一種深海真菌次生代謝產(chǎn)物中的化合物EngyodontiuminA、制備方法及其用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種深海真菌次生代謝產(chǎn)物中的化合物EngyodontiuminA、制備方法及其用途。該化合物具有如下的結(jié)構(gòu)式，其分子式為C12H15ClO4，分子量為258.0659。通過接種白色側(cè)齒霉Engyodontium?album菌絲體于海水中制備得到。該化合物具有抗菌功能，可用于制備抗菌藥物。
【專利說明】一種深海真菌次生代謝產(chǎn)物中的化合物
Engyodont i um i nA、制備方法及其用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及海洋微生物領(lǐng)域，尤其涉及一種抗菌化合物，具體為一種化合物EngyodontiuminA、制備方法及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002]海洋微生物(marine microorganism)是指分布在海洋中的個(gè)體微小、形態(tài)結(jié)構(gòu)簡單的單細(xì)胞或多細(xì)胞生物；是海洋中個(gè)體微小，構(gòu)造簡單的低等生物的總稱。包括細(xì)菌、真菌、放線菌、霉菌、酵母、病毒、衣原體、支原體、噬菌體和微型藻及微型原生動(dòng)物等。
[0003]1929年，F(xiàn)leming從真菌中發(fā)現(xiàn)青霉素開創(chuàng)了人類用抗生素與疾病作斗爭的新紀(jì)元。人們研究熱點(diǎn)一直是陸生真菌資源，90年代以前，關(guān)于海洋真菌的化學(xué)研究報(bào)道很少；1970-1990年，只有少數(shù)報(bào)道；但是到了 1990年以后，這方面的報(bào)道幾乎呈指數(shù)性增長。到2002年從海洋真菌中共發(fā)現(xiàn)272個(gè)新天然產(chǎn)物，其中也包括了一些深海真菌中發(fā)現(xiàn)的天然化合物，其中許多化合物具有新的骨架。1998年和2000年發(fā)現(xiàn)的新化合物數(shù)目最多，近年來海洋真菌來源的新化合物數(shù)目的總趨勢依然在增加，從而證明了海洋真菌具有獨(dú)特的代謝和生理機(jī)制，是潛在的藥物先導(dǎo)化合物的豐富資源。
[0004]深海真菌是指大于等于1000米水深處海洋中個(gè)體微小，結(jié)構(gòu)簡單的真菌。深海真菌白色側(cè)齒霉Engyodonium album分離于大西洋(經(jīng)度:W24° 23緯度:NO。8)-3542m的深海沉積物，屬于深海絲狀真菌。目前僅有文獻(xiàn)報(bào)道稱對黑乳海參共附生白色側(cè)齒霉菌的次級代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究，分離得到一些留體成分。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種具有抗菌作用的新的化合物。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種化合物EngyodontiuminA,其特征在于,其分子式為C12H15ClO4，分子量為258.0659，具有如下結(jié)構(gòu)式，
[0007]
【權(quán)利要求】
1.一種化合物EngyodontiuminA，其特征在于，其分子式為C12H15ClO4,分子量為258.0659，具有如下結(jié)構(gòu)式，
2.權(quán)利要求1所述化合物EngyodontiuminA的制備方法,其特征在于,包括如下步驟， 菌種的準(zhǔn)備:使用海水PDA培養(yǎng)基，高溫滅菌，制成平板，置于常溫狀態(tài)下，接種白色側(cè)齒霉Engyodontium album菌絲體培養(yǎng),作為菌種；所述海水PDA培養(yǎng)基成分為馬鈴薯200g,葡萄糖20g,瓊脂15-20g, IL海水； 發(fā)酵種子液制備:在多個(gè)錐形瓶中分別裝入海水PDA液體培養(yǎng)基，高溫滅菌后，接種上述菌種培養(yǎng)，將該培養(yǎng)物作為種子液； 接種:采用固體發(fā)酵方式，準(zhǔn)備發(fā)酵瓶，加入大米固體發(fā)酵培養(yǎng)基，接種上述種子液，培養(yǎng)；所述大米固體發(fā)酵培養(yǎng)基為每IL的三角錐瓶裝大米105g，小黃米45g，PDA培養(yǎng)基150ML，121°C，20min，高溫滅菌； 萃取:待真菌發(fā)酵成熟后，加入乙酸乙酯500mL/瓶浸泡發(fā)酵產(chǎn)物，發(fā)酵產(chǎn)物溶入乙酸乙酯溶液中，浸泡后，將上層乙酸乙酯相倒出，下層為固體發(fā)酵產(chǎn)物；加入新的乙酸乙酯500mL/瓶，此步驟可反復(fù)多次，每次浸泡一段時(shí)間，如此制備得到乙酸乙酯初提液；以乙酸乙酯和所得到的乙酸乙酯初提液為混合溶劑，采用高壓乳化切割機(jī)碾碎下層的固體發(fā)酵產(chǎn)物，胞內(nèi)物質(zhì)溶解到上述混合溶劑中，得到乙酸乙酯混合液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將乙酸乙酯混合液減壓濃縮至固態(tài)浸膏，得到初級浸膏； 