Gm-csf受體結合元件的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了粒細胞巨噬細胞集落刺激因子受體(GM-CSFR)的α鏈的結合元件，尤其抗體分子。本發(fā)明還公開了所述結合元件在治療如風濕性關節(jié)炎、哮喘、過敏反應、多發(fā)性硬化、髓系白血病和動脈硬化的炎性和自體免疫疾病中的應用。
【專利說明】GM-CSF受體結合元件
[0001]本申請是申請日為2007年03月27日和發(fā)明名稱為“GM-CSF受體結合元件”的200780015416.9號發(fā)明專利申請的分案申請。
【技術領域】
[0002]本發(fā)明涉及粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子受體α鏈(GM-CSFRa )的結合元件、尤其涉及抗-GMCSFR a抗體分子。本發(fā)明還涉及這些結合元件在治療GMCSFR α介導的包括風濕性關節(jié)炎、慢性阻塞性肺疾病和多發(fā)性硬化的炎性、呼吸和自體免疫疾病中的應用。
【背景技術】
[0003]GM-CSF為I型促炎細胞因子，其增強包括嗜中性粒細胞、嗜酸性細胞、巨噬細胞及其祖細胞的大范圍造血細胞類型的存活、增殖和/或分化。GM-CSF受體為造血因子(haematopoietin)受體超家族的成員。它是異二聚體，由α和β亞基組成。α亞基為GM-CSF高度特異性的，而β亞基為包括IL3和IL5的其它細胞因子受體所共有。β受體亞基的較廣泛的組織分布反映了這點。α亞基(GM-CSFRa)主要在脊髓細胞和非造血細胞(如嗜中性粒細胞、巨噬細胞、嗜酸性細胞、樹突細胞、內皮細胞和呼吸上皮細胞)上表達。全長GM-CSFRa為400氨基酸的I型膜糖蛋白，其屬于I型細胞因子受體家族，并且包括22個氨基酸的信號肽(1-22位置)、298個氨基酸的細胞外域(23-320位置)、321_345位的跨膜域和55個氨基酸的短的細胞內域。信號肽被切除以產生作為378個氨基酸蛋白的GM-CSFRa的成熟形式。人和鼠的GM-CSFRa的cDNA克隆是可獲得的，并且在蛋白質水平上其受體亞基具有36% —致性。GM-CSFR能夠以相對低的親和力結合單獨的α亞基(Kdl~5nM)，但完全不與單獨的β亞基結合。然而，α和β亞基的同時存在產生高親和性配體-受體復合物(Kd~ Ι ΟΟρΜ)。通過GM-CSF最初結合GM-CSFR α鏈、然后交聯(lián)較大亞基(共用β鏈)以產生高親和相互作用而產生GM-CSF信號發(fā)生，其磷酸化JAT-STAT途徑。在參考文獻[1]中論述了 GM-CSFR與GMCSF的結合。這種相互作用也能夠通過酪氨酸磷酸化和MAP激酶途徑的激活而發(fā)生信號。
[0004]從病理學來說，GM-CSF已顯示在加重炎性、呼吸和自體免疫疾病方面起作用。因而，對GM-CSF與GM-CSFR α結合的中和作用成為治療GM-CSFR介導的疾病和狀態(tài)的治療途徑。
[0005]Nicola等[2]描述了抗人GM-CSFR α的鼠抗體，命名為2Β7-17-Α或“2Β7”，據報道其具有相對高的對人GM-CSFR α的親和性、并且在多個不同的生物試驗中是人GM-CSF生物活性的有效抑制因子?？贵w2Β7可從Chemicon以MAB1037的名稱購得，且MAB1037的產品數據頁注明其為GM-CSF生物活性的有效抑制因子。2B7也在W094 / 09149中公開。

【發(fā)明內容】

[0006]通過利用天然scFv噬菌體庫的選擇、無規(guī)突變誘變和適當設計的生化和生物分析(參見以下試驗部分)的組合，我們已鑒定了結合人GM-CSFRa、并且抑制人GM-CSF在其受體上的作用的高效抗體分子。此處給出的結果說明與已知抗-GM-CSFRα抗體2Β7相t匕，我們的抗體結合GM-CSFRa的不同區(qū)或表位，并且令人驚奇的是，在各種生物試驗中證明甚至比2B7更有效。
[0007]因此，本發(fā)明涉及結合人GM-CSFRa、并且抑制人GM-CSF與GM-CSFRa的結合的結合元件。本發(fā)明的結合元件可能為GM-CSFR的拮抗劑。所述結合元件可能是通過GM-CSFR的GM-CSF信號轉導的競爭性可逆抑制劑。
[0008]本發(fā)明的抗體和其它結合元件在結合和中和GM-CSFRa方面是特別有意義的，因此，如此處包含的實驗研究和其它支持技術文獻所表明的，其在治療GM-CSFRa介導的包括炎癥和自體免疫疾病的疾病方面是有用的。例如，我們已在基于細胞的試驗中證實，本發(fā)明的抗體能夠抑制由天然GM-CSF結合其受體所誘導的細胞因子(如IL-6和TNFa )的釋放。如以下更詳細地解釋的，通過阻斷與GM-CSFR α的結合抑制GM-CSF活性是一種治療如風濕性關節(jié)炎(RA)、哮喘、吸煙誘導的氣道炎癥、慢性阻塞性肺疾病(C0PD)、過敏反應、多發(fā)性硬化(MS)、髓系白血病或動脈硬化的疾病的治療途徑。
[0009]根據本發(fā)明的結合元件通常結合GM-CSFRa的細胞外域。優(yōu)選地，本發(fā)明的結合元件結合位于成熟人GM-CSFRa (SEQ ID No:206)的226~230位的Tyr-Leu-Asp-Phe-Gln(YLDFQ) (SEQ ID NO:201)中至少一個殘基。所述結合元件可以結合人GM-CSFR α的YLDFQ序列中的至少一個殘基，例如其可以結合YLDFQ序列中的一個、兩個、三個或四個殘基。因此，所述結合元件可以識別該序列中的一個或多個殘基，并且任選地，其也可以結合GM-CSFRa細胞外域中的附加側翼殘基或結構相鄰的殘基。
[0010]可以通過任何適當的方法確定結合，例如，可以使用如本發(fā)明其它部分所詳細描述的肽結合掃描，如基于PEPSCAN的酶鏈免疫試驗(ELISA)。在如PEPSCAN系統(tǒng)提供的種類的肽結合掃描中，源自抗原的短重疊肽被系統(tǒng)地針對其與結合元件的結合進行篩選。所述肽可以共價地連接于載體表面，以形成肽陣列。簡言之，肽結合掃描(如“PEPSCAN”)包括鑒定(如使用ELISA)結合元件與其結合的一組肽，其中所述肽具有SEQ ID NO:206的片段(如約15個SEQ ID NO:206的連續(xù)殘基的肽)所相應的氨基酸序列，以及定位(aligning)所述肽以確定結合元件結合的殘基的足跡，其中所述足跡包括與重疊肽共用的殘基。根據本發(fā)明，通過肽結合掃描或PEPSCAN鑒定的足跡可能包括相應于SEQ ID NO:206的226~230位的YLDFQ的至少一個殘基。所述足跡可以包括YLDFQ的一個、兩個、三個、四個或所有殘基。如通過此處描述的肽結合掃描或PEPSCAN方法所確定的，根據本發(fā)明的結合元件可以結合包括一個或多個、優(yōu)選全部相應于SEQID N0:206的226~230位的YLDFQ殘基的SEQ ID NO:206的肽片段(如15個殘基)。因此本發(fā)明的結合元件可以結合具有SEQ IDNO:206的15個連續(xù)殘基的氨基酸序列的肽，其中所述15個殘基序列包括SEQ ID NO:206的226~230位的YLDFQ中的至少一個殘基、或者至少與YLDFQ部分重疊。在本說明書的其它部分詳細描述了用于確定結合的肽結合掃描方法的細節(jié)。本領域中公知的、并且可以用于確定抗體結合的殘基和/或確認肽結合掃描(如PEPSCAN)結果的其它方法包括定點突變、氫氘交換、質譜、NMR和X射線結晶學。
[0011]因此，本發(fā)明的結合元件優(yōu)選地中和GM-CSFRa。中和意味著降低或抑制GM-CSFR α的生物活性，如通過GM-CSFR α介導的反應進行測量顯示GM-CSF與GM-CSFR a的結合、或者通過GM-CSFRa的信號轉導的減少或抑制。生物學活性的降低或抑制可以是部分的或者全部的?？贵w中和GM-CSFRa的程度被稱作其中和效力。所述效力可以使用一種或多種本領域普通技術人員已知的、和/或如此處所描述或引用的試驗進行判斷或測量。例如，結合元件可以在一個或多個以下試驗中具有中和活性:
[0012]?生化配體結合試驗
[0013].TF-1增殖試驗 [0014]?人粒細胞形態(tài)改變試驗
[0015]?獼猴非人靈長類粒細胞形態(tài)改變試驗
[0016]?單核細胞TNFa釋放試驗
[0017]?粒細胞存活試驗
[0018]?集落形成試驗(GM-CSF介導的血細胞祖細胞體外分化的抑制)
[0019]?體內(如具有表達人GM-CSFR的轉基因骨髓的嵌合小鼠)GM-CSF生物活性的抑制
[0020]?外周血單核細胞細胞因子釋放試驗
[0021]除非另有說明，所述效力通常表示為以pM為單位的IC50值。在功能試驗中，IC50為生物反應降低其最大值的50%的濃度。在配體結合研究中，IC50為受體結合降低最大特異結合水平的50%的濃度。通過繪制％最大生物反應(如在增殖試驗中以細胞增殖表示，細胞增殖可以通過以cpm計的3H胸腺嘧啶摻入量測量；在形態(tài)改變試驗中以形態(tài)變化表示釋放試驗中以TNF a釋放表示；在存活試驗中以存活率表示；在集落形成試驗中以集落的數目表示；或者在生物活性測試中以具有表達人GM-CSFR的轉基因骨髓的嵌合小鼠的脾重量增加或循環(huán)單核細胞的減少表示)或作為結合元件濃度的對數函數的％特異性受體結合圖，并且使用如Prism(GraphPad)的軟件程序將Σ函數與產生IC50值的數據匹配，從而可以計算IC50。
[0022]IC50值可以表示多個測量的平均數。因此，例如，可以由三重試驗的結果獲得IC50值，并且然后可以計算平均IC50值。
[0023]在TF-1增殖試驗中，本發(fā)明的結合元件通常具有不到1500pM的IC50。例如，IC50可以〈300、〈60、〈10或〈1.5pM，如約1.0pM0通常地，IC50為至少0.5或1.0nM。已知的鼠抗體2B7在該試驗中具有約1600pM的IC50。此處使用的TF-1增殖試驗使用7pM的人GM-CSF終濃度。因此，TF-1增殖試驗中的IC50中和效力代表結合元件抑制由7pM人GM-CSF誘導的TF-1細胞增殖的能力。更詳細的內容參見試驗方法和材料部分。
[0024]本發(fā)明的結合元件在TF-1增殖試驗中具有比-6、-7、-8、-9、-10、-10.5或-11更低的pA2。例如，PA2可以為約-10.5或-11。在試驗方法和材料的試驗部分詳細討論PA2值的計算和含義。
[0025]在人粒細胞形態(tài)改變試驗中，本發(fā)明的結合元件通常具有不到IOOpM的IC50，如不到50pM或不到30、25、20、15或IOpM的IC50。通常地，IC50至少為5、6或7pM。作為對照的已知鼠抗體2B7在該試驗中具有477pM的IC50測量值的較低效力。此處使用的人粒細胞形態(tài)改變試驗使用7pM人GM-CSF的終濃度。因此，人粒細胞形態(tài)改變試驗中的IC50中和效力代表結合元件抑制由7pM人GM-CSF誘導的人粒細胞形態(tài)改變的能力。更多的細節(jié)參見試驗方法和材料部分。
[0026]在獼猴粒細胞形態(tài)改變試驗中，本發(fā)明的結合元件通常具有不到20pM的IC50，典型地不到10、5或2.5pM的IC50。IC50可以至少為0.5、1或1.5pM。已知的鼠抗體2B7在該試驗中測試時具有26pM的IC50。此處使用的獼猴粒細胞形態(tài)改變試驗具有7pM人GM-CSF終濃度。因此，獼猴粒細胞形態(tài)改變試驗中的IC50中和效力代表結合元件抑制由7pM人GM-CSF誘導的獼猴粒細胞形態(tài)改變的能力。更詳細的內容參見試驗方法和材料部分。
[0027]本發(fā)明的結合元件在人和/或獼猴形態(tài)改變試驗中具有比-6、-7、-8、-9、-10、-10.5 或-11 更低的 pA2。優(yōu)選地，pA2 為約-10 或-11。
[0028]在單核細胞TNFa釋放試驗中，本發(fā)明的結合元件通常具有不到150pM的IC50，典型地不到ΙΙΟρΜ，如不到100pM。IC50可以至少為30或40pM。此處使用的單核細胞TNF a釋放試驗具有InM人GM-CSF終濃度。因此，單核細胞TNF α釋放試驗中的IC50中和效力代表結合元件抑制由InM人GM-CSF刺激的人單核細胞TNFa釋放的能力。更詳細的內容參見試驗方法和材料部分。
[0029]在粒細胞存活試驗中，本發(fā)明的結合元件通常具有不到ΙΟΟΟρΜ的IC50，典型地不到 850pM 的 IC50。IC50 可以小于 500、250、150、100、50、30、20 或 10pM。IC50 可以至少為5pM。在該試驗中，已知的鼠抗體2B7直到83nM濃度仍為無活性的。此處使用的粒細胞存活試驗具有7pM人GM-CSF終濃度。因此，粒細胞存活試驗中的IC50中和效力代表結合元件抑制由7pM人GM-CSF誘導的粒細胞存活的能力。更詳細的內容參見試驗方法和材料部分。
[0030]在集落形成試驗中，本發(fā)明的結合元件可能具有不到5、不到2.5、不到1或不到0.3μ g / ml 的 IC50。優(yōu)選地，IC50 為(λ 25 μ g / ml 或更低，如不到(λ 1 μ g / ml。IC50可以至少為0.05 μ g / ml ο在該試驗中，已知鼠抗體2B7直到10 μ g / ml (67nM)仍具有很低的活性(如果有的話)。此處使用的集`落形成試驗使用10ng / ml人GM-CSF終濃度。因此，集落形成試驗中的IC50中和效力代表結合元件抑制由10ng / ml人GM-CSF誘導的集落形成的能力。更詳細的內容參見試驗方法和材料部分。
[0031]本發(fā)明的結合元件可以顯示出劑量依賴性地抑制具有表達人GM-CSFR的轉基因骨髓的嵌合鼠用人GM-CSF處理后的脾重量增加和/或抑制GM-CSF誘導的循環(huán)單核細胞降低的能力。抑制脾重量增加的IC50可以不到5、不到2.5、不到2、不到1或不到0.75mg /kg。在一些實施方式中IC50可以至少為0.5mg / kg。
[0032]此外，結合元件對人GM-CSFR α的結合動力學和親和性可以通過表面等離子共振(如使用BIAcore)測定。本發(fā)明的結合元件通常具有不到5nM、更優(yōu)選地不到4、3、2或InM的 KD。優(yōu)選地，KD 為不到 0.9,0.8,0.7,0.6,0.5,0.4,0.3,0.2 或 0.15nM。
[0033]除人GM-CSFR α外，本發(fā)明的結合元件通常結合如獼猴GM-CSFR α的非人靈長類GM-CSFRa。因為人和鼠GM-CSF受體之間具有低同源性(約36% )，因此，本發(fā)明的結合元件一般不與鼠受體結合或發(fā)生交叉反應。
[0034]如以下更詳細說明的，通常地，本發(fā)明的結合元件包括如完整抗體或抗體片段的抗體分子。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體分子為人抗體分子。
[0035]本發(fā)明的結合元件通常包括抗體VH和VL域。結合元件的VH域和VL域也作為本發(fā)明的一部分被提供。互補決定區(qū)(“⑶R”)和框架區(qū)(“FR”)在各個VH和VL域內。VH域包括一組HCDR，且VL域包括一組IXDR?？贵w分子典型地包括包含VH⑶Rl XDR2和⑶R3及框架的抗體VH域。其可以替代地或同時包括含VL⑶R1XDR2和⑶R3及框架的抗體VL域。VH或VL域框架包括以下結構的用⑶R間隔的四個框架區(qū)FR1、FR2、FR3和FR4:
[0036]FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
[0037]根據本發(fā)明的抗體VH和VL域、FR和CDR的例子列于形成本公開內容的一部分的附加序列表中。所有此處公開的VH和VL序列、⑶R序列、⑶R組和HCDR組及IXDR組代表本發(fā)明的多個方面和實施方式。因此，本發(fā)明的一方面為根據本發(fā)明的結合元件的VH域。“CDR 組”包括 CDR1、CDR2 和 CDR3。因此，HCDR 組意味著 HCDR1、HCDR2 和 HCDR3，LCDR 組意味著IXDR1、IXDR2和IXDR3。除非另有說明，“⑶R組”包括HCDR和IXDR。本發(fā)明的結合元件典型地為單克隆抗體(mAb)。
[0038]如試驗部分更詳細地描述的，我們鑒定了結合GM-CSFRa的抗體分子的組(panel)。我們也鑒定了 VH和VL域的互補決定區(qū)(OTR)中對于受體結合和中和效力尤其重要的特定殘基。因為CDR主要負責決定結合元件的結合和特異性，所以如本發(fā)明其它處詳細內容所述，一個或多個具有此處限定的適當殘基的CDR可以用于或引入任何適當框架(如抗體VH和/或VL域框架)或非抗體蛋白質支架(scaffold)內。例如，一個或多個⑶R或抗體的CDR組可以被接合到框架(如人框架)內以提供抗體分子或不同的抗體分子。例如，抗體分子可以包括此處所公開的CDR和人胚系基因片段序列的框架區(qū)?？贵w在可被胚系化(germlining)的框架內具有⑶R組，其中，改變該框架內一個或多個殘基以匹配最相似的人胚系框架內的相應位置處的殘基。因此，優(yōu)選抗體框架區(qū)為胚系的和/或人的。
[0039]按照試驗部分闡述的方法，我們進行了對于抗原識別重要的候選抗體殘基的研究，然后對在生物試驗中顯示出比親本抗體至少高5倍的效力的160個克隆進行了序列分析。結果表明以下位置有助于抗原結合:VL域中的Kabat殘基27A、27B、27C、32、51、52、53、90,92和96，以及VH域中的Kabat殘基17、34、54，57、95、97、99和IOOB0在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，這些Kabat殘基中的一個或多個為其序列在附加序列表中公開的編碼1、2和4~20的一個或多個抗體克隆在該位置出現的Kabat殘基。在各個不同實施方式中，該殘基可以與抗體3中該位置出現的殘基相同或不同。
