含有hpv l2的免疫原性vlp及相關(guān)組合物和方法
【專利摘要】在一個方面，本發(fā)明提供免疫原性的含HPV?L2病毒樣顆粒(VLP)。還提供相關(guān)的組合物(例如疫苗)、核酸構(gòu)建體和治療方法。在某些方面，所述VLP由噬菌體PP7或MS2的外殼多肽構(gòu)成，其中所述外殼蛋白通過插入源自HPV?L2的肽抗原修飾，且其中所述HPV?L2肽在VLP上展現(xiàn)且包裹PP7或MS2mRNA。具體地，本發(fā)明的VLP在噬菌體外殼蛋白的N端展現(xiàn)L2肽。令人驚訝地，這些展現(xiàn)L2的VLP比在AB環(huán)中展現(xiàn)同樣的肽時誘導更廣泛的中和抗體應答，從而該免疫原性應答增強了至少10倍因子。本發(fā)明的免疫原性VLP和相關(guān)組合物誘導針對HPV?L2的高滴度抗體應答并在體內(nèi)針對HPV激發(fā)保護。
【專利說明】含有HPV L2的免疫原性VLP及相關(guān)組合物和方法
[0001] 相關(guān)申請和政府權(quán)益
[0002] 本申請要求2012年1月12日提交的、名稱為"Immunogenic HPV L2_Containing VLPs and Related Compositions, Constructs and Therapeutic Methods" 的美國臨時申 請流水號US61/585, 839的優(yōu)先權(quán)權(quán)益，其完整內(nèi)容通過提述并入本文。
[0003] 本專利申請由NIAID Grant No. U19AI084081支持。政府對本發(fā)明有一定權(quán)利。 發(fā)明領(lǐng)域
[0004] 在一個方面，本發(fā)明提供免疫原性的含HPV L2病毒樣顆粒（VLP)。還提供相關(guān)的 組合物（例如疫苗）、核酸構(gòu)建體和治療方法。
[0005] 在某些方面，所述VLP由噬菌體PP7或MS2的外殼多肽構(gòu)成，其中所述外殼蛋白通 過插入源自HPV L2的肽抗原修飾，且其中所述HPV L2肽在VLP上展示。具體地，本發(fā)明的 VLP在噬菌體外殼蛋白的N端展示L2肽。令人驚訝地，這些展示L2的VLP比在AB環(huán)中展 示同樣的肽時誘導更廣泛的中和抗體應答。
[0006] 本發(fā)明的免疫原性VLP和相關(guān)組合物誘導針對HPV L2的高滴度抗體應答并在體 內(nèi)針對HPV假病毒激發(fā)進行保護。
[0007] 發(fā)明背景
[0008] 近年來的重組DNA技術(shù)的發(fā)展已導致疫苗的引入，其中已鑒定、克隆和在適宜的 宿主中表達免疫原性蛋白以獲得足量蛋白，從而允許在動物和人兩者中的有效保護性免 疫。在最有效的疫苗中有許多是基于病毒粒子表面引發(fā)中和抗體的有力能力。這些包括得 到許可的被殺死或減弱的病毒疫苗，如脊髓灰質(zhì)炎、流感和狂犬病，其有效地誘導保護性抗 體應答。更近期地，基于人乳頭狀瘤病毒（HPV)和乙肝病毒（HBV)的結(jié)構(gòu)蛋白的自身裝配 的亞基疫苗已被食品和藥物管理局批準。這些基于病毒樣顆粒（VLP)的疫苗引發(fā)強烈的抗 體應答且在針對HPV和HBV感染的保護中高度有效。
[0009] VLP不僅可用作單獨的疫苗，而且還可以用作多價和免疫原性展示異源抗原的平 臺。單鏈RNA噬菌體家族是一種用于展示這些異源表位的多功能平臺。MS2和PP7外殼蛋 白單鏈二聚體高度容忍肽插入并產(chǎn)生正確裝配的VLP，其以高致密性、重復陣列在VLP的表 面上展示肽插入。這些VLP是高度免疫原性的且將此免疫原性賦予在其表面上展示的異源 肽。
[0010] 目前的HPV疫苗基于由病毒大外殼蛋白（major capsid protein)L1構(gòu)成的VLP。 盡管L1-VLP疫苗高度有效，但它們是類型特異性的，意味著目前的HPV疫苗僅提供針對感 染人的超過100種類型HPV(包括致癌性的15-18種HPV類型）的一個小子集的保護。相 比之下，HPV小外殼蛋白（minor capsid protein)L2含有廣泛交叉中和表位。特異于L2 內(nèi)這些高度保守表位的抗體能中和廣泛范圍的HPV類型的感染。因此，靶向L2的疫苗可能 提供針對由多種HPV類型的感染的更全面的保護。然而，不同于Ll，L2蛋白自身不裝配成 VLP，因此不是非常免疫原性的，意味著難以誘導針對其的高滴度抗體。
[0011] 我們先前描述了兩種RNA噬菌體MS2和PP7的病毒樣顆粒（VLP)用于肽展示的用 途（參見（10))。如上文描述的，MS2和PP7外殼蛋白單鏈二聚體高度容忍肽插入且產(chǎn)生正 確裝配的VLP，其以高致密性、重復陣列在VLP的表面上展示肽插入。這些VLP是高度免疫 原性的且將此免疫原性賦予在其表面上展示的異源肽。肽可以展示在噬菌體外殼蛋白上的 兩個位點，即在所謂的AB環(huán)中和在N端中的任一處。
[0012] 我們先前描述了在AB環(huán)中展示源自人乳頭狀瘤病毒（HPV)小外殼蛋白L2的肽抗 原的VLP。這類重組VLP能充當預防性疫苗以預防多種HPV株系的感染，且在預防動物模型 中的用HPV假病毒體的感染中有效。參見例如2011年2月8日提交的、名稱為"Immunogenic HPV L2_Containing VLPs and Related Compositions, Constructs and Therapeutic Methods"的 PCT/US2011/024030,在 2011 年 8 月 18 日公開為 TO 2011/100234,其完整內(nèi)容 通過提述并入本文。
[0013] 我們在本文中描述了在噬菌體外殼蛋白N端展示L2肽的VLP的構(gòu)建。令人驚訝 地，這些展示L2的VLP比在AB環(huán)中展示同樣的肽時誘導更廣泛的中和抗體應答。如此，展 示L2肽的單重組VLP能提供針對HPV感染的廣泛保護。
[0014] 發(fā)明概述
[0015] 本發(fā)明提供免疫治療和預防性噬菌體病毒樣顆粒（VLP)，其可用于預防人乳頭狀 瘤病毒（HPV)感染和相關(guān)病癥，包括宮頸癌和與HPV有關(guān)的持續(xù)感染。還提供相關(guān)的組合 物（例如疫苗）、核酸構(gòu)建體和治療方法。本發(fā)明的VLP和相關(guān)組合物誘導針對HPV L2的 高滴度抗體應答并在體內(nèi)針對HPV假病毒激發(fā)進行保護。本發(fā)明的VLP、含VLP組合物和 治療方法誘導針對HPV感染的免疫原性應答，賦予針對HPV感染的免疫性，針對HPV感染保 護，并降低被HPV感染而感染的可能性。
