一種生物功能化羥丙基纖維素酯類液晶膜的制備及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種生物功能化羥丙基纖維素酯類液晶膜的制備及其應(yīng)用，屬于生物醫(yī)用材料領(lǐng)域。本發(fā)明的制備步驟為：首先通過(guò)羥丙基纖維素的酰氯化反應(yīng)制備低取代烷基?；u丙基纖維素酯類液晶；再與戊二酸酐反應(yīng)，將羧基官能團(tuán)接枝到羥丙基纖維素酯類液晶上，然后采用溶液澆注法制備液晶膜，薄膜表面的羧基經(jīng)EDC/NHS活化后，與含RGDS的短肽發(fā)生異相反應(yīng)，獲得表面接枝含RGDS短肽的生物功能化羥丙基纖維素酯類液晶。制備的表面固定含RGDS短肽的液晶薄膜，具有類細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和成分，有效改善細(xì)胞-材料之間的相互作用，促進(jìn)細(xì)胞在材料表面的粘附和增殖，可作為細(xì)胞模型或細(xì)胞支架在組織工程、再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域應(yīng)用。
【專利說(shuō)明】一種生物功能化羥丙基纖維素酯類液晶膜的制備及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料領(lǐng)域，具體涉及一種生物功能化羥丙基纖維素酯類液晶膜的制備及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]生物材料和再生醫(yī)學(xué)的一個(gè)基本主題是細(xì)胞-材料之間的相互作用，理想的生物材料應(yīng)能最大程度對(duì)細(xì)胞或組織產(chǎn)生有益的響應(yīng)。組織工程是通過(guò)應(yīng)用生命科學(xué)和工程化原理，借助生物材料結(jié)合細(xì)胞和合適的刺激因子實(shí)現(xiàn)受損組織的修復(fù)和再生的新興技術(shù)。組織工程技術(shù)的眾多策略之一是設(shè)計(jì)可以為細(xì)胞粘附和結(jié)構(gòu)支架提供初始支撐，并為細(xì)胞構(gòu)成功能性組織提供結(jié)構(gòu)骨架的生物材料。近年來(lái)已發(fā)展了很多方法對(duì)生物材料進(jìn)行表面改性以改善細(xì)胞-基體相互作用從而拓寬其應(yīng)用前景，其中通過(guò)在體外模擬天然微環(huán)境發(fā)展可以控制細(xì)胞行為的模型體系已證實(shí)可提供結(jié)構(gòu)性支持和適當(dāng)?shù)奈镔|(zhì)傳送因此有利于引導(dǎo)組織再生。這些模型體系不僅可提供結(jié)構(gòu)完整性，而且能控制大量信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，這個(gè)過(guò)程直接引導(dǎo)細(xì)胞的生存、細(xì)胞循環(huán)級(jí)數(shù)及不同顯型表達(dá)。生物功能化細(xì)胞模型體系的構(gòu)建對(duì)調(diào)控細(xì)胞-基質(zhì)相互作用提供了一種新思路，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
[0003]液晶相作為一種有序結(jié)構(gòu)，是自然界兩大基本法則流動(dòng)性和有序性通過(guò)自組裝的有機(jī)結(jié)合。生命體中的細(xì)胞膜、核酸、蛋白質(zhì)、脂類、多糖等亦都是通過(guò)自組裝而呈現(xiàn)與細(xì)胞形態(tài)和組織功能表達(dá)有關(guān)的液晶態(tài)[Y.Bouligand, V.Norris.Chromosome separation andsegregation in dinoflagellates and bacteria may de`pend on liquid crystallinestates [J].Biochimie2001, 83，187-192 (2001)]，利用溶液中的自組裝或細(xì)胞表面作用，將生物大分子引入膜中，是生命現(xiàn)象中典型液晶行為的體現(xiàn)。研究表明，新型的生物液晶態(tài)薄膜和支架材料，均對(duì)細(xì)胞的黏附、生長(zhǎng)及分化產(chǎn)生很好的促進(jìn)作用。