一種獨(dú)活香豆素活性單體及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】一種獨(dú)活香豆素活性單體的制備方法，其特征在于包括下述工藝步驟：取獨(dú)活藥材粉碎，用95%的乙醇回流提取3次，減壓回收95%乙醇，再對濃縮后的提取液依次用石油醚和乙酸乙酯萃取得到萃取液，合并上述的萃取液，經(jīng)減壓回收溶劑，制得60℃溫度下測相對密度1.0-1.2的浸膏；對浸膏進(jìn)行硅膠柱色譜分離，以石油醚：乙酸乙酯為100:0→5:1的混合液梯度洗脫，選取其中10:1梯度分離得到的無色結(jié)晶，即為化合物蛇床子素的結(jié)晶。本發(fā)明方法操作簡單，工藝成熟，所得蛇床子素量大、純度高、成本低，因此易于推廣，并被廣大阿爾茨海默病患者接受。具有廣闊的臨床應(yīng)用前景和明顯的社會經(jīng)濟(jì)價值。
【專利說明】一種獨(dú)活香豆素活性單體及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于一種中藥的制備方法，具體是一種中藥獨(dú)活活性單體的制備方法，該單體可用于治療阿爾茨海默病。
【背景技術(shù)】:
[0002]阿爾茨海默病(Alzheimer disease, AD)又稱老年性癡呆，是中老年人常見的神經(jīng)退行性疾病，主要表現(xiàn)為進(jìn)行性記憶力減退和認(rèn)知功能障礙，是當(dāng)今老年醫(yī)學(xué)面臨的最為嚴(yán)峻的課題之一 [1_2]。其發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，目前普遍認(rèn)為β淀粉樣蛋白(i3-Amyloid，Ai3)沉積是病變形成和發(fā)展的主要原因。在AD腦內(nèi)病灶周圍聚集著大量活化的小膠質(zhì)細(xì)胞，產(chǎn)生大量炎性介質(zhì)引起炎癥反應(yīng)，氧化應(yīng)激過強(qiáng)使自由基大量產(chǎn)生，影響了細(xì)胞的代謝與功能，導(dǎo)致以凋亡為主的大量神經(jīng)元潰變丟失、組織萎縮，其中以基底前腦膽堿能神經(jīng)元丟失最為嚴(yán)重，引起學(xué)習(xí)與記憶功能障礙[2_3]。傳統(tǒng)的治療藥物包括改善膽堿能神經(jīng)功能藥、改善腦循環(huán)藥、抗氧化藥及非留體抗炎藥等，都只能部分緩解癥狀，且副作用較重，病人難以長期服用，因而至今對該病仍無有效治療方法[2_3]。
[0003]獨(dú)活(Radix Angelicae pubescentis)是《中國藥典》收載的常用祛風(fēng)濕散寒藥，正品為傘形科植物重齒毛當(dāng)歸的干燥根，主治風(fēng)寒濕痹、腰膝疼痛等癥?？v觀歷代醫(yī)家對獨(dú)活的記載，會發(fā)現(xiàn)其除具有祛風(fēng)散寒的功效外，還具有調(diào)補(bǔ)五臟，尤善補(bǔ)腎，祛瘀化痰，宣通腦絡(luò)之功效，是一味入陰而升陽，通補(bǔ)并用的防治衰老良藥。作為祛風(fēng)除濕類中藥之首，獨(dú)活相當(dāng)于西醫(yī)的非 甾體類抗炎藥，能抑制AD腦內(nèi)的免疫炎癥反應(yīng)保護(hù)神經(jīng)組織，減輕神經(jīng)元損傷；同時其通實補(bǔ)虛的功效還能糾正AD腎精虧虛、本虛標(biāo)實之病機(jī)，調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫機(jī)能，增強(qiáng)抗病能力，因此具有防治AD的中醫(yī)理論基礎(chǔ)。
[0004]現(xiàn)代藥理研究已證實獨(dú)活煎劑或浸膏具有鎮(zhèn)靜催眠、降壓、抑制血小板聚集及抗腫瘤等作用，近年亦有報道獨(dú)活能減輕AD模型動物腦內(nèi)炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷，抑制細(xì)胞凋亡，改善學(xué)習(xí)與記憶能力等。但以上研究所用制劑僅限于獨(dú)活水煎劑和醇提物等，其中主要藥理活性部位香豆素的含量較低(最高為29.1 % )，且對其中化合物指認(rèn)不清，治療
效果欠佳[4_5]。
[0005]已知香豆素類化合物是獨(dú)活的主要藥理活性部位，包括蛇床子素、二氫歐山芹素、二氫歐山芹乙酸乙酯、異歐前胡素等[6_7]?，F(xiàn)有關(guān)獨(dú)活香豆素提取純化的報道較少，才謙等
