一種碳納米管復(fù)合基因載體系統(tǒng)及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明構(gòu)建了一種碳納米管復(fù)合基因載體系統(tǒng)，并研究了其有效性、生物相容性、細(xì)胞毒性及轉(zhuǎn)染效率等。本發(fā)明在碳納米管管壁上通過疏水作用結(jié)合聚乙烯亞胺-膽固醇（PEI-Chol）與聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（DSPE-PEG），獲得了碳納米管復(fù)合基因載體系統(tǒng)，具體方法如下：（1）以三乙胺為脫水劑，在無水低溫條件下，利用聚乙烯亞胺以及膽固醇甲酰氯合成聚乙烯亞胺-膽固醇；（2）通過超聲分散法，利用聚乙烯亞胺-膽固醇以及聚乙二醇-二硬脂酰乙醇胺獲得水溶性的陽離子碳納米管復(fù)合系統(tǒng)。本發(fā)明所得的碳納米管復(fù)合系統(tǒng)能夠24h穩(wěn)定均勻分散于磷酸鹽溶液（pH=7.4）、細(xì)胞培養(yǎng)基和血清中；毒性低；有效結(jié)合并濃縮DNA分子；轉(zhuǎn)染率高。
【專利說明】一種碳納米管復(fù)合基因載體系統(tǒng)及其制備方法
(-)【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種碳納米管復(fù)合基因載體系統(tǒng)及其制備方法。
(二)【背景技術(shù)】
[0002]基因治療在先天性及后天性疾病的治療或預(yù)防中，為一項(xiàng)有前景的治療手段。目前，大部分基因的體內(nèi)傳遞方式是靠病毒性載體或非病毒性載體。病毒性載體轉(zhuǎn)染效率雖高，卻存在一些缺陷，包括引起人體的炎癥及免疫反應(yīng)。非病毒性載體包括聚陽離子脂質(zhì)體、陽離子聚合物、納米粒子。雖然非病毒性載體的免疫原性較弱，但抵達(dá)和穿越核膜的能力也弱。因此，尋找一個(gè)低毒性、低免疫原性、高穿胞膜能力的基因載體，勢在必行。
[0003]碳納米管分為單壁碳納米管(SWNTs)和多壁碳納米管(MWNTs)。自1993年Ijima發(fā)現(xiàn)單壁碳納米管以來，單壁碳納米管(SWNTs)因其新穎獨(dú)特的結(jié)構(gòu)、機(jī)械、電子特性在多種領(lǐng)域得到關(guān)注和應(yīng)用。碳納米能任意彎曲，且修飾過的碳納米管能與細(xì)胞膜表面進(jìn)行多點(diǎn)結(jié)合；比表面積大，側(cè)壁能有效攜載多個(gè)分子進(jìn)入細(xì)胞，且?guī)缀鯚o毒性。碳納米管在700~IlOOnm處的近紅外吸收的光學(xué)特性，使其應(yīng)用于光熱治療或基因、化療、影像等多學(xué)科的綜合治療。且經(jīng)過合適修飾后的碳納米管能以“分子針”的形式穿過胞核，且能到達(dá)細(xì)胞核，是一個(gè)具有良好前景的基因載體。
[0004]然而，碳納米管幾乎不溶于所有溶劑，且碳納米管含有催化劑和無定形碳，具有生物不溶性。以上兩點(diǎn)限制了其作為藥物載體在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。目前，已有較多關(guān)于修飾碳納米管以獲得良好溶解性及應(yīng)用價(jià)值的研究報(bào)道，包括共價(jià)修飾方法以及非共價(jià)修飾。共價(jià)修飾通過對碳納米管頭端以及側(cè)壁的化學(xué)反應(yīng)使其接上親水基團(tuán)；共價(jià)修飾雖能極大增加碳納米管的溶解度，但卻會(huì)破壞碳納米管的結(jié)構(gòu)。而非共價(jià)修飾的方法能避免以上缺點(diǎn)。為此，本發(fā)明著力于尋找非共價(jià)修飾碳納米管，力圖設(shè)計(jì)出一種高水溶性、低毒性、高穩(wěn)定性及生物相容性、高轉(zhuǎn)染效率的基因載體系統(tǒng)。
(三)
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是構(gòu)建一種通過非共價(jià)修飾的手段獲得陽離子的碳納米管復(fù)合系統(tǒng)，此方法簡單、易行和高效，且極大增溶了碳納米管，并獲得了高生物相容性、低毒性、高轉(zhuǎn)染效率的基因載體。
[0006]本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