[0040]我們的分析顯示在CDR中對受體結合有特別強的影響的4個殘基位置:H97、H100B、L90和L92 (Kabat編號)。優(yōu)選地，VH CDR3的H97為S。在所有160個克隆中都觀察到了該位置的絲氨酸殘基，因此其表現為抗原識別的重要殘基。
[0041]優(yōu)選地，VH⑶R3包括一個或多個以下殘基:
[0042]在Kabat殘基H95處的V、N、A或L，最優(yōu)選V ；
[0043]在Kabat殘基H99處的S、F、H、P、T或W，最優(yōu)選S ；
[0044]在Kabat殘基H100B處的A、T、P、S、V或H，最優(yōu)選A或T。
[0045]優(yōu)選地，VH CDRl中的Kabat殘基H34為I。優(yōu)選地VH CDR2包括Kabat殘基H54處的E和/或Kabat殘基H57處的I。
[0046]當結合元件包括抗體VH域時，在VH域框架中的Kabat殘基H17優(yōu)選為S。Kabat殘基H94優(yōu)選地為I或其保守置換(如L、V、A或M)。通常H94為I。
[0047]優(yōu)選地，VL CDR3包括一個或多個以下殘基:
[0048]在Kabat殘基L90處的S、T或M，最優(yōu)選S或T ;
[0049] 在Kabat殘基L92處的D、E、Q、S、M或T，最優(yōu)選D或E ;
[0050]在Kabat殘基L96處的A、P、S、T、1、L、M或V，最優(yōu)選S、P、I或V，尤其是S。[0051 ] 在VL CDR3中的Kabat殘基L95A優(yōu)選為S。
[0052]優(yōu)選地，VL⑶R1包括一個或多個以下殘基:
[0053]在Kabat 殘基 27A 處的 S ;
[0054]在Kabat 殘基 27B 處的 N ;
[0055]在Kabat 殘基 27C 處的 I ;
[0056]在Kabat殘基32處的D。
[0057]優(yōu)選地，VL⑶R2包括一個或多個以下殘基:
[0058]在Kabat殘基51處的N;
[0059]在Kabat殘基52處的N ;
[0060]在Kabat殘基53處的K。
[0061]在優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的結合元件包含一個或多個選自VH和VL⑶R的⑶R，即，序列表所示抗體1、2或4~20中任一個、或親本抗體3的VH⑶Rl、2和/或3和/或VL⑶Rl、2和/或3。在優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的結合元件包含以下抗體分子中任一的VHCDR3:抗體 1(SEQ ID N05);抗體 2 (SEQ ID NO 15);抗體 3 (SEQ ID N025);抗體 4 (SEQ IDN035);抗體 5 (SEQ ID N045);抗體 6 (SEQ ID N055);抗體 7 (SEQ ID N065);抗體 8 (SEQ IDN075);抗體 9 (SEQ ID N 085);抗體 10 (SEQ ID N095);抗體 11 (SEQ ID N0105);抗體 12 (SEQID N0115);抗體 13(SEQ ID N0125);抗體 14(SEQ ID N0135);抗體 15(SEQ ID N0145);抗體 16 (SEQ ID N0155);抗體 17 (SEQ ID N0165);抗體 18 (SEQ ID N0175);抗體 19 (SEQ IDN0185);抗體20 (SEQ ID N0195)。優(yōu)選地，所述結合元件另外包含SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:173 的 VH CDR1 和 / 或 SEQ ID NO:4 的 VH CDR2。優(yōu)選地，包含 SEQ ID NO:175 的 VHCDR3的結合元件包含SEQ ID NO:173的VH CDR1，但可以替代地包含SEQ ID NO:3的VHCDR1。
[0062]優(yōu)選地，所述結合元件包括以下抗體之一的一組VH⑶R:抗體1 (SEQ ID3~5);抗體 2(SEQ ID13 ~15);抗體 3(SEQ ID23 ~25);抗體 4(SEQ ID33 ~35);抗體 5(SEQ ID43 ~45);抗體 6(SEQ ID53 ~55);抗體 7(SEQ ID63 ~65);抗體 8(SEQ ID73 ~75);抗體 9(SEQID83 ~85);抗體 10(SEQ ID93-95);抗體 11(SEQ ID103 ~105);抗體 12(SEQ ID113 ~115);抗體 13(SEQ ID123 ~125);抗體 14(SEQ ID133 ~135);抗體 15(SEQ ID143 ~145)；抗體 16(SEQ ID153 ~155);抗體 17(SEQ ID163 ~165);抗體 18(SEQ ID173 ~175);抗體19(SEQ ID183~185);抗體20(SEQ ID193~95)。任選地，其也可以包括這些抗體之一的一組VL⑶R，并且所述VL⑶R可以來自與VH⑶R相同或不同的抗體。盡管在一些實施方式中，單獨的VH或VL域可以被用于結合抗體，但是一般地，VH域與VL域配對以提供抗體抗原結合位點。在本領域中輕鏈廣宿(promiscuity)已被很好確立，因此VH和VL域不必源自如此處所公開的相同的克隆。
[0063]結合元件可以包含在公開的Η和/或L⑶R組內具有一個或多個、例如10個或更少、如1、2、3、4或5個取代的抗體1~20任一的一組Η和/或L⑶R。優(yōu)選的取代在VL域中的 Kabat 殘基 27A、27B、27C、32、51、52、53、90、92 和 96 以及 VH 域中的 Kabat 殘基 34、54、57、95、97、99和100B以外的Kabat殘基處。當在這些位置進行取代時，取代優(yōu)選為在此處表明為該位置的優(yōu)選殘基的殘基取代。
[0064]在優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的結合元件為具有包含人源胚系框架(如來自重鏈VHl或VH3家族的人胚系框架)中的一組HCDR的VH域的分離的人抗體分子。在優(yōu)選實施方式中，該分離的人抗體分子具有包含人胚系框架VH1DP5或VH3DP47中的一組HCDR的VH域。因此，VH域框架區(qū)可以包括人胚系基因片段VH1DP5或VH3DP47的框架區(qū)。VH FRl的氨基酸序列可以為SEQ ID NO:251。VH FR2的氨基酸序列可以為SEQ ID NO:252。VH FR3的氨基酸序列可以為SEQ ID NO:253。VH FR4的氨基酸序列可以為SEQ ID NO:254。
[0065]通常地，該結合元件也具有包含優(yōu)選人胚系框架(如來自輕鏈V λ I或V λ 6家族的人胚系框架)中的一組LCDR的VL域。在優(yōu)選實施方式中，該分離的人抗體分子具有包含人胚系框架V λ 1DPL8或V λ 1DPL3或V λ 6_6a中的一組IXDR的VL域。因此，VL域框架可以包含人胚系基因片段VA 1DPL8、VA 1DPL3或VA6_6a的框架區(qū)。VL域FR4可以包括人胚系基因片段JL2的框架區(qū)。VL FRl的氨基酸序列可以為SEQ ID NO:255。VL FR2的氨基酸序列可以為SEQ ID NO:256。VL FR3的氨基酸序列可以為SEQ ID NO:257。VL FR4的氣基酸序列可以為SEQ ID NO:258。
[0066]與胚系化(germlined)抗體相比，非胚系化抗體具有相同的⑶R，但具有不同的框
架。
[0067]本發(fā)明的結合元件可以與任何此處公開的任一結合元件(如抗體3或抗體1、2或4~20中任一種)競爭結合GM-CSFRa。因此，結合元件可以與包含抗體1、2或4~20中任一的VH域和VL域的抗體分子競爭結合GM-CSFRa。結合元件之間的競爭可以在體外方便地分析，例如通過將可以在一種或多種其它未標記結合元件存在時被檢測的示蹤分子(reporter mOlecular)標記到一種結合元件上,從而使能夠鑒別與相同表位或重疊表位結合的結合元件。
[0068]可以例如使用ELISA測定競爭，其中如GM-CSFRa的細胞外域或該細胞外域的肽被固定于板上、并且第一標記的結合兀件與一種或多種未標記的結合兀件一起被加入到板中。通過標記的結合元件發(fā)射的信號的降低觀察與標記的結合元件競爭的未標記結合元件的存在。類似地，表面等離子共振試驗可以被用于測定結合元件之間的競爭。
[0069]在競爭檢測中，可以使用抗原的肽片段，尤其是包括或主要由表位或目標結合區(qū)組成的肽。可以使用具有在任一端加上一個或多個氨基酸的表位或靶序列的肽。可以使得根據本發(fā)明的結合元件與抗原的結合被具有或包括給定序列的肽抑制。
[0070]例如，結合肽的結合元件可以通過用所述肽篩選(panning)從噬菌體呈現文庫中分離。
[0071]本發(fā)明也提供了上述結合元件在競爭試驗中測量抗原水平的應用，也就是說，通過在競爭試驗中使用本發(fā)明提供的結合元件測量樣品中的抗原水平的方法。這可以是不需要對結合的和未結合的抗原進行物理分離的情況。示蹤分子與結合元件連接使得結合時發(fā)生物理或光學變化，這是一種可能性。示蹤分子可以直接或間接產生可檢測的、優(yōu)選可測量的信號。示蹤分子的連接可以為直接或間接的、共價(如通過肽鍵的)或非共價的。通過肽鍵的連接可以是編碼抗體和示蹤分子的基因融合進行重組表達的結果。
[0072]本發(fā)明也提供通過在例如生物傳感器系統(tǒng)中使用根據本發(fā)明的結合元件直接測量抗原水平的方法。
[0073]本發(fā)明提供一種包括引起或使得此處提供的結合元件與GM-CSFRa結合的方法。這種結合可以在體內發(fā)生，例如在施用結合元件或編碼結合元件的核酸后，或者其可以在體外發(fā)生，例如在ELISA、蛋白質印跡、免疫細胞化學、免疫沉淀、親和層析或如TF-1試驗的基于細胞的試驗中。
[0074]可以測定結合元件與GM-CSFRa結合的量。定量可能與測試樣品中的抗原的量相關，其可能具有診斷或預后的意義。[0075]包含根據本發(fā)明的任何方面或實施方式的結合元件或抗體分子的試劑盒也作為本發(fā)明的一個方面。在本發(fā)明的試劑盒中，結合元件或抗體分子可以被標記以使其在樣品中的反應性能夠被測定，如下面進一步所述的。試劑盒的組分通常是無菌的，并置于密封小瓶或其它容器內?？梢栽谠\斷分析或抗體分子可以使用的其它方法中使用試劑盒。試劑盒可以含有在某一方法(如根據本發(fā)明的方法)中使用該組分的說明書。本發(fā)明的試劑盒中可以包括參與該方法或使得該方法能夠進行的輔助物質。
[0076]可以通過任何適當的手段測定樣品中抗體的反應性。放射免疫試驗(RIA)為一種可能。放射標記的抗原與未標記抗原(測試樣品)混合，并且使其結合抗體。結合的抗原與未結合的抗原被物理分離，并且測定與抗體結合的放射抗原的量。測試樣品中抗原越多，則越少的放射抗原結合到抗體上。通過使用與示蹤分子連接的抗原或類似物，競爭結合試驗也可以利用非放射抗原進行。示蹤分子可以為具有光譜分離的吸收或發(fā)射特征的熒光染料、磷光體或激光染料。適合的熒光染料包括熒光素、羅丹明、藻紅蛋白、和德克薩斯紅(Texas Red)。適合的顯色染料包括二氨基聯(lián)苯胺。其它示蹤物包括大分子膠體顆?；蛉缬猩?、磁性或順磁性的乳膠珠的顆粒物質、以及可以直接或間接產生可以視覺觀察、電檢測或以其它方式記錄的可檢測信號的生物或化學活性物質。例如，這些分子可以為催化生色或變色或引起電學性質變化的反應的酶。它們可以是可分子激發(fā)的，從而能態(tài)之間的電子躍遷導致特征光譜吸收或發(fā)射。它們可以包括與生物傳感器聯(lián)合使用的化學體?？梢允褂蒙锼?親和素或生物素/抗生蛋白鏈菌素和堿性磷酸酶檢測系統(tǒng)。
[0077]由個別的抗體-示蹤物偶聯(lián)物產生的信號可以用于得出樣品(正常和測試)中相關抗體結合的可計量的絕對或相對數據。
[0078]在本發(fā)明的另一方面中，本發(fā)明提供了包括編碼根據本發(fā)明的結合元件、VH域和/或VL域的序列的分離的核酸。該核酸可以包括DNA和/或RNA，并且可以全部或部分合成。如此處所述的核苷酸序列所指包括具有特定序列的DNA分子，并且包括具有其中，除非上下文特別要求外，以U代替T的特定序列的RNA分子。在優(yōu)選的方面中，本發(fā)明提供了編碼如此處限定的本發(fā)明的CDR或CDR組或VH域或VL域或抗體抗原結合位點或抗體分子(如scFv或IgGl或IgG4)的核酸。本發(fā)明也提供包括至少一種上述多核苷酸的質粒、載體、轉錄或表達盒形式的構建體。
[0079]本發(fā)明的再一方面為用本發(fā)明的核酸轉化的或含有本發(fā)明的核酸的宿主細胞。該宿主細胞可以為體外的、并且可以為培養(yǎng)中的。該宿主細胞可以為體內的。所述宿主細胞在體內的存在可以使得本發(fā)明的結合元件作為“內抗體”(intrabodies)或細胞內抗體進行細胞內表達。內抗體可以被用于基因治療。
[0080]本發(fā)明的再另一方面提供包括將所述核酸引入宿主細胞的方法。引入可以使用任何可用的技術。對于真核細胞，適合的技術可能包括磷酸鈣轉染、DEAE-葡聚糖、電穿孔、月旨質體介導的轉染和使用逆轉錄酶病毒或其它病毒(如牛痘病毒或對于昆蟲細胞的桿狀病毒)的轉導。在宿主細胞、尤其真核細胞中引入核酸可以使用基于病毒或質粒的系統(tǒng)。質粒系統(tǒng)可以保持為游離基因，或者可以整合到宿主細胞或人工染色體內。整合可以是在單個或多個位點隨機或靶向整合一個或多個復本。對于細菌細胞，適合的技術可以包括氯化鈣轉化、電穿孔和使用噬菌體的轉染。
[0081]引入后可以引發(fā)或使得核酸進行表達，例如通過在該基因表達的條件下培養(yǎng)宿主細胞。
[0082]在一個實施方式中，本發(fā)明的核酸被整合到宿主細胞的基因組(如染色體)中?？梢愿鶕藴始夹g通過包含促進基因組重組的序列來促進整合。
[0083]本發(fā)明也提供在表達系統(tǒng)中使用上述構建體以表達上述結合元件或多肽的方法。因此，制備本發(fā)明的結合元件、VH域和/或VL域的方法為本發(fā)明的再一方面。方法可以包括在導致所述結合元件、VH域和/或VL域產生的條件下表達所述核酸、并進行回收。該方法可以包括在產生所述結合元件或抗體域的條件下培養(yǎng)宿主細胞。
[0084]制備方法可以包括分離和/或純化產物的步驟。制備方法可以包括將產品配制為包括如藥學可接受的賦形劑的至少一種附加組分的組合物。
[0085]在各種不同的宿主細胞中克隆和表達多肽的系統(tǒng)是公知的。適合的宿主細胞包括細菌、哺乳動物細胞、植物細胞、酵母和桿狀病毒系統(tǒng)以及轉基因植物和動物?？贵w和抗體片段在原核細胞中的表達已在本領域中被很好地建立[3]。通用的優(yōu)選細菌宿主為大腸桿菌(E.coli)ο
[0086]在培養(yǎng)的真核細胞進行表達也可被本領域普通技術人員用作產生結合元件的可選方案[4、5、6]。本領域中可用于表達異源多肽的哺乳動物細胞系包括中國倉鼠卵巢細胞(CHO)、HeLa細胞、幼地鼠腎細胞、NSO小鼠黑色素瘤細胞、YB2 / O大鼠骨髓瘤細胞、人胚腎細胞、人胚視網膜細胞以及許多其它細胞。
[0087]適合的載體可以經選擇或構建為包含適當的調控序列，包括啟動子序列、終止子序列、多聚腺苷酸序列、增強子序列、標記基因和其它適當的序列。載體可以為適當的質粒(如噬粒)或病毒(如噬菌體)[7]。例如，Ausubel等[8]詳細描述了在例如核酸構建體制備、基因誘變、測序、DNA引入細胞和基因表達、以及蛋白質分析中的許多核酸操作的已知技術和方案。
[0088]本發(fā)明提供了獲得一個或多個能夠結合抗原的結合元件的方法，該方法包括使根據本發(fā)明的結合元件的庫與所述抗原接觸，以及選擇所述庫中一個或多個能夠結合所述抗原的結合元件。
[0089]所述庫可以在顆粒或分子復合物,例如可復制的遺傳包(genetic package)(如酵母、細菌或如T7噬菌體顆粒)上呈現，或在共價的、核糖體或其它體外呈現系統(tǒng)上呈現，各個顆?；蚍肿訌秃衔锇幋a在其上呈現的抗體VH可變域的核酸，并且任選地也包含呈現的VL域(如果存在)。在選擇能夠結合抗原并且在噬菌體或其它文庫顆?；蛘叻肿訌秃衔锷铣尸F的結合元件后，可以從呈現所述挑選的結合元件的噬菌體或其它顆粒或分子復合物獲取核酸。這種核酸可以通過表達具有從呈現所述挑選的結合元件的噬菌體或其它顆?；蚍肿訌秃衔铽@取的核酸序列的核酸而被用于隨后的結合元件或抗體VH或VL可變域的制備。
[0090]具有所述選擇的結合元件的抗體VH可變域氨基酸序列的抗體VH可變域可以以獨立形式產生，也可以是包含該VH域的結合元件的形式。[0091 ] 具有所述選擇的結合元件的抗體VL可變域氨基酸序列的抗體VL可變域可以以獨立形式產生，也可以是包含該VL域的結合元件的形式。
[0092]結合GM-CSFR α的能力可以進一步測試，與抗體1~20 (如scFv形式和/或IgG形式，如IgGl或IgG4)中任一競爭結合GM-CSFRa的能力也可以被進一步測試。中和GM-CSFR α的能力可以被測試。