[8]用超臨界提取工藝純化得到的獨(dú)活總香豆素提取物，香豆素含量略大于50%，其操作工藝復(fù)雜，設(shè)備昂貴，難以推廣應(yīng)用；中國專利200710024862.8 “一種獨(dú)活提取物的制備方法”，采用回流提取和有機(jī)溶劑萃取法制備的獨(dú)活提取物，雖方法工藝簡單，但重復(fù)此方法所得提取物中香豆素含量不超過30%，且成分不清、難以排除有機(jī)溶劑的殘留，用于體外細(xì)胞實驗效果不佳。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的，是提供一種獨(dú)活香豆素活性單體。[0007]本發(fā)明的另一個目的，是提供一種獨(dú)活香豆素活性單體的制備方法。
[0008]本發(fā)明的又一目的，是證明了該單體能治療阿爾茨海默病。
[0009]采用的技術(shù)方案是:
[0010]1、一種獨(dú)活香豆素活性單體，其特征在于該單體是香豆素中的蛇床子素。[0011]取純度99%的香豆素，經(jīng)LC-MS法檢測分析其結(jié)構(gòu)，確定所得化合物為蛇床子素(Osthole)。用于體內(nèi)、體外藥理實驗，證實該蛇床子素對阿爾茨海默病細(xì)胞模型-A β?lián)p傷神經(jīng)元有明顯保護(hù)作用，且能顯著改善APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠的學(xué)習(xí)與記憶能力，治療效果明顯優(yōu)于獨(dú)活水煎劑和醇提物。
[0012]2、一種獨(dú)活香豆素活性單體的制備方法，包括下述工藝步驟:
[0013]取獨(dú)活藥材粉碎，用95% (體積百分比)乙醇回流提取3次，減壓回收95%乙醇，再對濃縮后的提取液依次用石油醚和乙酸乙酯萃取得到萃取液，合并上述萃取液，經(jīng)減壓回收溶劑，制得60°C溫度下測相對密度為1.0-1.2的浸膏。對浸膏進(jìn)行硅膠柱色譜分離，以石油醚:乙酸乙酯為100: O —5:1的混合液梯度洗脫，選取其中10: I梯度分離得到的無色結(jié)晶，即為化合物蛇床子素的結(jié)晶。
[0014]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn):
[0015]用本發(fā)明方法制備的結(jié)晶的蛇床子素純度為99.0%以上，提高了治療阿爾茨海默病的療效。
[0016]本發(fā)明方法操作簡單，工藝成熟，所得蛇床子素量大、純度高、成本低，因此易于推廣，并被廣大AD患者接受，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景和明顯的社會經(jīng)濟(jì)價值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1是HPLC法對蛇床子素純度檢查示意圖。
[0018]圖2為樣品與蛇床子素HPCC示意圖。
[0019]圖2中1、樣品HPLC圖；2、蛇床子素HPLC圖；3、紫外全波長掃描匹配圖。
[0020]圖3為樣品負(fù)離子模式，[M+H]+峰示圖。
[0021]圖4為神經(jīng)元鑒定圖。其中:綠色=NF-M+ ;藍(lán)色=DAPI+細(xì)胞核。40倍放大。
[0022]圖5、圖6和圖7為獨(dú)活香豆素活性單體對Αβ25_35損傷神經(jīng)元的保護(hù)作用示圖。其中:
[0023](A)神經(jīng)元形態(tài)，40Χ ； (B)MTT法檢測細(xì)胞活力；(C) LDH釋放量測定。##Ρ < 0.01，與正常組相比；*Ρ < 0.05，**Ρ < 0.01與模型組比較。
[0024]圖8、圖9為:獨(dú)活香豆素活性單體抑制Αβ25_35$導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡示圖，其中:
[0025](A)Hoechst33258染色，箭頭所指為凋亡細(xì)胞核；(B)定量分析凋亡細(xì)胞百分率，P < 0.01與正常組相比；*P < 0.05，**P < 0.01與模型組比較。
[0026]圖10為獨(dú)活香豆素活性單體對AD小鼠腦內(nèi)炎性細(xì)胞因子水平的影響示圖。
[0027]^?<0.01，與正常組比較；#卩<0.05，呷<0.01與模型組比較；@Ρ<0.05，與吲哚美辛組比較。
【具體實施方式】
[0028]一種獨(dú)活香豆素活性單體的制備方法，包括下述步驟:[0029]1.儀器與材料
[0030]UV-1100型紫外可見分光光度計(日本島津)；BS21S型精密電子天平(德國賽多利斯天平有限公司)；RE_52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；SHZ-D循環(huán)水式真空泵(予華儀器公司)；Agilentl290UPLC-6520Q-T0F型質(zhì)譜儀(美國Agilent公司)；Agilentl260型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)。柱色譜硅膠(200~300目)及薄層色譜硅膠G為青島海洋化工廠產(chǎn)品；甲醇為色譜純，水為雙重蒸餾水；其余試劑均為分析純。