[0016] 由于特異于L2內(nèi)的高度保守表位的抗體能中和廣泛范圍的HPV類型的感染，因此 本發(fā)明的靶向HPV L2的VLP和相關(guān)組合物（例如疫苗）提供針對多種HPV類型的感染的 更全面的保護。
[0017] 在一個方面，本發(fā)明提供一種包含噬菌體單鏈外殼多肽二聚體和HPVL2肽的VLP， 其中HPV L2肽展示在VLP上，且其中使用VLP的疫苗接種預防HPV誘導的病癥。
[0018] 在另一個方面，本發(fā)明提供一種包含VLP的組合物，所述VLP包含噬菌體單鏈外殼 多肽二聚體和HPV L2肽，其中HPV L2肽展示在VLP上，且其中所述組合物預防HPV誘導的 病癥。
[0019] 更具體地，本發(fā)明提供VLP、或包含VLP的組合物，其中通過用包含以下任一項的 核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化原核生物來制備VLP :
[0020] (1) (a)細菌或噬菌體啟動子，其與噬菌體PP7單鏈外殼多肽二聚體的編碼序列可 操作地關(guān)聯(lián)，其中所述外殼多肽二聚體編碼序列修飾為：（i)限定第一限制位點，其位于外 殼多肽二聚體編碼序列的下游部分中，且位于限定外殼多肽二聚體N端的序列的5'或內(nèi) 部，和（ii)含有編碼HPV L2肽的核苷酸序列；(b)位于外殼多肽二聚體編碼序列3'的第 二限制位點；(c)與啟動子可操作關(guān)聯(lián)的抗生素抗性基因；和（d)用于在原核細胞中復制的 復制起點；或
[0021] (2) (a)細菌或噬菌體啟動子，其與噬菌體MS2單鏈外殼多肽二聚體的編碼序列可 操作地關(guān)聯(lián)，其中所述外殼多肽二聚體編碼序列修飾為：（i)限定位于以下序列部分的5' 的密碼子序列，該序列部分限定外殼多肽二聚體N端，和（ii)含有編碼HPV L2肽的核苷酸 序列；(b)位于外殼多肽二聚體編碼序列3'的限制位點；(c)位于第二限制位點3'的PCR 引物；（d)對第一抗生素抗性的阻遏物，其中所述阻遏物可操作地關(guān)聯(lián)于啟動子；（e)修飾 為含有賦予對第二抗生素抗性的基因的輔助噬菌體基因；和（f)用于在原核細胞中復制的 復制起點。
[0022] 在某些方面，本發(fā)明提供通過用如本文中描述的含HPV L2肽序列的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化原 核生物制備的VLP。在其他方面，本發(fā)明的VLP和含VLP組合物（例如疫苗）由包含源自不 同HPV類型的HPV L2肽的VLP構(gòu)成。在其他方面，本發(fā)明的VLP和含VLP組合物包含展示 多種HPV L2序列的雜合VLP。
[0023] 在某些方面，本發(fā)明提供一種接種有形成HPV相關(guān)病癥風險的受試者的方法，所 述方法包括對所述受試者施用一劑或多劑包含如本文中描述的含HPV L2的VLP的組合物。
[0024] 本發(fā)明的這些和其他方面進一步在發(fā)明詳述中描述。
[0025] 附圖簡述
[0026] 圖1列出了用于將所列序列克隆到MS2外殼的正向引物（顯示為5'至3'），以及 由這些引物編碼的氨基酸序列。Ncol限制位點顯示為劃線斜體，肽插入顯示為粗體，而接頭 序列斜體顯示。MS2外殼蛋白序列加下劃線。
[0027] 圖2描繪了野生型和重組MS2VLP的透射電子顯微圖。
[0028] 圖3.圖3顯示了在用野生型MS2VLP(對照）或展示L2肽（20-29)、（17-31) 或（14-40)的MS2VLP免疫的小鼠組中的IgG抗體應答。對綴合鏈霉親合素的代表來自 HPV16L2的氨基酸14-40的肽計算滴度。結(jié)果來自在初始疫苗接種后一周（紅色）或追加 后一周（黑色）獲得的血清。每個數(shù)據(jù)點代表來自個體小鼠的抗體滴度。線代表每個組的 幾何均值滴度。如指示的，將小鼠用沒有外源佐劑的5yg VLP免疫。顯示在一次或兩次免 疫后對HPV16L2 (14-40)肽的終點稀釋ELISA滴度。
[0029] 圖4.圖4顯示用在MS2外殼蛋白N端或PP7的AB環(huán)中展示的16L2(17-31)免疫 時引發(fā)的血清的交叉反應性。將ELISA板用代表HPV1，5, 6, 16, &18的綴合鏈霉親合素的L2 肽包被，并與來自小鼠的血清的1:2560稀釋反應。顯示來自每組中3只個體小鼠血清的光 密度（〇D 4J值的平均。誤差棒代表SEM。如顯示的，在N端展示HPV16L2序列的VLp誘導 更廣泛的交叉反應抗體應答。
[0030] 圖5.該圖顯示用在MS2外殼蛋白N端展示的16L2(17-31)免疫的小鼠相比于用 16L2(17-31)AB環(huán)PP7VLP免疫的那些小鼠顯示更廣泛的對多種HPV PsV類型的感染的保 護。將 Balb/c 小鼠用 5μ g 的 16L2(17-31)Nterm MS2VLP 或 16L2(17-31)AB 環(huán) PP7VLP 或 HPV16L1L2VLP或MS2/PP7VLP的混合物以兩周時間間隔免疫（肌內(nèi)）。在最后一次免疫 后 3 至 5 周，將小鼠用 A)PsV16 和 B)PsV5, 6, 31，33, 35, 39, 45, 51，53 和 PsV58 激發(fā)。所有 激發(fā)均陰道內(nèi)完成，除了 PsV5是在皮內(nèi)完成的以外。激發(fā)后48小時時，將0. 4mg的螢光素 經(jīng)由用于PsV激發(fā)的同一途徑施用，并使用Living Image 3.2軟件測定每只小鼠的平均輻 射（p/s/cmVsr)值。填充白色的黑圈代表用MS2/PP7VLP免疫的小鼠，填充黑色圈代表用 HPV16L1L2VLP免疫的小鼠，填充藍色的圈代表用16L2(17-31)AB環(huán)PP7VLP免疫的小鼠，而 填充紅色的圈代表用16L2(17-31)Nterm MS2VLP免疫的小鼠。黑色實線代表平均輻射的幾 何均值。
[0031] 圖6描繪pDSP62質(zhì)粒。
[0032] 圖7描繪質(zhì)粒pDSPl。
[0033] 圖8顯示在針對異源HPV PsV激發(fā)的保護的急劇差異。用L2-PP7VLP免疫導致對 異源PsV的適度或無保護。相比之下，用依照本發(fā)明的N端展示的L2-MS2VLP免疫導致對 用9種異源類型的陰道激發(fā)和用HPV5PsV的一種皮內(nèi)激發(fā)的顯著保護。我們觀察到對用測 試的10種異源PsV類型中的9種感染的非常強（信號中80至7, 190倍降低）的保護，這 是一項未預期到的結(jié)果。該保護實質(zhì)性強于在用AB環(huán)展示的L2免疫的小鼠中觀察到的。 使用依照本發(fā)明的VLP對異源激發(fā)的保護一般比其中在AB環(huán)中展示抗原L2肽的VLP高至 少約5-10倍。對異源激發(fā)的保護比使用N端VLP構(gòu)建體好10-25倍（HPV5, 31&39)、40-100 倍（HPV45, 51，53, &58)或 140-1000 倍（HPV6, 33, &35)。