[0007]—種碳納米管復(fù)合基因載體系統(tǒng)，由碳納米管(包括單壁碳納米管和多壁碳納米管)管壁上通過疏水作用結(jié)合聚乙烯亞胺-膽固醇共聚物(PE1-Chol)和聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG)得到，具體由如下方法制得:稱取質(zhì)量之比為1:10~50:1~2的碳納米管、聚乙烯亞胺-膽固醇共聚物和聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，加入適量去離子水，300~60 0w功率超聲波清洗20~60min，得到碳納米管分散液；將碳納米管分散液10000~13000rpm轉(zhuǎn)速離心取上清液，重復(fù)離心，收集上清液于IOOkDa的離心過濾器中，4000rpm離心30~40min，取膜上濃縮液，用去離子水定容，即得所述碳納米管復(fù)合基因載體系統(tǒng)的溶液。
[0008]所述聚乙烯亞胺-膽固醇共聚物(PE1-Chol)具體可由如下方法制得:稱取聚乙烯亞胺，加入適量無水二氯甲烷(用分子篩脫水)和三乙胺的混合溶液，冰浴攪拌混合均勻得到PEI溶液；稱取酰氯膽固醇溶于冰無水二氯甲烷中，將此溶液緩慢滴加到上述PEI溶液中，30min內(nèi)滴加完畢；混合物在冰浴條件下繼續(xù)攪拌反應(yīng)12h。反應(yīng)后的溶液轉(zhuǎn)移至茄形瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)出去溶劑，所得的產(chǎn)物經(jīng)真空干燥后，加入HCl (0.1M)溶液溶解，并用二氯甲烷萃取數(shù)次，以除去未反應(yīng)的酰氯膽固醇；萃取后的水溶液經(jīng)過冷凍干燥后得到白色粉末，即PE1-ChoL。所述的聚乙烯亞胺的分子量為0.6kDa~25kDa，優(yōu)選為0.6KDa~IOKDa ;聚乙烯亞胺與酰氯膽固醇的投料質(zhì)量之比為1000:20~2000，所述DSPE-PEG優(yōu)選為 DSPE-PEG2(I(I(I。所述的聚乙烯亞胺為 PEI600，PEI1800，PEI10000 或 PEI25000 時(shí)，與膽固醇甲酰氯的質(zhì)量之比分別為1000:1000~2000，1000:330~660,1000:60~120，或1000:24 ~48。
[0009]本發(fā)明還涉及一種制備所述碳納米管復(fù)合基因載體系統(tǒng)的方法，所述方法如下:稱取質(zhì)量之比為1:10~50:1~2的碳納米管、聚乙烯亞胺-膽固醇共聚物和聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，加入適量去離子水，300~600w功率超聲波清洗20~60min，得到碳納米管分散液；將碳納米管分散液10000~13000rpm轉(zhuǎn)速離心取上清液，重復(fù)離心，收集上清液于IOOkDa的離心過濾器中，4000rpm離心30~40min，取膜上濃縮液，用去離子水定容，即得所述碳納米管復(fù)合基因載體系統(tǒng)的溶液。
[0010]本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在:本發(fā)明用非共價(jià)方法修飾碳納米管，不破壞碳納米管的結(jié)構(gòu)，工藝溫和，操作簡單易控制。且以非共價(jià)修飾的方法構(gòu)建陽離子碳納米管是首次提出，此方法可充分利用碳納米管極大的比表面積，可彈性調(diào)節(jié)PE1-Chol的投料量，從而獲得不同的轉(zhuǎn)染效率。本發(fā)明得到的碳納米管復(fù)合基因載體系統(tǒng)能夠在磷酸鹽緩沖液、細(xì)胞培養(yǎng)基以及血清中穩(wěn)定分散，不易聚集或沉降；生物相容性好，毒性低；能夠濃縮并保護(hù)質(zhì)粒DNA，成功轉(zhuǎn)染L929細(xì)胞及HEK293細(xì)胞；攜載siRNA，結(jié)合激光治療還可以發(fā)揮出更為優(yōu)秀的抗腫瘤效果。
(四)【專利附圖】

【附圖說明】`
[0011]圖1是實(shí)施例1所制備的PE1-Chol的合成過程，以PEI1800為例。
[0012]圖2是實(shí)施例1所制備的四種PE1-Chol的傅立葉紅外光譜圖譜、核磁共振圖譜。其中，A 為膽固醇甲酰氯、B 為 PEI600-Chol、C 為 PEI1800_Chol、D 為 PEI1000O-Chol、E 為PEI25000-Chol。