單體分離純化:所得初級浸膏與正相硅膠拌樣成粉狀，，將拌好的粉末樣品加入空柱中待分離；將裝有粉末樣品的柱子與正相硅膠柱連接，利用中壓液相制備系統(tǒng)進(jìn)行洗脫，設(shè)置正己烷-乙酸乙酯，乙酸乙酯-甲醇層析比例，在中壓液相制備系統(tǒng)中接收分離后出峰信號，根據(jù)信號峰出峰的先后順序依次收集峰值在200mA-2000mA的洗脫液，將洗脫液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在35攝氏度24h真空濃縮為固態(tài)浸膏，即得到初級餾分15個(gè)，編號從F.1到F.15依次編號，每個(gè)初級餾分的量約是2g-3g ； 初級餾分分別以少量甲醇溶解，加入合適的助溶劑待分離；采用反相C18制備柱進(jìn)行次級餾分的制備，利用中壓液相制備系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫，根據(jù)信號峰出峰時(shí)間收集洗脫液，將洗脫液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在40攝氏度2-3天真空濃縮至固態(tài)浸膏，得到次級餾分，共得到88個(gè)次級餾分，編號從N0.1到N0.88依次編號，每個(gè)次級餾分的量是20mg-300mg ； 第N0.14的次級餾分采用高效液相色譜儀處理，儀器上體現(xiàn)目標(biāo)化合物的出峰時(shí)間在25min左右,然后采用高壓反相C18制備柱制備收集得到化合物EngyodontiuminA。
3.權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述菌種的準(zhǔn)備中，所述高溫滅菌為121°C，20min ;所述培養(yǎng)為于28 °C下靜置培養(yǎng)4-5天；任選的，所述發(fā)酵種子液制備中，高溫滅菌為12rC，20min ;所述培養(yǎng)為28°C下以180rpm/min振蕩培養(yǎng)2-3天； 任選的，所述接種為中種子液的接種量為15% ;28°C培養(yǎng)箱放置28天；
4.權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述萃取中，每瓶加入乙酸乙酯500mL浸泡發(fā)酵產(chǎn)物，所述浸泡時(shí)間為24h，所述多次可以是三次，每次浸泡24h ;所述混合溶劑中，乙酸乙酯與乙酸乙酯初提液的體積比為2:3 ;所述減壓濃縮條件為2-3h，35°C。
5.權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述單體分離純化中，所得初級浸膏與正相硅膠的重量比例為1:3左右；所述正相硅膠柱規(guī)格為43-60,60A ;所述正己烷-乙酸乙酯體積比例為80:20，60:40，40:60，20:80，0:100，所述乙酸乙酯-甲醇體積比例為70:30,0:100 ;所述洗脫液減壓濃縮條件為每個(gè)樣l_2h，35°C ； 初級餾分以少量甲醇溶解，比如lmL，加入四氫呋喃，500 μ L待分離；采用反相C18制備柱進(jìn)行次級餾分的制備，利用中壓液相制備系統(tǒng)，設(shè)置洗脫條件為:乙腈:水=100:0-0:100梯度洗脫，根據(jù)信號峰出峰時(shí)間收集洗脫液，減壓蒸餾，6-7天，40°C，至固態(tài)浸膏，得到次級餾分，共得到88個(gè)次級餾分，依次編號N0.1-N0.88。
6.權(quán)利要求1所述化合物EngyodontiuminA用于抗菌的用途。
7.權(quán)利要求6所述的用于抗菌的用途，其特征在于，所述菌為真菌和細(xì)菌。
8.權(quán)利要求7所述的用于抗菌的用途，其特征在于，所述真菌為黑曲霉。
9.權(quán)利要求7所述的用于抗菌的用途，其特征在于，所述細(xì)菌為抗甲氧西林金黃色葡萄球菌MRSA，輪蟲弧菌，坎式弧菌，創(chuàng)傷弧菌。
10.權(quán)利要求1所述化合物EngyodontiuminA用于制備抗菌藥物的用途。
【文檔編號】A61P31/04GK103724190SQ201310722849
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2013年12月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月24日
【發(fā)明者】陳建明, 王偉毅, 陳卓, 李芊, 王蔚, 楊慧, 陳巧玉 申請人:國家海洋局第三海洋研究所, 中國大洋礦產(chǎn)資源研究開發(fā)協(xié)會(huì)