[0093]包括具有此處所列氨基酸序列的本發(fā)明的VH和VL域以及⑶R的突變體可以通過序列變換或突變以及篩選的方法獲得，且可以用于GM-CSFRa的結合元件中。隨著在多變量數據分析技術應用于結構/特性-活性關系中計算機化學的引導[9]，可以使用如統(tǒng)計回歸、模式識別和分類的公知數學技術推導抗體的定量活性-性質關系[10、11、12、13、14、15]。可以從抗體序列、功能和三維結構的經驗和理論模型(例如，可能的接觸殘基或計算的理化性質的分析)推知抗體的性質，并且這些性質可以被單獨或組合地考慮。
[0094]包括VH域和VL域的抗體抗原結合位點由六個多肽環(huán)形成:三個來自輕鏈可變域(VL)、三個來自重鏈可變域(VH)。已知原子結構的抗體的分析已經闡明了序列和抗體結合部位的三維結構之間的關系[16、17]。這些關系暗示，除了 VH域的第三區(qū)(環(huán))之外，結合位點環(huán)具有少數主鏈構象之一:正則結構。在特定環(huán)內形成的正則結構已表明是通過其大小和特定殘基在環(huán)和框架區(qū)兩者內的關鍵位點處的存在來確定[16、17]。
[0095]該序列-結構關系的研究可以被用于預測已知序列、但未知三維結構的抗體中那些對于維持其CDR環(huán)的三維結構重要的、進而維持結合的殘基。這些預測可以得到所述預測與 先導物優(yōu)化試驗的結果之間的對比的支持。在結構方法中，可以使用任何免費獲得或者市售的包(如WAM)[19]建立抗體分子模型[18]。然后，可以使用如InsightII (Accelerys, Inc.)或Deep View[20]的蛋白可視化和分析軟件包估計⑶R中各個位置可能的取代。然后，該信息可以被用于進行很可能對活性有最小或有益影響的取代。
[0096]進行CDR、抗體VH或VL域以及結合元件的氨基酸序列中的取代所需的技術通常是可在本領域獲得的。變異體序列可以利用可能或不能被預測對活性有最小的或有益的影響的取代產生，并且可以對其結合和/或中和GM-CSFRa的能力和/或任何其它所需性質進行測試。
[0097]如上所述，根據本發(fā)明，可以使用其序列在此處特別公開的任何VH和VL域的可變域氨基酸序列變異體。特定變異體可以包括一個或多個氨基酸序列變換(氨基酸殘基的添加、缺失、取代和/或插入)，可以為少于約20個變換、少于約15個變換、少于約10個變換或少于約5個變換，可能是5、4、3、2或1個?？梢栽诟鱾€或多個框架區(qū)和/或一個或多個⑶R中進行變換。
[0098]優(yōu)選地，變換不導致功能喪失，從而包含這樣變換的氨基酸序列的結合元件優(yōu)選地保留結合和/或中和GM-CSFRa的能力。更優(yōu)選地，例如，如此處所述試驗中所測得的，其保留與其中未進行變換的結合元件一樣的定量結合和/或中和能力。最優(yōu)選地，例如，如此處所述試驗中所測得的，與其中未進行變換的結合元件相比，包含這樣變換的氨基酸序列的結合元件具有改善的結合或中和GM-CSFRa的能力。
[0099]變換可以包括用非天然形成的或非標準的氨基酸替代一個或多個氨基酸殘基、將一個或多個氨基酸殘基修飾為非天然形成或非標準的形式、或者在序列中插入一個或多個非天然形成或非標準的氨基酸。本發(fā)明的序列中變換的優(yōu)選數目和位置在其它處進行描述。天然形成的氨基酸包括由其標準單字母編碼標明為G、A、V、L、1、M、P、F、W、S、T、N、Q、Y、C、K、R、H、D、E的20種“標準” L氨基酸。非標準氨基酸包括可以被整合到多肽骨架之中或由修飾已存在的氨基酸殘基所得的任何其它殘基。非標準氨基酸可為天然形成的或非天然形成的。幾種天然形成的非標準氨基酸在本領域中是已知的，如4-羥基脯氨酸、5-羥基賴氨酸、3-甲基組氨酸、N-乙基絲氨酸等[21]。那些在其Ν-α位置處衍生的氨基酸殘基僅位于氨基酸序列的N末端。一般地，在本發(fā)明中，氨基酸為L氨基酸，但是在一些實施方式中，其可以為D-氨基酸。因而，變換可以包括將L-氨基酸改變?yōu)镈-氨基酸、或用D-氨基酸取代L-氨基酸。氨基酸的甲基化、乙?；?或磷酸化形式也是已知的，并且在本發(fā)明中的氨基酸可以進行這樣的修飾。 [0100]本發(fā)明的抗體域和結合元件中的氨基酸序列可以包括上述非天然或非標準氨基酸。在一些實施方式中，非標準氨基酸(如D-氨基酸)可以在合成過程中并入氨基酸序列中，而在其它實施方式中，可以在氨基酸序列合成后通過修飾或取代“原始”標準氨基酸引入非標準氨基酸。
[0101]非標準和/或非天然形成的氨基酸的使用增加結構和功能多樣性，并且，因此能夠增加實現本發(fā)明的結合元件所需的GM-CSFRa結合和中和性質的可能。此外，由于在給予動物后具L-氨基酸的多肽的體內降解，與標準L-氨基酸相比，D-氨基酸和類似物已顯示具有更好的藥物動力學性質。
[0102]如上所述，基本如此處所述的CDR氨基酸序列優(yōu)選地作為CDR被負載在人抗體可變域或其主要部分中?；救绱颂幩龅腍CDR3序列代表本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，并且優(yōu)選其中各個作為HCDR3被負載在人重鏈可變域或其主要部分中。
[0103]本發(fā)明中使用的可變域可以從任何胚系或重排的人可變域獲得或來源于此，或者可以為基于已知人可變域的通用或真實序列的合成可變域。使用重組DNA技術，本發(fā)明的⑶R序列(如⑶R3)可以被引入缺少⑶R(如⑶R3)的可變域的組成集合(repertoire)中。
[0104]例如，Marks等(1992) [22]描述了產生抗體可變域組成集合的方法，其中定位于可變域區(qū)的5’末端處或與其鄰近的通用引物與人VH基因的第三框架區(qū)的通用引物聯(lián)合使用，從而提供缺少CDR3的VH可變域的組成集合。Marks等進一步描述了該組成集合如何能與特定抗體的CDR3組合。使用類似技術，本發(fā)明的CDR3源序列可以與缺少CDR3的VH或VL域組成集合混合，并且該混合的完整VH或VL域與同源VL或VH域組合，從而提供本發(fā)明的結合元件。然后，該組成集合可以在如W092 / 01047中的噬菌體呈現系統(tǒng)或后面的參考文獻的大部分(包括參考文獻[23])中的任一種的合適的宿主系統(tǒng)中呈現，從而可以選擇適當的結合元件。組成集合可以由來自IO4以上個體成員(例如IO6至IO8或101°中成員)的任何部分組成。其它適合的宿主系統(tǒng)包括酵母呈現、細菌呈現、T7呈現、病毒呈現、細胞呈現、核糖體呈現和共價呈現。類似的混合或組合技術也被Stemmer (1994) [24]公開，其除觀察該技術可以被用于抗體的產生外，還描述了與內酰胺酶基因相關的技術。
[0105]進一步的替代方式為利用一個或多個選擇的VH和/或VL基因的隨機突變以在全可變域中產生突變，從而產生攜帶本發(fā)明的CDR源序列的新VH或VL區(qū)域。Gram等(1992)
[25]描述了這種技術,其使用了易錯PCR(error-prone PCR)。在優(yōu)選實施方式中，在一組HCDR和/或LCDR內進行一個或兩個氨基酸取代。另一可使用的方法是對VH或VL基因的⑶R區(qū)域的引導基因突變。[0106]本發(fā)明的再一方面提供了獲得GM-CSFRa抗原的抗體抗原結合位點的方法，該方法包括通過在此處所述的VH域氨基酸序列中一個或多個氨基酸的添加、缺失、取代或插入從而提供作為VH域的氨基酸序列變異體的VH域，任選地將如此獲得的VH域與一種或多種VL域結合，以及測試VH域或VH / VL的組合或多個組合以鑒別任選地具有一種或多種優(yōu)選性質(優(yōu)選中和GM-CSFRa活性的能力)的GM-CSFRa抗原的結合元件或抗體抗原結合位點。所述VL域可具有基本為如此處所述的氨基酸序列。
[0107]可以使用其中一個或多個此處公開的VL域的序列變異體與一個或多個VH域組合的類似方法。
[0108]本發(fā)明的再一方面提供了制備GM-CSFRa抗原結合元件的方法，該方法包括:
[0109](a)提供對包括待取代的CDR3或缺少CDR3編碼區(qū)的VH域進行編碼的核酸的起始組成集合；
[0110](b)組合所述組成集合和編碼基本如此處所述的VH CDR3氨基酸序列的供體核酸，從而所述供體核酸被插入所述組成集合的CDR3區(qū)以提供編碼VH域的核酸的產物組成
集合;
[0111](c)表達具有所述產物組成集合的核酸；
[0112](d)選擇GM-CSFR α結合元件；以及
[0113](e)回收所述結合元件或編碼所述結合元件的核酸。
[0114]同樣，可以使用其中本發(fā)明的VL⑶R3與編碼包括待取代⑶R3或缺少⑶R3編碼區(qū)的VL域的核酸組合的類似方法。`
[0115]類似地，一種或多種、或者所有三種⑶R可以被接合到隨后被用于篩選GM-CSFRa的結合元件或多種結合元件的VH或VL域的組成集合中。
[0116]在優(yōu)選實施方式中，可以使用一種或多種HCDR1、HCDR2和HCDR3，如抗體1(SEQ IDNOS:3 ~5);抗體 2 (SEQ ID NOS:13 ~15);抗體 4 (SEQ ID NOS:33 ~35);抗體 5 (SEQ IDNOS:43 ~45);抗體 6 (SEQ ID NOS:53 ~55);抗體 7 (SEQ ID NOS:63 ~65);抗體 8 (SEQID NOS:73 ~75);抗體 9 (SEQ ID NOS:83 ~85);抗體 10 (SEQ ID NOS:93 ~95);抗體
11(SEQ ID NOS:103 ~105);抗體 12 (SEQ ID NOS:113 ~115);抗體 13 (SEQ ID NOS:123 ~125);抗體 14 (SEQ ID NOS:133 ~135);抗體 15 (SEQ ID NOS:143 ~145);抗體 16 (SEQ IDNOS:153 ~155);抗體 17 (SEQ ID NOS:163 ~165);抗體 18 (SEQ ID NOS:173 ~175);抗體 19(SEQ ID N0S:183 ~185)或抗體 20 (SEQ ID N0S:193 ~195);或者任選地抗體 3 (SEQID NOS:23~25)的一組HCDR，和/或可以使用一種或多種IXDR1、IXDR2和IXDR3，如抗體
1(SEQ ID N0S:8 ~10);抗體 2 (SEQ ID NOS:18 ~20);抗體 4 (SEQ ID NOS:38 ~40);抗體 5 (SEQ ID NOS:48 ~50);抗體 6 (SEQ ID NOS:58 ~60);抗體 7 (SEQ ID NOS:68 ~70)；抗體 8 (SEQ ID NOS:78 ~80);抗體 9 (SEQ ID NOS:88 ~卯)；抗體 10 (SEQ ID NOS:98 ~100);抗體 11 (SEQ ID NOS:108 ~110);抗體 12 (SEQ ID NOS:118 ~120);抗體 13 (SEQ IDNOS:128 ~130);抗體 14 (SEQ ID NOS:138 ~140);抗體 15 (SEQ ID NOS:148 ~150);抗體 16 (SEQ ID NOS:158 ~160);抗體 17 (SEQ ID NOS:168 ~170);抗體 18 (SEQ ID NOS:178 ~180);抗體 19 (SEQ ID NOS:188 ~190)或抗體 20 (SEQ ID NOS:198 ~200);或者任選地抗體 3 (SEQ ID NOS:28 ~30)的一組 LCDR。
[0117]免疫球蛋白可變域的主要部分包括至少三個⑶R區(qū)以及其居間框架區(qū)。優(yōu)選地，所述部分也包括至少約50%的第一和第四框架區(qū)之一或兩者，該50%為第一框架區(qū)的C-末端50%和第四框架區(qū)的N-末端50%?？勺冇蛑饕糠值腘-末端或C-末端的附加殘基可以為那些通常不與天然形成的可變域區(qū)相關的殘基。例如，通過重組DNA技術進行本發(fā)明結合元件的構建可以導致引入由促進克隆或其它操作步驟的連接子所編碼的N-或C-末端殘基。其它操控步驟包括引入連接子以連接本發(fā)明的可變域和另外的蛋白序列，其包括抗體恒定區(qū)、其它可變域(例如在雙體(diabody)的制備中)或如本發(fā)明的其它處的更詳細內容所述的可檢測的/功能性的標記。
[0118]盡管在本發(fā)明的優(yōu)選方面中，優(yōu)選的是包括一對VH和VL域的結合元件，但是基于VH或VL域序列的單結合域形成本發(fā)明的另一方面。已知單免疫球蛋白域、尤其VH域能夠結合靶抗原。例如，參見本發(fā)明其它處的關于dAb的討論。
[0119]當為單結合域之一時，這些域可以被用于篩選能夠形成可結合GM-CSFRa的雙域結合元件的互補域。這可以通過使用如W092 / 01047中所公開的所謂等級雙重組合方法(hierarchical dual combinatorial approach)的卩遼菌體呈現篩選方法實現，其中含H或L鏈克隆的單獨集落被用于感染編碼另一鏈(L或H)的克隆的完整庫，并且根據噬菌體呈現技術(如該參考文獻和參考文獻[22]所描述的噬菌體呈現技術)對所得雙鏈結合元件進行選擇。
[0120]本發(fā)明的再一方面提供了含本發(fā)明的結合元件和至少一種額外組分的組合物，例如包括結合元件和藥物上可接受的賦形劑的組合物。該組合物可以在抑制或中和GM-CSFRa的方法(包括通過治療處理人或動物體的方法)中使用。
[0121]本發(fā)明提供包括抗GM-CSFRa抗體分子的異質制劑。例如，該制劑可以為具有全長重鏈和缺少C末端賴氨酸的重鏈、具有不同程度糖基化和/或具有衍生氨基酸(如N-末端谷氨酸環(huán)化以形成焦谷 氨酸殘基)的抗體的混合物。
[0122]本發(fā)明的多個方面包括治療方法(該方法包括給予所提供的結合元件)、包含該結合元件的藥物組合物、和該結合元件在制備藥物中的應用，如在包括將所述幾何元件和藥物可接受的賦形劑進行配制的制備藥物或藥物組合物的方法中的應用。
[0123]抗-GM-CSFR a治療可以口服(如納米抗體(nanobody))、通過注射(例如,皮下、靜脈內、動脈內、關節(jié)內、腹膜內或肌肉內)、通過吸入、通過泡內途徑(如膀胱內的灌輸)、或局部(如眼內、鼻內、直腸、傷口內或皮膚上)進行。該治療可以通過脈沖輸入(pulseinfusion)實施，特別是以結合元件的遞減劑量。給藥途徑可以根據治療的理化特性、對疾病的特殊考慮、或者使功效最優(yōu)或使副作用最小的需要決定?？梢栽O想抗GM-CSFRa治療將不限于臨床應用。因此，使用無針設備的皮下注射也是優(yōu)選的。
[0124]根據需要治療的狀態(tài)，組合物可以單獨或者與其它治療組合(同時或順序地)給予。組合治療、尤其抗-GM-CSFRa結合元件與一種或多種其它藥物的組合可以用于提供顯著的協(xié)同效應。根據本發(fā)明的結合元件可以與以下物質中的一種或多種進行組合或作為它們的附加被提供=NSAID(例如，如塞來昔布的環(huán)氧合酶抑制劑和其它類似的cox2抑制劑)、皮質甾醇(如強的松)和緩解疾病的抗風濕藥(DMARD)如修美樂(Humira)(阿達木單抗(adalimumab))、氨甲蝶呤、來氟米特(Arava)、依那西普(Enbrel)(依坦西普(Etanercept))、類克(Remicade)(英利昔單抗(Infliximab))、Kineret (阿那白滯素(Anakinra))、美羅華(Rituxan)(利妥昔單抗(Rituximab))、Orencia (阿巴他塞(abatacept))、氯金酸鈉(gold salt)、抗痕藥、柳氮磺胺吡唳(Ssulfasalazine)、D-青霉胺、環(huán)孢菌素A、雙氯芬酸、環(huán)磷酰胺和咪唑硫嘌呤。[0125]根據本發(fā)明，提供的組合物可以施用予個體。優(yōu)選以“治療有效量”施用，該量足以對病人顯示有利效果。這種有利效果可以為至少一種癥狀的至少改善。給藥的實際量和給藥的速度和時間過程取決于治療對象的狀態(tài)和嚴重程度。治療的處方，如決定劑量等，為一般執(zhí)業(yè)醫(yī)生和其它醫(yī)生的責任范圍，并且可能取決于癥狀的嚴重性和/或被治療疾病的進展。抗體的適當劑量為本領域公知的[28、29]。可以使用此處表明的或如“Physician’sDesk Reference^(2003)所示的對于被給予藥物的類型所適合的特定劑量。本發(fā)明的結合元件的治療有效量或適當量可以通過對比其體外活性和在動物模型中的體內活性確定。將小鼠和其它測試動物中的有效劑量外推到人的方法是已知的。精準劑量取決于多個因素，包括抗體是用于診斷還是用于治療、治療部位的大小和位置、抗體的精確性質(如全抗體、片段或雙體)、以及任何可檢測標記或其它與抗體連接的分子的性質。典型的抗體劑量對于全身施用在IOOyg~Ig的范圍內、對于局部施用在Iyg~Img的范圍內。典型地，抗體為全抗體，優(yōu)選IgGl、IgG2或更優(yōu)選IgG4。這是對成年患者單次治療的劑量，其對于兒童和嬰兒可以適當調整，并且對于其它抗體形式也可以按分子量成比例地調整。治療可以按照醫(yī)生的判斷以每日、一周兩次、每周或每月的間隔重復。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，治療為周期性的，并且給藥之間的期間約為兩周或更長、優(yōu)選約3周或更長、更優(yōu)選約4周或更長、或約每月一次。在本發(fā)明的其它優(yōu)選實施方式中，可以在手術之前和/或之后給予治療，并且更優(yōu)選地，可以在手術治療的切開位置直接給予或施用。
