眼鏡蛇蛇毒在制備免疫調(diào)節(jié)劑中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種眼鏡蛇蛇毒在制備免疫調(diào)節(jié)劑中的應(yīng)用，所述眼鏡蛇蛇毒來(lái)自中華眼鏡蛇蛇毒或泰國(guó)眼鏡蛇蛇毒。并且尤其優(yōu)選將物理改性的眼鏡蛇蛇毒運(yùn)用于制備免疫調(diào)節(jié)劑，改性方法是將眼鏡蛇蛇毒用去離子水溶解，再在50～100℃溫度下加熱1～30min后冷卻得到。制備而成的免疫調(diào)節(jié)劑具有增強(qiáng)機(jī)體非特異性免疫與體液免疫功能和抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫功能，人用有效劑量約為1～1000μg/kg，具有用量小、安全、可口服、可注射、可透過(guò)口鼻粘膜和皮膚給藥等優(yōu)點(diǎn)，具有較大的臨床應(yīng)用價(jià)值。
【專利說(shuō)明】眼鏡蛇蛇毒在制備免疫調(diào)節(jié)劑中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種眼鏡蛇蛇毒在制備免疫調(diào)節(jié)劑中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]免疫系統(tǒng)一方面通過(guò)免疫防御功能來(lái)保護(hù)機(jī)體免受外來(lái)微生物的入侵，同時(shí)及時(shí)清除體內(nèi)衰老及癌變的細(xì)胞，當(dāng)免疫功能低于正常水平，機(jī)體極易感染、誘發(fā)惡性腫瘤，常使病人的病情嚴(yán)重難以治療，這時(shí)需要應(yīng)用安全有效的藥物來(lái)改善機(jī)體的免疫功能。另一方面，機(jī)體通過(guò)免疫自穩(wěn)功能來(lái)使機(jī)體識(shí)別“自己”與“非己”，但當(dāng)機(jī)體不能有效進(jìn)行區(qū)分，便會(huì)對(duì)自身組織產(chǎn)生免疫反應(yīng)，從而產(chǎn)生一系列的自身免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、硬皮病等，這些疾病的發(fā)病過(guò)程復(fù)雜，但在炎癥反應(yīng)階段，T細(xì)胞為主要的效應(yīng)細(xì)胞?，F(xiàn)階段對(duì)于這些疾病的治療往往采用糖皮質(zhì)激素等藥物，它無(wú)論對(duì)固有免疫還是特異性細(xì)胞免疫與體液免疫均有抑制作用，長(zhǎng)期應(yīng)用會(huì)使機(jī)體易受外來(lái)微生物入侵，同時(shí)易誘發(fā)腫瘤，因此急需開(kāi)發(fā)新的免疫調(diào)劑藥物來(lái)抑制或延緩T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病的進(jìn)程，或提高機(jī)體的天然和B細(xì)胞免疫功能，提高抵御感染和腫瘤的能力。
[0003]蛇毒是由蛇的毒腺分泌的多種組分構(gòu)成的復(fù)雜混合物。中華眼鏡蛇蛇毒成分主要有眼鏡蛇蛇毒因子、心臟毒素、神經(jīng)毒素等其它類蛋白質(zhì)。祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為眼鏡蛇及其毒性成分并具有強(qiáng)身健體之功效。另有文獻(xiàn)報(bào)道蛇毒能夠緩解惡性腫瘤疼痛、神經(jīng)痛和關(guān)節(jié)痛，但是在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能方面的作用還未見(jiàn)報(bào)道。
[0004]機(jī)體免疫系統(tǒng)包括免疫器官或組織，免疫細(xì)胞與免疫分子。巨噬細(xì)胞是機(jī)體非特異性免疫系統(tǒng)的主要組成部分，碳粒廓清實(shí)驗(yàn)則主要反映巨噬細(xì)胞對(duì)異物的吞噬能力，補(bǔ)體C3主要通過(guò)結(jié)合在異物表面來(lái)促進(jìn)巨噬細(xì)胞的吞噬作用。NK細(xì)胞是機(jī)體非特異性免疫功能的另一個(gè)主要組成部分，它無(wú)需抗原提呈細(xì)胞或抗體的輔助作用便可對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生非特異的殺傷作用，IFN-Y則對(duì)NK細(xì)胞的殺傷作用產(chǎn)生促進(jìn)作用。