10A7
[0414] 抗體10A7的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列被列出為SEQ ID N0:79,輕鏈可變區(qū)的氨 基酸序列被列出為SEQ ID N0:80。在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明提供了結(jié)合與單克隆抗 體10A7基本上相同的表位或決定子的抗體；任選地該抗體包括抗體10A7的抗原結(jié)合區(qū)。 在本文的任何實(shí)施方式中，抗體10A7可以特征在于它的氨基酸序列和/或編碼它的核酸序 列。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，該單克隆抗體包括10A7的Fab或F(ab'） 2部分。還提供了包 括10A7的重鏈可變區(qū)的單克隆抗體。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，該單克隆抗體包括10A7的重鏈 可變區(qū)的三個(gè)CDR。還提供了一種單克隆抗體，該單克隆抗體進(jìn)一步包括10A7的可變輕鏈 可變區(qū)，或10A7的輕鏈可變區(qū)的⑶R中的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)。任選地，所述輕鏈或重鏈⑶R 中的任何一個(gè)或多個(gè)可以包含一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或五個(gè)或更多個(gè)氨基酸修飾（例如取 代、插入或缺失）。任選地，提供的是：其中輕鏈可變區(qū)和/或重鏈可變區(qū)中的任一個(gè)包括 抗體10A7的抗原結(jié)合區(qū)的一部分或全部的抗體被融合進(jìn)人類IgG型的免疫球蛋白恒定區(qū)， 任選地是人類恒定區(qū)，任選地是人類IgGl或IgG3同種型。
[0415] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了編碼抗體的純化的多肽，其中該抗體包括：HCDRl 區(qū)，該HCDRl區(qū)包括如在SEQ ID N0:81-83中列出的氨基酸序列TSGMGVG、GFSLSTSG或 GFSLSTSGMGVG，或它們的至少4、5、6、7、8、9或10個(gè)連續(xù)氨基酸的序列，其中這些氨基 酸中的一個(gè)或多個(gè)可以被取代為不同的氨基酸；HCDR2區(qū)，該HCDR2區(qū)包括如在SEQ ID NO: 84-85中列出的氨基酸序列HIffffDDDRYYNPSLKS或HIWWDDDRY，或它們的至少4、5、6、7、 8、9或10個(gè)連續(xù)氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的一個(gè)或多個(gè)可以被取代為不同的氨 基酸；HCDR3區(qū)，該HCDR3區(qū)包括如在SEQ ID NO: 86中列出的氨基酸序列RLNGYFDY，或它 的至少4、5、6、7、8、9或10個(gè)連續(xù)氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的一個(gè)或多個(gè)可以被 取代為不同的氨基酸山CDRl區(qū)，該LCDRl區(qū)包括如在SEQ ID NO:87中列出的氨基酸序列 RASQSISDYLH，或它的至少4、5、6、7、8、9或10個(gè)連續(xù)氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的一 個(gè)或多個(gè)可以被取代為不同的氨基酸；IXDR2區(qū)，該IXDR2區(qū)包括如在SEQ ID N0:88列出的 氨基酸序列YASQSIS，或它的至少4、5、6、7、8、9或10個(gè)連續(xù)氨基酸的序列，其中這些氨基酸 中的一個(gè)或多個(gè)可以被取代為不同的氨基酸；IXDR3區(qū)，該IXDR3區(qū)包括如在SEQ ID NO: 89 中列出的氨基酸序列QNGHSFPFT，或它的至少4、5、6、7、8、9或10個(gè)連續(xù)氨基酸的序列，其中 這些氨基酸中的一個(gè)或多個(gè)可以被缺失或取代為不同的氨基酸。
[0416] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了結(jié)合人類MICA的抗體，該抗體包括：
[0417] (a) SEQ ID NO: 79的重鏈可變區(qū)，其中一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取 代為不同的氨基酸；和/或
[0418] (b)SEQ ID N0:80的輕鏈可變區(qū)，其中一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取 代為不同的氨基酸；和/或
[0419] (c)如 SEQ ID N0:81-86 中所示的重鏈 CDR 1、2 和 3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基 酸序列，其中CDR中的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取代為不同的氨基酸；和/或
[0420] (d)如 SEQ ID N0S:87、88 和 89 中所示的輕鏈 CDR 1、2 和 3(LCDR1、LCDR2、LCDR3) 氨基酸序列，其中CDR中的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取代為不同的氨基酸； 和/或
[0421] (e)如 SEQ ID N0:81 至86 中所示的重鏈CDR1、2和 3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸 序列，其中CDR中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸可以被取代為不同的氨基酸；以及如SEQ ID N0:87、 88和89中所示的輕鏈⑶R 1、2和3(IXDR1、IXDR2、IXDR3)氨基酸序列，其中⑶R中的一個(gè)、 兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取代為不同的氨基酸；和/或
[0422] (f)與具有SEQIDN0:79的氨基酸序列的可變區(qū)至少60%、70%、80%、85%、 90%或95%相同的重鏈可變區(qū),其中一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取代為不同的 氨基酸；和/或
[0423] (g)與具有SEQIDN0:80的氨基酸序列的可變區(qū)至少60%、70%、80%、85%、 90%或95%相同的輕鏈可變區(qū)，其中一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取代為不同的 氨基酸。
[0424] 在本文的任何實(shí)施方式的另一個(gè)方面，重鏈和輕鏈的⑶R 1、2和3中的任一個(gè)可 以特征在于它的至少4、5、6、7、8、9或10個(gè)連續(xù)氨基酸的序列，和/或特征為具有與對(duì)應(yīng) SEQ ID NO中列出的具體CDR或CDR組共享至少50%、60%、70%、80%、85%、90%或95% 序列同一性的氨基酸序列。
[0425] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了對(duì)于MICA結(jié)合，與以上（a)至（g)的單克隆抗體競(jìng) 爭(zhēng)的抗體。
[0426] 抗體1部8
[0427] 抗體18E8的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列被列出為SEQIDN0:90,輕鏈可變區(qū)的氨 基酸序列被列出為SEQIDN0:91。在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明提供了結(jié)合與單克隆抗 體18E8基本上相同的表位或決定子的抗體；任選地該抗體包括抗體18E8的抗原結(jié)合區(qū)。 在本文的任何實(shí)施方式中，抗體18E8可以特征在于它的氨基酸序列和/或編碼它的核酸序 列。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，該單克隆抗體包括18E8的Fab或F(ab'） 2部分。還提供了包 括18E8的重鏈可變區(qū)的單克隆抗體。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，該單克隆抗體包括18E8的重鏈 可變區(qū)的三個(gè)CDR。還提供了一種單克隆抗體，該單克隆抗體進(jìn)一步包括18E8的可變輕鏈 可變區(qū)，或18E8的輕鏈可變區(qū)的⑶R中的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)。任選地，所述輕鏈或重鏈⑶R 中的任何一個(gè)或多個(gè)可以包含一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或五個(gè)或更多個(gè)氨基酸修飾（例如取 代、插入或缺失）。任選地，提供的是：其中輕鏈可變區(qū)和/或重鏈可變區(qū)中的任一個(gè)包括 抗體18E8的抗原結(jié)合區(qū)的一部分或全部的抗體被融合進(jìn)人類IgG型的免疫球蛋白恒定區(qū)， 任選地是人類恒定區(qū)，任選地是人類IgGl或IgG3同種型。