[0031]獨(dú)活藥材購自安徽毫州藥材市場(2012年)，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定教研室翟延君教授鑒定為傘形科重齒毛當(dāng)歸Angelica pubescens Maxim, f.biserrataShan et Yuan的干燥根；蛇床子素對照品由中國藥品生物制品檢定所提供(批號110822-200305)。
[0032]2.提取與分離
[0033]獨(dú)活干燥根2kg，粉碎，用95%乙醇回流提取3次，減壓濃縮提取液，依次用石油醚和乙酸乙酯萃取，合并萃取液，減壓回收溶劑，制得在60°C溫度下測相對密度為1.0-1.1的浸膏。對浸膏進(jìn)行硅膠柱色譜分離，以石油醚-乙酸乙酯(100: 0 — 5: I的不同比例)梯度洗脫，選取其中10: I梯度分離得到的無色結(jié)晶進(jìn)一步檢測。
[0034]3.純度檢查
[0035]3.1薄層檢查將步驟2所得無色結(jié)晶體配制成2.087mg/mL的樣品溶液，分別在三個展開系統(tǒng)內(nèi)展開，以10%硫酸乙醇溶液顯色。結(jié)果:得到3組單一斑點(diǎn)，確定為單一組分。
[0036]3.2HPLC 面積歸一化法色譜條件:Diamonsil C18 (5 μ m, 200 X 4.6mm)色譜柱，流動相為甲醇-水，梯度洗脫，O~30min，20%~100%甲醇；流速lmL/min ;檢測波長322nm ；柱溫30°C ;取經(jīng)薄層檢查的樣品溶液，進(jìn)樣量30 μ I ;結(jié)果表明，26.966min時出現(xiàn)單峰，歸一化法得該化合物純度為99.2% (圖1)。
[0037]4.結(jié)構(gòu)鑒定
[0038]4.1HPLC法色譜條件同3.2項下，分別取樣品和蛇床子素對照品溶液，進(jìn)樣量30 μ 1，比對保留時間和紫外全波長掃描特征譜圖，樣品和蛇床子素對照品保留時間一致，紫外全波長掃描圖譜重疊(圖2)，初步判斷該化合物為蛇床子素。
[0039]4.2LC-MS 法色譜條件:poroshell 1205B-C18 (150 X 3.0mm 2.7micron)(p.η.683975-302)色譜柱；Gas Temp:350 °C Drying Gas:9L/min Nebulizer:35psiVcap: 4000V Fragmentor: 175V Skimmer:65V OctlRF Vpp: 750V ;流動相:乙臆-水，流速:
0.4ml/min，柱溫:40°C，檢測波長:302nm、322nm。結(jié)果:測得該化合物MW = 244.1172(圖
3)，分子式為C15H1603，結(jié)合文獻(xiàn)推測該結(jié)晶為蛇床子素。
[0040]5.結(jié)論
[0041]本法制得的獨(dú)活活性單體化合物為蛇床子素，純度達(dá)99%。
[0042]二、獨(dú)活香豆素活性單體對A β 25_35誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用
[0043]1.材料與方法
[0044]1.1動物:出生3天的乳鼠(昆明種小鼠)，購自大連醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，合格證號:SCXK (遼):2008-0002。[0045]1.2主要試劑:DMEM高糖培養(yǎng)基，Hyclone公司；胎牛血清，Gibco公司；Α β 25_35多肽，北京博奧森生物技術(shù)有限公司；兔抗小鼠中分子量神經(jīng)絲蛋白(NF-M)抗體，Stem-CellTechnologies ;FITC 標(biāo)記羊抗兔 IgG, Jackson ImmunoResearch ;LDH試劑盒,南京建成生物工程研究所；DAP1、H0echst33258、多聚賴氨酸，Sigma公司；陽性對照藥丹酚酸B (Sal B)，美國Sigma公司。
[0046]1.3儀器:酶標(biāo)儀(MR-96A)，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；紫外可見分光光度計(UV-1800)，北京瑞利分析儀器公司；超低溫冰箱(DW-86L386)，青島海爾電器有限公司；倒置熒光顯微鏡(CKX41-F32FL) ,Olympus株式會社；Image J分析軟件，美國NIH ;二氧化碳培養(yǎng)箱(BPN-150CW)，上海一恒科技有限公司。