[0013]圖3是實(shí)施例1所制備的四種PE1-Chol的核磁共振圖譜。其中，A為PE1-Chol結(jié)構(gòu)圖，將氫信號(hào)編號(hào)。B 為 PEI600-Chol、C 為 PEI1800_Chol、D 為 PEI 10000-Chol、E 為PEI25000-Chol。
[0014]圖4是實(shí)施例1制備的PE1-Chol的緩沖能力的測定結(jié)果圖。
[0015]圖5是實(shí)施例2所制備的碳納米管復(fù)合系統(tǒng)分散液的透射電鏡圖，以PEI 1800-Chol/DSPE-PEG/SWNTs為例。A圖為未修飾的原始碳納米管(Hipco SffNTs), B圖為PEI1800-Chol/DSPE-PEG/SWNTs，C圖為四種含不同分子量PE1-Chol的碳納米管超聲后的圖片。[0016]圖6是碳納米管復(fù)合系統(tǒng)用不同介質(zhì)中放置24h后的圖，以PEI1800-Chol/DSPE-PEG/SWNTs為例。不同介質(zhì)從左至右，依次為水、磷酸鹽緩沖液(PBS，pH=7.4)、含10%胎牛血清的DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)基、100%的小牛血清。其中，A圖為PEI 1800-Chol/DSPE-PEG/SffNTS, B 圖為 PEI1800-Chol/SWNTs。
[0017]圖7是碳納米管復(fù)合系統(tǒng)的24h細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0018]圖8是碳納米管復(fù)合系統(tǒng)的體外轉(zhuǎn)染試驗(yàn)結(jié)果圖，以PEI 1800-Chol/DSPE-PEG/SffNTs為例。
[0019]圖9是碳納米管復(fù)合系統(tǒng)的24h細(xì)胞內(nèi)定位試驗(yàn)的CLSM結(jié)果圖，以PEI 1800-Chol/DSPE-PEG/SWNTs 為例。
[0020]圖10是碳納米管復(fù)合系統(tǒng)與cy3_DNA形成核酸載體復(fù)合物后，通過尾靜脈注射24h的活體成像圖。A圖為碳納米管/核酸組，B圖為裸cy3-DNA組。
(五)【具體實(shí)施方式】
[0021]下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此:
[0022]實(shí)施例1:聚乙烯亞胺-膽固醇的合成
[0023]分別稱取不同分子量的分枝狀聚乙烯亞胺(0.6kDa, 1.8kDa, IOkDa, 25kDa)各lg,置于50mL的圓底燒瓶中，加入IOmL無水二氯甲烷(用分子篩脫水)和IOOuL三乙胺的混合溶液，冰浴攪拌30m in得到PEI溶液；稱取酰氯膽固醇分別為1000、330、60、24mg，溶于5mL冰無水二氯甲烷中，將此溶液緩慢滴加到上述PEI溶液中，30min內(nèi)滴加完畢；混合物在冰浴條件下繼續(xù)攪拌反應(yīng)12h。反應(yīng)后的溶液轉(zhuǎn)移至茄形瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑。所得的產(chǎn)物經(jīng)真空干燥后，加入50mL HCl (0.1M)溶解，并用IOOmL 二氯甲烷萃取3次，以除去未反應(yīng)的酰氯膽固醇；萃取后的水溶液經(jīng)過冷凍干燥后得到白色粉末，即PE1-Chol，-20°C儲(chǔ)存。其合成過程以PEI1800為例，參見見圖1。
[0024]PEI600，1800，10000，25000Da 與膽固醇甲酰氯的反應(yīng)率分別為 87.5%,92.8%,
89.1%, 93.2%。
[0025]實(shí)施例2:碳納米管復(fù)合系統(tǒng)的制備
[0026]分別稱取Img單壁碳納米管(timesnano)或Img多壁碳納米管(南京先豐納米材料科技有限公司)、10~50mg實(shí)施例1中制備的PE1-Chol (用量分別為:PEI600-Chol50mg，PEI1800-Chol30mg, PEI10000_Chol20mg，PEI25000_Choll0mg)以及 2mg DSPE-PEG2000 (西安瑞禧生物科技有限公司)于50mL的圓底燒瓶中，再加入5mL的去離子水蒸餾水，在功率為300~600w的超聲波清洗其中超聲30min以上。取碳納米管分散液，10000~13000rpm轉(zhuǎn)速離心30min后取上清，棄碳納米管聚集體，離心取上清，重復(fù)離心3次，收集上清于IOOkDa的離心過濾器(Millipore)中，離心洗漆,離心轉(zhuǎn)速為4000rpm, 30min以上,棄去游離的聚合物分子，轉(zhuǎn)移膜上濃縮液，用去離子水定容至5mL，分別得到四種PE1-Chol/DSPE-PEG/SffNTs 和四種 PE1-Chol/DSPE-PEG/MWNTs 的溶液。