[0428] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了編碼抗體的純化的多肽，其中該抗體包括：HCDRl 區(qū)，該HCDRl區(qū)包括如在SEQ ID NO: 92-94中列出的氨基酸序列SDYSWH、GYSITSD或 GYSITSDYSWH，或它們的至少4、5、6、7、8、9或10個(gè)連續(xù)氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的 一個(gè)或多個(gè)可以被取代為不同的氨基酸；HCDR2區(qū)，該HCDR2區(qū)包括如在SEQ ID NO:95-96 中列出的氨基酸序列NIHYSGRINYNPSLRS或NIHYSGRIN，或它們的至少4、5、6、7、8、9或10 個(gè)連續(xù)氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的一個(gè)或多個(gè)可以被取代為不同的氨基酸；HCDR3 區(qū)，該HCDR3區(qū)包括如在SEQ ID N0:97中列出的氨基酸序列RRTFGNFEDY，或它的至少4、5、 6、7、8、9或10個(gè)連續(xù)氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的一個(gè)或多個(gè)可以被取代為不同的 氨基酸；LCDRl區(qū)，該LCDRl區(qū)包括如在SEQ ID NO:98中列出的氨基酸序列RSSSSVNYMH， 或它的至少4、5、6、7、8、9或10個(gè)連續(xù)氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的一個(gè)或多個(gè)可以 被取代為不同的氨基酸山CDR2區(qū)，該LCDR2區(qū)包括如在SEQ ID NO:99列出的氨基酸序列 ATSTLAS，或它的至少4、5、6、7、8、9或10個(gè)連續(xù)氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的一個(gè)或 多個(gè)可以被取代為不同的氨基酸；IXDR3區(qū)，該IXDR3區(qū)包括如在SEQ ID NO: 100中列出的 氨基酸序列QQWSSNPLT，或它的至少4、5、6、7、8、9或10個(gè)連續(xù)氨基酸的序列，其中這些氨基 酸中的一個(gè)或多個(gè)可以被缺失或取代為不同的氨基酸。
[0429] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了結(jié)合人類MICA的抗體，該抗體包括：
[0430] (a)SEQ ID N0:90的重鏈可變區(qū)，其中一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取 代為不同的氨基酸；和/或
[0431] (b)SEQIDN0:91的輕鏈可變區(qū)，其中一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取 代為不同的氨基酸；和/或
[0432] (c)如 SEQ ID N0:92-97 中所示的重鏈 CDR 1、2 和 3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基 酸序列，其中CDR中的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取代為不同的氨基酸；和/或
[0433] (d)如 SEQ ID N0S:98、99 和 100 中所示的輕鏈 CDR1、2 和 3(LCDR1、LCDR2、LCDR3) 氨基酸序列，其中CDR中的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取代為不同的氨基酸； 和/或
[0434] (e)如 SEQ ID N0:92-97 中所示的重鏈CDR 1、2 和 3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸 序列，其中CDR中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸可以被取代為不同的氨基酸；以及如SEQ ID N0:98、 99和100中所示的輕鏈⑶R 1、2和3(IXDR1、IXDR2、IXDR3)氨基酸序列，其中⑶R中的一 個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取代為不同的氨基酸；和/或
[0435] (f)與具有SEQIDN0:90的氨基酸序列的可變區(qū)至少60%、70%、80%、85%、 90%或95%相同的重鏈可變區(qū),其中一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取代為不同的 氨基酸；和/或
[0436] (g)與具有SEQIDN0:91的氨基酸序列的可變區(qū)至少60%、70%、80%、85%、 90%或95%相同的輕鏈可變區(qū)，其中一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取代為不同的 氨基酸。
[0437] 在本文的任何實(shí)施方式的另一個(gè)方面，重鏈和輕鏈的⑶Rl、2和3中的任一個(gè)可以 特征在于它的至少4、5、6、7、8、9或10個(gè)連續(xù)氨基酸的序列，和/或特征為具有與對(duì)應(yīng)SEQ ID NO中列出的具體CDR或CDR組共享至少50%、60%、70%、80%、85%、90%或95%序列 同一性的氨基酸序列。
[0438] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了對(duì)于MICA結(jié)合，與以上（a)至（g)的單克隆抗體競(jìng) 爭(zhēng)的抗體。
[0439]抗體 10F3
[0440] 抗體10F3的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列被列出為SEQ ID NO: 101，輕鏈可變區(qū)的氨 基酸序列被列出為SEQ ID NO: 102。在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明提供了結(jié)合與單克隆 抗體10F3基本上相同的表位或決定子的抗體；任選地該抗體包括抗體10F3的抗原結(jié)合區(qū)。 在本文的任何實(shí)施方式中，抗體10F3可以特征在于它的氨基酸序列和/或編碼它的核酸序 列。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，該單克隆抗體包括10F3的Fab或F(ab'） 2部分。還提供了包 括10F3的重鏈可變區(qū)的單克隆抗體。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，該單克隆抗體包括10F3的重鏈 可變區(qū)的三個(gè)CDR。還提供了一種單克隆抗體，該單克隆抗體進(jìn)一步包括10F3的可變輕鏈 可變區(qū)，或10F3的輕鏈可變區(qū)的⑶R中的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)。任選地，所述輕鏈或重鏈⑶R 中的任何一個(gè)或多個(gè)可以包含一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或五個(gè)或更多個(gè)氨基酸修飾（例如取 代、插入或缺失）。任選地，提供的是：其中輕鏈可變區(qū)和/或重鏈可變區(qū)中的任一個(gè)包括 抗體10F3的抗原結(jié)合區(qū)的一部分或全部的抗體被融合進(jìn)人類IgG型的免疫球蛋白恒定區(qū)， 任選地是人類恒定區(qū)，任選地是人類IgGl或IgG3同種型。