[0034] 發(fā)明詳述
[0035] 依照本發(fā)明，可以采用本領(lǐng)域技術(shù)中常規(guī)分子生物學、微生物學和重組DNA 技術(shù)。這類技術(shù)在文獻中有完全解釋。參見例如Sambrook等，2001，"Molecular Cloning:A Laboratory Manual" ;Ausubel 編，1994，"Current Protocols in Molecular Biology"Volumes I-III ；Celis 編，1994，"Cell Biology: A Laboratory Handbook^Volumes I-III ；Coligan 編，1994,"Current Protocols in Immunology^Volumes I-III ；Gait ed.，1984,"Oligonucleotide Synthesis" ;Hames &Higgins eds.，1985,"Nucleic Acid Hybridization" ；Hames&Higgins, eds.，1984, 〃 Transcription And Translation" ；Freshney 編，1986,"Animal Cell Culture" ；IRL Press,1986,"Immobilized Cells And Enzymes" ;Perbal, 1984, "A Practical Guide To Molecular Cloning"。
[0036] 在提供值的范圍時，應理解除非上下文清楚地另外指示，該范圍上限和下限之間 的每個中間值（到下限的1/10單位），和在該指定范圍中的任何其他指定值或中間值均涵 蓋在本發(fā)明中。那些更小范圍的上限和下限可以獨立地包含在該更小范圍中且亦涵蓋在本 發(fā)明中，隸屬于指定范圍內(nèi)的任何具體排除的限（subject to any specifically excluded limit in the stated range)。當指定的范圍包含一個或兩個限時，排除任一或兩個那些 所包括的限的范圍也包括在本發(fā)明中。
[0037] 除非另外指定，本文中使用的所有技術(shù)和科學術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域中的普 通技術(shù)人員普遍理解的相同的含義。盡管在本發(fā)明的實踐或測試中還可以使用與本文所述 那些相似或等同的任意方法和材料，但現(xiàn)在描述優(yōu)選的方法和材料。
[0038] 必須注意，如本文中和所附權(quán)利要求中使用的，單數(shù)形式的"一個"、"一種"和"該" 包括復數(shù)指代物，除非上下文清楚地另外指示。
[0039] 此外，下列屬于應具有下文列出的定義。
[0040] 如本文中使用的，術(shù)語"多核苷酸"指具有任意長度的核苷酸（核糖核苷酸或脫氧 核糖核苷酸）的聚合形式，且包括雙鏈和單鏈DNA和RNA。多核苷酸可以包括具有不同功能 的核苷酸序列，如編碼區(qū)和非編碼區(qū)如調(diào)控序列（例如啟動子或轉(zhuǎn)錄終止子）。多核苷酸可 直接從天然來源獲得，或者可由重組、酶法或化學技術(shù)輔助制備。多核苷酸在拓撲學上可以 是線性或環(huán)狀的。多核苷酸可以是例如載體（如表達或克隆載體）的一部分，或一個片段。
[0041] 如本文中使用的，術(shù)語"多肽"廣泛地指通過肽鍵連接在一起的兩個或更多個氨基 酸的聚合物。術(shù)語"多肽"還包括含有超過一種由肽鍵連接的多肽的分子，或共價或非共價 連接在一起作為多聚體（例如二聚體、四聚體）的多肽復合物。如此，術(shù)語肽、寡肽和蛋白質(zhì) 均包括在多肽的定義中，且這些術(shù)語可交換使用。應當理解，這些術(shù)語既不意味著特定長度 的氨基酸聚合物，也不意圖暗示或區(qū)分所述多肽是使用重組技術(shù)、化學或酶法合成產(chǎn)生的， 還是天然存在的。
[0042] 本文中描述的氨基酸殘疾優(yōu)選處于"L"異構(gòu)體形式。然而，可用"D"異構(gòu)體形式 的殘基取代任何L-氨基酸殘基，只要多肽保留了期望的功能。NH2指在多肽氨基末端存在 的游離氨基基團。C00H指在多肽羧基末端存在的游離羧基基團。
[0043] 術(shù)語"編碼序列"在本文中定義為直接指明其蛋白質(zhì)產(chǎn)物的氨基酸序列的核酸序 列的一部分。編碼序列的邊界一般由恰在開放閱讀框上游在mRNA5'端的核糖體結(jié)合位點 (原核生物）或ATG起始密碼子（真核生物）和恰在開放閱讀框下游在mRNA 3'端的轉(zhuǎn)錄 終止子序列確定。編碼序列可包括但不限于，DNA、cDNA和重組核酸序列。
[0044] 重組細胞的"異源"區(qū)是在更大的核酸分子內(nèi)的可鑒定的核酸區(qū)段，其未見于與該 更大的分子天然關(guān)聯(lián)。
[0045] "復制起點"指參與DNA合成的那些DNA序列。
[0046] "啟動子序列"是能在細胞中結(jié)合RNA聚合酶并啟動下游（3'方向）編碼序列轉(zhuǎn) 錄的DNA調(diào)控區(qū)。出于定義本發(fā)明的目的，啟動子序列在其3'端被轉(zhuǎn)錄起始位點結(jié)合，并 向上游延伸（5'方向）以包含以在背景之上的可檢測水平啟動轉(zhuǎn)錄所需的最小數(shù)目的堿基 或元件。在啟動子序列內(nèi)將發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄啟動以及負責RNA聚合酶結(jié)合的蛋白質(zhì)結(jié)合域（通用 序列）。真核啟動子將經(jīng)常但不總是地含有"TATA"盒和"CAT"盒。原核啟動子除了-10 和-35通用序列外還含有Shine-Dalgarno序列。