將與生命結(jié)構(gòu)及特性相似的液晶態(tài)結(jié)構(gòu)引入基底材料，已成為生物材料領(lǐng)域仿生設(shè)計(jì)的一個(gè)新的思考角度。生物學(xué)家公認(rèn)的生物膜流體鑲嵌模型認(rèn)為膜糖蛋白是浸泡在二維脂類雙親分子液體膜中的溶致液晶結(jié)構(gòu)，如果把雙親分子脂類分子膜當(dāng)成普通流體，則無(wú)法解釋蛋白質(zhì)在細(xì)胞膜上的擴(kuò)散本領(lǐng)，也無(wú)法解釋為什么人的紅細(xì)胞是雙碟形而不是其他形狀，只有將分子膜視為液晶，并采用液晶膜曲率彈性理論才能讓上述現(xiàn)象得到證明。蛋白質(zhì)的形成、細(xì)胞的生成及演化、DNA分子間的信號(hào)儲(chǔ)存和傳遞都是通過(guò)分子自組裝來(lái)實(shí)現(xiàn)的。生物膜本身也在從事大量精細(xì)而高度可控的基于分子自組裝的生命活動(dòng)，如生物膜的變形過(guò)程等。分子自組裝和生物學(xué)的交叉是仿生研究的必由之路，構(gòu)建自組裝結(jié)構(gòu)可以模擬生命的某些過(guò)程，以實(shí)現(xiàn)最大程度的仿生設(shè)計(jì)?；诜律鷮W(xué)的角度，國(guó)內(nèi)外一些學(xué)者對(duì)處于液晶態(tài)的生物材料與細(xì)胞的相互作用進(jìn)行了研究，已有的數(shù)據(jù)顯示，這些處于液晶態(tài)的生物材料，能很好地促進(jìn)細(xì)胞的粘附及分化，其作用機(jī)理的研究也越來(lái)越引起人們的關(guān)注。因此，從仿生學(xué)的角度，對(duì)液晶生物材料的研究為人們開(kāi)發(fā)新型的生物材料提供了新的方向。研究顯示，生物體內(nèi)的液晶態(tài)均為膽留相液晶，膽留醇液晶對(duì)細(xì)胞膜具有高度的熱力學(xué)親和性，并能改變生物膜的滲透性和流動(dòng)性。膽留醇的這些優(yōu)越性質(zhì)使其被廣泛應(yīng)用在仿生材料設(shè)計(jì)中。纖維素是分布最廣、含量最多的天然大分子多糖，具有良好的生物相容性、可降解性和可再生性，許多的纖維素在一般的溶劑或一定溫度下呈現(xiàn)熱致和溶致的膽留型液晶態(tài)。
[0004]精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列是纖連蛋白最小的結(jié)合域[M.D.Pierschbacher, E.Ruoslaht1.The cell attachment activity of fibronectincan be duplicated by small synthetic fragments of the molecule.Nature309, 30-33 (1984).]，可被細(xì)胞表面整合素識(shí)別。材料表面的RGD改性已被證明可以通過(guò)提高細(xì)胞遷移速率而促進(jìn)細(xì)胞的粘附、伸展和傷口的愈合[P.R.Patel, R.C.Kiser, Y.Y.Lu, E.Fong, ff.C.Ho, D.A.Tirrell, R.H.Grubbs.Synthesis and cell adhesiveproperties of linear and cyclic RGD functionalized polynorbonene thin films.Biomacromolecules 13, 2546-2553 (2012).]。RGD妝鏈已被用于與多種不同的生物材料結(jié)合如透明質(zhì)酸和聚乙二醇水凝膠、鈦合金植入體、聚氨酯和聚二甲基硅烷表面，而在液晶生物材料表面實(shí)施RGD功能化仍未有報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為克服上述現(xiàn)有仿生改性技術(shù)的缺陷和不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種生物功能化羥丙基纖維素酯類液晶膜的制備方法。該制備方法為通過(guò)異相反應(yīng)在羥丙基纖維素酯類液晶膜表面接枝含RGDS短肽。
[0006]本發(fā)明的另一目的在于提供上述制備方法獲得的生物功能化羥丙基纖維素酯類液晶膜。
[0007]本發(fā)明的再一目的在于提供上述的生物功能化羥丙基纖維素酯類液晶膜在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):一種生物功能化羥丙基纖維素酯類液晶膜的制備方法，包括如下步驟:
[0009](1)將羥丙基纖維素溶于丙酮中形成均相溶液，而后與脂肪酰氯發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)物經(jīng)水中透析，烘干，得到低取代烷基?；u丙基纖維素酯類液晶；
[0010](2)取步驟(1)制備的低取代烷基?；u丙基纖維素酯類液晶溶于丙酮溶液，在4-二甲基吡啶催化下與戊二酸酐反應(yīng)，產(chǎn)物經(jīng)過(guò)水透析后，真空烘干，獲得羧基功能化的羥丙基纖維素酷類液晶；
[0011](3)將步驟(2)制備的羧基功能化的羥丙基纖維素酯類液晶溶于四氫呋喃形成均一溶液，采用溶液澆注法在聚丙烯基底上成膜，獲得羧基功能化的羥丙基纖維素酯類液晶膜；
[0012](4)用EDC (1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亞胺碘甲烷鹽)/NHS (N-羥基琥珀酰亞胺)/PBS溶液活化步驟(3)制備的液晶膜表面的羧基；
[0013](5)將步驟(4)處理過(guò)的液晶膜在RGDS(K)-4~1(T3M)/PBS溶液中4°C下反應(yīng)12~24h ;純水浸泡，洗去物理吸附的RGDS，獲得生物功能化羥丙基纖維素酯類液晶膜。
[0014]步驟(1)中所述羥丙基纖維素分子量為5萬(wàn)~10萬(wàn)；
[0015]步驟(1)中所述脂肪酰氯的烷基碳鏈長(zhǎng)度為C3-C8 ；
[0016]步驟(1)中所述的羥丙基纖維素與脂肪酰氯的質(zhì)量體積比為15g:5~6ml ；[0017]步驟(1)中所述反應(yīng)的反應(yīng)溫度為55~60°C，反應(yīng)時(shí)間為5~6小時(shí)，磁力攪拌；
[0018]步驟(1)中所述的透析優(yōu)選為在水中透析3天，每天換水3次；
[0019]步驟(1)中所述的烘干優(yōu)選為在50~55°C真空烘干；
[0020]步驟(1)中所述的低取代烷基?；u丙基纖維素酯類液晶的側(cè)鏈烷基?；娜〈葹?0~50% ;所述的低取代烷基?；u丙基纖維素酯類液晶在生理溫度下呈現(xiàn)液晶態(tài)，其分子鏈上仍保留50~60%的羥基；
[0021]步驟(2)中所述低取代烷基?；u丙基纖維素酯類液晶溶于丙酮溶液的質(zhì)量百分濃度為6~10% ；
[0022]步驟(2)中所述的戊二酸酐與4-二甲基吡啶的摩爾比為15:10~15:12 ；
[0023]步驟(2)中所述反應(yīng)的反應(yīng)溫度為50~55°C，反應(yīng)時(shí)間為45~60min ；[0024]步驟(2)中戊二酸酐與羥丙基纖維素液晶中羥基的摩爾比為1:1~1.5:1 ;
[0025]步驟(2)中所述的水中透析的透析時(shí)間為3~5天，每天更換純凈水3次；
[0026]步驟(2)中所述羧基功能化的羥丙基纖維素酯類液晶，在生理溫度下呈現(xiàn)液晶態(tài)，羧基的取代度為30~40% ；
[0027]步驟(3)中所述羧基功能化的羥丙基纖維素酯類液晶溶于四氫呋喃形成的溶液質(zhì)量濃度為5~10% ；
[0028]步驟(3)中所述的溶液澆注法在聚丙烯基底上成膜具體操作為:溶液澆注在鋪有聚丙烯基底膜的玻璃培養(yǎng)皿上，室溫下溶劑完全揮發(fā)后形成羧基功能化的羥丙基纖維素酯類液晶膜。
[0029]步驟(4)中所述的EDC/NHS/PBS溶液為PBS緩沖液作為溶劑，EDC濃度為0.2mol/L，NHS濃度為0.lmol/L,活化溫度為4°C，活化時(shí)間為4~6小時(shí)；
[0030]步驟(5)中所述的含RGDS(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-絲氨酸)的短肽購(gòu)自Sigma公司；
[0031]步驟(5)中通過(guò)異相反應(yīng)把含RGDS (精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-絲氨酸)的短肽接枝到液晶膜表面；
[0032]步驟(5)中所述的RGDS/PBS溶液中PBS緩沖液為溶解溶劑，RGDS的濃度為10_4~103mol/L ；
[0033]步驟(5)中所述的純水浸泡時(shí)間為72~96小時(shí)，每12小時(shí)更換I次純水。
[0034]一種生物功能化羥丙基纖維素酯類液晶膜有上述制備方法獲得。制備獲得的生物功能化羥丙基纖維素酯類液晶膜為表面接枝含RGDS短肽的羥丙基纖維素酯類液晶膜。