[0441] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了編碼抗體的純化的多肽，其中該抗體包括：HCDRl 區(qū)，該HCDRl區(qū)包括如在SEQ ID N0:103-105中列出的氨基酸序列SYTMH、GYTFTS或 GYTFTSYTMH，或它們的至少4、5、6、7、8、9或10個(gè)連續(xù)氨基酸的序列，其中這些氨基酸 中的一個(gè)或多個(gè)可以被取代為不同的氨基酸；HCDR2區(qū)，該HCDR2區(qū)包括如在SEQ ID NO: 106-107中列出的氨基酸序列HNPSSGYTEYNQKFKD或HNPSSGYTE，或它們的至少4、5、 6、7、8、9或10個(gè)連續(xù)氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的一個(gè)或多個(gè)可以被取代為不同的 氨基酸；HCDR3區(qū)，該HCDR3區(qū)包括如在SEQ ID NO: 108中列出的氨基酸序列GGDWDVDWFVY， 或它的至少4、5、6、7、8、9或10個(gè)連續(xù)氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的一個(gè)或多個(gè)可以 被取代為不同的氨基酸；LCDRl區(qū)，該LCDRl區(qū)包括如在SEQ ID NO: 109中列出的氨基酸序 列SASSSISYMH，或它的至少4、5、6、7、8、9或10個(gè)連續(xù)氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的 一個(gè)或多個(gè)可以被取代為不同的氨基酸；IXDR2區(qū)，該IXDR2區(qū)包括如在SEQ ID NO: 110列 出的氨基酸序列STSKLAS，或它的至少4、5、6、7、8、9或10個(gè)連續(xù)氨基酸的序列，其中這些 氨基酸中的一個(gè)或多個(gè)可以被取代為不同的氨基酸；IXDR3區(qū)，該IXDR3區(qū)包括如在SEQ ID NO: 111中列出的氨基酸序列QHRSTYPFT，或它的至少4、5、6、7、8、9或10個(gè)連續(xù)氨基酸的序 列，其中這些氨基酸中的一個(gè)或多個(gè)可以被缺失或取代為不同的氨基酸。
[0442] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了結(jié)合人類MICA的抗體，該抗體包括：
[0443] (a) SEQ ID NO: 101的重鏈可變區(qū)，其中一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取 代為不同的氨基酸；和/或
[0444] (b) SEQ ID NO: 102的輕鏈可變區(qū)，其中一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取 代為不同的氨基酸；和/或
[0445] (c)如 SEQ ID NO: 103-108 中所示的重鏈 CDR 1、2 和 3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨 基酸序列，其中CDR中的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取代為不同的氨基酸；和/ 或
[0446] (d)如 SEQ ID N0S:109、110 和 111 中所示的輕鏈 CDR 1、2 和 3(LCDR1、LCDR2、 LCDR3)氨基酸序列，其中CDR中的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取代為不同的氨 基酸；和/或
[0447] (e)如 SEQ ID NO: 103-108 中所示的重鏈 CDR1、2 和 3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨 基酸序列，其中CDR中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸可以被取代為不同的氨基酸；以及如SEQ ID 勵(lì)：109、110和111中所示的輕鏈0?1、2和3(10)1?1、10)1?2、10)1?3)氨基酸序列，其中0)1? 中的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取代為不同的氨基酸；和/或
[0448] (f)與具有SEQIDN0:101的氨基酸序列的可變區(qū)至少60%、70%、80%、85%、 90%或95%相同的重鏈可變區(qū),其中一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取代為不同的 氨基酸；和/或
[0449] (g)與具有SEQIDN0:102的氨基酸序列的可變區(qū)至少60%、70%、80%、85%、 90%或95%相同的輕鏈可變區(qū)，其中一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取代為不同的 氨基酸。
[0450] 在本文的任何實(shí)施方式的另一個(gè)方面，重鏈和輕鏈的⑶Rl、2和3中的任一個(gè)可以 特征在于它的至少4、5、6、7、8、9或10個(gè)連續(xù)氨基酸的序列，和/或特征為具有與對(duì)應(yīng)SEQ ID NO中列出的具體CDR或CDR組共享至少50%、60%、70%、80%、85%、90%或95%序列 同一性的氨基酸序列。
[0451] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了對(duì)于MICA結(jié)合，與以上（a)至（g)的單克隆抗體競(jìng) 爭(zhēng)的抗體。
[0452]抗體 I5F9
[0453] 抗體15F9的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列被列出為SEQ ID NO: 112,輕鏈可變區(qū)的氨 基酸序列被列出為SEQ ID NO: 113。在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明提供了結(jié)合與單克隆 抗體15F9基本上相同的表位或決定子的抗體；任選地該抗體包括抗體15F9的抗原結(jié)合區(qū)。 在本文的任何實(shí)施方式中，抗體15F9可以特征在于它的氨基酸序列和/或編碼它的核酸序 列。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，該單克隆抗體包括15F9的Fab或F (ab'）2部分。還提供了包 括15F9的重鏈可變區(qū)的單克隆抗體。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，該單克隆抗體包括15F9的重鏈 可變區(qū)的三個(gè)CDR。還提供了一種單克隆抗體，該單克隆抗體進(jìn)一步包括15F9的可變輕鏈 可變區(qū)，或15F9的輕鏈可變區(qū)的⑶R中的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)。任選地，所述輕鏈或重鏈⑶R 中的任何一個(gè)或多個(gè)可以包含一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或五個(gè)或更多個(gè)氨基酸修飾（例如取 代、插入或缺失）。任選地，提供的是：其中輕鏈可變區(qū)和/或重鏈可變區(qū)中的任一個(gè)包括 抗體15F9的抗原結(jié)合區(qū)的一部分或全部的抗體被融合進(jìn)人類IgG型的免疫球蛋白恒定區(qū)， 任選地是人類恒定區(qū)，任選地是人類IgGl或IgG3同種型。
[0454] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了編碼抗體的純化的多肽，其中該抗體包括：HCDRl 區(qū)，該HCDRl區(qū)包括如在SEQ ID NO: 114-116中列出的氨基酸序列SGYSWH、GYSITSG或 GYSITSGYSWH，或它們的至少4、5、6、7、8、9或10個(gè)連續(xù)氨基酸的序列，其中這些氨基酸 中的一個(gè)或多個(gè)可以被取代為不同的氨基酸；HCDR2區(qū)，該HCDR2區(qū)包括如在SEQ ID NO: 117-118中列出的氨基酸序列FIHYSGSTDYNPSLKS或FIHYSGSTD，或它們的至少4、5、6、 7、8、9或10個(gè)連續(xù)氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的一個(gè)或多個(gè)可以被取代為不同的氨 基酸；HCDR3區(qū)，該HCDR3區(qū)包括如在SEQ ID NO: 119中列出的氨基酸序列DYGHWYFDV，或 它的至少4、5、6、7、8、9或10個(gè)連續(xù)氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的一個(gè)或多個(gè)可以被 取代為不同的氨基酸；LCDRl區(qū)，該LCDRl區(qū)包括如在SEQ ID NO: 120中列出的氨基酸序列 KASQSVSYDVA，或它的至少4、5、6、7、8、9或10個(gè)連續(xù)氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的一 個(gè)或多個(gè)可以被取代為不同的氨基酸；IXDR2區(qū)，該IXDR2區(qū)包括如在SEQ ID NO: 121列出 的氨基酸序列YASNRYT，或它的至少4、5、6、7、8、9或10個(gè)連續(xù)氨基酸的序列，其中這些氨 基酸中的一個(gè)或多個(gè)可以被取代為不同的氨基酸；IXDR3區(qū)，該IXDR3區(qū)包括如在SEQ ID N0:122中列出的氨基酸序列QQDYSSLT，或它的至少4、5、6、7、8、9或10個(gè)連續(xù)氨基酸的序 列，其中這些氨基酸中的一個(gè)或多個(gè)可以被缺失或取代為不同的氨基酸。