溶血素實(shí)驗(yàn)主要反映機(jī)體體液免疫功能，綿羊紅細(xì)胞為典型的T細(xì)胞依賴型抗原，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性的抗體，這種特異性抗體在體外在補(bǔ)體的參與下會(huì)對(duì)綿羊紅細(xì)胞產(chǎn)生溶血作用，又稱為溶血素。在機(jī)體產(chǎn)生抗體過(guò)程中，抗原提呈細(xì)胞呈遞抗原給輔助性T細(xì)胞，輔助T細(xì)胞分泌IL-4，對(duì)B細(xì)胞的增殖及分泌抗體都有促進(jìn)作用。T細(xì)胞主要分為⑶4T細(xì)胞與⑶8T細(xì)胞，⑶4T細(xì)胞又稱輔助性T細(xì)胞，根據(jù)分泌細(xì)胞因子的不同，分為T(mén)hl、Th2與Thl7等細(xì)胞亞型，Thl與Th2亞型分別分泌IFN-Y與IL-4，分別對(duì)固有免疫與體液免疫起輔助作用，Thl7亞型主要分泌IL-17，它與CD8T細(xì)胞共同介導(dǎo)遲發(fā)型超敏反應(yīng)。地塞米松為糖皮質(zhì)激素的一種，長(zhǎng)期應(yīng)用會(huì)產(chǎn)生免疫抑制作用，研究藥物對(duì)免疫功能低下機(jī)體的作用則可進(jìn)一步確定藥物的免疫調(diào)節(jié)功能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的是:提供一種眼鏡蛇蛇毒在制備免疫調(diào)節(jié)劑中的應(yīng)用，所述制備得到的免疫調(diào)節(jié)劑具有增強(qiáng)機(jī)體非特異性免疫與體液免疫功能和抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫功能，具有用量小、安全、可口服、可注射、可透過(guò)口鼻粘膜和皮膚給藥等優(yōu)點(diǎn)，具有較大的臨床應(yīng)用價(jià)值。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案是:一種眼鏡蛇蛇毒在制備免疫調(diào)節(jié)劑中的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明中所述免疫調(diào)節(jié)劑是具有雙向免疫調(diào)節(jié)作用的免疫調(diào)節(jié)劑。
[0008]本發(fā)明中所述眼鏡蛇蛇毒選自中華眼鏡蛇蛇毒或泰國(guó)眼鏡蛇蛇毒。[0009]本發(fā)明中所述免疫調(diào)節(jié)劑是眼鏡蛇蛇毒與其他藥物活性成分一起形成的復(fù)方制劑，或眼鏡蛇蛇毒與藥用輔料形成單方制劑。
[0010]優(yōu)選的，本發(fā)明中所述眼鏡蛇蛇毒是通過(guò)物理改性后的眼鏡蛇蛇毒。
[0011]進(jìn)一步的，本發(fā)明中所述通過(guò)物理改性后的眼鏡蛇蛇毒是指將眼鏡蛇蛇毒用去離子水溶解后加熱變性，加熱溫度在50~100°C，加熱時(shí)間為I~30min后得到的眼鏡蛇蛇毒。
[0012]更進(jìn)一步的，本發(fā)明中所述通過(guò)物理改性后的眼鏡蛇蛇毒是指將眼鏡蛇蛇毒用去離子水溶解后加熱變性，加熱溫度在100°c，加熱時(shí)間為IOmin后得到的眼鏡蛇蛇毒。
[0013]當(dāng)然需要說(shuō)明的是，本發(fā)明中無(wú)論是通過(guò)物理改性后的，還是未經(jīng)物理改性后的眼鏡蛇蛇毒，均可與其他藥物活性成分一起形成復(fù)方制劑，或與藥用輔料一起形成單方制劑。
[0014]優(yōu)選的，本發(fā)明中所述眼鏡蛇蛇毒是指眼鏡蛇蛇毒活性成分中的神經(jīng)毒素，心臟毒素或眼鏡蛇毒因子。
[0015]本發(fā)明中所述免疫調(diào)節(jié)劑是用于藥物的免疫調(diào)節(jié)劑，或者用于保健品的免疫調(diào)節(jié)劑。
[0016]本發(fā)明中所述免疫調(diào)節(jié)劑的給藥劑型為口腔速溶藥膜、口服液、片劑、膠囊、噴霧劑、注射劑或透皮吸收制劑。
[0017]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是:
[0018]1.眼鏡蛇蛇毒能增強(qiáng)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力。
[0019]2.本發(fā)明優(yōu)選采用經(jīng)物理改性的眼鏡蛇蛇毒，毒性低而療效高。