[0035]本發(fā)明獲得的生物功能化羥丙基纖維素酯類液晶膜可作為細(xì)胞模型(或支架)在組織工程、再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域獲得廣泛應(yīng)用。
[0036]本發(fā)明的原理為:首先通過(guò)羥丙基纖維素的酰氯化反應(yīng)制備低取代烷基?；u丙基纖維素酯類液晶；再與戊二酸酐反應(yīng)，將羧基官能團(tuán)接枝到羥丙基纖維素酯類液晶上，然后采用溶液澆注法制備液晶膜。薄膜表面的羧基經(jīng)EDC (1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亞胺碘甲烷鹽)/NHS (N-羥基琥珀酰亞胺)活化后，與含RGDS (精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-絲氨酸)的短肽發(fā)生異相反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后反復(fù)清洗，洗去物理吸附的RGDS即得表面接枝含RGDS短肽的生物功能化羥丙基纖維素酯類液晶。本發(fā)明制備的表面固定含RGDS短肽的液晶薄膜，具有類細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和成分，有效改善細(xì)胞-材料之間的相互作用，促進(jìn)細(xì)胞在材料表面的粘附和增殖，可作為細(xì)胞模型(或細(xì)胞支架)在組織工程、再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域展現(xiàn)廣闊的應(yīng)用前景。
[0037]本發(fā)明利用異相反應(yīng)在生物相容性較好的液晶膜表面通過(guò)共價(jià)鍵固定含RGDS的短肽，異相反應(yīng)既保證了 RGDS的活性，又能使RGDS均勻分布在材料表面，提高了 RGDS的利用率。因此本發(fā)明制備的含RGDS短肽功能化液晶膜可顯著提高基質(zhì)與細(xì)胞之間的親和性，是一種新型的生物功能化細(xì)胞基質(zhì)，將來(lái)可作為細(xì)胞模型體系(或細(xì)胞支架)在生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域獲得廣闊的應(yīng)用前景。
[0038]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果:
[0039]1.本發(fā)明在液晶膜表面引入生物活性分子，液晶作為模擬生物膜結(jié)構(gòu)與性質(zhì)的軟物質(zhì)，具有良好的細(xì)胞相容性，在液晶膜表面接枝含RGDS的短肽系列，為細(xì)胞提供結(jié)合位點(diǎn)，可進(jìn)一步提聞液晶I旲的細(xì)胞未和性。
[0040]2.本發(fā)明通過(guò)異相反應(yīng)在液晶膜上接枝含RGDS的短肽，既可保證RGDS的活性不被破壞，同時(shí)RGDS全部均勻分布在薄膜表面，提高了其生物利用率。
[0041]3.本發(fā)明制備的生物功能化羥丙基纖維素酯類液晶膜上接枝的RGDS短肽密度達(dá)到9.32X 10-9mol/cm2，促進(jìn)細(xì)胞在材料表面的粘附和增殖，能夠很好的實(shí)現(xiàn)細(xì)胞親和性。
[0042]4.本發(fā)明制備的表面固定含RGDS短肽的液晶薄膜，具有類細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和成分，有效改善細(xì)胞-材料之間的相互作用，促進(jìn)細(xì)胞在材料表面的粘附和增殖。
[0043]5.本發(fā)明的制備方法工藝簡(jiǎn)單，制備得到表面固定有含RGDS短肽的纖維素酯類液晶膜可作為細(xì)胞模型體系在組織工程、再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域獲得廣闊的應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0044]圖1為羥丙基纖維素辛酯的偏光顯微鏡照片。
`[0045]圖2為羥丙基纖維素辛酯-戊二酸酐的偏光顯微鏡照片。
[0046]圖3為羥丙基纖維素辛酯-戊二酸酐-RGDS-FITC的熒光顯微鏡照片。
【具體實(shí)施方式】
[0047]下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
[0048]實(shí)施例