[0455] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了結(jié)合人類MICA的抗體，該抗體包括：
[0456] (a) SEQ ID NO: 112的重鏈可變區(qū)，其中一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取 代為不同的氨基酸；和/或
[0457] (b) SEQ ID NO: 113的輕鏈可變區(qū)，其中一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取 代為不同的氨基酸；和/或
[0458] (c)如 SEQ ID NO: 114-119 中所示的重鏈 CDR 1、2 和 3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨 基酸序列，其中CDR中的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取代為不同的氨基酸；和/ 或
[0459] (d)如 SEQ ID N0S:120、121 和 122 中所示的輕鏈 CDR 1、2 和 3(LCDR1、LCDR2、 LCDR3)氨基酸序列，其中CDR中的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取代為不同的氨 基酸；和/或
[0460] (e)如 SEQ ID NO: 114-119 中所示的重鏈 CDR 1、2 和 3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨 基酸序列，其中CDR中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸可以被取代為不同的氨基酸；以及如SEQ ID N0:120、121和122中所示的輕鏈CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列，其中CDR 中的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取代為不同的氨基酸；和/或
[0461] (f)與具有SEQ ID N0:112的氨基酸序列的可變區(qū)至少60%、70%、80%、85%、 90%或95%相同的重鏈可變區(qū),其中一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取代為不同的 氨基酸；和/或
[0462] (g)與具有SEQIDN0:113的氨基酸序列的可變區(qū)至少60%、70%、80%、85%、 90%或95%相同的輕鏈可變區(qū)，其中一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取代為不同的 氨基酸。
[0463] 在本文的任何實(shí)施方式的另一個(gè)方面，重鏈和輕鏈的⑶R 1、2和3中的任一個(gè)可 以特征在于它的至少4、5、6、7、8、9或10個(gè)連續(xù)氨基酸的序列，和/或特征為具有與對(duì)應(yīng) SEQ ID NO中列出的具體CDR或CDR組共享至少50%、60%、70%、80%、85%、90%或95% 序列同一性的氨基酸序列。
[0464] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了對(duì)于MICA結(jié)合，與以上（a)至（g)的單克隆抗體競(jìng) 爭(zhēng)的抗體。
[0465]抗體 14B4
[0466] 抗體14B4的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列被列出為SEQ ID NO: 123,輕鏈可變區(qū)的氨 基酸序列被列出為SEQ ID NO: 124。在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明提供了結(jié)合與單克隆 抗體14B4基本上相同的表位或決定子的抗體；任選地該抗體包括抗體14B4的抗原結(jié)合區(qū)。 在本文的任何實(shí)施方式中，抗體14B4可以特征在于它的氨基酸序列和/或編碼它的核酸序 列。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，該單克隆抗體包括14B4的Fab或F(ab'） 2部分。還提供了包 括14B4的重鏈可變區(qū)的單克隆抗體。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，該單克隆抗體包括14B4的重鏈 可變區(qū)的三個(gè)CDR。還提供了一種單克隆抗體，該單克隆抗體進(jìn)一步包括14B4的可變輕鏈 可變區(qū)，或14B4的輕鏈可變區(qū)的⑶R中的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)。任選地，所述輕鏈或重鏈⑶R 中的任何一個(gè)或多個(gè)可以包含一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或五個(gè)或更多個(gè)氨基酸修飾（例如取 代、插入或缺失）。任選地，提供的是：其中輕鏈可變區(qū)和/或重鏈可變區(qū)中的任一個(gè)包括 抗體14B4的抗原結(jié)合區(qū)的一部分或全部的抗體被融合進(jìn)人類IgG型的免疫球蛋白恒定區(qū)， 任選地是人類恒定區(qū)，任選地是人類IgGl或IgG3同種型。
[0467] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了編碼抗體的純化的多肽，其中該抗體包括：HCDRl 區(qū)，該HCDRl區(qū)包括如在SEQ ID N0:125-127中列出的氨基酸序列SYWMN、GYSFTS或 GYSFTSYWMN、或G，或它們的至少4、5、6、7、8、9或10個(gè)連續(xù)氨基酸的序列，其中這些氨基 酸中的一個(gè)或多個(gè)可以被取代為不同的氨基酸；HCDR2區(qū)，該HCDR2區(qū)包括如在SEQ ID NO: 128-129中列出的氨基酸序列MIHPSDSETRLNQKFKD或MIHPSDSETR，或它們的至少4、5、 6、7、8、9或10個(gè)連續(xù)氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的一個(gè)或多個(gè)可以被取代為不同的 氨基酸；HCDR3區(qū)，該HCDR3區(qū)包括如在SEQ ID NO: 130中列出的氨基酸序列EMGPYTLDY，或 它的至少4、5、6、7、8、9或10個(gè)連續(xù)氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的一個(gè)或多個(gè)可以被 取代為不同的氨基酸；LCDRl區(qū)，該LCDRl區(qū)包括如在SEQ ID NO: 131中列出的氨基酸序列 RASQNIDTSIH，或它的至少4、5、6、7、8、9或10個(gè)連續(xù)氨基酸的序列，其中這些氨基酸中的一 個(gè)或多個(gè)可以被取代為不同的氨基酸；IXDR2區(qū)，該IXDR2區(qū)包括如在SEQ ID NO: 132列出 的氨基酸序列YASESIS，或它的至少4、5、6、7、8、9或10個(gè)連續(xù)氨基酸的序列，其中這些氨 基酸中的一個(gè)或多個(gè)可以被取代為不同的氨基酸；IXDR3區(qū)，該IXDR3區(qū)包括如在SEQ ID NO: 133中列出的氨基酸序列QQSNYWPLT，或它的至少4、5、6、7、8、9或10個(gè)連續(xù)氨基酸的序 列，其中這些氨基酸中的一個(gè)或多個(gè)可以被缺失或取代為不同的氨基酸。
[0468] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了結(jié)合人類MICA的抗體，該抗體包括：
[0469] (a) SEQ ID NO: 123的重鏈可變區(qū)，其中一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取 代為不同的氨基酸；和/或