[0020]3.眼鏡蛇蛇毒能增強(qiáng)機(jī)體補(bǔ)體C3含量。
[0021]4.眼鏡蛇蛇毒能增強(qiáng)機(jī)體NK細(xì)胞對(duì)腫瘤的殺傷作用。
[0022]5.眼鏡蛇蛇毒能增強(qiáng)機(jī)體對(duì)特異性抗體綿羊紅細(xì)胞的體液免疫反應(yīng)。
[0023]6.眼鏡蛇蛇毒能增強(qiáng)B細(xì)胞的增殖能力。
[0024]7.眼鏡蛇蛇毒能促進(jìn)機(jī)體淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IFN-Y與IL-4的能力。
[0025]8.眼鏡蛇蛇毒能逆轉(zhuǎn)免疫功能低下小鼠非特異性免疫與體液免疫功能。
[0026]9.眼鏡蛇蛇毒能抑制T細(xì)胞的增殖能力，抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)。
[0027]10.眼鏡蛇蛇毒多種給藥途徑包括皮膚給藥、口服、口(鼻)粘膜噴霧和注射等均有效。
[0028]11.眼鏡蛇蛇毒用量少，有效范圍大，在10~3000 μ g/kg劑量范圍內(nèi)都有很好的免疫調(diào)節(jié)作用。人用劑量約為I~1000 μ g/kg。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0029]下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述:[0030]圖1為物理改性的眼鏡蛇蛇毒對(duì)正常小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響圖；
[0031]圖2為物理改性的眼鏡蛇蛇毒對(duì)正常小鼠血清補(bǔ)體C3含量的影響圖；
[0032]圖3為物理改性的眼鏡蛇蛇毒對(duì)正常小鼠NK細(xì)胞殺傷功能的影響圖；
[0033]圖4為物理改性的眼鏡蛇蛇毒對(duì)正常小鼠溶血素生成的影響圖；
[0034]圖5為物理改性的眼鏡蛇蛇毒對(duì)正常小鼠B細(xì)胞增殖能力的影響圖；
[0035]圖6為物理改性的眼鏡蛇蛇毒對(duì)正常小鼠淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IFN-Y、IL-4與對(duì)⑶4Thl、Th2細(xì)胞分化的影響圖；
[0036]圖7為物理改性的眼鏡蛇蛇毒對(duì)正常小鼠T細(xì)胞增殖能力的影響圖；
[0037]圖8為物理改性的眼鏡蛇蛇毒對(duì)正常小鼠T細(xì)胞周期分布的影響圖；
[0038]圖9為物理改性的眼鏡蛇蛇毒對(duì)正常小鼠T細(xì)胞分化能力的影響圖；
[0039]圖10為物理改性的眼鏡蛇蛇毒對(duì)正常小鼠淋巴細(xì)胞產(chǎn)IL-17與對(duì)⑶4Thl7細(xì)胞分化的影響圖；
[0040]圖11為物理改 性的眼鏡蛇蛇毒對(duì)正常小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)的影響圖；
[0041]圖12為物理改性的眼鏡蛇蛇毒對(duì)免疫低下小鼠T淋巴細(xì)胞亞型的影響圖；
[0042]圖13為物理改性的眼鏡蛇蛇毒對(duì)免疫低下小鼠白細(xì)胞含量的影響圖；
[0043]圖14為物理改性的眼鏡蛇蛇毒對(duì)免疫低下小鼠IgG、IgM含量的影響圖；
[0044]圖15為物理改性的眼鏡蛇蛇毒對(duì)免疫低下小鼠脾臟生發(fā)中心形成的影響圖。
【具體實(shí)施方式】
[0045]以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)上述方案做進(jìn)一步說(shuō)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例是用于說(shuō)明本發(fā)明而不限于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中采用的實(shí)施條件可以根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)的條件做進(jìn)一步調(diào)整，未注明的實(shí)施條件通常為常規(guī)實(shí)驗(yàn)中的條件。
[0046]實(shí)施例:
[0047]1、對(duì)固有免疫與體液免疫的增強(qiáng)作用
[0048](I)碳粒廓清實(shí)驗(yàn)