[0126]本發(fā)明的結合元件通常以藥物組合物的形式被給予，該藥物組合物可以包括至少一種結合元件以外的組分。因此，根據本發(fā)明的藥物組合物以及用于本發(fā)明的應用的藥物組合物除活性組分外還可以包括藥物可接受的賦形劑、載體、緩沖劑、穩(wěn)定劑或其它本領域普通技術人員公知的物質。該物質應為無毒的，并且不應干擾活性組分的效力。載體或其它物質的準確性質取決于給藥途徑，其可以為口服、或者通過如靜脈內的注射?？诜o藥的藥物組合物可以為片劑、膠囊、粉末、液體或半固體形式。片劑可以包括如凝膠或佐劑的固體載體。液體藥物組合物通常包括如水、石油、動物或植物油、礦物油或合成油的液體載體。可以包括生理鹽水、葡萄糖或其它糖類溶液或如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇的二醇類。對于靜脈注射或病痛處的注射，活性組分為無熱原并具有適當PH值、等滲性和穩(wěn)定性的腸道外可接受的水溶液形式。例如，本領域相關技術人員能夠使用如氯化鈉注射液、林格氏注射液、乳酸化林格氏注射液的等滲載體制備適當的溶液?？梢愿鶕枰栏瘎⒎€(wěn)定劑、緩沖劑、抗氧化劑和/或其它添加劑。本發(fā)明的結合元件可以根據分子的理化性質和遞送途徑配制成液體、半固體或固體形式。制劑可以包括賦形劑或賦形劑的組合，例如:糖、氨基酸和表面活性劑。液體制劑可以包括寬范圍的抗體濃度和pH。例如，固體制劑可以通過冷凍干燥、噴霧干燥或通過超臨界流體技術的干燥進行制備?？?GM-CSFRa的制劑取決于預定的遞送途徑:例如，用于肺部遞送的制劑可以由具有確保在吸入時滲透到深肺部的物理性質的顆粒組成；局部制劑可以包括延長藥物在作用部位滯留的時間的粘性改性劑。在特定實施方式中，結合元件可以采用防止結合元件快速釋放的載體進行制備，例如包括植入物、透皮貼片和微膠囊化遞送系統(tǒng)的控釋制劑。如乙烯醋酸乙烯酯、多聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸的生物可降解、生物相容的聚合物可以被使用。制備該制劑的許多方法對于本領域普通技術人員是已知的。例如參見Robinson, 1978 [30]。
[0127]根據本發(fā)明的結合元件可以在人或動物體的治療或診斷方法中使用，如在治療人類患者的疾病或病癥(其可以包括預防治療)的方法中，包括給予所述患者有效劑量的本發(fā)明的結合元件。根據本發(fā)明的可治療的狀態(tài)包括其中GM-CSFRa起作用的任何疾病。公開的技術文件顯示了 GM-CSF在總結如下的許多疾病中的作用。由于GM-CSF特異性結合GM-CSFR α，因此GM-CSF的病理和/或癥狀效應可以通過抑制GM-CSF與GM-CSFR α的結合被抵消。因此，除此處在試驗部分所描述的抗體分子呈現的體內和體外藥理學數據外，公開出版的證據顯示本發(fā)明的結合元件可以在治療如風濕性關節(jié)炎、哮喘、過敏反應、多發(fā)性硬化、髓系白血病和動脈硬化的自體免疫和/或炎性狀態(tài)、疾病和病癥中應用。關于這些狀態(tài)的公開出版的證據總結如下:
[0128]哮喘和過敏反應
[0129]支氣管哮喘是一種肺的常見的持久的炎性病癥，特征為氣道高反應性、粘液過量產生、纖維變性和升高的IgE水平。氣道高反應性(AHR)為氣道對非特異性刺激的過度收縮。AHR和粘液過量產生兩者被認為是造成導致哮喘發(fā)作(惡化)的呼吸短促特征的可變氣道阻塞的原因，并且是造成與該疾病相關的死亡(在英國每年約2000例死亡)的原因。
[0130]最近的研究已經證明在哮喘中GM-CSF及其受體在蛋白質和mRNA水平上都是上調的。此外，表達水平與疾病的嚴重程度相互關聯(lián)。與非哮喘對象相比時，哮喘患者的支氣管肺泡灌洗(BAL)液、BAL細胞、唾液、支氣管上皮細胞和抗原刺激的外周血單核細胞中已測到GM-CSF產生增加[31、32]。此外，在過敏原激發(fā)后GM-CSF的氣道表達水平顯示出與組織嗜酸性細胞增多的水平和延期哮喘反應的嚴重程度相關[33]。隨后的研究將上調的GM-CSFR表達與內源性或非變應性哮喘關聯(lián)，將表達水平與非功能數據關聯(lián)[34]。在小鼠卵清蛋白致敏和激發(fā)模型中，在卵清蛋白激發(fā)前通過鼻內給藥產生的以羊多克隆抗體對GM-CSF活性的中和防止了氣道高反應性并同時減少了氣道內嗜酸性細胞的浸潤和粘液分泌[35]。類似地，在通過鼻內給予柴油機廢氣顆粒引發(fā)的小鼠過敏性呼吸疾病模型中，再次通過鼻內給予羊多克隆抗體中和GM-CSF防止了對乙酰甲膽堿的氣道高反應性、降低了 BAL嗜酸性細胞計數并且也減少粘液產生杯形細胞在氣道上皮上的表達[36]。
[0131 ] GM-CSF在過敏反應中的作用進一步在鼠誘導耐受模型中研究。暴露于每日反復劑量的霧狀卵清蛋白而不進行預先致敏的小鼠形成對卵清蛋白的耐受并且不會引起氣道的嗜酸性細胞炎癥。GM-CSF通過腺病毒構建體在肺中表達改變了這些動物的反應，并且促進嗜酸性細胞流入BAL中、表型過敏組織學的產生和相關杯狀細胞增生。該典型Th2反應的產生通過IL-5的血清和BAL濃度的增加和血清IL-4的增加進一步得到證實。在采用MHC IIKO小鼠的該模型中進行進一步研究顯示GM-CSF調節(jié)氣道中抗原呈遞細胞和T細胞之間的相互作用，從而促進T細胞介導的對卵清蛋白的反應[37]。值得注意的是，GM-CSF作為Th2反應的有效活化劑的活性也可以在缺少IL-3和/或IL-4的小鼠中被證實，說明GM-CSF活性的中和提供了完全不同于這些細胞因子的活性的可選擇的治療途徑。
[0132] 在另一鼠模型中已進行了類似的觀察，其中鼻內反復暴露于豚草導致再暴露于抗原時的Th2型致敏和輕微氣道炎癥[38]。抗GM-CSF抗體與豚草聯(lián)合給予減少了 Th2相關的細胞因子產生，大概是通過內源GM-CSF的抑制。相反，向通過多次共同施用重組GM-CSF或單次遞送攜帶GM-CSF轉基因的腺病毒載體向富有GM-CSF的氣道微環(huán)境遞送豚草導致顯著增強的嗜酸性細胞氣道炎癥和豚草特異性的Th2記憶性反應。
[0133]風濕性關節(jié)炎(RA)
[0134]RA為影響到工業(yè)化世界中約1%人口的慢性炎癥和破壞性關節(jié)疾病。RA的特征為滑膜的增生和炎癥、滑液內炎癥、以及通常導致顯著失能的周圍骨骼和軟骨的漸進破壞。
[0135]盡管RA的原因仍未知，但是有GM-CSF在RA的發(fā)展中起作用的累積證據。RA被認為通過T細胞介導的抗原特異性過程被引發(fā)和驅動。簡言之，在易感宿主中的未鑒定抗原的存在被認為引發(fā)導致T細胞細胞因子產生的T細胞反應，結果增加了包括嗜中性粒細胞、巨噬細胞和B細胞的炎癥細胞。
[0136]許多促炎癥和抗炎癥細胞因子在風濕性關節(jié)中產生。而且，疾病發(fā)展、復發(fā)和靜息都由關節(jié)內細胞因子產生的動態(tài)變化介導。特別地，TNF-α和IL-1被認為在RA的發(fā)病過程中起關鍵作用，并且許多更新的已研究完成的或正在研制過程中的對該病的治療方法注意到抑制這兩種 促炎癥細胞因子的活性。
[0137]最近在嚙齒類動物模型中的研究已顯示GM-CSF在RA的發(fā)生和進展中發(fā)揮著中心的和非多余的作用。外源重組GM-CSF的使用在膠原誘導關節(jié)炎(CIAK39]和單關節(jié)關節(jié)炎模型[40]的兩種不同小鼠RA模型中增強了病理癥狀。除此之外，另外已證實GM-CSF敲除(GM-CSF—^)小鼠對CIA發(fā)生具有抗性，并且與野生型小鼠相比，在滑膜關節(jié)液中發(fā)現的IL-1和腫瘤壞死因子(TNF-a)水平降低[41、42]。類似地，與野生型小鼠相比，在GM-CSF]—小鼠中利用關節(jié)內注射甲基化牛血清白蛋白和IL-1誘導單關節(jié)炎產生的疾病嚴重程度降低[43]。
[0138]此外，給予鼠抗GM-CSF mAb顯著改善CIA和單關節(jié)關節(jié)炎模型中的疾病嚴重程度。在CIA模型中，mAb治療在處理已確立疾病的發(fā)展、組織病理學和顯著降低關節(jié)IL-1和TNF-a水平方面是有效的。此外，在關節(jié)炎發(fā)作之前的mAb治療減輕CIA疾病嚴重程度[44,43]ο
[0139]許多研究已經分析了來自人體組織的關節(jié)滑液和膜活體組織樣品中存在的細胞因子和受體的水平。通過使用ΡΕ標記的GM-CSF，對27位RA患者、13位健康志愿者和14位骨質疏松患者的循環(huán)系統(tǒng)單核細胞的GM-CSFR水平進行了測定[45]。在該研究中證實與健康對照(20% )和經調查有骨質疏松的患者(25% )相比，在RA患者(53% )中檢測到兩倍之多的受體陽性細胞，因此說明單核細胞可能很容易對局部產生的GM-CSF作出反應。利用SF細胞的原位雜交，RA患者的細胞因子基因表達證明GM-CSF、IL_1、TNF-a和IL-6水平的提高。此外，分離和培養(yǎng)的源自正常志愿者的纖維原細胞的滑膜細胞顯示出響應于IL-1 a、IL-1 β、TNF- a 和 TNF- β 的 GM-CSF 蛋白水平的升高[47]。RA 患者中 GM-CSF 血清水平的定量[48]顯示，嚴重(366pg / ml，n=26)和中度(376pg / ml，n=58)RA患者的蛋白質水平與對照組(174pg / ml，n=43)相比增加，此外，也顯示在患RA患者的SF中GM-CSF顯著提高(1300pg / ml)。
[0140]以前已觀察到在治療嗜中性白血球減少癥的患者中給予重組GM-CSF可能導致RA加重[49]。對費爾蒂綜合征(Felty’ s syndrome)治療后的患者施用重組GM-CSF也觀察類似的現象[50]。
[0141]慢性阻塞性肺疾病(C0PD)
[0142]慢性阻塞性肺疾病(C0PD)被定義為以不可完全恢復的氣流限制為特征的疾病狀態(tài)。慢性氣流限制通常為漸進性的并且與肺對毒性顆?；驓怏w的異常炎癥反應相關。該氣流限制由小的氣道疾病(閉塞性支氣管炎)和薄壁組織破壞(肺氣腫)的混合導致，其對于COPD的相對影響因人而異。COPD的最終特征癥狀為咳嗽、生痰、以及用力時呼吸困難。coro為重要的公眾健康問題并且在美國為導致慢性病和死亡的第四位的原因。目前使用最初研制用于哮喘病的藥物治療該病，如帶有或不帶有支氣管擴張劑(包括β拮抗劑)的皮質類留醇。然而，這些藥物中無一顯示出減緩COPD的發(fā)展的功效[51]。例如，顯著抑制哮喘中嗜酸性細胞炎癥的皮質類甾醇未顯示出對主要為中性粒細胞介導的COPD中所見炎癥有任何作用[52]。因此，需要以該病的病理學為基礎研制特異性以炎癥過程為目標的新的COPD治療藥物。GM-CSF通過其在中性粒細胞和巨噬細胞功能方面的作用可能在COPD病理發(fā)生方面起重要作用。
[0143]在使用定量PCR的研究中，已顯示出相對于非阻礙吸煙者的痰，在年齡匹配的COPD患者的痰中GM-CSF復本數顯著提高[53]。此外，在吸煙誘導的肺炎癥的嚙齒類模型中，在煙霧暴露前2天、4小時和I小時用GM-CSF抗體鼻內處理的動物與同種型對照抗體對比，在激發(fā)后5天BAL的中性粒細胞、巨噬細胞和ΜΜΡ-9水平顯示出顯著下降[54]。我們自己在大的COPD嚴重程度范圍內的患者的誘導痰中GM-CSF水平的研究中觀察的結果也支持這些研究。在這些研究中，我們表明，無論疾病的嚴重程度，在約40 %測試的COPD患者的痰中GM-CSF增加，在某些情況下GM-CSF水平接近500pg / ml。在不吸煙或吸煙的匹配對照患者中GMCSF不表現出增加。這些數據暗示GM-CSF可能為吸煙誘導的氣道炎癥和COPD中的關鍵介體之一。
[0144]多發(fā)性硬化(MS)
[0145]GM-CSF參與到自體免疫疾病多發(fā)性硬化中。通過向嚙齒類動物給予髓鞘少突膠質細胞糖蛋白(MOG)抗原，可以誘導人多發(fā)性硬化模型，其顯示了如中樞神經系統(tǒng)炎癥和能夠導致MS樣麻痹的髓鞘脫失的許多MS表型。在GM-CSF空白小鼠中，MOG不能誘導EAE表型[55]。此外，這些小鼠顯示具有對MOG抗原的T細胞增殖反應降低和Thl細胞因子IL-6和IFN-Y的產生下降。在抗原激發(fā)的同時施用GM-CSF中和抗體在治療后的10天內防止了疾病發(fā)作，同時具有明顯的損傷減少。如果在疾病發(fā)作之后給藥，小鼠在治療的20天內完全康復[55]。
[0146]白血病
[0147]GM-CSF也與髓系白血病、幼年慢性髓系白血病(JCML)相關。該狀態(tài)為主要侵襲不到四歲的患者的骨髓增生性疾病。在體外，JCML外周血粒細胞-巨噬細胞祖細胞(CFU-GM)顯示了在低細胞密度下的自發(fā)增殖，這是先前對于其它骨髓增生性疾病未描述過的現象。此外，從這些培養(yǎng)物中耗竭單核細胞消除了該增殖。隨后，已證實這種自發(fā)增殖由JCML祖細胞對單核細胞源的細胞因子GM-CSF的超敏性介導[56、57、58、59、60、61]。JCML祖細胞的超敏性表現為通過下調的GM-CSF誘導的Ras信號轉導途徑，而非在JCML患者中GM-CSF過量產生或水平升高[62]。最近利用GM-CSF類似物(E21R)(其拮抗GM-CSF在結合研究和功能分析兩個方面中的作用)的研究已顯示出通過抑制GM-CSF的作用可以在重度復合免疫缺陷/非肥胖糖尿病(SCID / N0D)小鼠的JCML異種移植模型中顯著降低JCML細胞負載[63]。在移植時的E21R的預防性系統(tǒng)給藥防止在骨髓中建立JCML祖細胞、并且在移植后4周給予E21R導致JCML的緩解，同時細胞負載減少。此外，向以正常人骨髓和JCML骨髓共同移植的SCID / NOD小鼠給予E21R導致JCML負載下降，然而正常骨髓細胞保持未受影響。
[0148]動脈硬化癥
[0149]缺血性心臟病為世界范圍內最常見的死亡原因。近些年來，炎癥在動脈硬化的病理形成中起重要作用的觀點已得到加強，因為隨著動脈壁的脂類積累同時發(fā)生炎癥細胞積累。
[0150]一旦駐留于動脈壁中，炎癥細胞(如單核細胞和巨噬細胞)就參與和保持局部炎癥反應。這些巨噬細胞也表達各種脂蛋白的清道夫受體，因而有助于細胞分化為“泡沫細胞(foamy cell)”。正是這些“泡沫細胞”的死亡有助于形成脂質核，這是這些損傷的典型特征。由于炎癥在這些動脈硬化樣斑塊內持續(xù)，因此，這些活化的炎癥細胞釋放促進平滑肌細胞(SMC)增殖和斑塊纖維化的纖維發(fā)生介體和生長因子。除了促進纖維化外，這些細胞也釋放有助于弱化纖維變性斑塊的蛋白水解酶，如基質金屬蛋白酶(MMPs)，從而使其易于破裂。一旦這些斑塊破裂，其釋放細胞碎片和如組織因子的凝血因子到血管內，刺激凝血連鎖和血栓塊的形成。然后，所導致的動脈血栓能夠導致心肌缺血或梗死。
[0151]最近發(fā)現，在動脈硬化的疾病發(fā)展的許多方面涉及GM-CSF。在膽固醇飼喂的兔的動脈硬化損傷中，GM-CSF被發(fā)現與巨噬細胞共同定位并且達到更低水平的內皮細胞和SMC[64]。此外，已顯示在巨噬細胞積累處的人動脈硬化血管內及在中間SMC和內皮細胞內GM-CSF表達增加[65 ]。這種GM-CSF水平的增加部分由于在動脈硬化損傷形成和病理發(fā)生過程中單核細胞/巨噬細胞與內皮細胞的直接細胞-細胞接觸[66]。動脈損傷(atheroticlesion)中另一關鍵因素為“泡沫細胞”，即已通過表面上的清道夫受體攝取氧化的低密度脂蛋白(LDL)的巨噬細胞。在體外，該Ox-LOD的攝取可以通過GM-CSF依賴的機制進一步刺激巨噬細胞增殖[67]。
[0152]由于動脈硬化為慢性炎癥過程，已對如糖皮質激素的抗炎劑進行了研究。地塞米松(一種抗炎癥糖皮質激素)在各種試驗動物模型中抑制動脈硬化的形成[68、69、70、71]。其功效歸因于抑制SMC遷移[72]和增殖[73]及循環(huán)單核細胞和白細胞的趨化性[74]。最近的研究顯示ox-LDL可以誘導鼠腹膜巨噬細胞釋放GM-CSF[75]。此外，在使用地塞米松治療后，這種GM-CSF釋放受到劑量依賴性的抑制，暗示地塞米松的抗炎癥作用是通過抑制ox-LDL誘導的GM-CSF合成介導的。由于GM-CSF在動脈硬化中顯示出具有核心作用，因此根據這一啟示，替代糖皮質激素的方式可以抑制GM-CSF活性。
[0153]術語
[0154]此處使用的“和/或”被理解為明確公開兩種特定特征或組分中的任一種而同時具有或不具有另一種。例如“A和/或B”理解為明確地公開了(i)A、(ii)B和(iii)A和B中的各個情形，正如它們在此處單獨給出。
[0155]GM-CSFR α 和 GM-CSF
[0156]GM-CSFR α為粒細胞巨噬細胞集落刺激因子受體的α鏈。人GM_CSFRa的全長序列以登錄號S06945(g1:106355)進行保藏[76]，并且此處作為SEQ ID NO:202列出。人GM-CSFRa的成熟形式，即剪去信號肽的形式在此處作為SEQ ID NO:206列出。除非上下文另有說明，此處對GM-CSFRa的引用指人或非人靈長類(如獼猴)的GM-CSFRa，通常指人的GM-CSFRa。GM-CSFRa可以為天然形成的GM-CSFR α或重組的GM-CSFR α。[0157]人GM-CSF受體α的298個氨基酸的細胞外域具有SEQ ID NO:205所示氨基酸序列。
[0158]除非上下文另有說明，此處對GM-CSF的引用指人或非人靈長類(如獼猴)的GM-CSF，通常指人的GM-CSF。
[0159]GM-CSF通常結合成熟GM-CSF受體α鏈(SEQ ID NO:206)的細胞外域(SEQ IDNO:205)。如本發(fā)明其它內容所述，該結合被本發(fā)明的結合元件抑制。