[0047] "表達調(diào)控序列"是控制和調(diào)節(jié)另一 DNA序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯的DNA序列。編碼序列 在細胞中"處于"轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列的"控制下"，當RNA聚合酶將編碼序列轉(zhuǎn)錄成mRNA 時，然后mRNA被翻譯成由該編碼序列編碼的蛋白質(zhì)。轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列是DNA調(diào)控序列 如啟動子、增強子、多腺苷酸化信號、終止子等，其提供編碼序列在宿主細胞中的表達。
[0048] 當已將外源或異源DNA引入細胞內(nèi)部時，該細胞是已被這類DNA "轉(zhuǎn)化的"。轉(zhuǎn)化 DNA可能或可能不整合（共價連接）到構(gòu)成細胞基因組的染色體DNA中。在原核生物、酵母 和例如哺乳動物細胞中，轉(zhuǎn)化DNA可保持在附加體元件上如質(zhì)粒。
[0049] 應領(lǐng)會還在本發(fā)明范圍內(nèi)的是編碼本發(fā)明多肽的核酸序列，其編碼具有與本文中 所述序列相同的氨基酸序列的多肽，但其與本文中公開的核酸是簡并的。"與…簡并"意指 使用不同的三字密碼子來指定特定的氨基酸。
[0050] 如本文中使用的，"表位"指多肽的抗原決定簇。表位可以包含處于對表位獨特的 空間構(gòu)象的3個氨基酸。一般地，表位由至少5個這類氨基酸組成，更通常地，由至少8-10 個這類氨基酸組成。測定氨基酸的空間構(gòu)象的方法是本領(lǐng)域中已知的，且包括例如X射線 晶體學和二維核磁共振。
[0051] 如本文中使用的，術(shù)語"外殼蛋白"指能摻入噬菌體或RNA噬菌體的殼體裝配中的 噬菌體或RNA噬菌體蛋白。
[0052] 如本文中使用的，"外殼多肽"在本文中定義為外殼蛋白的多肽片段，其擁有外殼 蛋白功能且另外還涵蓋全長外殼蛋白或其單鏈變體。
[0053] 如本文中使用的，術(shù)語"免疫應答"指體液免疫應答和/或細胞免疫應答，其導致 B和/或T淋巴細胞和/或抗原提呈細胞的活化或增殖。然而，在一些情況中，免疫應答可 以是低強度的，且僅在使用至少一種依照本發(fā)明的物質(zhì)時變?yōu)榭蓹z測的。"免疫原性"指用 于刺激活生物體免疫系統(tǒng)的試劑，從而免疫系統(tǒng)的一種或多種功能增加并針對該免疫原性 齊U。"免疫原性多肽"是引發(fā)如上文描述的細胞和/或體液免疫應答的多肽，其在存在或缺 乏佐劑的情況下為單獨的或與載體連接的。優(yōu)選地，抗原提呈細胞可以是活化的。
[0054] 如本文中使用的，術(shù)語"疫苗"指含有本發(fā)明的組合物的制劑，且其處于能對動物 施用的形式。
[0055] 如本文中使用的，術(shù)語"噬菌體的病毒樣顆粒"指一種類似于噬菌體結(jié)構(gòu)的病毒樣 顆粒（VLP)，其為非復制性和非感染性的，而且至少缺少編碼噬菌體復制體系的基因，典型 地還缺少編碼負責病毒附接或進入宿主的蛋白質(zhì)的基因。
[0056] 然而，該定義還應該涵蓋其中前述基因仍存在但失活的噬菌體的病毒樣顆粒，因 此其還導致噬菌體的非復制性和非感染性病毒樣顆粒。
[0057] RNA噬菌體外殼蛋白的VLP :從RNA噬菌體外殼蛋白一個或多個亞基的自身裝配形 成，并任選地含有宿主RNA的的殼體結(jié)構(gòu)被稱為"RNA噬菌體外殼蛋白的VLP"。在一個具體 的實施方案中，所述殼體結(jié)構(gòu)式從90個外殼蛋白單鏈二聚體或180個外殼蛋白單體的自身 裝配形成的。
[0058] 核酸分子是"可操作地連接于"或"可操作地關(guān)聯(lián)于"表達調(diào)控序列的，當該表達 調(diào)控序列控制并調(diào)節(jié)核酸序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯時。術(shù)語"可操作地連接"包括在要表達的核 酸序列前面具有適宜的起始信號（例如ATG)，并維持正確的閱讀框以允許該核酸序列在表 達調(diào)控序列控制下的表達和產(chǎn)生由該核酸序列編碼的期望的產(chǎn)物。如果期望插入重組DNA 分子的基因不含有適宜的起始信號，那么可將這類起始信號插入基因的前面。
[0059] HPV誘導的病癥、免疫原性和預防功效
[0060] "HPV誘導的病癥"或"HPV相關(guān)病癥"包括但不限于，在本節(jié)中鑒定的病癥。免疫 原性和預防功效（例如組合物對于HPV誘導的病癥是否是預防性的）可通過本節(jié)中提及的 技術(shù)和標準，或本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的其他方法學來評估。
[0061] 已鑒定出超過100種不同的HPV類型并通過數(shù)字指代。類型 16, 18, 31，33, 35, 39, 45, 51，52, 56, 58和59是"高風險"性傳播的HPV的子集且可能導致 宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變（cervical intraepithelial neoplasia) (CIN)、夕卜陰上皮內(nèi)瘤樣病 變（vulvar intraepithelial neoplasia) (VIN)、陰道癌、陰莖上皮內(nèi)瘤樣病變（penile intraepithelial neoplasia) (PIN)、和 / 或肛門上皮內(nèi)瘤樣病變（anal intraepithelial neoplasia) (AIN)的形成。已發(fā)現(xiàn)幾種類型的HPV，特別是類型16,與口咽鱗狀細胞癌（頭和 頸癌的一種形式）有關(guān)。HPV (例如HPV 6和11)導致生殖器疣，而HPV 6和11能導致復發(fā) 性呼吸道乳頭狀瘤。HPV能導致免疫受損個體中的疣狀表皮發(fā)育不良（印idermodysplasia verruciformis)〇
[0062] 如此，高風險的人宮頸上皮的HPV感染與宮頸癌的生成有因果聯(lián)系。參見Durst 等·，PNAS 803812-3815, 1983 ;Gissmann 等，J. Invest. Dermatol 83 265-285, 1984 (HPV16 與泌尿生殖道的惡性前和惡性疾病有關(guān)，且具體地與宮頸癌有關(guān)）。乳頭狀瘤病毒預防性疫 苗靶向系統(tǒng)性免疫系統(tǒng)以誘導中和抗體，其保護基底細胞免于感染。