[0049]實(shí)施例1:羥丙基纖維素丙酯-戊二酸酐液晶的合成及其表面接枝含RGD短肽的制備過(guò)程:
[0050](I )3g羥丙基纖維素在丙酮中與1.2mL丙酰氯，55°C，磁力攪拌反應(yīng)反應(yīng)6小時(shí)后，經(jīng)水中透析3天，每天換水3次，50°C真空烘干，制得低取代羥丙基纖維素丙酯(PPC)。
[0051](2) 3g低取代PPC溶于50mL蒸餾過(guò)的丙酮中并加熱至50°C，往均質(zhì)溶液中加入2g戊二酸酐(GA)和0.15g4-二甲基吡啶，磁力攪拌下反應(yīng)45分鐘。把反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至透析袋中，在超純水中透析3天，每天換水3次，透析結(jié)束后，產(chǎn)物在50°C真空烘箱中烘干，得到產(chǎn)物記作PPC-GA。
[0052](3)PPC-GA溶于四氫呋喃中形成質(zhì)量濃度為5%的均質(zhì)溶液，然后通過(guò)溶液澆注法在聚丙烯基底膜上形成PPC-GA膜。[0053](4)制備的PPC-GA膜裁剪成Φ 10的尺寸置于24孔板中，每孔加入ImL的EDC (0.2Μ) /NHS (0.1Μ) /PBS溶液中，于4°C下活化薄膜表面的羧基4h，取出，清洗。
[0054](5)往活化后的樣品中加入ImL RGDS(10_4M)/PBS溶液，在4°C下反應(yīng)12h。反應(yīng)結(jié)束后，吸去RGDS溶液，加入超純水浸泡薄膜72h，每12h更換一次水，以洗去物理吸附的RGDS。PPC-GA液晶膜上接枝的含RGDS短肽經(jīng)水解成氨基酸后，用超高效液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)得密度為2.63X 10_nmOl/Cm2。[檢測(cè)方法參考如下文獻(xiàn):C.Deng, X.Chen, H.Yu, J.Sun, T.Lu, X.Jing.A biodegradable triblock copolymer poly (ethyleneglycol)-b-poly (L-1actide)-b-poly (L-1ysine): Synthesis,self-assembly, and RGDpeptide modification]
[0055]實(shí)施例2:羥丙基纖維素丁酯-戊二酸酐液晶的合成及其表面接枝含RGDS短肽的制備步驟:
[0056](I) 3g羥丙基纖維素在丙酮中與ImL 丁酰氯，60°C，磁力攪拌反應(yīng)5小時(shí)后，經(jīng)水透析，55°C真空烘干，制得低取代羥丙基纖維素丁酯(BPC)。
[0057](2) 3g低取代BPC溶于50mL蒸餾過(guò)的丙酮中并加熱至50°C，往均質(zhì)溶液中加入2g戊二酸酐(GA)和0.15g4-二甲基吡啶，磁力攪拌下反應(yīng)45分鐘。把反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至透析袋中，在超純水中透析5天，每天換水3次，透析結(jié)束后，產(chǎn)物在50°C真空烘箱中烘干，得到產(chǎn)物記作BPC-GA。
[0058](3)BPC-GA溶于四氫呋喃中形成質(zhì)量濃度5%的均質(zhì)溶液，然后通過(guò)溶液澆注法在聚丙烯基底膜上形成BPC-GA膜。
[0059](4)制備的BPC-GA膜裁剪成Φ 10的尺寸置于24孔板中，每孔加入ImL的EDC (0.2M) /NHS (0.1M) /PBS溶液中，于4°C下活化薄膜表面的羧基4h，取出，清洗。
[0060](5)往活化后的樣品中加入I`mL RGDS(10-4M)/PBS溶液，在4°C下反應(yīng)12h。反應(yīng)結(jié)束后，吸去RGDS溶液，加入超純水浸泡薄膜72h，每12h更換一次水，以洗去物理吸附的RGDS。BPC-GA液晶膜上接枝的含RGDS短肽經(jīng)水解成氨基酸后，用超高效液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)得密度為2.63X 10_nmOl/Cm2。[檢測(cè)方法參考如下文獻(xiàn):C.Deng, X.Chen, H.Yu, J.Sun, T.Lu, X.Jing.A biodegradable triblock copolymer poly (ethyleneglycol)-b-poly (L-1actide)-b-poly (L-1ysine): Synthesis,self-assembly, and RGDpeptide modification]
