一種mPEG-SPA-pGLP-2復合物及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種mPEG-SPA-pGLP-2復合物及其制備方法和應用，其由豬胰高血糖素樣肽-2（porcineglucagon-likepeptide-2,pGLP-2）與單甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亞胺丙酸酯（methoxy-polyethyleneglycol-succinimidyl-propionicacidester,mPEG-SPA）通過加成反應連接構成，所述pGLP-2第30位的Lys與所述mPEG-SPA的末端雙鍵形成共價鍵而連接；該復合物是通過用弱酸性陽離子交換樹脂層析法從修飾混合物中分離得到的單點修飾產物。本發(fā)明mPEG-SPA-pGLP-2復合物修飾產物單一，分離純化簡單。
【專利說明】—種mPEG-SPA-pGLP-2復合物及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于肽或蛋白質的修飾復合物及其制備的【技術領域】，具體涉及一種單甲氧基聚乙二醇修飾的豬胰高血糖素樣肽-2 (porcine glucagon-like peptide-2, pGLP-2),即一種單甲氧基聚乙二醇-豬胰高血糖素樣肽-2復合物及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002]胰高血糖素樣肽-2 (glucagon-like peptide-2, GLP-2)是胰高血糖素原基因轉錄、翻譯后處理加工的33個氨基酸的胰高血糖素衍生肽之一，主要由遠端回腸和結腸的L細胞分泌。GLP-2通過特異性促進腸上皮增殖、抑制腸上皮凋亡、增加腸道血供、抑制胃酸分泌、降低腸道通透性等多方面促進損傷腸粘膜的結構恢復和屏障功能改善，且作用強于以往發(fā)現(xiàn)的其他非特異的腸生長因子，為治療仔豬腸道損傷和功能紊亂提供了廣闊的研究前景。pGLP-2與hGLP-2具有相似的腸道促生長作用，同源性為82%，通過C端延長，含有35個氨基酸。 [0003]但是，在豬體內，pGLP-2易被體內廣泛存在的二肽酰肽酶-1V (dipeptidylpeptidase-1V, DPP-1V)快速降解掉N端的前兩個氨基酸His1-Ala2,體內半衰期為8.4min，嚴重制約了其推廣應用。
[0004]聚乙二醇(PEG)是一種親水、不帶電荷的線性大分子，蛋白質經PEG修飾后，分子量增加，腎小球的濾過減少，PEG的屏障作用保護了蛋白質不易被蛋白酶水解，有助于蛋白質類藥物半衰期的延長。但蛋白PEG修飾產物的分離純化均比較困難。原因如下:(1)蛋白經PEG修飾后，許多理化性質發(fā)生了改變，如等電點、分子質量、溶解度、沉降系數(shù)等；(2)PEG分子在水溶液中具有伸展的構象，其流體動力學體積遠遠大于同樣分子質量的球狀蛋白，使得與PEG的分離非常困難；(3) PEG分子的不均一性，存在一定的分子質量分布，因此即使包含相同PEG個數(shù)的同一種蛋白質，其相對分子量也不完全相同；(4)蛋白質表面可修飾的氨基酸位點較多時，PEG分子可結合在多個不同的氨基酸殘基上，使PEG修飾蛋白的空間結構進一步復雜化。以上為蛋白PEG修飾及產品開發(fā)的核心與難點所在。
[0005]目前，通過PEG修飾pGLP-2延長其半衰期治療仔豬腸道疾病的研究未見報道。

【發(fā)明內容】

[0006]針對PGLP-2中僅含有一個Lys殘基的優(yōu)勢，本發(fā)明的第一個目的是提供一種mPEG-SPA-pGLP-2復合物，該復合物得到單點修飾產物，從而避免了修飾位點的多態(tài)性，使后續(xù)純化簡便。mPEG-SPA-pGLP-2復合物保留了 pGLP_2的生物學活性，與pGLP_2相比，半衰期延長，可更方便地應用于腸道疾病的治療。本發(fā)明的第二個目的是提供上述的一種mPEG-SPA-pGLP-2復合物的制備方法。本發(fā)明的本發(fā)明的第三個目的是提供上述的一種mPEG-SPA-pGLP-2復合物的制藥用途。
[0007]為了實現(xiàn)上述的第一個目的，本發(fā)明采用了以下的技術方案:
一種 mPEG-SPA-pGLP-2 復合物，由豬胰高血糖素樣肽-2 (porcine glucagon-likepeptide-2, pGLP-2)與單甲氧基聚乙二醇-琥拍酰亞胺丙酸酸酯(methoxy-polyethyleneglycol-succinimidyl-propionic acid ester, mPEG-SPA)通過加成反應連接構成，所述pGLP-2第30位的Lys與所述mPEG-SPA的末端雙鍵形成共價鍵而連接。
[0008]作為優(yōu)選，所述的pGLP-2 的氨基酸序列為:His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser_Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Val-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Thr-Arg-Asp-Phe-1le-Asn-Trp-Leu-Leu-His-Thr-Lys_IIe-Thr-Asp-Ser-Leu-NH2。
[0009]作為優(yōu)選，所述單甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亞胺丙酸酸酯的分子量為5~20KD。
[0010]為了實現(xiàn)上述的第二個目的，本發(fā)明采用了以下的技術方案:
一種制備上述任一技術方案所述的mPEG-SPA-pGLP-2復合物的方法，該方法包括以下的步驟:
1)將pGLP-2制備成pH為7.5^9.0的溶液；
2)將步驟I)制備的pGLP-2溶液與mPEG-SPA反應，所述pGLP_2與mPEG-SPA的摩爾濃度比為1:廣1:8，反應溫度為4~37°C，反應時間為0.5~24小時；
3)分離純化，得到mPEG-SPA-pGLP-2復合物。
[0011]作為優(yōu)選，所述的步驟I)將pGLP-2溶解于50 mmol/L pH 7.5~9.0的Tris-HCl緩沖液中，終濃度為1.2 mg/mL。
[0012]作為優(yōu)選，所述的步驟2)中加入1%的TFA終止反應。
[0013]作為優(yōu)選，所述的步驟3)分離純化采用弱酸性陽離子交換樹脂層析法；再優(yōu)選，所述的弱酸性陽離子交換樹脂采用C M Sepharose Fast Flow層析柱。
[0014]作為優(yōu)選，將步驟2)制備的粗品溶液用20 mmol/L pH 4.0的醋酸緩沖液稀釋10倍，上 C M Sepharose Fast Flow 層析柱,用含 I mol/L NaCl 的 20 mmol /T, pH 4.0 的醋酸緩沖液進行0%到100%的梯度洗脫，流速為I mL/min，在波長為215 nm處收集3個吸收峰中的第2和第3個吸收峰的洗脫溶液；將收集到的洗脫溶液用截留分子量為3~10KD的Millipore Amicon Ultra超濾管濃縮,并除去NaCl,冷凍干燥。
[0015]常見的聚乙二醇修飾蛋白質反應時，由于蛋白質中含有多個帶有游離氨基的賴氨酸，在聚乙二醇反應中會形成多點修飾產物，例如，GLP-1中含有2個賴氨酸，能提供的游離氨基有2個，會形成雙修飾產物和單修飾產物的混合產物，給后續(xù)純化和質量控制帶來了難題。本發(fā)明的PGLP-2只有一個Lys，通過反應條件的優(yōu)化，得到單點修飾產物，分離純化簡單。mPEG-SPA-pGLP-2復合物保留了 pGLP_2的生物學活性，與pGLP_2相比，半衰期延長，一次注射可顯著DSS引起的小鼠結腸炎性改變，使給藥一次成為可能，可更方便地應用于腸道疾病的治療。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1為mPEG-SPA-pGLP-2復合物的C M Sepharose F F層析分離純化圖。其中，I是穿透峰，2為mPEG-SPA的吸收峰，3是單點修飾產物mPEG-SPA-pGLP-2的吸收峰。
[0017]圖2 mPEG-SPA-pGLP-2復合物與pGLP-2對DPP-1V酶的體外酶解穩(wěn)定性(n=5)。pGLP-2 ( ?)和mPEG-SPA-pGLP-2 ()與DPP-1V在37° C反應，在預設的時間點用RP-HPLC檢測，用t = O時的峰面積含量作為100%。
[0018]圖3為小鼠結腸炎性變化的HE染色圖。[0019]圖4為小鼠結腸炎炎性評分(n=6)。數(shù)據(jù)采用非參數(shù)的Wilcoxon秩和檢驗，沒有相同字母表示差異顯著{P < 0.05)。