[0160]天然形成的GM-CSFRa剪接變異體已被鑒定-參見例如參考文獻[77和78]。在這些剪接變異體中細胞外域是高度保守的。本發(fā)明的結合元件可以結合或不結合一種或多種GM-CSFR a的剪接變異體，并且可以抑制或不抑制GM-CSF與一種或多種GM-CSFR a的結合變異體的結合。
[0161]結合元件
[0162]此處描述了一對互相結合的分子的一個成員。該結合對的成員可以天然形成或全部或部分合成產生。該分子對的一個成員其表面上具有與分子對的另一成員的特定空間和極性組織結合并因而互補的區(qū)域或孔穴。結合對的類型的例子為抗原-抗體、生物素-抗生物素蛋白、激素-激素受體、受體-配體、酶-底物。本發(fā)明涉及抗原-抗體型反應。
[0163]結合元件通常包括具有抗原結合位點的分子。例如，結合元件可以是抗體分子或包括抗原結合位點的非抗體蛋白?？梢酝ㄟ^CDR在如人纖連蛋白或細胞色素B等的非抗體蛋白支架上的排列[80、81、82]，或者通過使蛋白支架內的環(huán)的氨基酸殘基隨機化或發(fā)生突變而賦予與期望目標結合的能力來提供抗原結合位點。對蛋白質中新結合位點進行工程化的支架已被詳細評述[82]。在WO / 0034784中公開了用于抗體模擬物的蛋白支架，其中發(fā)明人描述了包括具有至少一個隨機環(huán)的III型纖連蛋白域的蛋白質(抗體模擬物)?？梢酝ㄟ^免疫球蛋白基因超家族的`任何域成員提供其中接合一個或多個CDR(如一組HCDR)的合適支架。
[0164]非抗體蛋白支架的優(yōu)點為其可以在比至少某些抗體分子更小和/或更易操作的支架分子中提供抗原結合位點。結合元件的小尺寸可以賦予其有利的生理特性，如進入細胞、滲透到組織內深處或到達其它結構內的目標的能力、或者結合到靶抗原的蛋白孔穴內的能力。
[0165]在參考文獻[79]中綜述了抗原結合位點在非抗體蛋白支架中的應用。典型的為具有穩(wěn)定的骨架和一個或多個可變環(huán)的蛋白質，其中一個或多個環(huán)的氨基酸序列被特意地或隨機地突變以產生結合靶抗原的抗原結合位點。這種蛋白質包括來自金黃色葡萄球菌(S.aureus)的蛋白A的IgG結合域、轉鐵蛋白、四連接素(tetranectin)、纖連蛋白(如第10III型纖連蛋白域)和脂籠蛋白(Iipocalin)。其它的途徑包括合成的“微體”(SelecoreGmbH),其基于植物大環(huán)寡肽(cyclotide)-具有分子內二硫鍵的小蛋白質。
[0166]除抗體序列和/或抗原結合位點外，根據本發(fā)明的結合元件可以包括如形成肽或多肽(如折疊域)的、或者賦予分子除結合抗原能力外的另一功能特性的其它氨基酸。本發(fā)明的結合元件可以攜帶可檢測標記，或者可以與毒素或者靶向結構或酶偶聯(lián)(如經肽鍵或連接物)。例如，結合元件可以包括催化位點(如在酶域內)以及抗原結合位點，其中抗原結合位點結合抗原，而因此將催化位點指向抗原。催化位點可以通過例如切割來抑制抗原的生物功能。[0167]盡管如所述的，⑶R可以由如纖連蛋白或細胞色素B的支架攜帶[80、81、82]，但是攜帶本發(fā)明的CDR或CDR組的結構通常為抗體重或輕鏈序列或其基本部分，其中CDR或CDR組位于相應于由重排的免疫球蛋白基因所編碼的天然形成VH和VL抗體可變域的⑶R或⑶R組的位置。免疫球蛋白可變域的結構和位置可以參照現在在互聯(lián)網上可獲得的(http: / / immun0.bme.nwu.edu或用任何搜索引擎尋找"Kabat")文獻kabat等,1987[98]及其更新來確定。
[0168]本發(fā)明的結合元件可以包括抗體恒定區(qū)或其部分、優(yōu)選人抗體恒定區(qū)或其部分。例如，VL域可以在其C末端與包括人Ck或CX鏈(優(yōu)選CX鏈)的抗體輕鏈恒定域連接。類似地，基于VH域的結合元件可以在其C末端與源自如IgG、IgA、IgE和IgM的任何抗體同種型和任何同種型亞類(特別是IgGl、IgG2和IgG4)的免疫球蛋白重鏈的全部或部分(如CH1域)連接。優(yōu)選為IgGl、IgG2或IgG4。因為IgG4不結合補體且不產生效應子功能，所以IgG4是優(yōu)選的。具有這些特性且使可變區(qū)穩(wěn)定的任何合成的或其它恒定區(qū)變異體在本發(fā)明的實施方式中的應用中也是優(yōu)選的。
[0169]本發(fā)明的結合元件可以用可檢測的或功能性的標記物標記。可檢測的標記物包括如1311或"Tc的放射性標記物，其可以使用抗體成像領域中已知的常規(guī)化學方法連接于本發(fā)明的抗體。標記物也包括如辣根過氧化物酶的酶標記物。標記物進一步包括可以通過結合特定同源可檢測結構(如標記的抗生物素蛋白)進行檢測的化學結構(如生物素)。因此，本發(fā)明的結合元件或抗體分子可以為包括任選地經連接物(如肽)聯(lián)接的結合元件和標記物的綴合物的形式。例如，結合元件可以與酶(如過氧化物酶、堿性磷酸酶)或包括，但不限于生物素、熒光色素、綠色熒光蛋白的熒光標記物偶聯(lián)。此外，標記物可以包括毒素結構，如選自假單胞菌外毒素(PE或其細胞毒性片段或突變體)、白喉毒素(其細胞毒性片段或突變體)、肉毒桿菌毒素A~F、蓖麻毒素或其細胞毒性片段、相思豆毒素或其細胞毒性片段、皂草毒蛋白(saporin)或其細胞毒性片段、美洲商陸抗病毒毒素或其細胞毒性片段以及異株瀉根毒蛋白l(bryo dinl)或其細胞毒性片段的組的毒素結構。當結合元件包括抗體分子時，標記的結合元件可被稱作免疫綴合物(immunoconjugate)。
[0170]抗體分子
[0171]這描述了天然產生的或者部分或全部合成產生的免疫球蛋白。該術語也涵蓋任何包括抗體抗原結合位點的多肽或蛋白。包括抗體抗原結合位點的抗體片段為如Fab、F(ab，)2、Fab’、Fab’ _SH、scFV、Fv、dAb、Fd 和雙體的分子。
[0172]取得單克隆和其它抗體分子并且利用重組DNA技術制備其它抗體或保留原始抗體的特異性的嵌合分子是可能的。這種技術可以涉及向不同免疫球蛋白的恒定區(qū)(或恒定區(qū)加框架區(qū))引入編碼抗體的免疫球蛋白可變區(qū)(或CDR)的DNA。例如，參見EP-A-184187、GB2188638A或EP-A-239400以及大量的后續(xù)文獻。雜交瘤或其它產生抗體的細胞可以發(fā)生遺傳突變或其它改變，這可能改變或不改變產生的抗體的靶結合。
[0173]因為抗體可以以許多方式被修飾，因此，術語“抗體分子”應理解為涵蓋任何具有抗體抗原結合位點的結合元件或物質。因此，該術語涵蓋抗體片段和衍生物，包括任何含抗體抗原結合位點的多肽，而無論其是天然的或全部或部分合成的。因而包括與另一多肽融合的包含抗體結合位點的嵌合分子、或者其等價物。在ΕΡ-Α-0120694和ΕΡ-Α-0125023以及大量的后續(xù)文獻中描述了嵌合抗體的克隆和表達。[0174]抗體工程領域中可獲得的進一步的技術使得分離人和人源抗體成為可能。人和人源抗體為本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，并且可以使用任何適當的方法制備。例如，可以制備人雜交瘤[83]。噬菌體呈現(用于制備結合元件的另一種已建立技術)已在如參考文獻[83]和TO92 / 01047(以下進一步討論)的許多公開文獻中進行了詳細描述。其中小鼠抗體基因被滅活并且用人抗體基因功能性取代、而同時小鼠免疫系統(tǒng)的其它組分保持完整的轉基因小鼠可以被用于分離人抗體[84]?？梢岳萌缭赪091 / 09967、US5585089、EP592106、US565332和W093 / 17105中公開的本領域中的已知技術制備人源抗體。此外W02004 /006955描述了基于通過對比非人抗體的可變區(qū)⑶R序列的正則⑶R結構類型和來自人抗體序列庫(如胚系抗體基因片段)的相應CDR的正則CDR結構類型從人抗體基因選擇可變區(qū)框架序列的用于抗體人源化的方法。具有與非人CDR類似的正則CDR結構類型的人抗體可變區(qū)構成從其中選擇人框架序列的人抗體序列成員子集?？梢酝ㄟ^人和非人CDR序列之間的氨基酸類似性進一步對子集成員分級。在W02004 / 006955的方法中，頂級的人序列被選擇來提供用于利用選擇的子集成員人框架構建以非人CDR對應部分功能性取代人CDR序列的嵌合抗體的框架序列，從而提供高親和性和低免疫原性的人源化抗體而無需在非人和人抗體之間對比框架序列。根據本發(fā)明的方法制備的嵌合抗體也被公開。
[0175]通過表達由在適當的表達載體內合成和組裝的寡核苷酸產生的基因可以制備合成抗體分子[85、86]。
[0176]已表明完整抗體的片段可以實行結合抗原的功能。結合片段的例子為(i)由VL、VH、CL和CHl域組成的Fab片段；(ii)由VH和CHl域組成的Fd片段；(iii)由單個抗體的VL和VH域組成的Fv 片段；(iv)由VH或VL域組成的dAb片段[87，88，89] ； (v)分離的CDR區(qū)；(vi)F(ab’)2片段，為包括兩個連接的Fab片段的雙價片段；(vii)單鏈Fv分子(scFv)，其中VH域和VL域通過使得兩個域聯(lián)合的肽連接物連接以形成抗原結合位點[90、91] ; (viii)雙特異性的單鏈Fv 二聚體(PCT / US92 / 09965)和(ix) “雙體”，通過基因融合構建的多價或多特異性片段(W094 / 13804 ;[92])。可以通過引入連接VH和VL域的二硫橋穩(wěn)定Fv、scFV或雙體分子[93]。包括與CH3域聯(lián)接的scFv的微體也可以被制備[94]。
[0177]dAb (域抗體)為抗體的小型單體抗原結合片段，即抗體重或輕鏈的可變區(qū)[89]。VH dAb在駝類(如駱駝、美洲鴕)中自然形成，并且可以通過用特定抗原免疫駱駝、分離抗原特異性B細胞并直接克隆來自個體B細胞的dAb基因而被制備。dAb也在細胞培養(yǎng)中產生。其較小的尺寸、良好的溶解性和溫度穩(wěn)定性使其在生理上尤其有用，且適于選擇和親合力成熟。本發(fā)明的結合元件可以為包括基本如此處所示的VH或VL域或者包括包含基本如此處所示的一組⑶R的VH或VL域的dAb?！盎救缢尽币馕吨景l(fā)明的相關⑶R或者VH或VL域與序列在此被給出的特定區(qū)域相同或高度相似?！案叨认嗨啤币馕吨贑DR和/或VH或VL域內可以進行I~5個、優(yōu)選I~4個(如I~3個，或I個、或2個、或3個或4個)氨基酸的取代。
[0178]當使用雙特異性抗體時，其可以為通過多種方法[95]制備的(如化學或雜交瘤制備的)常規(guī)雙特異性抗體，或者可以為任何上述雙特異性抗體片段。雙特異性抗體的例子包括BiTE?技術的雙特異性抗體，其中具有不同特異性的兩種抗體的結合域可以被使用和經短的柔性肽直接連接。這將兩種抗體組合在短的單個多肽鏈上。通過僅使用可變域可構建雙體和scFv而無Fc域，從而潛在地降低了抗個體型反應的效應。
[0179]因為其可以在大腸桿菌中容易地構建和表達，所以與雙特異性全抗體相比，雙特異性雙體也可能是特別有利的。利用文庫的噬菌體呈現(W094 / 13804)可以容易地選擇具有適當結合特異性的雙體(和如抗體片段的許多其它多肽)。如果雙體的一個臂保持恒定，例如對準GM-CSFRa，則可以形成其中另一臂被改變且選擇具有適當目標結合的抗體的庫?？梢酝ㄟ^件白(knob-1nto-hole)工程產生雙特異全抗體[96]。
[0180]抗原結合位點
[0181]這描述了與靶抗原的全部或部分結合并互補的分子的部分。在抗體分子中，其被稱作抗體抗原結合位點，并且包括與靶抗原的全部或部分結合并互補的抗體部分。當抗原較大時，抗體可以僅結合抗原的特定部分，該部分被稱為表位。抗體抗原結合位點可以由一個或多個抗體可變域提供。優(yōu)選地，抗體抗原結合位點包括抗體輕鏈可變區(qū)(VL)和抗體重鏈可變區(qū)(VH)。
[0182]Kabat 編號
[0183]此處的抗體序列的殘基通常利用如Kabat等，1971 [97]中所定乂的Kabat編號指稱。也參見參考文獻[98、99]。
[0184]分離的
[0185]這指其中本發(fā)明的結合元件或編碼該結合元件的核酸按照本發(fā)明一般所處的狀態(tài)。分離的元件和分離的核酸沒有或基本沒有其天然相關的物質，如在其自然環(huán)境或當通過體外或體內實施的重組DNA技術制備時在其被制備的環(huán)境(如細胞培養(yǎng))中被發(fā)現的其它多肽或核酸。元件和核酸可以利用稀釋液或輔劑進行配制，并且出于實際目的可以仍然是分離的-例如，如果在免疫試驗中用于涂覆微滴定板，元件通常與凝膠或者其它載體混合，或者當用于診斷或治療時與藥物可接受的載體或稀釋液混合。結合元件可以天然地或通過異源真核細胞系統(tǒng)(如CH0或NS0(ECACC85110503))被糖基化，或者其可以是未糖基化的(例如，如果通過在原核細胞中表達產生)。
[0186]具體地，本發(fā)明涉及以下各項:
[0187]1、一種分離的人GM-CSFRa結合元件，其中，所述結合元件抑制GM-CSF與GM-CSFRa的結合，并且其中所述結合元件結合如SEQ ID NO:206所示人GM-CSFR α的226~230位的Tyr-Leu-Asp-Phe-Gln中的至少一個殘基。
[0188]2、根據第1項的結合元件，在表面等離子共振試驗中，其以5nM或更低的親和性(KD)結合到人GM-CSFRa的細胞外域。
[0189]3、根據第1或2項的結合元件，其包括抗體分子。
[0190]4、根據第3項的結合元件，包括抗體VH域，所述抗體VH域包含一組互補決定區(qū)CDR1、CDR2和CDR3及框架，其中，所述互補決定區(qū)組包括具有SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:173的氨基酸序列的⑶R1、具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的⑶R2、以及具有選自SEQ IDNO:5,SEQ ID NO: 15,SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:55、SEQ IDNO:65,SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:115、SEQID NO:125,SEQ ID NO:` 135,SEQ ID NO:145、SEQ ID NO: 155,SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:185 和 SEQ ID NO:195 的氨基酸序列的 CDR3 ；
[0191]或者包含具有一個或兩個氨基酸取代的該⑶R序列組。[0192]5、根據第3或4項的結合元件，包括包含互補決定區(qū)⑶R1XDR2和⑶R3以及框架的抗體VH域，并且其中VH CDR3中的Kabat殘基H97為S。
[0193]6、根據第5項的結合元件，其中VH⑶R3進一步包含一個或多個以下殘基:[0194]在Kabat 殘基H95 處的 V、N、A 或 L;
[0195]在Kabat 殘基 H99 處的 S、F、H、P、T 或W ;
[0196]在Kabat 殘基 H100B 處的 A、T、P、S、V 或 H。
[0197]7、根據第6項的結合元件，其中Kabat殘基H95為V。
[0198]8、根據第6或7項的結合元件，其中Kabat殘基H99為S。
[0199]9、根據第6-8項中任一項的結合元件，其中Kabat殘基H100B為A或T。
[0200]10、根據第6-9項中任一項的結合元件，其中，VH CDR3具有選自SEQ ID NO:5、SEQID NO:15、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:125、SEQ IDNO:135,SEQ ID NO:145、SEQ ID NO: 155,SEQ ID NO: 165,SEQ ID NO: 175,SEQ ID NO:185和SEQ ID NO:195的氨基酸序列。
[0201]11、根據第5-10項任一項的結合元件，其中，在VH CDRl中Kabat殘基H34為I。
[0202]12、根據第5-11項中任一項的結合元件，其中VH⑶Rl具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
[0203]13、根據第5-12項中任一項的結合元件，其中VH⑶R2包含位于Kabat殘基H54處的E和/或位于Kabat殘基H57處的I。
[0204]14、根據第5-13項中任一項的結合元件，其中VH CDR2具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
[0205]15、根據第5-14項中任一項的結合元件，其中在VH域框架中的Kabat殘基H17為S0
[0206]16、根據第5-15項中任一項的結合元件，包含抗體VL域，所述抗體VL域包含互補決定區(qū)⑶R1、⑶R2和⑶R3以及框架。
[0207]17、根據第16項的結合元件，其中VL⑶R3包含一個或多個以下殘基:
[0208]在Kabat 殘基 L90 處的 S、T 或 M ;
[0209]在Kabat 殘基 L92 處的 D、E、Q、S、M 或 T ;
[0210]在Kabat 殘基 L96 處的 S、P、I 或 V。
[0211]18、根據第17項的結合元件，其中Kabat殘基L90為S。