[0061]實(shí)施例3:羥丙基纖維素辛酯(OPC)-戊二酸酐膜表面接枝含RGD短肽的制備，包括如下步驟:
[0062](I) 3g羥丙基纖維素在丙酮中與ImL辛酰氯，60°C，磁力攪拌反應(yīng)4小時(shí)后，經(jīng)水透析，55°C真空烘干，制得低取代羥丙基纖維素辛酯(OPC)。
[0063](2)5g低取代OPC溶于50mL蒸餾過(guò)的丙酮中并加熱至50°C，往均質(zhì)溶液中加入3g戊二酸酐和0.225g4-二甲基吡啶，磁力攪拌下反應(yīng)I小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，把反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至透析袋中，在超純水中透析5天，每天換水3次，除去副產(chǎn)物和未反應(yīng)的小分子。透析結(jié)束后，產(chǎn)物在50°C真空烘箱中烘干，除盡水分，得到產(chǎn)物，記作羥丙基纖維素辛酯(OPC)-戊二酸酐(OPC-GA)。
[0064](3)0PC-GA溶于四氫呋喃中形成質(zhì)量濃度5%的均質(zhì)溶液，然后通過(guò)溶液澆注法在聚丙烯基底膜上形成OPC-GA膜。[0065](4)制備的OPC-GA膜裁剪成Φ 10的尺寸置于24孔板中，每孔加入ImL的EDC (0.2M)/NHS(0.1M)/PBS溶液中，于4°C下活化薄膜表面的羧基4h。
[0066](5)吸去步驟(4)中的溶液，加入超純水反復(fù)清洗15min，然后往活化后的樣品中加入ImL RGDS (I(T3M)/PBS溶液，在4°C下反應(yīng)過(guò)夜。反應(yīng)結(jié)束后，吸去RGDS溶液，加入超純水浸泡薄膜72h，每12h更換一次水，以洗去物理吸附的RGDS，獲得羥丙基纖維素辛酯-戊二酸酐-RGDS液晶膜。OPC-GA液晶膜上接枝的含RGDS短肽經(jīng)水解成氨基酸后，用超高效液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)得密度為9.32X10_9mol/Cm2。[檢測(cè)方法參考如下文獻(xiàn):C.Deng, X.Chen, H.Yu, J.Sun, T.Lu, X.Jing.A biodegradable triblock copolymerpoly (ethylene glycol)-b-poly(L-1actide)-b-poly(L-1ysine): Synthesis, self-assembly, and RGD peptide modification]。
[0067]上述步驟(1)制備獲得的羥丙基纖維素辛酯(OPC)的偏光顯微鏡照片見(jiàn)圖1，圖中顯示OPC在偏光下為彩色油狀織構(gòu)，具有典型的膽留醇液晶的特征。
[0068]上述步驟(2)中制備獲得的羥丙基纖維素辛酯-戊二酸酐的偏光顯微鏡照片圖見(jiàn)圖2，圖中顯示羥丙基纖維素辛酯-戊二酸酐偏光下也顯示典型的膽留醇液晶的彩色油狀織構(gòu)。
[0069]上述實(shí)施例3步驟(5)中的RGDS用經(jīng)FITC標(biāo)記的RGDS，即RGDS-FITC (購(gòu)自Sigma公司)等摩爾量替代，制備獲得的羥丙基纖維素辛酯-戊二酸酐-RGDS-FITC，熒光顯微鏡下觀察，激發(fā)波長(zhǎng)494nm，發(fā)射波長(zhǎng)520nm，可激發(fā)出綠色熒光。熒光顯微鏡照片圖如圖3所示，圖中綠色熒光為FITC標(biāo)記的RGDS，可見(jiàn)RGDS均勻地分布在材料表面。
[0070]上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含`在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種生物功能化羥丙基纖維素酯類液晶膜的制備方法，其特征在于包括如下步驟: (1)將羥丙基纖維素溶于丙酮中形成均相溶液，而后與脂肪酰氯發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)物經(jīng)水中透析，烘干，得到低取代烷基?；u丙基纖維素酯類液晶； (2)取步驟(1)制備的低取代烷基?