[0470] (b) SEQ ID NO: 124的輕鏈可變區(qū)，其中一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取 代為不同的氨基酸；和/或
[0471] (c)如 SEQ ID NO: 125-130 中所示的重鏈 CDR 1、2 和 3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨 基酸序列，其中CDR中的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取代為不同的氨基酸；和/ 或
[0472] (d)如 SEQ ID N0S:131、132 和 133 中所示的輕鏈 CDR 1、2 和 3(LCDR1、LCDR2、 LCDR3)氨基酸序列，其中CDR中的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取代為不同的氨 基酸；和/或
[0473] (e)如 SEQ ID NO: 125-130 中所示的重鏈 CDR 1、2 和 3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨 基酸序列，其中CDR中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸可以被取代為不同的氨基酸；以及如SEQ ID N0:131、132和133中所示的輕鏈CDR1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列，其中CDR 中的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取代為不同的氨基酸；和/或
[0474] (f)與具有SEQ ID N0:123的氨基酸序列的可變區(qū)至少60%、70%、80%、85%、 90%或95%相同的重鏈可變區(qū),其中一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取代為不同的 氨基酸；和/或
[0475] (g)與具有SEQIDN0:124的氨基酸序列的可變區(qū)至少60%、70%、80%、85%、 90%或95%相同的輕鏈可變區(qū)，其中一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取代為不同的 氨基酸。
[0476] 在本文的任何實(shí)施方式的另一個(gè)方面，重鏈和輕鏈的⑶R 1、2和3中的任一個(gè)可 以特征在于它的至少4、5、6、7、8、9或10個(gè)連續(xù)氨基酸的序列，和/或特征為具有與對(duì)應(yīng) SEQ ID NO中列出的具體CDR或CDR組共享至少50%、60%、70%、80%、85%、90%或95% 序列同一性的氨基酸序列。
[0477] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了對(duì)于MICA結(jié)合，與以上（a)至（g)的單克隆抗體競(jìng) 爭(zhēng)的抗體。
[0478]在本發(fā)明的任何抗體，例如 6E4、20C6、16A8、9C10、19E9、12A10、10A7、18E8、10F3、 15F9或14B4中，指定的可變區(qū)和⑶R序列可以包括保守性序列修飾（1、2、3、4、5、6、7、8個(gè) 或更多個(gè)序列修飾）。保守性序列修飾是指并不顯著影響或改變包含該氨基酸序列的抗體 的結(jié)合特征的氨基酸修飾。此類保守性修飾包括氨基酸取代、添加和缺失?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域 已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，例如定點(diǎn)誘變和PCR介導(dǎo)的誘變，將修飾引入本發(fā)明的抗體中。典型地， 保守性氨基酸取代是其中氨基酸殘基被替換為具有側(cè)鏈的氨基酸殘基，該側(cè)鏈具有類似的 理化特性。指定的可變區(qū)和CDR序列可以包括一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或更多個(gè)氨基酸插入、 缺失或取代。當(dāng)做出取代時(shí)，優(yōu)選的取代將是保守性修飾。在本領(lǐng)域已經(jīng)限定了具有類似側(cè) 鏈的氨基酸殘基的多個(gè)家族。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈（例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸）， 酸性側(cè)鏈（例如天冬氨酸、谷氨酸），不帶電荷的極性側(cè)鏈（例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、 絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸），非極性側(cè)鏈（例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異 亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸），3分支側(cè)鏈（例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸）以及芳 香側(cè)鏈（例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸）的氨基酸。因此，本發(fā)明的抗體的CDR區(qū) 內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基可以被替換為來(lái)自相同側(cè)鏈家族的其他氨基酸殘基，并且可以 使用在此所述的測(cè)定來(lái)測(cè)試改變的抗體的保留功能（即在此列出的特性）。
[0479] 當(dāng)在兩個(gè)或更多個(gè)多肽的序列之間的關(guān)系中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)"同一性"或"同一 的"是指多個(gè)多肽之間序列相關(guān)性的程度，如通過(guò)兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基的鏈之間 的匹配數(shù)進(jìn)行確定。"同一性"測(cè)量了具有通過(guò)具體的數(shù)學(xué)模型或計(jì)算機(jī)程序（即"算 法"）解決的間隙配準(zhǔn)（如果有的話）的兩個(gè)或更多個(gè)序列中的更小的序列之間的同一 性匹配的百分?jǐn)?shù)?？梢酝ㄟ^(guò)已知方法容易地計(jì)算相關(guān)多肽的同一性。相關(guān)方法包括但不 局限于，在以下文獻(xiàn)中描述的那些！Computational Molecular Biology(計(jì)算分子生物 學(xué)），Lesk (萊斯克），A. M.，編輯，Oxford University Press (牛津大學(xué)出版社），紐約， 1988 ;Biocomputing: Informatics and Genome Projects (生物計(jì)算：信息學(xué)和基因組工 程），Smith (史密斯），D. W.，編輯，Academic Press (學(xué)術(shù)出版社），紐約，1993 !Computer Analysis of Sequence Data(序列數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)分析），部分1，Griffin(格里芬），A. M., 和Griffin (格里芬），H. G.，編輯，Humana Press (人類出版社），新澤西州，1994 !Sequence Analysis in Molecular Biology (分子生物學(xué)中的序列分析），von Heinje (馮海因切）， G.，Academic Press (學(xué)術(shù)出版社），1987 !Sequence Analysis Primer(序列分析引物）， Gribskov (哥博斯科夫），M?和 Devereux (德弗羅?），J.，編輯，M. Stockton Press (M?斯托 克頓出版社），紐約，1991 ;以及Carillo (卡里羅）等人，SIAM J. Applied Math?(工業(yè)與應(yīng) 用數(shù)學(xué)學(xué)會(huì)應(yīng)用數(shù)學(xué)雜志）48, 1073(1988)。