[0049]本實(shí)驗(yàn)選用ICR小鼠40只，隨機(jī)分為4組，分為正常組(control)、中華眼鏡蛇蛇毒低劑量組(20 μ g/kg)、中劑量組(40 μ g/kg)、高劑量組(80 μ g/kg),每組10只。將中華眼鏡蛇蛇毒用去離子水溶解后加熱變性，加熱溫度在100°C，加熱時(shí)間為lOmin，冷卻至室溫備用。各給藥組用相應(yīng)濃度藥物按0.lml/10g.d體積灌胃，正常組灌服0.lml/10g.d蒸餾水，實(shí)驗(yàn)連續(xù)給藥21天。末次給藥后3h，各組小鼠尾靜脈注射用1%明膠稀釋4倍的印度墨汁0.lml/10g。分別于注射后2min和20min眼眶靜脈叢取血20 μ 1，放入1.5ml0.l%Na2C03溶液中，混勻。取血完畢后，立即脫頸處死小鼠，稱取肝臟、脾臟濕重。吸取200μ1 Na2CO3溶液置于酶標(biāo)板中，680nm測(cè)量吸光度。計(jì)算校正廓清指數(shù)(Phagocytic index) α
休 1R , I iogOD:ii,ii, — !ogOD2n,mn(α=脾重 + 肝重 xY Ti0niin-Timin )。
[0050]實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
[0051]圖1為物理改性的中華眼鏡蛇蛇毒(NNAV)對(duì)正常小鼠碳粒廓清能力的影響。其中*表示p〈0.05，與正常組比較。由圖1可以看出，給予物理改性后的中華眼鏡蛇蛇毒(NNAV)能夠?qū)π∈筇剂＠迥芰Ξa(chǎn)生不同程度的促進(jìn)作用。[0052](2)血清補(bǔ)體C3檢測(cè)
[0053]本實(shí)驗(yàn)選用ICR小鼠40只，隨機(jī)分為4組，分為正常組、中華眼鏡蛇蛇毒(NNAV)低劑量組(20 μ g/kg)、中劑量組(40 μ g/kg)、高劑量組(80 μ g/kg),每組10只。將中華眼鏡蛇蛇毒用去離子水溶解后加熱變性，加熱溫度在100°c，加熱時(shí)間為lOmin，冷卻至室溫備用。各給藥組用相應(yīng)濃度藥物按0.lml/10g.d體積灌胃，正常組灌服0.lml/10g.d蒸餾水，實(shí)驗(yàn)連續(xù)給藥21天。末次給藥后，眼球剝奪取血，全血靜置Ih后3000r/min離心分離血清,參照ELISA試劑盒說(shuō)明檢測(cè)血清中補(bǔ)體C3含量。
[0054]實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
[0055]圖2為物理改性中 華眼鏡蛇蛇毒對(duì)小鼠補(bǔ)體C3含量影響。其中*表示p〈0.05，與正常組(control)比較。由圖2可以看出，給予物理改性后的中華眼鏡蛇蛇毒能夠增強(qiáng)機(jī)體補(bǔ)體(serum C3)的生成。
[0056](3) NK細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)
[0057]本實(shí)驗(yàn)選用ICR小鼠16只，隨機(jī)分為4組，分為正常組(control)、中華眼鏡蛇蛇毒(NNAV)低劑量組(20μ g/kg)、中劑量組(40μ g/kg)、高劑量組(80μ g/kg)，每組4只。將中華眼鏡蛇蛇毒用去離子水溶解后加熱變性，加熱溫度在100°C，加熱時(shí)間為lOmin，冷卻至室溫備用。各給藥組用相應(yīng)濃度藥物按0.lml/10g.d體積灌胃，正常組灌服0.lml/10g.d蒸餾水，實(shí)驗(yàn)連續(xù)給藥21天。脫頸處死小鼠，無(wú)菌取脾至于含雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基中平衡3~5min，將脾臟置于200目細(xì)胞篩，用剪刀將脾臟剪碎，PBS沖洗過(guò)濾除去其中的碎片及結(jié)締組織，細(xì)胞懸液離心后以2ml含150mM NH4ClUOmM KHCO3>0.1mM EDTA的溶液重懸作用Imin以除去紅細(xì)胞，PBS洗漆2次,每次1500r/min,離心5min,臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)細(xì)胞存活率>95%，用含1%滅活胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞至5X IO6個(gè)/ml。實(shí)驗(yàn)前24h將靶細(xì)胞YAC-1進(jìn)行傳代培養(yǎng)，應(yīng)用前以PBS洗I次，用含1%滅活胎牛血清的RPMI1640調(diào)整細(xì)胞濃度至I X IO5個(gè)/ml。