[0212]19、根據第17或18的項結合元件，其中Kabat殘基L92為D或E。
[0213]20、根據第17-19項中任一項的結合元件，其中Kabat殘基L95A為S。
[0214]21、根據第17-20項中任一項的結合元件，其中Kabat殘基L96為S。
[0215]22、根據第16或17項任一項的結合元件，其中VL CDR3具有選自SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:40,SEQ ID NO: 50,SEQ ID NO:60,SEQ ID NO:70,SEQ ID NO:80、SEQ ID N0:90、SEQ ID NO: 100、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 120、SEQ ID NO: 130、SEQID NO:140,SEQ ID NO: 150,SEQ ID NO:160、SEQ ID NO: 170,SEQ ID NO:180、SEQ ID NO:190和SEQ ID NO:200的氨基酸序列。
[0216]23、根據第16-22項中任一項的結合元件，其中VL⑶Rl包含一個或多個以下殘基:
[0217]在Kabat 殘基 27A 處的 S ;
[0218]在Kabat 殘基 27B 處的 N ;
[0219]在Kabat 殘基 27C 處的 I ;
[0220]在Kabat殘基32處的D。
[0221]24、根據第16-23項中任一項的結合元件，其中VL CDR1具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
[0222]25、根據第16-24項中任一項的結合元件，其中VL⑶R2包含一個或多個以下殘基:
[0223]在Kabat殘基51處的N;
[0224]在Kabat殘基52處的N ;
[0225]在Kabat殘基53處的K。
[0226]26、根據第16-25項中任一項的結合元件，其中VL CDR2具有SEQ ID NO:9的氨基
酸序列。
[0227]27、根據第3-26項中任一項的結合元件，包括其中Kabat殘基H94為I的抗體VH域。`
[0228]28、一種分離的人GM-CSFR α結合元件，其中所述結合元件抑制GM-CSF與GM-CSFRa的結合，并且其中在表面等離子共振試驗中，所述結合元件以5nM或更低的親和性(KD)結合人GM-CSFRa細胞外域。
[0229]29、根據第28項的結合元件，其包括抗體分子。
[0230]30、一種分離的人GM-CSFR α結合元件，其中所述結合元件抑制GM-CSF與GM-CSFR α的結合，并且其中所述結合元件包括與具有選自以下的氨基酸序列的VH域和VL域的抗體分子競爭結合人GM-CSFRa的細胞外域的人或人源化抗體分子:
[0231]VH 域 SEQ ID NO:2 和 VL 域 SEQ ID NO:7 ；
[0232]VH 域 SEQ ID NO:12 和 VL 域 SEQ ID NO: 17 ;
[0233]VH 域 SEQ ID NO:22 和 VL 域 SEQ ID NO:27 ;
[0234]VH 域 SEQ ID NO:32 和 VL 域 SEQ ID NO:37 ;
[0235]VH 域 SEQ ID NO:42 和 VL 域 SEQ ID NO:47 ;
[0236]VH 域 SEQ ID NO:52 和 VL 域 SEQ ID NO:57 ;
[0237]VH 域 SEQ ID NO:62 和 VL 域 SEQ ID NO:67 ;
[0238]VH 域 SEQ ID NO:72 和 VL 域 SEQ ID NO:77 ;
[0239]VH 域 SEQ ID NO:82 和 VL 域 SEQ ID NO:87 ;
[0240]VH 域 SEQ ID NO:92 和 VL 域 SEQ ID NO:97 ;
[0241 ]VH 域 SEQ ID NO: 102 和 VL 域 SEQ ID NO: 107 ；
[0242]VH 域 SEQ ID NO: 112 和 VL 域 SEQ ID NO: 117 ;
[0243]VH 域 SEQ ID NO: 122 和 VL 域 SEQ ID NO: 127 ;
[0244]VH 域 SEQ ID NO: 132 和 VL 域 SEQ ID NO: 137 ;
[0245]VH 域 SEQ ID NO: 142 和 VL 域 SEQ ID NO: 147 ；
[0246]VH 域 SEQ ID NO: 152 和 VL 域 SEQ ID NO: 157 ;[0247]VH 域 SEQ ID NO: 162 和 VL 域 SEQ ID NO: 167 ；
[0248]VH 域 SEQ ID NO: 172 和 VL 域 SEQ ID NO: 177 ;
[0249]VH 域 SEQ ID NO:182 和 VL 域 SEQ ID NO:187 ;或
[0250]VH 域 SEQ ID NO:192 和 VL 域 SEQ ID NO:197。
[0251]31、一種分離的人GM-CSFRa結合元件，其中所述結合元件抑制GM-CSF與GM-CSFR a的結合，并且其中所述結合元件包括含抗體VH域的抗體分子，所述抗體VH域包含一組互補決定區(qū)HCDR1、HCDR2和HCDR3以及框架，其中所述互補決定區(qū)組包括具有SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:173的氨基酸序列的HCDRl、具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的 HCDR2 和具有選自 SEQ ID N0:5、SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:35, SEQ IDNO:45, SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:95、SEQID NO:105,SEQ ID NO: 115、SEQ ID NO: 125,SEQ ID NO: 135、SEQ ID NO: 145,SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:165, SEQ ID NO:175, SEQ ID NO:185 和 SEQ ID NO:195 的氨基酸序列的HCDR3。
[0252]32、根據第3-27項中任一項或第29_31項中任一項所述的結合元件，其中所述抗體分子為人或人源化抗體分子。
[0253]33、根據第32項所述的結合元件，其中所述VH域框架為人種系VH1DP5或VH3DP47框架。
[0254]34、根據第32或33項的結合元件，包括VL域，其中所述VL域框架為人種系V λ 1DPL8、V λ 1DPL3 或 V λ 6_6a 框架。
[0255]35、一種分離的人GM-CSFRa抗體分子，其抑制GM-CSF與GM-CSFR a的結合，并且其包括:
[0256]具有如SEQ ID NO:52所示VH域氨基酸序列的VH域或具有一個或兩個氨基酸改變的其變異體，和
[0257]具有如SEQ ID NO:57所示VL域氨基酸序列的VL域或具有一個或兩個氨基酸改變的其變異體；
[0258]其中所述氨基酸改變選自替代、插入和缺失。
[0259]36、根據第3-27或29_34項中任一項的結合元件，或者根據第35項的抗體分子，其中所述抗體分子為IgG4。
[0260]37、根據第1-36項中任一項的結合元件或抗體分子，其在表面等離子共振試驗中，以InM或更低的親和性(KD)結合人GM-CSFRa細胞外域。
[0261]38、根據第37項的結合元件或抗體分子，其在表面等離子共振試驗中，以0.5nM或更低的親和性(KD)結合人GM-CSFR a細胞外域。
[0262]39、根據上述各項中任一項的結合元件或抗體分子，其在使用7pM人GM-CSF的TF-1細胞增殖試驗中具有60pM或更低的IC50中和效力。
[0263]40、根據第38項的結合元件或抗體分子，在使用7pM人GM-CSF的TF-1細胞增殖試驗中具有IOpM或更低的IC50中和效力。
[0264]41、根據上述各項中任一項的結合元件或抗體分子，其在使用7pM人GM-CSF的人粒細胞形態(tài)改變試驗中具有50pM或更低的IC50中和效力。
[0265]42、根據第41項的結合元件或抗體分子，其在使用7pM人GM-CSF的人粒細胞形態(tài)改變試驗中具有25pM或更低的IC50中和效力。
[0266]43、根據上述各項中任一項的結合元件或抗體分子，其在使用InM人GM-CSF的單核細胞TNFa釋放試驗中具有ΙΟΟρΜ或更低的IC50中和效力。
[0267]44、包含上述各項中任一項的結合元件或抗體分子和藥物可接受的賦形劑的組合物。
[0268]45、一種包含編碼第1-43項中任一項的結合元件或抗體分子的核酸序列的分離的核酸分子。
[0269]46、一種含第43項的核酸分子的體外宿主細胞。
[0270]47、一種制備第1-43項中任一項的結合元件或抗體分子的方法，包括培養(yǎng)第46項的宿主細胞。
[0271]48、根據第47項的方法，進一步包括純化所述結合元件。
[0272]49、一種制備人GM-CSFR α抗體分子的方法，所述方法包括
[0273]通過包括HCDR1、HCDR2和HCDR3的親本VH域的氨基酸序列中一個或多個氨基酸的插入、缺失或取代提供為親本VH域的氨基酸序列變異體的VH域；其中
[0274]所述親本VH CDR1具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列；
[0275]所述親本VH CDR2 具有SEQ ID N0:4的氨基酸序列；并且
[0276]所述親本VH CDR3 具有選自 SEQ ID N0:5、SEQ ID NO: 15,SEQ ID NO:25,SEQ IDNO:35, SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:85、SEQID NO:95, SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO: 125、SEQ ID NO: 135、SEQ ID NO:145,SEQ ID NO: 155,SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:185 和 SEQ ID NO:195 的氨基酸序列；或者其中
[0277]所述親本VH CDR1具有SEQ ID NO:173的氨基酸序列、所述親本VH CDR2具有SEQID NO:174的氨基酸序列和所述親本VH⑶R3具有SEQ ID NO:175的氨基酸序列；
[0278]和
[0279]任選地組合如此提供的VH域和一個或多個VL域，從而提供一個或多個VH / VL組合；以及
[0280]檢測所述VH域或所述VH / VL組合或多個組合，以識別人GM-CSFRa的抗體分子。
[0281]50、根據第49項所述的方法，其中通過在包括IXDR1、IXDR2和IXDR3的親本VL域的氨基酸序列中一個或多個氨基酸的插入、缺失或取代提供所述一個或多個VL域；其中
[0282]所述親本VL CDR1具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列；
[0283]所述親本VL CDR2具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列；并且
[0284]所述親本VLCDR3具有選自 SEQ ID NO: 10,SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:40, SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:90、SEQID NO:100,SEQ ID NO:110、SEQ ID NO: 120,SEQ ID NO: 130、SEQ ID NO: 140,SEQ ID NO:150、SEQ ID N0:160、SEQ ID N0:170、SEQ ID N0:180、SEQ ID NO:190 和 SEQ ID NO:200的氨基酸序列。
[0285]51、根據第49或50項的方法，包括測試所述抗體分子抑制人GM-CSF與人GM-CSFRa的結合的能力。
[0286]52、一種制備抗體分子組合物的方法，包括使用第49-51項中任一項的方法獲得抗體分子和將所述抗體分子配制為包含至少一種額外組分的組合物。
[0287]53、第1-43項中任一項的結合元件或抗體分子在制備用于治療炎性、呼吸或自體免疫狀態(tài)或疾病的藥物中的用途。
[0288]54、根據第53項的用途，其中所述狀態(tài)或疾病為風濕性關節(jié)炎、哮喘、慢性阻塞性肺疾病、過敏反應、多發(fā)性硬化、髓系白血病或動脈硬化。
[0289]附圖簡要說明
[0290]圖1、在TF-1增殖試驗中兩種抗GM-CSFRa抗體的pA2分析。當存在濃度增加的兩種優(yōu)化IgG4 (分別為抗體6 (圖1A)和抗體I (圖1B))時，利用濃度增加的GM-CSF誘導TF-1細胞增殖。對于曲線圖1A和曲線圖1B所顯示的數據，氚標記的胸腺嘧啶的摻入被測量，并且各抗體濃度下GM-CSF的EC50被計算。然后對于曲線圖1C和曲線圖1D中所顯示的數據，通過schild回歸對劑量比進行計算和分析以獲得PA2值。
[0291]圖2、在粒細胞形態(tài)變化試驗中抗GM-CSFRa抗體，即抗體6的pA2分析。當存在濃度增加的IgG4時，用濃度增加的GM-CSF處理人(曲線圖2A或2C)或獼猴(2B和2D)粒細胞。利用流式細胞儀測量粒細胞形態(tài)改變，并且各抗體濃度下GM-CSF的EC50被計算(曲線圖2A和曲線圖2B)。然后通過schild回歸對劑量比進行計算和分析以獲得PA2值。
[0292]圖3、在測量由7pM人GM-CSF誘導的TF-1細胞增殖的試驗中，兩種作為IgG4的抗體(即分別為抗體I和抗體6)的拮抗效力。也顯示了陽性對照IgG42B7和同種型對照IgG4的數據。數據代表在同一試驗內三次測定的平均值加標準差條。
[0293]圖4、在測量由7pM人GM-CSF誘導的人粒細胞形態(tài)變化的試驗中，兩種作為IgG4的抗體(即分別為抗體I和抗體6)的拮抗效力。也顯示了對照IgG42B7和同種型對照IgG4的數據。數據代表在同一試驗`內三次測定的平均值加標準差條。
[0294]圖5、在測量由InM人GM-CSF刺激的人單核細胞TNFa釋放的試驗中，兩種作為IgG4的抗體(即分別為抗體I和抗體6)的拮抗效力。也顯示了對照抗體2B7和同種型對照IgG4的數據。數據代表在同一試驗內三次測定的平均值加標準差條。
[0295]圖6、在測量由7pM人GM-CSF誘導的人粒細胞存活的試驗中，兩種作為IgG4的抗體(即分別為抗體I和抗體6)的拮抗劑力。也顯示了對照抗體2B7和同種型對照IgG4的數據。數據代表在同一試驗內三次測定的平均值加標準差條。
[0296]圖7、親合力成熟的人mAb抗體I和抗體6,而不是親本人mAb28G5 (抗體3)或已知的鼠抗體2B7，抑制人的造血祖細胞的GM-CSF驅動分化。來自脫落(apheresis)樣品的5xl04個解凍單核細胞在存在IOng / ml GM-CSF和所示濃度的mAb的情況下在半固體瓊脂中培養(yǎng)。在第14天進行集落計數。曲線圖顯示了對抗yg / ml濃度的mAb的集落數。
[0297]圖8、在huGM-CSFR Tg嵌合小鼠中親合力成熟的mAb的效力的劑量-反應分析。用500ng huGM-CSF (或PBS)處理5Tg嵌合小鼠的組(皮下注射，每天兩次，共4天(D.1-D.4))，并在D.0施用對照(CAT001)或所示濃度的測試mAb (抗體6)。在D.5時測定脾重量。
[0298]圖9、抗體6在人外周血單核細胞內源細胞因子釋放試驗中的效力的劑量-反應分析。1x106個細胞在存在和無抗體條件下培養(yǎng)72小時，并且對上清液進行IL-6和TNFaELISA分析。數據代表在同一試驗中兩次測定的平均抑制加標準差條。
【具體實施方式】[0299]試駘部分
[0300]直量
[0301]人抗體片段可以在體外從在絲狀噬菌體的表面上呈現的組成集合中選擇。該過程稱作噬菌體呈現并且提供了獲得人抗體片段的方法。該過程可以用于分離人抗人特異性并且可以進行特別修飾以得到具有特定親合特征的抗體。
[0302]僅由通過短肽連接物聯(lián)合在一起的重鏈可變(VH)和輕鏈可變(VL)域組成的抗體片段包含確定抗原結合所需的全部信息。該片段已知為單鏈Fv(SCFv)。當在噬菌體表面呈現時，scFv顯示正確的折疊和與抗原的結合。通過該方法已經構建了大的人scFv組成集合，并且其提供了從其中分離用于開發(fā)為候選藥物的單個克隆的來源。然后，候選的scFv被重組為用于治療用途的全IgG(典型地人IgG)分子。
[0303]摘要
[0304]為了富集與人GM-CSFRa結合的噬菌體群，對源自人脾淋巴細胞的scFv噬菌體呈現庫進行選擇。我們分離了具有選擇的特征的scFv抗體，并且將這些scFv轉化為IgG4。利用各種試驗，抗體組(panel)被分離、優(yōu)化和胚系化以產生具有治療抗體的適當規(guī)格的IgG4。
[0305]其序列在序列表中顯示為抗體1、2和4~20的19個抗體克隆得自親本抗體。該親本在序列表中顯示為抗體3，且在此也稱為28G5。該19個克隆由于在如試驗部分所描述的多種生物試驗中顯示出特別優(yōu)良的性狀而被選擇，并且被賦予抗體號碼1、2以及4~20。