[0027]實(shí)施例3:聚乙烯亞胺-膽固醇的表征
[0028]取實(shí)施例1所得的PE1-Chol，分別用IR、1H_NMR表征其官能團(tuán)與化學(xué)結(jié)構(gòu)；利用鹽酸進(jìn)行電位滴定，測定其緩沖能力。IR結(jié)果如圖2所示，3300 - 3500(3!^1附近的-NH吸收峰為PE1-Chol的-NH2的伸縮振動(dòng)峰:29000^1峰代表亞甲基C-H伸縮振動(dòng)，表明聚合物PEI中存在有-NH-和CH2-;圖2A中的1776(^1是C=O鍵的吸收峰，因?yàn)槟懝檀技柞Ｂ戎新仍拥奈娮诱T導(dǎo)效應(yīng)，使羰基吸收峰的位置向高頻方向移動(dòng)；圖2B-E中的羰基吸收峰為1650CHT1處，這表明膽固醇甲酰氯中的C=O中的-Cl被PEI中的氨基取代而形成酰胺鍵，吸收峰發(fā)生向低頻區(qū)遷移。IH-NMR (500MHz, D2O)結(jié)果如圖3所示，A~D依次是 PEI600-Chol、PEI 1800-Chol、PEI 10000-Chol、PEI25000-Chol。根據(jù)聚合物中 δ ~2.50-3.60ppm (N-CH2CH2-N, PEI)和 δ ~4.50ppm (-CH-C00)中相關(guān)氫的積分面積之比，計(jì)算出聚合物中兩組分的摩爾比，結(jié)果可知，四種聚合物的兩組分摩爾比分別為2.23/1、2.01/1、1.02/1、1.06/1。緩沖性能的測定結(jié)果如圖4所示。在ρΗ3.87~6.87之間，PEI的分子量越長，聚合物PE1-Chol的緩沖能力相對較大。
[0029]實(shí)施例4:碳納米管復(fù)合系統(tǒng)不同介質(zhì)中的分散性、生物相容性及穩(wěn)定性研究
[0030]圖5中的C圖為碳納米管復(fù)合系統(tǒng)PE1-Chol/DSPE-PEG/SWNTs的溶液圖，由C圖可知，碳納米管被極大地增溶，故而，溶液顏色非常深。另取PEI 1800-Chol/DSPE-PEG/SWNTs的水溶液10 μ L，滴于銅網(wǎng)上，充分揮干后進(jìn)行TEM測定。TEM結(jié)果如圖5所示，圖A為原始Hipco SffNTs,管子較長，并聚集團(tuán)繞，分散性差。圖B為經(jīng)PEI1800-Chol和DSPE-PEG2ciqq修飾后的碳納米管。管子長度明顯縮短，且呈單根分散。可見，碳納米管被成功修飾，能極大溶解于水溶液中、分散性也得到極大增加。取上述水溶液、僅由PEI 1800-Chol修飾的碳納米管水溶液少量，分別用去離子水、磷酸鹽緩沖液(pH=7.4)、DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)基+10%胎牛血清、100%小牛血清稀釋，靜置24h，觀察碳納米管是否絮集、沉降。結(jié)果如圖6所示，A圖為復(fù)合系統(tǒng)在上述四種介質(zhì)中24h保持穩(wěn)定，不發(fā)生絮集、沉降。B圖為僅由PEI1800-Chol修飾的碳納米管，在DMEM+10%胎牛血清、100%小牛血清的介質(zhì)中均不穩(wěn)定，24h后均發(fā)生絮集沉降?？梢姡珼SPE-PEG2_能顯著增加系統(tǒng)的穩(wěn)定性和生物相容性，是體系中必要的組分。
[0031]實(shí)施例5:碳納米管復(fù)合系統(tǒng)濃度測定
[0032]取實(shí)施例2中的PE1-Chol/DSPE-PEG/SWNTs剛超聲結(jié)束后的水分散液和最終的碳納米管溶液，取定量稀釋100倍后，進(jìn)行`紫外-可見吸收光譜(300-1100nm)測定，因?yàn)镻E1-Chol與DSPE-PEG均無紫外吸收。取兩者500nm處的吸光度比值，從而計(jì)算出四種復(fù)合系統(tǒng)的碳納米管含量約為最初碳納米管水分散液的48.93% (PEI600-Chol/DSPE-PEG/SffNTs),57.6% (PEI1800-Chol/DSPE-PEG/SWNTs),43.68% (PEI10000-Chol/DSPE-PEG/SffNTs),45.08% (PEI25000-Chol/DSPE-PEG/SWNTs)。
[0033]實(shí)施例6:碳納米管復(fù)合系統(tǒng)體外細(xì)胞毒性研究