；u丙基纖維素酯類液晶溶于丙酮溶液，在4-二甲基吡啶催化下與戊二酸酐反應(yīng)，產(chǎn)物經(jīng)過(guò)水透析后，真空烘干，獲得羧基功能化的羥丙基纖維素酯類液晶； (3)將步驟(2)制備的羧基功能化的羥丙基纖維素酯類液晶溶于四氫呋喃形成均一溶液，采用溶液澆注法在聚丙烯基底上成膜，獲得羧基功能化的羥丙基纖維素酯類液晶膜； (4)用EDC/NHS/PBS溶液活化步驟(3)制備的液晶膜表面的羧基； (5)將步驟(4)處理過(guò)的液晶膜在RGDS/PBS溶液中4°C下反應(yīng)12~24h;純水浸泡，洗去物理吸附的RGDS，獲得生物功能化羥丙基纖維素酯類液晶膜。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物功能化羥丙基纖維素酯類液晶膜的制備方法，其特征在于:步驟(1)中所述羥丙基纖維素分子量為5萬(wàn)~10萬(wàn)； 步驟(1)中所述脂肪酰氯的烷基碳鏈長(zhǎng)度為C3-C8 ； 步驟(1)中所述的羥丙基纖維素與脂肪酰氯的質(zhì)量體積比為15g:5~6ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物功能化羥丙基纖維素酯類液晶膜的制備方法，其特征在于:步驟(1)中所述反應(yīng)的反應(yīng)溫度為55~60°C，反應(yīng)時(shí)間為5~6小時(shí)，磁力攪拌； 步驟(1)中所述的透析為在水中透析3天，每天換水3次； 步驟(1)中所述的烘干為在50~55°C真空烘干； 步驟(1)中所述的低取代烷基?；u丙基纖維素酯類液晶的側(cè)鏈烷基酰基的取代度為40 ~50%ο
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物功能化羥丙基纖維素酯類液晶膜的制備方法，其特征在于:步驟(2)中所述低取代烷基?；u丙基纖維素酯類液晶溶于丙酮溶液的質(zhì)量百分濃度為6~10% ； 步驟(2)中所述的戊二酸酐與4-二甲基吡啶的摩爾比為15:10~15:12 ； 步驟(2)中所述反應(yīng)的反應(yīng)溫度為50~55°C，反應(yīng)時(shí)間為45~60min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物功能化羥丙基纖維素酯類液晶膜的制備方法，其特征在于:步驟(2)中戊二酸酐與羥丙基纖維素液晶中羥基的摩爾比為1:1~1.5:1 ; 步驟(2)中所述的水中透析的透析時(shí)間為3~5天，每天更換純凈水3次。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物功能化羥丙基纖維素酯類液晶膜的制備方法，其特征在于:步驟(3)中所述羧基功能化的羥丙基纖維素酯類液晶溶于四氫呋喃形成的溶液質(zhì)量濃度為5~10% ； 步驟(3)中所述的溶液澆注法在聚丙烯基底上成膜具體操作為:溶液澆注在鋪有聚丙烯基底膜的玻璃培養(yǎng)皿上，室溫下溶劑完全揮發(fā)后形成羧基功能化的羥丙基纖維素酯類液晶月旲。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物功能化羥丙基纖維素酯類液晶膜的制備方法，其特征在于:步驟(4)中所述的EDC/NHS/PBS溶液為PBS緩沖液作為溶劑，EDC濃度為0.2mol/L,NHS濃度為0.lmol/L，活化溫度為4°C，活化時(shí)間為4~6小時(shí)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的 生物功能化羥丙基纖維素酯類液晶膜的制備方法，其特征在于:步驟(5)中所述的RGDS/PBS溶液中PBS緩沖液為溶解溶劑，RGDS的濃度為10_4~103mol/L ； 步驟(5)中所述的純水浸泡時(shí)間為72~96小時(shí)，每12小時(shí)更換I次純水。
9.一種生物功能化羥丙基纖維素酯類液晶膜由權(quán)利要求1~8任一項(xiàng)所述的制備方法獲得。
10.權(quán)利要求9所述的生物功能化羥丙基纖維素酯類液晶膜作為細(xì)胞模型或支架在組織工程、再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用。`
【文檔編號(hào)】A61L27/20GK103739866SQ201310713996
【公開(kāi)日】2014年4月23日 申請(qǐng)日期:2013年12月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月19日
【發(fā)明者】屠美, 查振剛, 曾戎, 吳昊, 韓婉清 申請(qǐng)人:暨南大學(xué)