【具體實施方式】
[0020]結合以下具體實施例和附圖，對本發(fā)明作進一步的詳細說明。實施本發(fā)明的過程、條件、試劑、實驗方法等，除以下專門提及的內容之外，均為本領域的普遍知識和公知常識，本發(fā)明沒有特別限制內容。以下實施中所用mPEG-SPA、化學試劑等，以及未注明具體條件的實驗方法，按常規(guī)或按商品供貨商所建議的條件進行。
[0021]實施例1 mPEG-SPA-pGLP-2復合物的制備
在本實施例中，pGLP-2復合物的結構式為:pGLP-2 (1-35)，序列如下:His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Val-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Thr-Arg-Asp-Phe-1le-Asn-Trp-Leu-Leu-Hi s-Thr-Lys_I Ie-Thr-Asp-Ser-Leu_NH2。mPEG-SPA 的分子量為 5KD。
[0022]第一步，將1.2mg pGLP-2 溶解于 ImL 50 mmol/L pH 7.5~9.0 的 Tris-HCl 緩沖液中。
[0023]第二步，向第一步所得的溶液中加入6.0mg,分子量為5KD的mPEG_SPA，混合均勻。
[0024]第三步，將第二步所得的溶液置于4~30°C下進行mPEG修飾反應0.5~24h。
[0025]第四步， 將經第三步處理的溶液加入1%的TFA終止反應，得到mPEG-SPA-pGLP-2復合物粗品溶液。
[0026]第五步，取第四步制得的粗品溶液用20 mmol/L pH 4.0的醋酸緩沖液稀釋10倍，上 C M Sepharose Fast Flow 層析柱,用含 I mol/L NaCl 的 20 mmol /T, pH 4.0 的醋酸緩沖液進行0%到100%的梯度洗脫，流速為I mL/min，在波長為215 nm處收集3個吸收峰中的第2和第3個吸收峰的洗脫溶液。
[0027]說明，參見圖1，圖中，I是3個吸收峰中的第一個吸收峰，即穿透峰，2和3分別是3個吸收峰中的第2和第3個吸收峰，2是mPEG-SPA，3是單點修飾產物mPEG-SPA-pGLP-2。
[0028]第六步，將第五步收集到的洗脫溶液用截留分子量為3KD的MilliporeAmicon Ultra超濾管濃縮，并除去NaCl，冷凍干燥。得到0.4mg的分子量為8873Da的mPEG-SPA-pGLP-2 復合物純品。
[0029]說明，將第六步制得的mPEG-SPA-pGLP-2復合物純品用蒸餾水復溶，制備成Img/mL的溶液。取WL使用UltrafleXtreme MALD1-T0F-MS儀進行分子量測定，結果示于圖1，圖1中峰3是單點修飾的mPEG-SPA-pGLP-2。
[0030]實施例2 mPEG-SPA-pGLP-2復合物的體外酶解穩(wěn)定性
第一步，將 25 nmol/L 的 mPEG-SPA-pGLP-2 或 pGLP-2 溶解在 10 mmol/L, pH 7.4 的三乙胺-HCl緩沖液。
[0031]第二步，向第一步的溶液中加入100 mU/mL的DPP-1V酶(美國Sigma-Aldrich公司)，37°C孵育，在預設的時間點用10% TFA終止反應，RP-HPLC檢測mPEG-SPA-pGLP-2或pGLP-2的剩余量。
[0032]說明，RP-HPLC檢測條件為:使用美國安捷倫公司1200液相色譜儀，ZORBAXSB-C18柱子(4.6 mm X 250 mm, 5 Mm),自動進樣器進樣量為20 KL,流速I mL/min,流動相A為含0.1% TFA的去離子水，流動相B為含0.1% TFA的乙腈，流動相B 38%到50%洗脫15 min, 215 nm 監(jiān)測。
[0033]說明，結果參見圖2，圖中，mPEG-SPA-pGLP-2的半衰期為296.3min,pGLP-2的半衰期為18.3min，說明mPEG-SPA-pGLP-2復合物可延長pGLP-2的半衰期。
[0034]實施例3 mPEG-SPA-pGLP-2復合物的腸道修復作用 實驗材料與方法:
雄性健康BALB/C小鼠(清潔級，浙江省醫(yī)學科學院動物實驗中心提供)；
石蠟切片機(德國Leica公司)，熒光顯微鏡攝像機(日本OLYMPUS公司BX20型)，自動脫水機(英國Thermo shandon公司)；