[0063] 為了評估免疫原性（例如組合物是否誘導針對HPV L2的高滴度抗體應答），可通 過ELISA測量抗-HPV 16L2幾何均值滴度（GMT)，例如在治療后幾周（例如3或4周）或在 幾次劑量（例如3或4)的施用后。還可以測定在幾周治療（例如3或4周）或幾次劑量 (例如3或4)后對HPV 16血清轉(zhuǎn)化的受試者的百分數(shù)以評估免疫原性。
[0064] 為了測定預防功效，可以在激發(fā)后的各個終點處在保持對HPV感染HPV16血清反 應陰性和PCR陰性（拭樣和活組織檢查）的受試者上進行免疫原性分析。
[0065] HPV L2
[0066] 如本文中使用的，"HPV L2"包括所有人乳頭狀瘤病毒的L2殼體蛋白。
[0067] 病毒樣顆粒的產(chǎn)生
[0068] 本發(fā)明針對病毒樣噬菌體顆粒以及用于體內(nèi)及體外生成這些顆粒的方法。如本文 中使用的，"體外"產(chǎn)生病毒體指在細胞外產(chǎn)生病毒體，例如在無細胞系統(tǒng)中，而"體內(nèi)"產(chǎn) 生病毒體指在細胞內(nèi)部產(chǎn)生病毒體，例如在大腸桿菌（Escherichia coli)或銅綠假單胞菌 (Pseudomonas aeruginosa)細胞中。
[0069] 噬菌體
[0070] 本文中描述的VLP由單鏈RNA噬菌體的外殼蛋白的裝配組成[RNA Bacteriophages, in The Bacteriophages. Calendar, RL 編 Oxford University Press. 2005]。該組的已知病毒攻擊多種細菌，如大腸桿菌、假單胞菌和不動桿菌 (Acinetobacter)。每種擁有高度類似的基因組組織、復制策略和病毒體結(jié)構(gòu)。具體地，噬菌 體含有單鏈（+)_有義RNA基因組，含有成熟酶、外殼和復制酶基因，且具有小的（〈300埃） 二十面殼體。這些包括但不限于 MS2、PP7、Qb、R17、SP、PP7、GA、Mil、MX1、f4、Cb5、Cbl2r、 Cb23r、7s 和 f2RNA 噬菌體。
[0071] 裝配該噬菌體家族的二十面殼體殼所需要的信息完全包含在外殼蛋白本身內(nèi)。例 如，純化的外殼蛋白能在由RNA存在刺激的過程中體外形成殼體[Beckett等.，1988, J. Mol Biol 204:939-47]。而且，在細胞中從質(zhì)粒表達的外殼蛋白體內(nèi)裝配成病毒樣顆粒 [Peabody, D.S·，1990, J Biol Chem 265:5684-5689]。
[0072] PP7外殼多肽的例子包括但不限于與Rna發(fā)夾復合的PP7外殼蛋白二聚體的多個 鏈（例如 Genbank 登錄號 2QUXR ;2QUX0 ;2QUX_L ;2QUX_I ;2QUX_F ;和 2QUX_C)。亦參見本文 中實施例 1 和 Peabody,等·，RNA recognition site of PP7coat protein, Nucleic Acids Research, 2002, Vol. 30, No. 19 4138-4144。
[0073] RNA噬菌體外殼多肽
[0074] 可用于本發(fā)明的外殼多肽還包括那些與上文公開的一種或多種外殼多肽序列具 有相似性的多肽。相似性稱為結(jié)構(gòu)相似性。結(jié)構(gòu)相似性可通過將兩條氨基酸序列（即候選 氨基酸序列和氨基酸序列）的殘基比對以優(yōu)化沿其序列長度上的相同氨基酸的數(shù)目來確 定；在進行比對時允許任一或兩條序列中的缺口以優(yōu)化相同氨基酸的數(shù)目，但是每條序列 中的氨基酸必須保留其適當?shù)拇涡?。候選的氨基酸序列可從單鏈RNA病毒分離，或可使 用重組技術(shù)產(chǎn)生，或化學或酶法合成。優(yōu)選地，使用GCG程序包（版本10. 2, Madison WI) 中的BESTFIT算法，或BLAST 2搜索算法的Blastp程序來比較兩條氨基酸序列，所述搜索 算法如由 Tatusova,等·（FEMS Microbial Lett 1999,174:247-250)描述并可在 http:// www. ncbi. nlm. nih. gov/blast/bl2seq/bl2. html 獲得的。優(yōu)選地，使用對于所有 BLAST 2搜索參數(shù)的缺省值，包括矩陣=BL0SUM62 ;開放缺口罰分=11，延伸缺口罰分=1，缺口 xdropoff = 50,預期=10,詞長=3,且任選地過濾打開（filter on)。在使用BLAST搜索算 法對兩條氨基酸序列的比較中，結(jié)構(gòu)相似性被稱為"同一性"。優(yōu)選地，外殼多肽還包括具有 與上文公開的一條或多條氨基酸序列有至少80%氨基酸同一性、至少85%氨基酸同一性、 至少90%氨基酸同一性、或至少95%氨基酸同一性的氨基酸序列的多肽。優(yōu)選地，外殼多 肽是活性的。外殼多肽是否有活性可通過評估該多肽形成殼體和包裝單鏈RNA分子的能力 來確定。這類評估可使用體內(nèi)或體外系統(tǒng)完成，且這類方法是本領(lǐng)域中已知和常規(guī)的?；?者，如果多肽具有與所記載的外殼多肽相似的三維結(jié)構(gòu)和/或功能活性，則該多肽可視為 結(jié)構(gòu)相似的。
[0075] HPV L2 肽
[0076] 如本文中描述的，HPV L2肽序列可存在于外殼多肽的N端。優(yōu)選地，所述HPV L2 肽序列依照下文呈現(xiàn)的實施例在殼體的外表面上表達。
[0077] HPV L2肽序列包括但不限于源自人乳頭狀瘤病毒類型16(HPV16)的小殼體蛋白 L2的氨基酸序列。
[0078] 為了確定結(jié)構(gòu)相似外殼多肽中的相應位置，將該結(jié)構(gòu)相似外殼多肽的氨基酸序列 與指定的外殼多肽的序列比對，如上文說明的。
[0079] 在一個具體的實施方案中，所述外殼多肽是含有上游和下游亞基的單鏈二聚體。 每個亞基含有功能性外殼多肽序列。HPV L2肽序列可在上文所提及的位點處插入上游和/ 或下游亞基，例如在下游亞基的N端。在一個具體的實施方案中，所述外殼多肽是MS2外殼 多肽的單鏈二聚體。
[0080] 轉(zhuǎn)錄單元的制備