[0034]MTT法檢測碳納米管復(fù)合系統(tǒng)對細(xì)胞的24h毒性。取100 μ L的L929細(xì)胞培養(yǎng)液按3000個(gè)/孔的密度接種于96孔板，于37°C，5%C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞貼壁率達(dá)到70%時(shí)，用PBS細(xì)胞培養(yǎng)液配制四種碳納米管(PE1-Chol/DSPE-PEG/SWNTs，實(shí)施例2制備)溶液，分別加入到含有細(xì)胞的孔中，不加藥孔作為空白對照，每個(gè)濃度平行6個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24h，用倒板法棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗兩三次，去掉未入胞的碳納米管材料(碳納米管在570nm處有紫外吸收)，分別加入31.5 μ L的MTT溶液(5mg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄去培養(yǎng)液，加入200 μ L DMS0，孵育IOmin后，吸出每孔的DMSO溶液，用酶標(biāo)儀570nm條件下測定其吸光度，各濃度復(fù)孔的吸光度取平均值。以空白組的細(xì)胞存活率為100%，并通過公式(2)計(jì)算各濃度梯度條件下細(xì)胞的存活率:[0035]細(xì)胞存活率％=(Asample/Acontrol) *100%
[0036]Asample-實(shí)驗(yàn)組吸光值
[0037]Acontrol——對照組吸光值
[0038]結(jié)果見圖7。四種碳納米管系統(tǒng)的細(xì)胞存活率隨濃度增大而減小，即毒性增大，PEI25000-Chol/DSPE-PEG/SWNTs 系統(tǒng)的毒性較大。
[0039]實(shí)施例7:碳納米管復(fù)合系統(tǒng)與DNA結(jié)合后的體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)
[0040]在超凈臺(tái)內(nèi)，將L929細(xì)胞按每孔I X IO5個(gè)細(xì)胞接種到放好蓋玻片的24孔板中，每個(gè)孔的培養(yǎng)液體積為lmL。將24孔板于細(xì)胞培養(yǎng)箱中37°C、5%C02條件下的培育18h。。吸取4 μ L標(biāo)記的碳納米管復(fù)合系統(tǒng)(PEI1800-Chol/DSPE-PL/SWNTs，實(shí)施例2制備，250 μ g/mL)溶液于無雙抗的1640培養(yǎng)基中，吸取0.8μ g的pCCl (Hollis,Roger)于無雙抗無血清的1640培養(yǎng)基中，靜置5s后，將載體溶液滴入質(zhì)粒溶液中，分別混合均勻，室溫靜置30min孵育。吸去24孔板內(nèi)的培養(yǎng)液，然后在每孔中分別加入碳納米管質(zhì)粒復(fù)合物，加無FBS的RMPI1640培養(yǎng)基補(bǔ)至每孔總體積為500 μ L，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中37°C、5%C02條件下的培育。轉(zhuǎn)染6h后，棄去培養(yǎng)基，加入含10%CS的1640培養(yǎng)基lmL，繼續(xù)培養(yǎng)42h后。熒光倒置顯微鏡(Leica DMI4000H,Germany)觀察碳納米管復(fù)合系統(tǒng)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，觀測GFP的綠色熒光結(jié)果如圖8所示，表明此復(fù)合系統(tǒng)可成功轉(zhuǎn)染L929細(xì)胞。
[0041]實(shí)施例8:碳納米管復(fù)合系統(tǒng)的細(xì)胞內(nèi)定位實(shí)驗(yàn)