[0306]生物試驗設計為反映如風濕性關節(jié)炎的疾病的炎癥性質。例如，將中性粒細胞募集到作用位點所必須的中性粒細胞的形態(tài)變化、單核細胞的促炎癥因子釋放和響應于特定信號的炎癥細胞類型的存活增加?？贵w在這些試驗中顯示有效的中和活性。
[0307]所用的試驗方法的詳細方案在下面名為“試驗材料和方法”的部分中提供。
[0308]抗體引導分離
[0309]大的單鏈Fv(scFv)人抗體庫被用于進行選擇。這源自20位健康供體的脾淋巴細胞并且被克隆至噬粒載體內。識別GM-CSFRa的ScFv在對由HEK293T細胞中的受體的純化標記、可溶、細胞外域的超表達得到的純化GM-CSFRa進行的系列重復選擇循環(huán)中從噬菌體呈現庫中分離。這基本按照Vaughan等所述實行[102]。簡言之，在生物素化的受體暴露于噬菌體庫之后，在抗生蛋白鏈菌素包被的磁珠上捕獲具有結合的噬菌體的蛋白。未結合的噬菌體被洗去。然后，如Vaughan等所述得到結合的噬菌體，并且重復選擇過程。在降低抗原濃度的情況下下進行三輪選擇。對來自選擇循環(huán)輸出的scFv的代表性部分進行DNA測序。
[0310]在這些對噬菌體呈現庫的最初選擇后，在被設計為確認能夠抑制GM-CSF與純化的GM-CSFRa細胞外域結合的噬菌體表達scFv抗體的配體結合試驗中鑒定了獨特的scFv組。在配體結合試驗中這些scFv的中和效力為0.65~3.3nM。
[0311]在生化配體結合試驗中有活性的抗體在TF-1增殖試驗中測定其生物活性，F-1增殖試驗通過測試抗體抑制GM-CSF刺激的TF-1細胞增殖的能力測量中和效力。TF-1為從紅白血病患者建立的人前骨髓(premyeloid)細胞系。該細胞系的存活和增殖是因子依賴的，并且常規(guī)地在人GM-CSF中維持。通過測量在分裂細胞的新合成DNA中氚標記的胸腺嘧啶的摻入量的降低確定GM-CSF依賴的增殖的抑制。在該試驗中，所有scFv都具有可測量的效力，IC50值范圍為約180~1200nM。
[0312]最有效的scFv克隆被重排(reformat)為具人Y 4重鏈恒定域和人λ輕鏈恒定域的人IgG4抗體分子。為了使抗體能夠表達為經過一些修飾的Persic等描述的全IgG4抗體[100]，對于最有效的scFv克隆構建載體。所述載體中包括oriP片段，以有利于與HEK-EBNA293細胞一起應用并允許游離型復制。VH可變域被克隆至表達載體pEU8.1 (+)的分泌前導序列和人Y4恒定域之間的多接頭內。VL可變域被克隆至表達載體pEU4.1(-)的分泌前導序列和人λ恒定域之間的多接頭內。ΗΕΚ-ΕΒΝΑ293細胞用表達重和輕鏈的構建體共轉染，并且全抗體使用蛋白A親和層析從條件培養(yǎng)基中純化。純化的抗體制劑被無菌過濾、并且在測試前在4°C下保存于磷酸緩沖鹽水(PBS)中。通過使用BCA方法(Pierce)測量在280nm處的吸收值確定蛋白濃度。
[0313]在TF-1增殖試驗中，重排的IgG與已知鼠抗體2B7進行比較。IgG4在該試驗中保留或增加了活性，IC50值范圍為6~約1600nM。
[0314]在炎性疾病中，中性粒細胞的形態(tài)變化對于其募集到作用位點是必須的。人粒細胞形態(tài)變化試驗被設計為利用熒光活化細胞分選(FACS)測量從血液中分離的粒細胞在暴露于GM-CSF后的形態(tài)改變而模擬該生物反應。測定了抗GM-CSFRa IgG4抗體抑制中性粒細胞對GM-CSF的形態(tài)改變反應的能力，并且確定克隆的IC50值范圍為約15~350nM。代表性抗體28G5在獼猴粒細胞形態(tài)改變試驗中以約5nM的IC50中和獼猴GM-CSFR。已知的鼠抗體2B7也能夠中和由GM-CSF結合獼猴受體所導致的生物反應。
[0315]然后，使用BIAcore測量抗體的受體結合親和力。計算的Kd值范圍為32~377nM。
[0316]優(yōu)化
[0317]為了提高28G5的效力，啟動了優(yōu)化程序。在完成Vh或\ CDR3的隨機誘突的情況下產生了抗體庫。各個⑶R3`在兩個6氨基酸的塊中被隨機化以覆蓋整個⑶R，從而產生Hl (VH CDR3中的6aa的N末端塊)、H2 (VH CDR3中的6aa的C末端塊)、LI (VL CDR3中的6aa的N末端塊)和L2 (VL⑶R3中的6aa的C末端塊)庫。所獲得的庫進行人GM-CSFR α結合的重復選擇循環(huán)。然后，由該選擇過程分離的克隆被用于構建包含具有變異重鏈⑶R3和變異輕鏈CDR3的scFv的組合噬菌體庫。這些庫也被進行相同的選擇過程。
[0318]在優(yōu)化過程的各個階段，利用28G5和受體的表位競爭試驗鑒定能夠抑制28G5IgG4結合GM-CSF受體的scFv，并且然后在如下所述的TF-1增殖試驗中進行測試。
[0319]在28G5的重鏈⑶R3序列的隨機誘變后，scFv的組利用在TF-1試驗中可測量的中和效力進行鑒定。當VH CDR3的3’末端被隨機化時，獲得了大多數效力改善。
[0320]在28G5的輕鏈⑶R3序列的隨機誘變后，scFv的組利用在TF-1試驗中可測量的中和效力進行鑒定。當\ CDR3的3’末端被隨機化時，獲得了所有的效力改善。
[0321]在重和輕鏈⑶R3隨機突變庫組合后，scFv的組利用在TF-1增殖試驗中具有超過親本scFv28G5的較高效力進行確認。分離具有超過親本>60000倍的效力提高的scFv。所有庫組合產生改進的scFv，即Hl / LU Hl / L2、H2 / L1、H2 / L2。因為沒有從LI庫分離出改進的scFv,所以這是特別有趣的現象。
[0322]使用上述方法，在28G5的優(yōu)化過程中被鑒定的19個scFv的組被重排并表達為IgG4。所述組包括抗體克隆1、2和4~20。在該組中某些最有效的克隆從組合的H和LCDR3突變庫獲得。在TF-1增殖試驗中測試該組中的IgG4抗體的活性，并且與已知鼠抗體2B7對比。在該試驗中，所有優(yōu)化的IgG4比2B7更有效。此時，2B7具有約1.6nM的計算IC50，而這些克隆具有約1ρΜ~約1100ρΜ的IC50計算值范圍。數據列于以下表1中，并總結如下:
[0323]IC50〈1500pM 抗體 1、2 和 4 ~20
[0324]IC50〈300pM 抗體 1、2、4_12 和 14-20
[0325]IC50〈60pM 抗體 1、2、4_6、8_11、14 和 16-20
[0326]IC50〈10pM 抗體 1、5、6、11 和 20。
[0327]圖3說明在TF-1增殖試驗中，與已知的抗體2B7相比，本發(fā)明的兩種代表性抗體，抗體1和抗體6的拮抗效力。
[0328]BIAcore2000系統(tǒng)(Pharmacia Biosenser)被用于測定某些先導優(yōu)化的IgG4與重組純化標記的GM-CSF受體細胞外域的相互作用的動力學參數?？贵w的親和性被極大改進，具有0.127nM~約5nM的KD計算值。數據列于表2中。結合速率(on-rate)和解離速率(off-rate)都獲得改進。IgG4對GM-CSFR α可溶性細胞外域的親和性與其在TF_1試驗中的性能之間的相關性是極好的，具有0.85 (p〈0.0001)的皮爾遜系數。通過對比，2B7的KD被單獨計算并且顯示為約7nM。
[0329]在28G5的優(yōu)化過程中鑒定的IgG4抗體在人粒細胞形態(tài)改變試驗中進行測試，并且與已知鼠抗體2B7比較。所有在該試驗中測試的抗體(抗體1、2、5、6、9-11、16和20)都是非常有效的，具有7.8~90pM的IC50值范圍。其中，抗體1、2、5、6、9、16和20具有不到50pM的IC50，且抗體1、2、6、16和20具有不到25pM的IC50。我們的抗體比具有477pM的IC50的2B7更有效。數據顯示在表3中。圖4說明在人粒細胞形態(tài)改變試驗中，與已知抗體2B7相比，本發(fā)明的兩個代表性抗體，抗體1和抗體6的拮抗效力。
[0330]在28G5的優(yōu)化過程中鑒定的IgG4抗體在獼猴形態(tài)變化試驗中進行測試。所有抗體能夠中和GM-CSF對獼猴受體以及人受體的活性，并且所有抗體都比2B7更有效。2B7具有26pM的IC50，而抗體組中的代表性抗體(抗體6、抗體1和抗體2)分別具有1.73,2.03和 3.2pM 的 IC50 值。
[0331]在單核細胞TNF α釋放試驗中，對在28G5的優(yōu)化過程中鑒定的IgG4組進行中和效力測試。該試驗測試抑制人單核細胞在用GM-CSF處理時釋放促炎癥因子TNFa的能力。抗體1、2、5、6、9和10被測試，它們在該試驗中都是有活性的，并且能夠完全中和GM-CSF對受體的作用(IC50范圍為約43~139)，而333nM濃度的2B7僅能夠實現GM-CSF誘導的TNFa釋放的50%抑制，表明在該試驗中該抗體僅為部分抑制因子。圖5說明在單核細胞TNF α釋放試驗中，與已知抗體2B7相比，本發(fā)明的兩個代表性抗體的拮抗效力。數據在表4中顯示，并且總結如下:
[0332]<150pM 抗體 1、2、5、6、9 和 10 號
[0333]〈ΙΙΟρΜ 抗體 1、2、5、6 和 9 號
[0334]〈ΙΟΟρΜ 抗體 1、5、6 和 9 號
[0335]炎性疾病的特點為炎癥細胞類型響應于特定信號而增加存活。粒細胞在GM-CSF存在時能夠存活更長，因此，在粒細胞存活試驗中測試在28G5優(yōu)化過程中分離的IgG4抗體抑制該反應的能力。所有來自先導物優(yōu)化的抗GM-CSFR a IgG4在該試驗中都是有活性的，代表性中和效力(IC50)的范圍為7.0~843.7pM。這與已知鼠抗體2B7相反，其直到83nM濃度時還是完全無活性的。圖6說明在粒細胞存活試驗中，與已知抗體2B7相比，本發(fā)明的兩個代表性抗體，抗體1和抗體6的拮抗效力。
[0336]如圖3~6所示的這些數據表明與已知鼠抗體2B7相比，我們的抗體具有顯著不同的特性。例如，在粒細胞存活和TF-1增殖試驗中，本發(fā)明的代表性抗體分別抑制用7pMGM-CSF刺激的粒細胞存活和TF-1增殖，而2B7不抑制粒細胞存活、但抑制TF-1增殖(雖然是比我們的抗體低的程度)。數據顯示，與已知GM-CSFRa抗體相比，本發(fā)明的結合元件具有較高的親和性和較高的抑制各種由GM-CSF-R介導的生物效應的能力。
[0337]28G5的衍生氨基酸序列及其衍生物與VBASE數據庫中的已知人胚系序列比對，并且通過序列相似性鑒定最接近的胚系。28G5及其衍生物的VH域的最接近胚系被鑒定為VH1DP5。28G5VH在框架區(qū)內具有與VH1-24(DP5)胚系相比的14個改變 。
[0338]VL域的最接近胚系為VAVLl_e(DPL8)，其在框架區(qū)內僅具有胚系的5個改變。28G5及其衍生物的框架區(qū)通過定點突變返回胚系以同樣地匹配天然的人抗體。除了一個氨基酸以外的所有這些氨基酸可以被轉變?yōu)樵诳贵w效力方面僅具有適當改變的胚系。重鏈的94位的氨基酸異亮氨酸(使用Kabat編號，Kabat等1971)不能被改變?yōu)榕呦堤K氨酸而不完全喪失活性。因此，在抗體框架區(qū)內保持胚系的該單一改變。
[0339]在TF-1增殖試驗中進行抗-GM-CSFR α抗體中的兩個，抗體6和抗體1，的全ρΑ2分析。數據證實在該系統(tǒng)中這些抗體是高度有效的拮抗劑，計算的ρΑ2值分別為-11.3±0.2和-11.0±0.2(圖 1)。
[0340]在人和獼猴粒細胞形態(tài)改變試驗中進行抗-GM-CSFRa抗體之一(抗體6)的全pA2分析。數據證實在這些系統(tǒng)中該抗體是高度有效的拮抗劑，在人和獼猴試驗中計算的pA2值分別為-10.58 和-10.78 (圖 2)。
[0341]在半固體瓊脂試驗中，CM-CSF驅動造血祖細胞分化為粒細胞和巨噬細胞集落。因此,在集落形成試驗中，使用源自外周血的祖細胞測試親和力成熟抗體6和抗體1、親本mAb抗體3(28G5)和陰性對照(CAT001)的拮抗該GM-CSF特異性活性的能力。圖7中顯示的數據表明兩種親和力成熟的代表性mAb都為人GM-CSF介導的體外造血集落形成的有效抑制因子。
[0342]對于親和力成熟的mAb，大致的IC50值為0.08 μ g / ml (抗體6)和0.25 μ g /ml (抗體1)。有趣的是已知的鼠抗體2B7在該試驗中直到66nM濃度時仍表現出很少(如果有的話)的抑制活性。
[0343]在對照試驗中，如所預想的，親和力成熟的mAb對SCF+IL_3+G_CSF的組合所介導的集落形成沒有影響，并且當無細胞因子時，集落形成可以忽略(〈4個集落/培養(yǎng)物)。
[0344]對于huGM-CSFRa特異性mAb拮抗活性的體內分析，表達人GM-CFSR的α和β兩條鏈的轉基因(Tg)小鼠的骨髓移植至野生型小鼠中可以被用于產生嵌合動物，從而轉基因的huGM-CSFR表達限于骨髓源的造血細胞、并且因此更類似內源受體的表達特征(expression profile)。在這些Tg嵌合小鼠中，給予huGM_CSF導致脾重量增加和循環(huán)血液單核細胞的邊緣化。對親和力成熟的抗體6和陰性對照mAb (CAT001)測試其拮抗這些GM-CSF介導的體內反應的能力。對于劑量反應分析，包括5只Tg嵌合鼠的6個組用500ng的huGM-CSFR α皮下注射，每天處理2次，共4天(第1_4天)，則5只動物組成的第七對照組僅接受PBS。6組huGM-CSF處理的動物中的4組在D.0時以16mg / kg、5.3mg / kg、1.78mg / kg或0.59mg / kg的量接受測試mAb (抗體6),而第五組huGM-CSF處理的動物在D.0時以16mg / kg的量接受對照CAT001。圖8中呈現的結果證明，與對照PBS相比，使用huGM-CSF處理誘導了脾重量的顯著增加和循環(huán)血單核細胞的降低。如預想的，使用16mg /kg對照CATOOl進行處理對脾重量的增加或血液單核細胞的降低都沒有影響。相反，在以測試mAb抗體6處理后,具有清晰的劑量-反應效應,如在16mg / kg時,該抗體消除了脾重量的增加，盡管在使用0.59mg / kg的mAb時仍然有明顯的反應,但效應被顯著降低。IC5tl似乎在0.59mg / kg和1.78mg / kg之間的某處。對于GM-CSF誘導的循環(huán)單核細胞的減少觀察到類似結果-使用16mg / kg的測試mAb抗體6的處理消除了降低,而0.59mg / kg的mAb對該反應僅有很小影響。這些數據顯示抗-GM-CSFRa抗體為人GM-CSFR a的體內拮抗劑。
[0345]為了進一步研究這些抗-GM-CSFR a抗體的抗炎特性，在外周血單核細胞細胞因子釋放試驗中測試抗體6。在該試驗中，TNFa和IL-6可以內源釋放，這取決于供體。在該試驗中，GM-CSF也是由細胞內源產生的，而非外源添加，并且因此在該試驗中觀察到的結果代表天然的內源GM-CSF結合其受體的生物學效應的抑制。
[0346]在給予抗體6后，如圖9所示，這兩種細胞因子都受到劑量依賴性的抑制。這些數據表明這些抗體可以抑制天然GM-CSF的活性，以及通過抑制GM-CSF信號發(fā)生，可以抑制如IL-6和TNFa的關鍵促炎癥細胞因子，兩者都與多種如風濕性關節(jié)炎的炎癥指征相關。
[0347]此外，基于抗體6的這一結果，可以預計抗體I~20中每個在該試驗中表現抑制作用，因為所有抗體I~20被認為結合GM-CSFRa的相同區(qū)域。
[0348]重要的抗原識別殘基的定位、以及序列分析
[0349]為了鑒定哪個位置對于配體結合通常是保守的、以及在仍保留配體結合活性的抗體中哪個位置是可變的，我們確定了在胚系化抗體6scFv序列中多個位置的殘基的可變性。`
[0350]對抗原結合有作用的位置顯示為VL域中的Kabat殘基27A、27B、27C、32、51、52、53、90、92 和 96，以及 VH 域中的 Kabat 殘基 17、34、54、57、95、97、99 和 00B。
[0351]確認了 7個顯示為對抗原結合重要的位置:H95、H97、H99、H100B、L90、L92和L96。然后我們分析了在28G5抗體優(yōu)化過程中分離的160個變異體的序列中這些位置處的殘基，所有這些變異體在TF-1增殖試驗中都顯示出最少5倍的效力提高。
[0352]以下表5中的數據總結了在這些位置中的各處和L95A處觀察到的不同氨基酸(來自可能的20種當中)。28G5和/或抗體6中這些位置的氨基酸是極保守的，這很好地證明了那些氨基酸對于結合抗原是關鍵的。例如，以下位置的氨基酸是極保守的:H97、H100B、L90、L92ο
[0353]方法
[0354]基本如參考文獻[101]所述，編碼親和力成熟的和胚系化抗體6scFv的DNA序列被轉化為核糖體呈現形式。為了產生含隨機點突變的變異體574D04序列的庫，采用制造商的方案(BD Bioscience)中的高突變條件(7.2個突變/ 1000bp)對抗體6序列進行易錯PCR。該庫在核糖體上表達，并且與純化示蹤的GM-CSFRa共培養(yǎng)以使得結合發(fā)生。能夠結合標記的GM-CSFR a的變異體被捕獲，并且利用蛋白G(Dynal)包被的順磁珠移除。群體中殘留的未結合變異體被加入到四種生物素化的抗-個體型抗體的池中，其預先得自如參考文件[102]所述的大的人抗體噬菌體呈現庫并且已知與抗體6scFv結合。生物素化的抗-個體型抗體結合的變異體利用抗生蛋白鏈菌素珠捕獲，而未結合的變異體被洗去。根據參考文件[101]中的一般方法，該過程重復進行核糖體呈現選擇的另兩個循環(huán)。