取效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞各100 μ I加入96孔培養(yǎng)板中，同時(shí)設(shè)最大釋放孔和自發(fā)釋放孔，上述各項(xiàng)均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h，在培養(yǎng)結(jié)束前Ih于最大釋放孔加入LDH釋放試劑20 μ I。培養(yǎng)結(jié)束后1800r/min離心5min,取120 μ I上清至另一 96孔板中，每孔加入LDH基質(zhì)液60 μ 1，將96孔板置于水平搖床，室溫避光孵育30min，于酶標(biāo)儀490nm測(cè)定每孔吸光度，計(jì)算NK細(xì)胞活性(NK cells activity%)
,反應(yīng)孔OD-自發(fā)釋放孔1ΛΛ0/、
【權(quán)利要求】
1.一種眼鏡蛇蛇毒在制備免疫調(diào)節(jié)劑中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的眼鏡蛇蛇毒在制備免疫調(diào)節(jié)劑中的應(yīng)用，其特征在于所述免疫調(diào)節(jié)劑是具有雙向免疫調(diào)節(jié)作用的免疫調(diào)節(jié)劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的眼鏡蛇蛇毒在制備免疫調(diào)節(jié)劑中的應(yīng)用，其特征在于所述眼鏡蛇蛇毒選自中華眼鏡蛇蛇毒或泰國(guó)眼鏡蛇蛇毒。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的眼鏡蛇蛇毒在制備免疫調(diào)節(jié)劑中的應(yīng)用，其特征在于所述免疫調(diào)節(jié)劑是眼鏡蛇蛇毒與其他藥物活性成分一起形成的復(fù)方制劑，或眼鏡蛇蛇毒與藥用輔料形成單方制劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的眼鏡蛇蛇毒在制備免疫調(diào)節(jié)劑中的應(yīng)用，其特征在于所述眼鏡蛇蛇毒是通過(guò)物理改性后的眼鏡蛇蛇毒。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的眼鏡蛇蛇毒在制備免疫調(diào)節(jié)劑中的應(yīng)用，其特征在于所述通過(guò)物理改性后的眼鏡蛇蛇毒是指將眼鏡蛇蛇毒用去離子水溶解后加熱變性，加熱溫度在50~100°C，加熱時(shí)間為I~30min后得到的眼鏡蛇蛇毒。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的眼鏡蛇蛇毒在制備免疫調(diào)節(jié)劑中的應(yīng)用，其特征在于所述通過(guò)物理改性后的眼鏡蛇蛇毒是指將眼鏡蛇蛇毒用去離子水溶解后加熱變性，加熱溫度在100°C,加熱時(shí)間為IOmin后得到的眼鏡蛇蛇毒。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4或5或6或7所述的眼鏡蛇蛇毒在制備免疫調(diào)節(jié)劑中的應(yīng)用，其特征在于所述眼鏡蛇蛇毒是指眼鏡蛇蛇毒活性成分中的神經(jīng)毒素，心臟毒素或眼鏡蛇毒因子。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的眼鏡蛇蛇毒在制備免疫調(diào)節(jié)劑中的應(yīng)用，其特征在于所述免疫調(diào)節(jié)劑是用于藥物的免疫調(diào)節(jié)劑，或者用于保健品的免疫調(diào)節(jié)劑。`
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的眼鏡蛇蛇毒在制備免疫調(diào)節(jié)劑中的應(yīng)用，其特征在于所述免疫調(diào)節(jié)劑的給藥劑型為口腔速溶藥膜、口服液、片劑、膠囊、噴霧劑、注射劑或透皮吸收制劑。
【文檔編號(hào)】A61K9/12GK103690566SQ201310699935
【公開(kāi)日】2014年4月2日 申請(qǐng)日期:2013年12月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月19日
【發(fā)明者】秦正紅, 寇建群 申請(qǐng)人:蘇州人本藥業(yè)有限公司