[0480] 優(yōu)選的用于確定同一性的方法被設(shè)計(jì)為給出所測(cè)試序列之間的最大匹配。確定 同一性的方法描述于公開(kāi)可獲得的計(jì)算機(jī)程序中。優(yōu)選的用于確定兩個(gè)序列之間同一性 的計(jì)算機(jī)程序方法包括GCG程序包，包括GAP (Devereux (德弗羅）等人，Nucl. Acid. Res. (核酸研究）12, 387 (1984) ;Genetics Computer Group (遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)組），University of Wisconsin(威斯康星州大學(xué)），Madison(麥迪遜），威斯康星州），BLASTP，BLASTN，以及 FASTA (Altschul (阿特休爾）等人，J. Mol. Biol?(分子生物學(xué)雜志）215, 403-410 (1990))。 BLASTX程序是從生物技術(shù)信息國(guó)家中心（NCBI)和其他來(lái)源（BLAST手冊(cè)，Altschul (阿特 休爾）等人，NCB/NLM/NIH Bethesda (貝塞斯達(dá)），馬里蘭州20894 ;阿特休爾等人，同上） 公開(kāi)可獲得的。還可以使用熟知的史密斯-沃特曼算法確定同一性。
[0481]根據(jù) AbM (Oxford Molecular' s AbM ant ibody model I ing software definition(牛津分子 AbM 抗體建模軟件定義）），Kabat and Chothia definitions systems (卡巴特和喬西亞定義體系），⑶R的序列已經(jīng)概述于下表A中。雖然可以使用 任何適合的編號(hào)體系來(lái)指定CDR區(qū)，但在任何其他指示不存在的情況下，在此使用的編號(hào) 是Abm。已經(jīng)使用以下指示建立了這樣的編號(hào)：⑶R-Ll :起始：大約殘基24,殘基前：總 是 Cys,殘基后：總是 Trp(典型地為 Trp-Tyr-Gln,而且為 Trp-Leu-Gln，Trp-Phe-Gln, Trp-Tyr-Leu)，長(zhǎng)度：10至17個(gè)殘基；CDR-L2 :起始：在Ll的末端之后總是16個(gè)殘基，殘基 前：通常為116-171'(并且還有￥&1-1 71'、116-1^8、116-?1^)，長(zhǎng)度：總是7個(gè)殘基；0)1?-13， 起始：在L2的末端之后總是33個(gè)殘基，殘基如：總是Cys，殘基后：總是Phe_Gly-Xaa_Gly， 長(zhǎng)度：7至11個(gè)殘基；⑶R-H1，起始：大約殘基26(總是在Cys之后4個(gè)）（喬西亞/AbM定義， 卡巴特定義開(kāi)始于5個(gè)殘基之后），殘基前：總是Cys-Xaa-Xaa-Xaa,殘基后：總是Trp (典型 地為Trp-Val,并且還有Trp-Ile，Trp-Ala)，長(zhǎng)度：10至12個(gè)殘基（AbM定義，喬西亞定義排 除最后4個(gè)殘基）；CDR-H2,起始：在CDR-Hl的卡巴特/AbM定義的末端之后總是15殘基，殘 基前：典型地為 Leu-Glu-Trp-Ile-Gly (但有多個(gè)變化，在 Lys/Arg-Leu/Ile/Val/Phe/Thr/ Ala-Thr/Ser/Ile/Ala之后的殘基），長(zhǎng)度：卡巴特定義16至19個(gè)殘基；AbM(和喬西亞）定 義在7個(gè)殘基前終止；⑶R-H3,起始：在⑶R-H2末端之后總是33殘基（在Cys之后總是2 個(gè)），殘基前：總是Cys-Xaa-Xaa (典型地為Cys-Ala-Arg)，殘基后：總是Trp-Gly-Xaa-Gly, 長(zhǎng)度3至25個(gè)殘基。
[0482] 根據(jù)本發(fā)明的抗體可變鏈的序列列于下表B中，前導(dǎo)子序列在每個(gè)序列的開(kāi)始處 加有下劃線（任何抗體鏈可以被指定為在緊隨于前導(dǎo)子序列末端之后的氨基酸位置處起 始），并且每個(gè)CDR加有下劃線。在此處的任何實(shí)施方式中，VL或VH序列可以被指定或編 號(hào)從而使得包含或缺乏信號(hào)肽或其任何部分。
[0483] 在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體具有人類IgGl或IgG3同種型。在一個(gè)實(shí)施方 式中，本發(fā)明的抗體是保持其結(jié)合和/或功能特性的抗體片段。
[0484]表 A
[0485]
【權(quán)利要求】
1. 一種單克隆抗體，其結(jié)合至包括SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的MICA多肽、包括SEQ ID N0:2的氨基酸序列的MICA多肽、以及包括SEQ ID N0:4的氨基酸序列的MICA多肽。
2. 如權(quán)利要求1所述的抗體，其中所述抗體的特征在于通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)確定的下述 EC50:對(duì)于與在其表面表達(dá)包括SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的MICA多肽的細(xì)胞、在其表 面表達(dá)包括SEQ ID N0:2的氨基酸序列的MICA多肽的細(xì)胞、以及在其表面表達(dá)包括SEQ ID N0:4的氨基酸序列的MICA多肽的細(xì)胞的結(jié)合而言，該EC50至多5μ g/ml，任選地至多 3 μ g/ml、至多 2 μ g/ml、至多 1 μ g/ml 或至多 0· 5 μ g/ml。
3. 如權(quán)利要求1-2所述的抗體，其中所述抗體進(jìn)一步結(jié)合至包括SEQ ID NO:3的氨基 酸序列的MICA多肽；任選地，其中所述抗體的特征在于對(duì)于與在其表面表達(dá)所述MICA多肽 的細(xì)胞的結(jié)合而言至多5 μ g/ml，任選地至多3 μ g/ml、至多2 μ g/ml、至多1 μ g/ml或至多 0· 5μ g/ml 的 EC50。
4. 如權(quán)利要求1-3所述的抗體，其中所述抗體進(jìn)一步結(jié)合至包括SEQ ID N0:6的氨基 酸序列的MICB多肽；任選地，其中所述抗體的特征在于對(duì)于與在其表面表達(dá)所述MICB多肽 的細(xì)胞的結(jié)合而言至多5 μ g/ml，任選地至多3 μ g/ml、至多2 μ g/ml、至多1 μ g/ml或至多 0· 5μ g/ml 的 EC50。
5. 如權(quán)利要求1-4所述的抗體，其中所述抗體結(jié)合至SEQ ID NO: 1的MICA多肽的α? 和/或α 2結(jié)構(gòu)域。
6. 如權(quán)利要求1-5所述的抗體，其中所述抗體不抑制MICA在NKG2D表達(dá)細(xì)胞中誘導(dǎo) NKG2D活性的能力。
7. 如權(quán)利要求1-5所述的抗體，其中所述抗體阻斷MICA與NKG2D的相互作用。
8. 如權(quán)利要求1-5或7所述的抗體，其中所述抗體抑制sMICA誘導(dǎo)的NKG2D在細(xì)胞的 表面上的表達(dá)的下調(diào)。
9. 如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述抗體結(jié)合至表位，該表位包括選自 下組的任何一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，該組由以下組成：SEQ ID NO: 1的MICA多肽的R6、N8、 Q48、W49、E51、D52、V53、L54、N56、K57、T58、R61、R64、K81、D82、Q83、K84、E97、H99、E100、 D101、N102、S103、T104、R105、H109、Y111、D113、E115、L116、N121、E123、T124、E126、Q131、 S132、S133、R134、Q136、T137、M140、N141、R143、N144、L178、R179、R180、S224、H225、D226、 T227、Q228、Q229、W230 以及 D232。