[0047]1.4 方法:
[0048]1.4.1小鼠皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng)與純化:分離新生乳鼠大腦皮層，剪碎、消化、過100 μ m細(xì)胞篩網(wǎng)，制備單細(xì)胞懸液；以6 X IOVmL細(xì)胞密度接種于多聚賴氨酸包被的96孔板中，加入含10%胎牛血清、青霉素(100U/mL)、鏈霉素(lOOyg/mL)的DMEM高糖培養(yǎng)基，37°C,5% CO2培養(yǎng)，每3天換液I次；第5天時加入阿糖胞苷(終濃度為2.5 μ mol/L, 24h)抑制膠質(zhì)細(xì)胞生長，第12天時神經(jīng)元成熟，用于實驗[9]。 [0049]1.4.2免疫熒光化學(xué)法鑒定神經(jīng)元:用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30min，PBS洗3次；加入 0.1% Triton X-100 通透 15min，PBS 洗 3 次；加入一抗稀釋液(NF-M，I: 100)，4°C孵育過夜；次晨PBS洗3次，加入FITC標(biāo)記二抗稀釋液(I: 200, green)，室溫孵育30min，PBS洗3次；滴加含有DAPI的封片劑封片，倒置熒光顯微鏡下觀察，Image J cell counter計數(shù)NF-M+細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)(DAPI+)的百分比[1°]。
[0050]1.4.3Αβ 25_35損傷神經(jīng)元和獨(dú)活香豆素活性單體的干預(yù):將Αβ 25_35干粉溶于三蒸水(1000ymol/L)，37°C孵育7天成聚合態(tài)[11]。向培養(yǎng)神經(jīng)元的96孔板中分別加入八325_35(3(^11101/1)、不同濃度獨(dú)活香豆素活性單體(^11016(0、10、50、100、150、50(^8/mL)和陽性對照藥丹酚酸B (Sal B)，共同孵育24h后，光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，并用于以下檢測。
[0051]1.4.4MTT法檢測細(xì)胞活率:將MTT液加入96孔板中(10 μ L/孔)，37°C孵育4h，棄去含MTT的培養(yǎng)基，加入二甲亞砜(150 μ L/孔)，Ih后用酶標(biāo)儀測定492nm處吸光度值。設(shè)空白組吸光度值為100%，其余各組與之相比得相對細(xì)胞活率[12]。
[0052]1.4.5LDH的測定:取各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按LDH測定試劑盒說明書操作，用紫外-可見分光光度計于450nm下測定吸光度值[12]。
[0053]1.4.6Hoechst33258染色檢測凋亡細(xì)胞核:各組細(xì)胞用4%多聚甲醛固定、0.1 %Triton X-100 通透后，再加入 Hoechst33258 (0.5 μ g/mL, ρΗ7.4)室溫下 30min, PBS 洗滌、封片，倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核改變[13]。Image J cell counter計數(shù)凋亡細(xì)胞百分比
[14]
O
[0054]1.4.7統(tǒng)計學(xué)處理:結(jié)果以均值土標(biāo)準(zhǔn)差(f 士50表示，采用SPSS15.0軟件完成統(tǒng)計處理，各組間比較采用t檢驗。
[0055]2.結(jié)果
[0056]2.1神經(jīng)元鑒定:原代培養(yǎng)至第12天時神經(jīng)元呈成熟狀態(tài)，免疫熒光染色結(jié)果顯示NF-M+細(xì)胞數(shù)占DAPI+細(xì)胞總數(shù)90%以上(圖4)。[0057]2.2獨(dú)活香豆素活性單體對A β 25_35損傷神經(jīng)元的保護(hù)作用
[0058]與正常組相比，經(jīng)A β 25_35處理的神經(jīng)元數(shù)量減少，胞體縮小，軸突縮短或消失；加入獨(dú)活香豆素活性單體Osthole (100 μ g/mL)共孵育24h后神經(jīng)元數(shù)量明顯增多，胞體明顯增大，軸突明顯增長，生長狀態(tài)明顯好于A β25_35模型組(圖5)。