[0081] 本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄單元包含表達調(diào)控區(qū)，（例如啟動子），編碼外殼多肽的序列和轉(zhuǎn)錄 終止子。RNA多核苷酸可任選地包含外殼識別位點（亦稱為"包裝信號"、"翻譯操縱子序 列"、"外殼識別位點"）?；蛘?，轉(zhuǎn)錄單元可以沒有翻譯操縱子序列。啟動子、編碼區(qū)、轉(zhuǎn)錄 終止子和外殼識別位點（當存在時），一般是可操作連接的。"可操作地連接"或"可操作地 關(guān)聯(lián)"指一種并置，其中如此描述的組分處于允許其以其所意圖的方式發(fā)揮功能的關(guān)系中。 調(diào)控序列"可操作地連接"或"可操作地關(guān)聯(lián)"于編碼區(qū)，當其以使得編碼區(qū)的表達在與調(diào) 控序列相容的條件下實現(xiàn)的方式連接時。外殼識別位點在存在時可以在RNA多核苷酸內(nèi)的 任何位置，只要其以意圖方式發(fā)揮功能。
[0082] 本發(fā)明不受到任何具體啟動子的使用的限制，而且很多種啟動子是已知的。本發(fā) 明中使用的啟動子可以是組成型或誘導型啟動子。優(yōu)選的啟動子能驅(qū)動由編碼外殼多肽的 編碼區(qū)編碼的高水平的RNA。這類啟動子的例子是本領(lǐng)域中已知的且包括例如lac啟動子、 T7、T3和SP6啟動子。
[0083] 容易確定編碼本文中描述的外殼多肽的編碼區(qū)的核苷酸序列。這些核苷酸序列的 類別是大且有限的，且每個類別成員的核苷酸序列可由本領(lǐng)域技術(shù)人員參照標準遺傳碼容 易地確定。此外，RNA噬菌體單鏈外殼多肽的編碼序列包含用于插入HPV L2肽編碼序列的 位點。在一個具體的實施方案中，用于插入HPV L2肽編碼序列的位點是限制酶位點。在另 一個實施方案中，使用利用了標準技術(shù)的聚合酶鏈式反應（PCR)插入HPV L2肽編碼序列。
[0084] 在一個具體的實施方案中，所述編碼區(qū)編碼外殼多肽的單鏈二聚體。在一個最具 體的實施方案中，編碼區(qū)編碼經(jīng)修飾的單鏈外殼多肽二聚體，其中所述修飾包含在插入位 點至少4個氨基酸的編碼序列插入。轉(zhuǎn)錄單元可含有細菌啟動子，如lac啟動子或者它可 以含有噬菌體啟動子，如T7啟動子。
[0085] 合成
[0086] 本發(fā)明的VLP可通過將轉(zhuǎn)錄單元引入細菌中而體內(nèi)產(chǎn)生，尤其是如果轉(zhuǎn)錄單元含 有細菌啟動子的話。或者，它可以在偶聯(lián)的無細胞轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中體外合成。
[0087] 包裹異源物質(zhì)的VLP的裝配
[0088] 如上文記載的，本發(fā)明的VLP包裹有HPV L2肽編碼序列。這些VLP還可以與另一 種物質(zhì)如佐劑組合裝配。特定地，從用變性劑（通常為乙酸）分解的VLP獲得純化的外殼 蛋白。將佐劑與外殼蛋白混合，然后在其存在下重裝配。在一個具體的實施方案中，該物 質(zhì)對VLP的內(nèi)部具有一些親和力且優(yōu)選帶負電荷。
[0089] 在另一個實施方案中，將佐劑經(jīng)由天然存在于VLP表面的孔被動擴散到VLP中。在 一個具體的實施方案中，該物質(zhì)足夠小以通過這些孔，而且對VLP的內(nèi)部具有高親和力。 實施例
[0090] 通過對以下非限制性例子的提述可以更好地理解本發(fā)明，這些例子提供為例示本 發(fā)明。呈現(xiàn)以下例子以更完全地示例本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，但不應以任何方式理解為限 制本發(fā)明的廣泛范圍。對應于數(shù)字指示引用的參考文獻在實施例后列出。
[0091] 噬菌體PP7和MS2和相關(guān)質(zhì)粒
[0092] 先前我們描述了噬菌體MS2的病毒樣顆粒用于肽展示的用途。我們確立了 MS2 外殼蛋白單鏈二聚體高度容忍肽插入且其產(chǎn)生正確裝配的VLP，該VLP特定地包裹有編碼 其合成的 mRNA (Peabody, D. S.，Manifold-Wheeler, B.，Medford, A.，Jordan, S. K.，do Carmo Caldeira，J·，and Chackerian，B. (2008) J Mol Biol 380, 252-263)。如上文解釋的，MS2 僅 是一個大病毒家族的一個成員，該家族的個體成員共享相似的分子生物學，例如PP7 ( -種 噬菌體）。
[0093] 實駘概沭
[0094] 如上文解釋的，我們先前已描述了兩種RNA噬菌體MS2和PP7的VLP用于肽展示 的用途。MS2和PP7外殼蛋白單鏈二聚體高度容忍肽插入，且產(chǎn)生正確裝配的VLP，其以高 致密性、重復陣列在VLP的表面上展示肽插入。這些VLP是高度免疫原性的，且將此高免疫 原性賦予在其表面展示的異源肽。在本文中，我們還描述了展示源自人乳頭狀瘤病毒（HPV) 小殼體蛋白L2的肽抗原的VLP。這類重組VLP充當預防性疫苗以阻止通過多種HPV株系的 感染。下文描述的疫苗誘導針對L2的高滴度抗體應答，并且保護小鼠免于多種HPV假病毒 的感染。
[0095] 實施例1
[0096] 如上文記載的，目前的HPV疫苗基于包含病毒大殼體蛋白L1的VLP。盡管L1-VLP 疫苗是高度有效的，但其為類型特異性的，意味著目前的HPV疫苗僅提供針對感染人的超 過100種HPV類型（包括15-18種致癌性HPV類型）的小子集的保護。相對地，HPV小殼 體蛋白L2含有廣泛的交叉中和性表位。特異于L2內(nèi)的這些高度保守表位的抗體能中和廣 泛范圍的HPV類型的感染（7)。因此，靶向L2的疫苗可以提供針對多種HPV類型感染的更 全面的保護。不同于L1，L2蛋白不自身裝配成VLP，因此不是非常免疫原性的，這意味著難 以誘導針對其的高滴度抗體。
[0097] 我們構(gòu)建并建立了靶向HPV L2蛋白的基于VLP的疫苗的效用。下文數(shù)據(jù)描述了 展示L2肽的重組MS2VLP的構(gòu)建。這些疫苗在小鼠感染模型中誘導針對L2的高滴度抗體 應答并針對HPV激發(fā)進行保護。還可以使用類似的技術(shù)來構(gòu)建展示L2肽的PP7VLP。
[0098] 設計展示L2的VLP :
[0099] 如上文記載的，我們先前描述了表達質(zhì)粒pDSP62和pDSPl (3)(圖6和7)的構(gòu)建。 該質(zhì)粒編碼一種MS2外殼蛋白版本的表達，其中兩個拷貝的外殼蛋白遺傳融合成"單鏈"二 聚體。這些質(zhì)粒含有獨特的Ncol限制位點，其允許在單鏈二聚體N端的序列遺傳插入。為 了創(chuàng)建展示L2肽的VLP，我們設計了 PCR引物，其允許我們將3條HPV16L2來源的序列克隆 到外殼蛋白的N端上。這些序列代表來自HPV16的L2氨基酸20-29, 17-31，和14-40。用 于創(chuàng)建這些構(gòu)建體的引物和這些插入的氨基酸序列顯示于圖1。