10. 如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述抗體具有至突變型MICA多肽的減 少的結(jié)合，該突變型MICA多肽在以下各項(xiàng)處包括突變 ： (a) 選自下組的1、2、3、4個(gè)或更多個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：Q48、W49、E51、D52、 V53 和 L54 ; (b) 選自下組的1、2、3、4個(gè)或更多個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：N56、K57、T58、R61和 R64 ； (c) 選自下組的1、2、3、4個(gè)或更多個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：K81、D82、Q83、K84、 H109、Y111、D113、L116、S133、R134、T137、M140、N141、R143 和 N144 ; (d) 選自下組的1、2、3、4個(gè)或更多個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：K81、D82、Q83、K84、 H109、Y111、D113、L116、Q131、S132、Q136、M140、N141、R143 和 N144 ; (e) 選自下組的1、2、3、4個(gè)或更多個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：E100、D101、N102、 S103、T104、R105、N121、E123、T124 和 E126 ; (f) 選自下組的1、2、3、4個(gè)或更多個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：R6、N8、E97、H99、 E100、D101、N102、S103、T104、R105、E115、L178、R179 和 R180 ;或 (g) 選自下組的1、2、3、4個(gè)或更多個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：S224、H225、D226、 T227、Q228、Q229、W230 和 D232， 在每種情況下相對(duì)于所述抗體與SEQ ID NO: 1的野生型MICA多肽之間的結(jié)合。
11. 如權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的抗體,其中所述抗體結(jié)合至SEQ ID NO: 1的MICA 多肽的α 3結(jié)構(gòu)域。
12. 如權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述抗體結(jié)合至SEQ ID NO: 1的MICA 多肽的α 1和/或α 2結(jié)構(gòu)域。
13. -種單克隆抗體，其結(jié)合SEQ ID NO: 1的人類MICA多肽，其中所述抗體不阻斷MICA 與NKG2D的相互作用并且不阻斷MICA自MICA-表達(dá)細(xì)胞脫落。
14. 一種單克隆抗體，其結(jié)合SEQ ID NO: 1的人類MICA多肽，其中所述抗體抑制sMICA 誘導(dǎo)的NKG2D在免疫效應(yīng)細(xì)胞的表面上的表達(dá)的下調(diào)而不阻斷MICA自MICA表達(dá)細(xì)胞脫 落。
15. -種單克隆抗體，其結(jié)合至SEQ ID N0:1的MICA多肽的α 1和/或α 2結(jié)構(gòu)域，其 中所述抗體不阻斷MICA與NKG2D的相互作用和/或不抑制MICA在NKG2D表達(dá)細(xì)胞中誘導(dǎo) NKG2D活性的能力。
16. -種單克隆抗體，其結(jié)合至SEQ ID NO: 1的MICA多肽的α 3結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體 阻斷MICA與NKG2D的相互作用和/或抑制sMICA誘導(dǎo)的NKG2D在NKG2D表達(dá)細(xì)胞中的活 性。
17. 如權(quán)利要求16所述的抗體，其中所述抗體抑制sMICA誘導(dǎo)的NKG2D在細(xì)胞的表面 上的表達(dá)的下調(diào)。
18. 如權(quán)利要求13-17所述的抗體，其中所述抗體結(jié)合至包括SEQ ID NO: 1的氨基酸序 列的MICA多肽、包括SEQ ID N0:2的氨基酸序列的MICA多肽、包括SEQ ID N0:4的氨基酸 序列的MICA多肽、以及包括SEQ ID NO:5的氨基酸序列的MICA多肽。
19. 如權(quán)利要求18所述的抗體，其中所述抗體結(jié)合至包括SEQ ID N0:6的氨基酸序列 的MICB多肽和/或包括SEQ ID NO:3的氨基酸序列的MICA多肽。
20. 如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述抗體結(jié)合至包括0聯(lián)和/或N聯(lián)聚 糖的MICA多肽，任選地其中所述抗體結(jié)合至由腫瘤細(xì)胞表達(dá)的糖基化MICA多肽。
21. 如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述抗體不阻斷MICA自細(xì)胞脫落。
22. -種單克隆抗體，其結(jié)合SEQ ID NO: 1的MICA多肽，其中所述抗體具有至突變型 MICA多肽的減少的結(jié)合，該突變型MICA多肽在以下各項(xiàng)處包括突變： (a) 選自下組的1、2、3、4個(gè)或更多個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：Q48、W49、E51、D52、 V53 和 L54 ; (b) 選自下組的1、2、3、4個(gè)或更多個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：N56、K57、T58、R61和 R64 ； (c) 選自下組的1、2、3、4個(gè)或更多個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：K81、D82、Q83、K84、 H109、Y111、D113、L116、S133、R134、T137、M140、N141、R143 和 N144 ; (d) 選自下組的1、2、3、4個(gè)或更多個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：K81、D82、Q83、K84、 H109、Y111、D113、L116、Q131、S132、Q136、M140、N141、R143 和 N144 ; (e) 選自下組的1、2、3、4個(gè)或更多個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：E100、D101、N102、 S103、T104、R105、N121、E123、T124 和 E126 ; (f) 選自下組的1、2、3、4個(gè)或更多個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：R6、N8、E97、H99、 E100、D101、N102、S103、T104、R105、E115、L178、R179 和 R180 ;或 (g) 選自下組的1、2、3、4個(gè)或更多個(gè)殘基，該組由以下各項(xiàng)組成：S224、H225、D226、 T227、Q228、Q229、W230 和 D232， 在每種情況下相對(duì)于所述抗體與SEQ ID NO: 1的野生型MICA多肽之間的結(jié)合。
23. -種單克隆抗體，其結(jié)合至表位，該表位包括選自下組的任何一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘 基，該組由以下各項(xiàng)組成：SEQ ID N0:1 的 MICA 多肽的 R6、N8、Q48、W49、E51、D52、V53、L54、 N56、K57、T58、R61、R64、K81、D82、Q83、K84、E97、H99、E100、D101、N102、S103、T104、R105、 H109、Y111、D113、E115、L116、N121、E123、T124、E126、Q131、S132、S133、R134、Q136、T137、 M140、N141、R143、N144、L178、R179、R180、S224、H225、D226、T227、Q228、Q229、W230 以及 D232。
24. 如前面權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的抗體，其中對(duì)于與SEQ ID N01的MICA多肽的結(jié) 合，所述抗體與選自下組的抗體競(jìng)爭(zhēng)，該組由以下各項(xiàng)組成： (a) 分別具有SEQ ID N0:7和8的VH和VL區(qū)的抗體（6E4); (b) 分別具有SEQ ID NO: 20和21的VH和VL區(qū)的抗體（20C6); (c) 分別具有SEQ ID N0:33和34的VH和VL區(qū)的抗體（16A8); ⑷分別具有SEQ ID N0:46和47的VH和VL區(qū)的抗體（19E9); (e)分別具有SEQ ID N0:57和58的VH和VL區(qū)的抗體（9C10); ⑴分別具有SEQ ID N0:68和69的VH和VL區(qū)的抗體（12A10); (g) 分別具有SEQ ID N0:79和80的VH和VL區(qū)的抗體（10A7); (h) 分別具有SEQ ID N0:90和91的VH和VL區(qū)的抗體（18E8); (i) 分別具有SEQ ID NO: 101和102的VH和VL區(qū)的抗體（10F3); (j) 分別具有SEQIDN0:112和113的VH和VL區(qū)的抗體（15F9);以及 (k) 分別具有SEQ ID NO: 123和124的VH和VL區(qū)的抗體（14B4)。