[0059]MTT法檢測結(jié)果顯示，Aβ 25_35處理后的神經(jīng)元活率明顯降低(49% )，而Osthole能劑量依賴性地提高細(xì)胞活力，在100 μ g/mL時
[0060]使活率達(dá)89.8%，顯著高于A β 25_35模型組(P <0.01)，與陽性對照組丹酚酸B無明顯差異(90.32%)，說明Osthole對Αβ25_35損傷的神經(jīng)元具有保護(hù)作用；但當(dāng)其濃度高達(dá)500 μ g/mL時，細(xì)胞活率降至26.2%，說明過高濃度Osthole具有一定細(xì)胞毒性(圖6)。
[0061]LDH檢測結(jié)果顯示，A β25_35模型組細(xì)胞LDH釋放量為正常組的2倍(207% )，與Osthole共孵育使LDH水平明顯下降，在100 μ g/mL時使LDH降低最明顯(125% )，與模型組比較差異顯著(P < 0.01)，與陽性對照藥丹酚酸B組無明顯差異，但500 μ g/mL時又使LDH明顯升高(254% )，說明過高濃度Osthole導(dǎo)致神經(jīng)元損害(圖7)。
[0062]2.3獨(dú)活香豆素活性單體抑制A β 25_35誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡
[0063]Hoechst33258染色結(jié)果顯示，Αβ25_35&理后，以皺縮、明亮為特征的凋亡細(xì)胞核明顯增多(27%，如箭頭所指)，而與Osthole共孵育組凋亡核明顯減少，其中Osthole濃度為100 μ g/mL時凋亡細(xì)胞百分率最低(17% ),說明Osthole能顯著抑制A β 25_35誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡(圖8，圖9)。
[0064]3.結(jié)論
[0065]獨(dú)活香豆素活性單體能使Αβ25_35損傷神經(jīng)元的生長狀態(tài)明顯好轉(zhuǎn)，存活率明顯提高，LDH釋放量和凋亡數(shù)目明顯減少，有效保護(hù)損傷神經(jīng)元，為臨床用于AD的治療奠定基礎(chǔ)。
[0066]三、獨(dú)活香豆素活性單體對AD動物模型的治療作用
[0067]1.材料與方法
[0068]1.1動物模型:APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠購自南京模式動物中心，攜帶突變的APP及PSl基因，表現(xiàn)了人類AD的主要病理變化，有記憶力缺失(3月齡)及老年斑(5月齡)等出現(xiàn)，是研究AD的理想動物模型。同種野生型C57BL/6J小鼠為正常對照組(WT)。
[0069]1.2主要試劑、藥品與儀器:吲哚美辛片(國藥準(zhǔn)字H13023005)，河北億能普藥業(yè)有限公司；丹參顆粒劑(國藥準(zhǔn)字Z61021162)，陜西奧星制藥有限公司；IL-1、IL-6、TNF-a Elisa試劑盒，美國R&D公司；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、乙酰膽堿酯酶(AchE)檢測試劑盒，南京建成生物工程研究所；H0echst33258，美國Sigma公司；酶標(biāo)儀(MR-96A)，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；超低溫冰箱(DW-86L386)，青島海爾電器有限公司；倒置熒光顯微鏡(CKX41-F32FL)，Olympus株式會社；Image J分析軟件，美國NIH ;M0rris水迷宮儀，成都儀器廠。獨(dú)活醇提物(2kg獨(dú)活干燥根，粉碎后用95%乙醇回流提取3次，回收乙醇至無醇味，減壓濃縮提取液至含生藥1.5g/ml)。
[0070]1.3 方法:
[0071]1.3.1AD模型小鼠分組及給藥取7月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠，隨機(jī)分為TCA治療組、陽性藥對照組和模型對照組，10只/組，治療組分別灌胃高、中、低劑量獨(dú)活香豆素活性單體Osthole (25、50、100mg/kg);獨(dú)活醇提物組每日灌服12ml/kg體重(相當(dāng)含生藥18g/kg) [15];陽性對照組分別灌胃丹參(5mg/kg)、吲哚美辛(20mg/kg)，根據(jù)成人臨床用量換算為小鼠等效劑量；模型對照組灌胃等量生理鹽水。每日給藥一次，連續(xù)給藥6周。另取同種野生型C57BL/6J小鼠15只為正常對照組(WT)，不予任何處理。