雄性健康BALB/C小鼠，分為4組。第I組，DSS (分子量36000 - 50000，購自上海MP公司)對照組；第2組，DSS+pGLP-2組；第3組，DSS+mPEG-SPA-pGLP-2組；第4組，飲水組，所有復合物mPEG-SPA-pGLP-2為實施例1中制備得到的目的產物。本實施例中各組的給藥量見表1。
[0035]表1各組的給藥量
【權利要求】
1.一種mPEG-SPA-pGLP-2復合物，其特征在于:由豬胰高血糖素樣肽_2 (pGLP-2)與單甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亞胺丙酸酸酯(mPEG-SPA)通過加成反應連接構成，所述pGLP_2第30位的Lys與所述mPEG-SPA的末端雙鍵形成共價鍵而連接。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種mPEG-SPA-pGLP-2復合物，其特征在于:所述pGLP_2的氨基酸序列為=His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Val-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Thr-Arg-Asp-Phe-1le-Asn-Trp-Leu-Leu-His-Thr-Lys-1le-Thr-Asp-Ser-Leu-NH2。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的一種mPEG-SPA-pGLP-2復合物，其特征在于:單甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亞胺丙酸酸酯的分子量為5~20KD。
4.一種制備權利要求f 3任意一項權利要求所述的mPEG-SPA-pGLP-2復合物的方法，其特征在于該方法包括以下的步驟: 1)將pGLP-2制備成pH為7.5-9.0的溶液； 2)將步驟I)制備的pGLP-2溶液與mPEG-SPA反應，所述pGLP_2與mPEG-SPA的摩爾比為1:廣1:8，反應溫度為4~37°C，反應時間為0.5~24小時； 3)分離純化，得到mPEG-SPA-pGLP-2復合物。
5.根據(jù)權利要求4所述的mPEG-SPA-pGLP-2復合物的制備方法，其特征在于:步驟I)將 pGLP-2 溶解于 50 mmol/L pH 7.5^9.0 的 Tris-HCl 緩沖液中，終濃度為 1.2 mg/mL。
6.根據(jù)權利要求4所述的mPEG-SPA-pGLP-2復合物的制備方法，其特征在于:步驟2)中加入1%的TFA終止反應。
7.根據(jù)權利要求4所述的mPEG-SPA-pGLP-2復合物的制備方法，其特征在于:步驟3)分離純化采用弱酸性陽離子交換樹脂層析法；優(yōu)選，所述的弱酸性陽離子交換樹脂采用C MSepharose Fast Flow 層析柱。
8.根據(jù)權利要求7所述的mPEG-SPA-pGLP-2復合物的制備方法，其特征在于:將步驟2)制備的粗品溶液用20 mmol/L pH 4.0的醋酸緩沖液稀釋10倍，上C M Sepharose FastFlow層析柱，用含I mol/L NaCl的20 mmol/L pH 4.0的醋酸緩沖液進行0%到100%的梯度洗脫，流速為I mL/min，在波長為215 nm處收集3個吸收峰中的第2和第3個吸收峰的洗脫溶液；將收集到的洗脫溶液用截留分子量為3~10KD的Millipore Amicon Ultra超濾管濃縮，并除去NaCl，冷凍干燥，第3個吸收峰即為mPEG-SPA-pGLP-2復合物。
9.權利要求1-3中任意一項所述的mPEG-SPA-pGLP-2復合物用于制備治療和預防仔豬腸道功能紊亂藥物中的應用。
10. 權利要求1-3中任意一項所述的mPEG-SPA-pGLP-2復合物用于制備治療豬腸道疾病藥物中的應用。
【文檔編號】A61K47/48GK103724424SQ201310737735
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2013年12月27日 優(yōu)先權日:2013年12月27日
【發(fā)明者】齊珂珂, 徐子偉, 吳杰 申請人:浙江省農業(yè)科學院