25. 根據(jù)以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述抗體包括輕鏈和重鏈，所述輕鏈 包括： a包括具有式VI的氨基酸序列（SEQ ID N0:266)的輕鏈CDRl(LCDRl); b包括具有式VII的氨基酸序列（SEQ ID N0:267)的輕鏈CDR2(LCDR2);和 c包括具有式VIII的氨基酸序列（SEQ ID N0:268)的輕鏈CDR3(LCDR3); 所述重鏈包括： d包括選自式I、II以及III的氨基酸序列（分別為SEQ ID NO:261、262以及263)的 重鏈 CDR1 (HCDR1);和 / 或 e包括具有式IV的氨基酸序列（SEQ ID N0:264)的重鏈CDR2(HCDR2);和/或 f包括具有式V的氨基酸序列（SEQ ID N0:265)的重鏈CDR3(HCDR3)。
26. 選自下組的單克隆抗體，該組由以下各項(xiàng)組成： (a) 單克隆抗體，其包括（i)包括SEQ ID NO:7的重鏈可變區(qū)的⑶Rl、2和3的重鏈以 及（ii)包括SEQ ID N0:8的輕鏈可變區(qū)的⑶Rl、2和3的輕鏈； (b) 單克隆抗體，其包括（i)包括SEQ ID NO: 20的重鏈可變區(qū)的⑶Rl、2和3的重鏈以 及（ii)包括SEQ ID N0:21的輕鏈可變區(qū)的⑶Rl、2和3的輕鏈； (c) 單克隆抗體，其包括（i)包括SEQ ID NO: 33的重鏈可變區(qū)的⑶Rl、2和3的重鏈以 及（ii)包括SEQ ID N0:34的輕鏈可變區(qū)的⑶Rl、2和3的輕鏈； ⑷單克隆抗體，其包括⑴包括SEQ ID NO: 46的重鏈可變區(qū)的⑶Rl、2和3的重鏈以 及（ii)包括SEQ ID N0:47的輕鏈可變區(qū)的⑶Rl、2和3的輕鏈； (e)單克隆抗體，其包括（i)包括SEQ ID NO: 57的重鏈可變區(qū)的⑶Rl、2和3的重鏈以 及（ii)包括SEQ ID N0:58的輕鏈可變區(qū)的⑶Rl、2和3的輕鏈； ⑴單克隆抗體，其包括⑴包括SEQ ID NO:68的重鏈可變區(qū)的⑶Rl、2和3的重鏈以 及（ii)包括SEQ ID N0:69的輕鏈可變區(qū)的⑶Rl、2和3的輕鏈； (g) 單克隆抗體，其包括（i)包括SEQ ID NO: 79的重鏈可變區(qū)的⑶Rl、2和3的重鏈以 及（ii)包括SEQ ID N0:80的輕鏈可變區(qū)的⑶Rl、2和3的輕鏈； (h) 單克隆抗體，其包括⑴包括SEQ ID NO: 90的重鏈可變區(qū)的⑶Rl、2和3的重鏈以 及（ii)包括SEQ ID N0:91的輕鏈可變區(qū)的⑶Rl、2和3的輕鏈； (i) 單克隆抗體，其包括（i)包括SEQ ID NO: 101的重鏈可變區(qū)的⑶Rl、2和3的重鏈 以及（ii)包括SEQ ID NO: 102的輕鏈可變區(qū)的⑶Rl、2和3的輕鏈； (j) 單克隆抗體，其包括⑴包括SEQ ID NO: 112的重鏈可變區(qū)的⑶Rl、2和3的重鏈 以及（ii)包括SEQ ID NO: 113的輕鏈可變區(qū)的⑶Rl、2和3的輕鏈；以及 (k) 單克隆抗體，其包括（i)包括SEQ ID NO: 123的重鏈可變區(qū)的⑶Rl、2和3的重鏈 以及（ii)包括SEQ ID NO: 124的輕鏈可變區(qū)的⑶Rl、2和3的輕鏈。
27. 如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述抗體包括結(jié)合人類Fc γ IIIA受體 的人類重鏈恒定區(qū)。
28. 如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述抗體對(duì)于結(jié)合至MICA多肽具有小 于1(Γ9Μ的二價(jià)Kd。
29. 如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述抗體是嵌合抗體、人類抗體或人源 化抗體。
30. 如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述抗體是四聚體抗體。
31. 如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的抗體，其中該抗體是選自以下的抗體片段：Fab、 Fab'、Fab' -SH、F(ab'）2、Fv、雙抗體、單鏈抗體片段、或包括多個(gè)不同抗體片段的多特異性 抗體。
32. 如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述抗體共軛或共價(jià)地結(jié)合至毒劑。
33. 如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述抗體共軛或共價(jià)地結(jié)合至可檢測(cè) 部分。
34. -種抗體，其通過(guò)嵌合化或人源化如權(quán)利要求1至28所述的抗體而獲得。
35. -種藥物組合物，其包括根據(jù)以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的抗體以及藥學(xué)上可接 受的載體。
36. 如權(quán)利要求35所述的組合物，其中所述抗體以約25mg與500mg之間的量存在。
37. -種試劑盒，其包括如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的抗體，任選地進(jìn)一步包括特異 性識(shí)別如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的抗體的標(biāo)記的第二抗體。
38. -種雜交瘤或重組宿主細(xì)胞，其產(chǎn)生如權(quán)利要求1至28所述的抗體。
39. -種用于治療或預(yù)防對(duì)其有需要的患者的疾病的方法，所述方法包括向所述患者 給予有效量的如權(quán)利要求1-34所述的抗體或如權(quán)利要求35-36所述的組合物。
40. 如權(quán)利要求39所述的方法，其中所述疾病是癌癥。
41. 一種用于在對(duì)象中鑒定MICA表達(dá)細(xì)胞的方法，所述方法包括從對(duì)象獲得包括細(xì)胞 的生物樣品，使所述細(xì)胞與如權(quán)利要求1-34所述的抗體接觸并且評(píng)價(jià)所述抗體是否結(jié)合 至所述細(xì)胞。
42. -種用于在對(duì)象中鑒定MICA表達(dá)疾病相關(guān)細(xì)胞的方法，所述方法包括從對(duì)象獲得 包括疾病相關(guān)細(xì)胞的生物樣品，使所述疾病相關(guān)細(xì)胞與如權(quán)利要求1-34所述的抗體接觸 并且評(píng)價(jià)所述抗體是否結(jié)合至疾病相關(guān)細(xì)胞，其中所述抗體結(jié)合至疾病相關(guān)細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)指 示所述對(duì)象罹患疾病、所述對(duì)象具有疾病相關(guān)細(xì)胞和/或所述疾病相關(guān)細(xì)胞表達(dá)MICA。
43. -種用于選擇罹患對(duì)用如權(quán)利要求1-34所述的抗體的治療應(yīng)答的對(duì)象的方法，所 述方法包括確定所述對(duì)象中的腫瘤細(xì)胞是否表達(dá)MICA多肽，任選地腫瘤細(xì)胞是否表達(dá)升 高水平的MICA多肽，MICA多肽或升高水平的MICA多肽的所述表達(dá)是應(yīng)答對(duì)象的指征。
44. 如權(quán)利要求43所述的方法，進(jìn)一步包括向應(yīng)答對(duì)象給予如權(quán)利要求1-34所述的抗 體。
45. 如權(quán)利要求42-44所述的方法，其中所述疾病是癌癥。
46. 如權(quán)利要求42-45所述的方法，其中所述疾病相關(guān)細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞表達(dá)糖基化 MICA多肽，任選地是包括一個(gè)或多個(gè)核心20-聚糖的MICA多肽。
47. 如權(quán)利要求41-46所述的方法，其中所述方法在確定所述對(duì)象、所述疾病相關(guān)細(xì)胞 或所述腫瘤細(xì)胞是否包括選自下組的MICA等位基因之前沒(méi)有另外的步驟，該組由以下各 項(xiàng)組成 ：MICA*001、MICA*004、MICA*007 以及 MICA*008。
【文檔編號(hào)】A61K39/395GK104244977SQ201380017820
【公開(kāi)日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2013年2月7日 優(yōu)先權(quán)日:2012年2月7日
【發(fā)明者】M·布萊瑞, L·高蒂爾, I·佩羅特, C·邦納福斯 申請(qǐng)人:先天制藥公司