[0042]在超凈臺(tái)內(nèi)，將無菌的蓋玻片放于6孔板內(nèi)，每孔I片。將L929細(xì)胞按每孔I X IO5個(gè)細(xì)胞接種到放好蓋玻片的6孔板中，每個(gè)孔的培養(yǎng)液體積為2mL。將6孔板于細(xì)胞培養(yǎng)箱中37°C、5%C02條件下的培育24h，使細(xì)胞爬片生長。FITC預(yù)先標(biāo)記PE1-Chol，用此熒光標(biāo)記的PE1-Chol按照實(shí)施例2制備碳納米管復(fù)合系統(tǒng)(PEI1800-Chol/DSPE-PEG/SWNTs)。并吸取16 μ L標(biāo)記的碳納米管復(fù)合系統(tǒng)(250 μ g/mL)與pCMV質(zhì)粒(4μ g)分別混合均勻，室溫靜置60min孵育。吸去6孔板內(nèi)的培養(yǎng)液，然后在每孔中分別加入碳納米管質(zhì)粒復(fù)合物，加無FBS的RMPI1640培養(yǎng)基補(bǔ)至每孔總體積為lmL，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中37°C、5%C02條件下的培育。轉(zhuǎn)染4h后，加入含10%FBS的培養(yǎng)基lmL，繼續(xù)培養(yǎng)8h后，棄去培養(yǎng)基，加入含10%FBS的培養(yǎng)基2mL，繼續(xù)培養(yǎng)12h后。然后除去培養(yǎng)基，用2mL PBS沖洗蓋玻片3次，每孔中加入1.5mL4%的多聚甲醛溶液，室溫下固定30min。吸除多聚甲醛溶液，PBS洗3次，加入1.5mL10 μ g/mL的Hoechest33342溶液，室溫下染色15min,用PBS沖洗3次，然后取出蓋玻片，滴加一滴含甘油水溶液(1/1，V/V),置于載玻片上封片。激光共聚焦顯微鏡(CLSM)觀察標(biāo)記的碳納米管復(fù)合系統(tǒng)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，分別采用488nm和405nm兩個(gè)激發(fā)波長分別觀測FITC的綠色熒光和H0echeSt33342的藍(lán)色熒光。結(jié)果如圖9所示，綠色熒光散落在核中，由此可見，附著在碳納米管上的PE1-Chol可以運(yùn)載質(zhì)粒，進(jìn)入核中。
[0043]實(shí)施例8:碳納米管復(fù)合系統(tǒng)的體內(nèi)分布
[0044]以cy3-DNA 為模型藥物，取 PEI1800-Chol/DSPE_PEG/SWNTs50uL，與 3nmol 的cy3-DNA的50uL的PBS溶液混合，避光靜置30min后，通過尾靜脈注入小鼠體內(nèi)。等體積等濃度裸cy3-DNA作為治療對照組。24h后觀察，如圖10可見，裸cy3_DNA幾乎已不存在小鼠內(nèi)臟，而碳納米管系統(tǒng)能保護(hù)DNA。
【權(quán)利要求】
1.一種碳納米管復(fù)合基因載體系統(tǒng)，由碳納米管管壁上通過疏水作用結(jié)合聚乙烯亞胺-膽固醇共聚物和聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺得到，具體由如下方法制得:稱取質(zhì)量之比為1:10~50:1~2的碳納米管、聚乙烯亞胺-膽固醇共聚物和聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，加入適量去離子水，300~600w功率超聲波清洗20~60min,得到碳納米管分散液；將碳納米管分散液10000~13000rpm轉(zhuǎn)速離心取上清液，重復(fù)離心，收集上清液于IOOkDa的離心過濾器中，4000rpm離心30~40min,取膜上濃縮液,用去離子水定容，即得所述碳納米管復(fù)合基因載體系統(tǒng)的溶液。
2.制備權(quán)利要求1所述碳納米管復(fù)合基因載體系統(tǒng)的方法，所述方法如下:稱取質(zhì)量之比為1:10~50:1~2的碳納米管、聚乙烯亞胺-膽固醇共聚物和聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，加入適量去離子水，300~600w功率超聲波清洗20~60min，得到碳納米管分散液；將碳納米管分散液10000~13000rpm轉(zhuǎn)速離心取上清液，重復(fù)離心，收集上清液于IOOkDa的離心過濾器中，4000rpm離心30~40min,取膜上濃縮液,用去離子水定容，即得所述碳納米管復(fù)合基因載體系統(tǒng)的溶液`。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK103877580SQ201310558175
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2013年11月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月11日
【發(fā)明者】金 一, 孔芬芬, 沈松, 王成潤 申請人:浙江大學(xué)