鹽芥耐低磷基因ThPHT1-1及重組載體及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域，更加具體地說，涉及一種鹽芥耐低磷基 因及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 磷是生物生長發(fā)育的重要營養(yǎng)元素之一，是蛋白質(zhì)、核酸、脂類以及各種重要的小 分子的重要組成成分，在植物新陳代謝過程中扮演著十分重要的角色。然而，磷是一種不可 再生的資源，大部分土壤有效磷含量較低，難以滿足植物生長的正常需求。據(jù)報道，世界上 至少有30%~40%的作物產(chǎn)量受到低磷脅迫的嚴(yán)重抑制（Runge-Metzger A.)。農(nóng)業(yè)生產(chǎn) 上，主要通過施用磷肥來解決土壤磷缺乏問題，但是使用的磷肥很容易被土壤固定為作物 不易吸收的難溶性磷，難以完全滿足作物對磷的需求。因此，提高植物對磷的吸收和利用 率，創(chuàng)制耐低磷作物品種，對于減少農(nóng)業(yè)磷的施用量，維護生態(tài)安全，提高作物的產(chǎn)量等方 面具有重要意義。隨著對植物低磷脅迫應(yīng)答的分子機理研究不斷深入，特別是以擬南芥為 研究對象，植物在低磷脅迫條件下的研究取得了突破性的進展。目前，對具有耐低磷性能的 基因的分離是當(dāng)前利用基因工程方法進行耐低磷作物培育的首要任務(wù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種鹽芥耐低磷基因。
[0004] 本發(fā)明的第二個目的是提供一種含鹽芥耐低磷基因的重組載體。
[0005] 本發(fā)明的第三個目的是提供一種含上述重組載體的宿主細胞。
[0006] 本發(fā)明的第四個目的是提供一種鹽芥耐低磷基因在提高植物耐低磷的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：
[0008] 一種鹽芥耐低磷基因 ThPHTl-Ι，該基因是序列表中SEQ ID N0.1所示的核苷酸序 列。
[0009] 含上述一種鹽芥耐低磷基因 ThPHTl-Ι的重組載體。
[0010] 含上述重組載體的宿主細胞。
[0011] 上述一種鹽芥耐低磷基因 ThPHTl-Ι在提高植物耐低磷性能的應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明的鹽芥耐低磷基因 ThPHTl-Ι，從鹽芥中獲取并具有序列表中SEQ ID N0.1 所示的核苷酸序列，并能夠獲得含有該基因的重組載體和宿主細胞，采用該基因轉(zhuǎn)染的擬 南芥表現(xiàn)出對低磷脅迫的耐受力，說明本發(fā)明提供的耐低磷基因 ThPHTl-Ι在改良作物耐低 磷的能力方面，起著重要的作用。
【附圖說明】
[0013] 圖1是本發(fā)明的鹽芥耐低磷ThPHTl-Ι基因克隆電泳示意圖。
[0014]圖2是包含本發(fā)明的鹽芥耐低磷的基因 ThPHTl-Ι的表達載體示意圖。
[0015]圖 3是pCAMBIA3301_ThPHTl-l 轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌C58PCR 篩選結(jié)果。
[0016] 圖4是ThPHTl-1轉(zhuǎn)基因擬南芥T3純合體半定量PCR結(jié)果。
[0017]圖5是ThPHTl-Ι轉(zhuǎn)基因擬南芥T3純合體耐低磷根系實驗效果。
[0018]圖6是ThPHTl-Ι轉(zhuǎn)基因擬南芥耐低磷實驗根系生長情況。
[0019] 本發(fā)明中涉及到的實驗材料、所用試劑來源如下：
[0020] 鹽芥：由中國科學(xué)院植物所李銀心教授帶領(lǐng)，采自北京大興區(qū)鹽漬化的農(nóng)田邊。 [0021 ] pJETl · 2:購自賽默飛公司http://www. thermofisher· com/cn/zh/home .html
[0022] pD0NR201:購自賽默飛公司http: //www. thermofisher · com/cn/zh/home .html
[0023] pCAMBIA3301:購自賽默飛公司http: //www. thermofisher · com/cn/zh/home .html
[0024] DH5a感受態(tài)細胞，反轉(zhuǎn)錄試劑盒：購自北京北京全式金生物技術(shù)有限公司， http://www.transgen.com.cn/shop.htmlo
[0025] 膠回收試劑盒:購自寶生物工程公司，http: //www · takara · com · cn/。
[0026] 農(nóng)桿菌菌株C58:購自中國質(zhì)粒載體菌株細胞株基因保藏中心，
[0027] http://biovector.blog.163.com。
[0028]本發(fā)明中涉及到的反應(yīng)體系：
[0029] BP 反應(yīng)：
[0030] attB-PCR lul
[0031] PDonr 201 0.5ul
[0032] 1XTE Buffer(PH8.0)to 4ul
[0033] LR 反應(yīng)：
[0034] Entry clone(lOOng/ul) lul
[0035] Destination vector(150ng/ul) 0.5ul
[0036] 1XTE Buffer(PH8.0) 2.5ul
【具體實施方式】
[0037] 實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件以及手冊中所述的條 件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0038]下面結(jié)合具體實施例進一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0039] 實施例1
[0040] -種鹽芥耐低磷基因的獲得
[0041] 首先，以采自農(nóng)田邊的鹽芥為原料，利用基因克隆技術(shù)，獲取本發(fā)明的鹽芥耐低磷 ThPHTl-Ι 基因。
[0042] 取生長了五周的新鮮鹽芥植株，使用植物RNeasy Plant Mini Kit(Trans gene Code#EP101-0150rxns)提取total RNA，并且利用EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix(Trans gene Code#AE301_03100rxns)去除基因組DNA干擾，反轉(zhuǎn)錄出 cDNA〇
[0043] 在Phytozome和TAIR數(shù)據(jù)庫中，找出擬南芥全部PHT1基因（9個），然后將這些 AtPHTs放入phytozome的鹽芥數(shù)據(jù)庫中進行檢索。再利用獲得的鹽芥PHT1基因，在 phytozome再次檢索，共找到14個鹽芥PHT1基因。
[0044] 對ThPHTls基因進行了蛋白全序列對比，繪制了鹽芥與擬南芥PHT1家族基因和系 統(tǒng)發(fā)生樹，將與AtPHTl-1親緣關(guān)系最近的鹽芥Thhalv100 03186m命名為ThPHTl-1，并進行基 因克隆。本實驗根據(jù)鹽芥ThPHTl-l基因序列設(shè)計上游引物:PHT-F(SEQIDN0.2所示，5'-AATGCTTGGAATCAGGAGAGACA-S'）和下游弓 | 物：PHT-R(SEQ ID N0.3 所示，5'-CACATC