[0100] 使用含有重組序列的經(jīng)修改PDSP62在大腸桿菌中表達重組VLP。在我們的用于表 達和純化的標準規(guī)程后，通過透射電子顯微鏡使重組VLP可見。如圖2中顯示的，所有3種 重組外殼蛋白形成VLP。
[0101] 在MS2VLP上展示的L2肽是免疫原性的
[0102] 為了測試VLP的免疫原性，將小鼠通過肌內(nèi)注射用16L2-VLP或野生型MS2VLP免 疫。將3小鼠的組用10 μ g VLP無任何外源佐劑進行肌內(nèi)免疫。將所有小鼠在兩周后用相 同量的VLP加強免疫。在每次接種后一周收集血清。通過終點稀釋ELISA測試來自小鼠的 血清中特異于16L2肽的IgG抗體（圖3)。如顯示的，用所有3種16L2-VLP免疫的小鼠生 成針對相應肽的高滴度（幾何均值滴度>10 4)IgG應答，而在對照小鼠中沒有檢測到抗體。 如此，在MS2單鏈二聚體VLP表面展示的L2肽出高免疫原性，這是其他展示VLP的抗原特 征性的。
[0103] 展示HPV16L2肽的PP7VLP能誘導中和抗體，其保護小鼠免于同源和異源生殖性 HPV假病毒激發(fā)
[0104] 我們設計的16L2-VLP疫苗含有來自HPV16L2的氨基酸17-31，該區(qū)域顯示為含 有一個或多個高度交叉反應性中和表位（1，5)，表明16L2VLP能引發(fā)與來自其他HPV株系 的L2序列廣泛交叉反應的抗體而且能潛在地保護免于HPV激發(fā)。首先，我們評估來自用 在N端展示HPV16L2(17-31)的重組MS2VLP免疫的小鼠的血清是否能與來自5種HPV株系 (HPV1，5, 6, 16, &18)的代表L2氨基酸14-40的肽交叉反應。如圖4中顯示的，該血清是廣泛 交叉反應性的，與所有5種肽均反應。沒有預料到的是，來自用在AB環(huán)中展示相同HPV16L2 肽的PP7VLP免疫的小鼠的血清則遠沒有那么廣泛地交叉反應。
[0105] 為了確定在MS2外殼蛋白N端插入表位17 - 31所觀察到的更廣泛的交叉反應性 與保護相關(guān)，將小鼠用在MS2外殼蛋白N端[16L2(17-31)Nterm MS2VLP]或在PP7外殼蛋 白AB環(huán)[16L2 (17 - 31) AB環(huán)PP7VLP]展示HPV16L2表位的VLP或?qū)φ誚LP免疫，然后在第 二次免疫后 3 至 5 周用一組 HPV 假病毒（PsV) (PsV5, 6, 16, 31，33, 35, 39, 45, 51，53 和 58) 激發(fā)。如預期的，用 16L2(17-31)Nterm MS2VLP 或 16L2(17-31)AB 環(huán) PP7VLP 免疫的小 鼠顯示對使用同源HPV16PsV的高劑量陰道激發(fā)的幾乎完全保護（圖5A)。保護類似于用 HPV16L1L2VLP免疫的小鼠。然而，在對異源HPV PsV激發(fā)的保護中有急劇差異（圖5B)。用 L2-PP7VLP免疫導致針對異源PsV的適度保護或無保護。相比之下，用L2-MS2VLP免疫導 致對使用9種異源類型的陰道激發(fā)和一種使用HPV5PsV的皮內(nèi)激發(fā)的顯著保護。在測試的 10種異源PsV類型中，我們觀察到針對其中9種的感染的非常強（信號中80至7, 190倍降 低）的保護。針對HPV31PsV的保護稍微低一些（17倍），但仍是統(tǒng)計學顯著的（p〈0.01，單 側(cè)t-檢驗）。如此，使用展示單HPV16L2肽的MS2VLP免疫提供針對多種HPV假病毒類型的 保護。
[0106] 我們的實驗顯示在對異源HPV PsV激發(fā)的保護中有急劇差異。見圖8。使用 L2-PP7VLP免疫導致針對異源PsV的適度或無保護。相對地，使用依照本發(fā)明的N端展示 的L2-MS2VLP免疫導致針對用9種異源類型的陰道激發(fā)和一種用HPV5PsV的皮內(nèi)激發(fā)的顯 著保護。在測試的10種異源PsV類型中，我們觀察到針對其中9種的感染的非常強（信號 中約80至7, 190倍降低）的保護，這是一項未預料到的結(jié)果。令人驚訝地，該保護實質(zhì)性強 于在用AB環(huán)展示的L2免疫的小鼠中所觀察到的。因此，我們的實驗結(jié)果證明針對使用依照 本發(fā)明的VLP的同源激發(fā)的保護一般比其中將抗原性L2肽插入AB環(huán)的VLP至少高約5-10 倍。具體地，針對異源激發(fā)的保護顯示為比使用N端VLP構(gòu)建體好10-25倍（HPV5, 31&39)、 40-100 倍（HPV45, 51，53, &58)或 140-1000 倍（HPV6, 33, &35)。
[0107] 總結(jié)
[0108] 在PP7VLP上的肽的遺傳展示很適用于已知為中和抗體靶物的特定B細胞表位的 準確靶向。對于包括流感（4, 12)、丙肝病毒（8)和HIV(2)在內(nèi)的許多病原體，廣泛中和 性抗體的靶表位是免疫原性較差的，意味著全長蛋白質(zhì)不適宜誘導通過疫苗接種的抗體應 答。另一方面，使用肽表位作為疫苗由于其較差的免疫原性而受限，除非偶聯(lián)于載體蛋白。 我們描述過的PP7和MS2VLP平臺允許在高度免疫原性背景中靶向引入特定的肽表位。在 該例子中，我們將廣泛中和性表位靶向到HPV16L2蛋白的N端。該表位是HPV中和性單克 隆抗體的靶物（5)，而且已知相應的合成肽在連接于載體蛋白時能引發(fā)針對HPV的交叉中 和性抗體（1)。我們顯示在噬菌體外殼蛋白N端展示L2表位的MS2VLP誘導高滴度的肽特 異性抗體，且該抗體具有足夠高的滴度以對小鼠提供幾乎完全的保護免于同源（HPV16)以 及異源（HPV 5, 6, 31，33, 35, 39, 45, 51，53,和58)假病毒的生殖激發(fā)。如此，MS2VLP顯示 對靶向誘導針對特定表位的抗體的效用。
[0109] 參考文獻
[0110] 1. Alphs, Η. Η. , R. Gambhira, B. Karanam, J. N. Roberts, S. Jagu, J. T. Schiller, W. Zeng,D. C. Jackson, and R. B. Roden. 2008. Protection against heterologous human papillomavirus challenge by a synthetic lipopeptide vaccine containing a broadly cross-neutralizing epitope of L2. Proc Natl Acad Sci USA 105:5850-5.