[0072]1.3.2Morris水迷宮實驗用于測量AD小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。實驗系統(tǒng)由水迷宮裝置、圖像自動采集和處理分析系統(tǒng)組成。水迷宮池分為四個象限，每天在4個象限各訓(xùn)練I次，訓(xùn)練時將小鼠從任一象限1/2弧度處面向池壁輕放于水中，其游泳圖像經(jīng)拍攝系統(tǒng)采集、分析，可提供潛伏期(即從入水點(diǎn)找到平臺所用時間)、路徑、搜索策略等指標(biāo)，本實驗選用潛伏期和游泳路徑作為衡量學(xué)習(xí)和記憶能力的指標(biāo)，潛伏期和游泳路徑越短，說明小鼠的學(xué)習(xí)、記憶能力越強(qiáng)。于治療后第5周末開始連續(xù)訓(xùn)練，連續(xù)7d，以第7d成績作為測試成績。
[0073]1.3.3AD腦內(nèi)相關(guān)炎癥介質(zhì)、抗氧化指標(biāo)及膽堿酯酶活力的檢測治療6周后處死小鼠，每只小鼠各取一半腦組織，稱重、勻漿、離心后取上清液，按試劑盒操作說明書進(jìn)行以下檢測:①相關(guān)炎癥介質(zhì)IL-l、IL-6、TNF-a含量測定(美國R&D Elisa Kit);②腦組織內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量及膽堿酯酶(AChE)活力測定。
[0074]1.3.4AD腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的檢測治療6周后取各組小鼠的另一半腦組織，，制成冰凍切片，用H0echst33258染色、倒置熒光顯微檢測腦內(nèi)海馬區(qū)凋亡細(xì)胞核數(shù)目，Image Jcell counter計數(shù)凋亡細(xì)胞百分比 (方法同第二部分)。
[0075]通過以上研究揭示獨(dú)活香豆素活性單體Osthole抑制AD免疫炎癥損傷、改善膽堿能神經(jīng)功能、抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用與機(jī)制。
[0076]1.3.5統(tǒng)計學(xué)處理實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差土 S)表示，組間比較采用t檢驗，
多組間比較采用方差分析。
[0077]2.結(jié)果
[0078]2.1獨(dú)活香豆素活性單體改善AD小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力
[0079]經(jīng)過6天Morris水迷宮檢測訓(xùn)練后，第7天測試結(jié)果顯示，模型組小鼠的潛伏期和游泳路徑明顯長于正常組(P < 0.05)，說明AD小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力顯著下降；而獨(dú)活香豆素活性單體Osthole中、高劑量治療6周后使其潛伏期和游泳路徑明顯縮短，與模型組比較差異顯著(P < 0.05)，但仍長于正常組，說明Osthole能使AD小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力明顯提高，但尚未完全恢到正常水平，恢復(fù)程度與吲哚美辛組相似，強(qiáng)于獨(dú)活醇提物組和丹參組。見表1、2。
[0080]表1 AD小鼠給藥前后潛伏期的變化s)
[0081]
【權(quán)利要求】
1.一種獨(dú)活香豆素活性單體，其特征在于該單體為香豆素中的蛇床子素。
2.一種獨(dú)活香豆素活性單體的制備方法，其特征在于包括下述工藝步驟: 取獨(dú)活藥材粉碎，用體積百分比為95%的乙醇回流提取3次，減壓回收95%乙醇，再對濃縮后的提取液依次用溶劑石油醚和乙酸乙酯萃取得到萃取液，合并上述萃取液，經(jīng)減壓回收溶劑，制得60°C溫度下測相對密度為1.0-1.2的浸膏；對浸膏進(jìn)行硅膠柱色譜分離，以石油醚:乙酸乙酯為100:0 — 5:1的混合液梯度洗脫，選取其中10:1梯度分離得到的無色結(jié)晶，即為化合物蛇床子素的結(jié)晶。
3.如權(quán)利要求2所述的一種獨(dú)活香豆素活性單體的制備方法，其特征在于用該方法制備的香豆素單體能治療阿爾茨海默病。
【文檔編號】A61P25/28GK103709134SQ201310568116
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年11月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月15日
【發(fā)明者】楊靜嫻 申請人:遼寧中醫(yī)藥大學(xué)