[0111] 2. Burton, D. R. , R. L. Stanfield, and I. A. Wilson. 2005. Antibody vs. HIV in a clash of evolutionary titans. Proc Natl Acad Sci USA 102:14943-8.
[0112] 3. Chackerian, B. , C. Caldeira Jdo, J. Peabody, and D. S. Peabody. 2011. Peptide Epitope Identification by Affinity Selection on Bacteriophage MS2Virus_Like Particles. J Mol Biol 409:225-37.
[0113] 4. Ekiert, D. C. , G. Bhabha, M. A. Elsliger, R. H. Friesen, M. Jongeneelen, M. Throsby, J. Goudsmit,and I. A. Wilson. 2009.Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope.Science 324:246-51.
[0114] 5. Gambhira，R.，Β· Karanam，S. Jagu，J. Ν· Roberts，C. Β· Buck，I. Bossis，Η· Alphs, T. Culp, N. D. Christensen,and R. B.Roden. 2007.A protective and broadly cross-neutralizing epitope of human papillomavirus L2. J Virol 81:13927-31.
[0115] 6. Johnson, K. M. , R. C. Kines, J. N. Roberts, D. R. Lowy, J. T. Schiller, and P. M. Day. 2009. Role of heparan sulfate in attachment to and infection of the murine female genital tract by human papillomavirus. J Virol83:2067-74.
[0116] 7. Karanam, B. , S. Jagu, W. K. Huh, and R. B. Roden. 2009. Developing vaccines against minor capsid antigen L2to prevent papillomavirus infection. Immunol Cell Biol 87:287-99.
[0117] 8. Law, Μ. , T. Maruyama, J. Lewis, E. Giang, A. W. Tarr, Z. Stamataki, P. Gastaminza, F. V. Chisari, I. M. Jones, R. I. Fox, J. K. Ball, J. A. McKeating,
[0118] N. M. Kneteman, and D. R. Burton. 2008. Broadly neutralizing antibodies protect against hepatitis C virus quasispecies challenge. Nat Med 14:25-7.
[0119] 9. Lim, F. , T. P. Downey, and D. S. Peabody. 2001. Translational repression and specific RNA binding by the coat protein of the Pseudomonas phage PP7. J Biol Chem 276:22507-13.
[0120] 10. Peabody, D. S. , B. Manifold-Wheeler, A. Medford, S. K. Jordan, J. do Carmo Caldeira，and B. Chackerian. 2008. Immunogenic display of diverse peptides on Virus-like Particles of RNA phage MS2. Journal of Molecular Biology doi:10. 1016/ j. jmb/2008. 04. 049.
[0121] 11. Roberts, J. N. , C. B. Buck, C. D. Thompson, R. Kines, M. Bernardo, P. L.Choyke,D. R. Lowy, and J.T. Schiller. 2007. Genital transmission of HPV in a mouse model is potentiated by nonoxynol-9and inhibited by carrageenan. Nat Med 13:857-61.
[0122] 12. Sui, J. , W. C. Hwang, S. Perez, G. Wei, D. Aird, L. M. Chen, E. Santelli, B. Stec, G. Cadwell, M. Ali, H. Wan, A. Murakami, A. Yammanuru, T. Han, N. J. Cox, L. A. Bankston, R. 0. Donis, R. C. Liddington, and W. A. Marasco. 2009. Structural and functional bases for broad-spectrum neutralization of avian and human influenza A viruses. Nat Struct Mol Biol 16:265-73.
【權(quán)利要求】
1. 一種組合物，其包含：(a)病毒樣顆粒；和（b)至少一種抗原或抗原決定簇；其中所 述抗原或抗原決定簇展示在所述病毒樣顆粒上，且其中所述抗原包含源自人乳頭狀瘤病毒 (HPV)L2蛋白的肽。
2. 權(quán)利要求1的組合物，其中所述抗原或抗原決定簇展示在噬菌體外殼蛋白的N端。
3. 權(quán)利要求2的組合物，其中所述噬菌體外殼蛋白是源自MS2噬菌體的單鏈二聚體外 殼蛋白。
4. 權(quán)利要求2的組合物，其中所述噬菌體外殼蛋白是源自PP7噬菌體的單鏈二聚體外 殼蛋白。
5. 權(quán)利要求2的組合物，其中所述噬菌體外殼蛋白是源自單鏈RNA噬菌體家族的單鏈 二聚體外殼蛋白，所述單鏈RNA噬菌體家族包括但不限于Qb、R17、SP、PP7、GA、Mll、MXl、f4、 Cb5、Cbl2r、Cb23r、7s 和 f2。
6. 權(quán)利要求2的組合物，其中所述HPV L2肽源自HPV 16型。
7. 權(quán)利要求2的組合物，其中所述HPV L2肽源自HPV 1、5、6、11、16、18、31、33、35、39、 45、51、52、53、56、58 或 59 型。
8. 權(quán)利要求2的組合物，其中展示的肽與HPV L2序列具有70、75、80、85、90或95%同 源性。
9. 權(quán)利要求6或7的組合物，其中所述HPV L2肽源自HPV 16型L2的氨基酸1-120。
10. 權(quán)利要求6的組合物，其中所述HPV L2肽源自HPV 16型L2的氨基酸14-40、17-31 或 20-29。
11. 權(quán)利要求6的組合物，其中展示的肽與HPV 16型L2的氨基酸14-40U7-31或 20-29 具有 70、75、80、85、90 或 95% 同源性。
12. 權(quán)利要求2的組合物，其中展示的HPV L2肽源自超過一種HPV類型。
13. 權(quán)利要求2的病毒樣顆粒的群體。
14. 一種用于在動物中增強針對抗原的免疫應答的方法，包括將權(quán)利要求1或2的組合 物引入所述動物中，其中在所述動物中產(chǎn)生增強的針對所述抗原的免疫應答。
15. 權(quán)利要求14的方法，其中所述組合物對于HPV誘導的病癥是預防性的。
16. 權(quán)利要求14的方法，其中所述免疫應答是增強的B細胞應答和/或增強的T細胞 應答。
17. 權(quán)利要求14的方法，其中所述動物是哺乳動物。
18. 權(quán)利要求14的方法，其中將所述組合物皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、鼻內(nèi)、陰道內(nèi)引入所述 動物中或直接引入淋巴結(jié)中。
19. 一種疫苗，其包含免疫有效量的權(quán)利要求1或2的組合物以及藥學可接受的稀釋 齊U、載體或賦形劑。
20. -種免疫或治療動物的方法，包括對所述動物施用免疫有效量的權(quán)利要求18的疫 苗。
21. 權(quán)利要求19的方法，其中所述動物是哺乳動物。
22. 權(quán)利要求14的疫苗，其中所述疫苗還包含佐劑。
【文檔編號】A61K39/12GK104159606SQ201380012267
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2013年1月10日 優(yōu)先權(quán)日:2012年1月12日
【發(fā)明者】B.查克利安, D.皮博迪, E.圖姆班 申請人:Stc.Unm公司