[0355]使用與Edwards BM 等(2003) Journal of Molecular Biology Vol334:103 中所述相同的方法，來自選擇結果的變異體的代表性部分被克隆至噬粒載體中，并且在噬菌體上表達scFv變異體以用于通過ELISA進行測試。那些不顯示與純化標記的GM-CSFRa結合的突變體被測試與在選擇中使用的四種抗-個體型抗體池的結合。在抗-個體型結合試驗中表現出等于或大于抗體6scFv的結合的變異體被測序，并且對序列進行分析以發(fā)現具有高頻突變的位置。 [0356]使用486個VH鏈序列和451個\鏈序列，發(fā)現變異體群的平均突變率為每VH或\鏈3.05個氨基酸。對他們分析突變熱點，測繪與其沿scFv的位置相關的突變頻率。該分析集中于每VH或\具有至少一個⑶R突變且每VH或\具有不到4個突變的那些克隆。從該123個VH和148個\序列的組中，熱點被限定為具有5%或更高突變頻率的位置。
[0357]使用核糖體呈現負選擇方法，抗體6的VfDR3和'CDR3中的七個位置作為抗原結合重要的推定位置而受到特別關注。然后對在28G5抗體優(yōu)化過程中分離的、其中VhCDR3和VlCDR3的整個序列被隨機化且選擇較高親和性的160個序列變異體進行分析。
[0358]線性表位的確定
[0359]利用PEPSCAN方法，我們對抗體6和已知抗體2B7抗各代表GM-CSFR α細胞外部分氨基酸序列的短區(qū)域的2442個肽的信號進行了篩選。各抗體抗所有肽的結合信號被平均以產生平均的背景信號，并且對于各個肽計算信號/背景比。對于抗體6和2B7兩者，4或更高的信號/背景比被記作特異性的陽性信號。分析產生特異性陽性信號的肽序列的保守結合基序，并且發(fā)現抗體6優(yōu)先結合相應于成熟人GM-CSFR α的226~230殘基的YLDFQ基序，且2B7優(yōu)先結合相應于成熟的人GM-CSFR α的278~281殘基的DVRI基序。對于成熟受體的氨基酸序列的編號如SEQ ID NO:206所示。
[0360]PEPSCAN方法(肽結合掃描)
[0361]如先前文獻所述[103],合成具有源自GMCSF的序列的大部分重疊的15_mer合成肽，并且使用信用卡式(credit-card format)min1-PEPSCAN卡(具有3 μ 1孔的455-孔板)進行篩選。在基于PEPSCAN的酶聯(lián)免疫試驗(ELISA)中測試抗體與各個肽的結合。含共價連接肽的455-孔信用卡式聚丙烯卡與樣品(例如10yg / ml抗體，或以PBS溶液稀釋1000倍的血清，其含5%馬血清(v / v)和5%卵清蛋白(w / v))和1% Tween80，或者在PBS溶液中溫和封閉的情況下，與4%馬血清(v / v)和1% TWeen80共孵育(40°C，過夜)。清洗后，肽與抗-抗體過氧化物酶共孵育(1 / 1000稀釋液，例如兔-抗-小鼠過氧化物酶，Dako) (1小時，25°C )，然后，在清洗后，加入過氧化物酶底物2,2，-連氮基-雙-3-乙基苯并噻唑磺酸鹽(ABTS)和2μ 1 / ml的3% H202。一小時后，測量顯色。用C⑶相機和圖像處理系統(tǒng)定量ELISA的顯色。裝置包括(XD-相機和55mm鏡頭(Sony (XD Video CamaraXC-77RR, Nikon micro-nikkor55mmf/2.8 鏡頭)、相機適配器(Sony 相機適配器 DC-77RR)和圖像處理軟件包 0ptima6.5 版(Media Cybernetics, Silver Spring,MD20910,U.S.A.) ?Optima運行于奔騰計算機系統(tǒng)上。
[0362]試駘材料和方法[0363]生化配體結合試驗[0364]如WOOl / 66754[104]的實施例3所述制備純化的scFv制劑。使用BAC方法[105]確定純化的scFv制劑的蛋白質濃度。以50 μ I /孔用PBS稀釋到2.5 μ g / ml的抗人IgG4在4°C下涂覆Fluoronuc?96孔微滴定板過夜。以300 μ I /孔的PBS / 0.1 %Tween-20清洗板3次，然后用300 μ I /孔的溶于PBS的3% BSA在室溫下封閉一小時。該板用300 μ I /孔的PBS / 0.1% Tween-20再清洗3次，然后向各個孔中加入50μ I在1%BSA / PBS中稀釋至62.5ng / ml的人GM-CSFR α，并且板在室溫下孵育I小時。如上所述清洗3次后，向各個孔中加入25 μ I樣品材料，然后加入25μ I在1% BSA / PBS中稀釋至2ηΜ的生物素化GM-CSF。為了確定全結合，僅緩沖液被用作樣品材料。為了確定非特異性結合，在1% BSA中稀釋至IOOnM的未標記GM-CSF被用作樣品材料。在如上所述清洗3次前，板在室溫下孵育I小時。向板的各個孔中加入50 μ I在DELFIA?分析緩沖液中稀釋至IOOng / ml的銪標記抗生蛋白鏈菌素(PerkinElmer)，并且在用DELFIA?清洗緩沖液清洗7次之前，在室溫下孵育30~60分鐘。向板中加入50 μ I /孔的DELFIA?增強液，在讀板器上于615nm處對樣品進行讀數。
[0365]TF-1增殖試驗
[0366]從1?&0系統(tǒng)獲得的、并且常規(guī)地保持在1^11640、10%?83、11111丙酮酸鈉和4叩/ml GM-CSF中的TF-1細胞通過在分析培養(yǎng)基(RPMI1640、5% FBS、ImM丙酮酸鈉)中清洗3次、在分析培養(yǎng)基中重懸、以及在37°C下5% CO2中孵育7~24小時而使細胞饑餓。然后將細胞以IXlO5 / ml的濃度重懸在分析培養(yǎng)基中，并且向96孔平底組織培養(yǎng)板的各個孔中加入100μ I。在用分析培養(yǎng)基稀釋之前，測試樣品通過無菌過濾原液樣品進行制備。然后，向各個細胞孔中加入50 μ I測試材料，并且將其在37°C下5% CO2中孵育45~60分鐘。然后，向各個孔中加入50 μ I的以分析培養(yǎng)基稀釋至EC8tl值的GM-CSF(或者對于某些批次的GM-CSF為0.4ng / ml)，將板在加濕室內在37°C下5% CO2中孵育16小時。這代表了 7pMGM-CSF的終濃度。為了測量細胞的增殖，向板的各個孔中加入20 μ I在分析培養(yǎng)基中稀釋到5.0 μ Ci / ml的3H-胸腺嘧啶，并將板在37°C下5% CO2中孵育4小時±30分鐘。然后使用板收集器在96孔GF / C Unifilter?板上收獲細胞，并且清洗。在向過濾板的各孔中加入50 μ I MicroScint20?后，密封板，并且在TopCount讀板器上計數。
[0367]人粒細胞形態(tài)改變試驗
[0368]人的血沉棕黃層(來自輸血服務的人血包裝)與溶于0.9% NaCl的3% DextranT-500等體積混合。然后將混合物以豎直位置孵育直至形成界面。收集上層，并且在histopaque1.077密度梯度頂上成層，然后以400g離心40分鐘，并且使其無制動停止。去除該梯度的上層，留下粒細胞球。通過在20ml冰水中重懸細胞30秒、然后立即加入冰冷的1.8%氯化鈉裂解該球粒中殘留的任何紅血球。然后以1200rpm使細胞重新成球，并且以1X106 / ml 的濃度在分析培養(yǎng)基(RPMI1640、10% FBSUOOu / ml 青霉素、IOOyg / ml 鏈霉素、25mM HEPES)中重懸。然后向96孔平底組織培養(yǎng)板的各個孔中加入100 μ I細胞。測試樣品通過無菌過濾原液樣品、并且在分析培養(yǎng)基中適當稀釋而制備。
[0369]對于先導分離(lead isolation)，50 μ I的測試樣品隨后加入細胞中，且將板在37°C下5% CO2中孵育45~60分鐘。這代表了 7pM GM-CSF的終濃度。然后向各個孔內加Λ 50 μ I在分析培養(yǎng)基中稀釋到0.4ng / ml的GM-CSF，并且在加濕箱內、在37°C下5% CO2中孵育4小時。
[0370]對于先導物優(yōu)化，在分析培養(yǎng)基中稀釋的過濾IgG4與溶于分析培養(yǎng)基的0.4ng /ml GM-CSF等體積混合。這代表了 7pM GM-CSF的終濃度。然后向各個孔內加入100 μ 1抗體/ GM-CSF混合物。然后在加濕箱內、在37°C下5% C02中孵育3小時。
[0371]加入冷甲醛達到1.25%的終濃度，并且細胞在4°C固定過夜。每孔通過流式細胞儀分析2000~5000個事件。然后，使用CellQuest得出各個樣品的前向散射(FSC)的幾何平均值。當計算幾何平均值時，細胞被屏蔽(gate)以排除不相關的群體(如死亡細胞/碎片)。
[0372]獼猴粒細胞形態(tài)改變試驗
[0373]在測量用GM-CSF刺激后的獼猴粒細胞的形態(tài)改變的試驗中對抗體進行測試。從獼猴全血中純化粒細胞，并且基本如人粒細胞形態(tài)改變試驗所述進行試驗。
[0374]使用生物傳感器分析的結合親和力數據
[0375]BIAcore200 系統(tǒng)(Pharmacia Biosensor)用于測定 scFv 和 IgG4 與重組受:體之間相互作用的動力學參數。Biosensor利用表面等離子共振的光學效應研究分析物分子與共價連接到右旋糖酐基質上的配體分子的相互作用所導致的表面濃度變化。典型地，在自由溶液中的分析物物質放過偶聯(lián)的配體，并且隨著局部SPR信號增加檢測到任何結合。然后進入清洗期，在此期間，隨著SPR信號降低觀察到分析物物質的解離，其后，任何保留的分析物與配體剝離并以幾個不同的分析物濃度重復該過程。在試驗期間通常使用系列對照以確保絕對結合能力或偶聯(lián)配體的動力學特征不發(fā)生顯著改變。專有的hepes緩沖鹽水(HBS-EP)通常被用作分析樣品的主稀釋液和解離相溶劑。試驗數據相對于時間以共振單位(直接對應于SPR信號)記錄。共振單位直接與結合的分析物的大小和量成正比。然后，BIA評估軟件包可以被用于`指定解離相(解離速率單位s—1)和締合相(締合速率單位M^s-1)的速率常數。然后，這些數字使得能夠計算締合和解離親和常數。
[0376]使用其中IgG4通過氨基蛋白A表面非共價捕獲的單個試驗估計IgG4的親和性。然后重組純化-標記的GM-CSF受體細胞外域的系列稀釋液(從100~6.25nM)順序經過IgG4。利用濃度(Bradford)和預測的非翻譯后修飾的成熟多肽質量(39.7kDa)計算受體的摩爾濃度。以相同的模式分析兩個獨立的數據集中的每一個。使用設置為對締合和解離速率進行同時整體計算的1:1朗繆爾模型對參考細胞校正數據進行擬合，Rmax值設定為全局的(global)。測定在各個周期中捕獲的IgG4的水平以確保捕獲的量在整個試驗過程中保持穩(wěn)定。此外，IgG4的解離速率被測定以判斷是否需要對于基線漂移進行校正。然而，兩種蛋白A相互作用被證明是可充分再現的和足夠穩(wěn)定的。數據的有效性由計算出的chi2和T值(參數值/偏移量)限制，其分別必須為〈2和>100。
[0377]純化標記的GM-CSFRa細胞外域的制備:
[0378]整合編碼人GM-CSF受體α細胞外域的序列(SEQ ID NO:205，代表成熟GM-CSF R的1-298氨基酸)和鼠IL-3信號序列并且加入N-末端純化標記的pEFBOS表達載體[106]被用于產生重組的N末端標記的GM-CSF受體細胞外域(E⑶)多肽。利用標準程序標記的EOT多肽在CH0細胞內使用pEFBOS載體表達。該多肽也可稱作純化的GM-CSFRa細胞外域、或稱作GM-CSFRa的可溶性細胞外域。
[0379]如Flag肽(DYKDDDE-SEQ ID NO:204)、Fc、生物素或his標簽的任何適當的純化標簽都可以使用?？梢允褂萌魏芜m當的技術進行純化，例如，Flag標記的E⑶多肽(SEQ IDNO:203)可以在M2親和層析柱上純化，并且用FLAG肽洗脫。
[0380]單核細胞TNFa釋放試驗
[0381]單核細胞的純化(單核細胞分離試劑盒-Miltenyi Biotec-130-053-301):
[0382]人血沉棕黃層(來自輸血服務的人血包裝)在histopaquel.077密度梯度(Sigma，貨號1077-1)頂上成層，并且細胞以400X g離心40分鐘。在停止離心時不施加制動。然后，由界面處收集PBMC細胞。細胞在PBS中清洗，并以300 X g離心10分鐘成球，然后殘留的紅血球通過在20ml冰水中重懸15秒，接著立即加入冰冷的1.8%氯化鈉進行裂解。然后將細胞以1200印111離心5分鐘成球，并且在600u1 MACS緩沖液(PBS，2mM EDTA)中重懸。在加入200 μ 1半抗原-抗體混合體(Hapten-antibody cocktail)(也是由試劑盒提供的)并混合之前，200 μ 1由試劑盒提供的Fc封閉試劑被加入到細胞中并且混合。然后，在50ml MACS緩沖液中清洗兩次之前，將細胞于4°C孵育15分鐘。在加入200 μ 1半抗原-抗體混合體并混合之前，將細胞球重懸在600 μ 1 MACS緩沖液中，然后加入200 μ 1 MACS抗-半抗原微球并混合。細胞于4°C孵育45分鐘，然后在50ml MACS緩沖液中清洗并在500 μ 1MACS緩沖液中重懸。在將細胞懸浮液加到柱子上之前，通過用3ml MACS緩沖液清洗準備單柱(Miltenyi Biotecl30-042-401) 0收集的流出液為富集的單核細胞部分。用2X3mlMACS緩沖液洗柱，并且收集流出液。使用標準的流式細胞儀方法，通過以抗-CD14-PE染色檢查單核細胞純度。最終將細胞以4X106 / ml濃度重懸在分析培養(yǎng)基中(RPMI1640、10%FBSUOOu / ml 青霉素、100 μ g / ml 鏈霉素)。
[0383]單核細胞的刺激:
[0384]向Costar96孔平底組織培養(yǎng)板的各個孔內加入50 μ 1細胞。向所有孔內加入25 μ 1的150 μ g / ml rhIFN y (R&D systyems)。在分析培養(yǎng)基中稀釋的過濾IgG4與溶于分析培養(yǎng)基的56ng / ml (4nM) GM-CSF等體積混合。這代表1nM的GM-CSF終濃度。然后，將75 μ 1的抗體/ GM-CSF混合物加入到各個孔內。對照為僅具有GM-CSF的孔、或無GM-CSF和無抗體的孔。然后，將板在加濕室內、在37°C下以5%C02孵育18小時。然后收集上清液以通過ELISA測試TNFa水平。
[0385]TNF a ELISA(R&D Systems ELISA Development System DY210):
[0386]用100 μ 1溶于PBS中的4 μ g / ml捕獲抗體室溫下涂覆Fluoronunc ImmunosorbELISA板過夜。然后，用PBS / 0.1% Tween清洗板三次，并且用300 μ 1 /孔的溶于PBS中的3% Marvel在室溫封閉1小時。用PBS / 0.1 % Tween清洗板三次。100 μ 1來自測試板的上清液被移至ELISA板，并且在分析培養(yǎng)基中稀釋的TNF- α被滴定液被加入到對照孔內。在以PBS / 0.1 % Tween清洗4_5次之前，將板在室溫下孵育2小時。100 μ 1在1 % Marvel /PBS中稀釋至300ng / ml的檢測抗體被加入到板的各個孔內，并在以PBS / 0.1% Tween清洗4-5次之前，將板在室溫下再孵育2小時?？股鞍祖溇?銪(PerkinElmerl244-360)于DELFIA分析緩沖液(PerkinElmer4002-0010)中以1:1000進行稀釋，并且以100 μ 1 /孔加入，然后在室溫下孵育45分鐘。然后，將板在DELFIA清洗緩沖液中洗7次，然后加入100 μ 1 /孔增強液(PerkinElmer4001-0010)，并且使用讀板器在615nm處讀數。
[0387]粒細胞存活試驗
[0388]如中性粒細胞活化試驗(形態(tài)改變試驗)所述，從人血沉棕黃層中純化細胞、在分析培養(yǎng)基(RPMI1640、GlutamaxUO % FBSUOOU / ml 青霉素、IOOyg / ml 鏈霉素)中清洗，并且以IXlO6 / ml的濃度在分析培養(yǎng)基中重懸。100 μ I細胞被加入到Costar96孔平底組織培養(yǎng)板的各個孔內。過濾的抗體原液在分析培養(yǎng)基中稀釋，并且與0.4ng / ml的GM-CSF等體積混合。這代表7pM GM-CSF的終濃度。對照孔只含培養(yǎng)基或只含GM-CSF。然后，100 μ I測試樣品/ GM-CSF混合物被加入板的各個孔內，并且將細胞在加濕箱內37°C /5% CO2下孵育68小時。向各孔中加入20 μ I的AlamarBlue，并且板在加濕箱內37°C / 5%CO2下再孵育24小時。然后，使用讀板器在560nm和590nm處讀數。
[0389]抗-GM-CSFRα抗體在TF-1增殖試驗中及在人和獼猴粒細胞形態(tài)改變試驗中的PA2分析 [0390]定量競爭性拮抗劑的親和性的主要藥學工具為Schild分析。使用該途徑，可以確定在功能試驗中估測拮抗劑親和性的系統(tǒng)獨立的手段。該方法基于拮抗劑濃度及其親和性決定激動劑反應的對抗作用的概念。因為對抗作用可以被量化并且拮抗劑的濃度是已知的，所以，拮抗劑的親和性可以被確定。通過測量(在有或無拮抗劑時測量)激動劑的等活性濃度比值(稱作劑量比(DR))對該對抗作用進行量化。
[0391]可以通過使用激動劑(典型地GM-CSF)在無結合元件時的EC50與該激動劑在有單濃度的結合元件存在時的EC50的比值計算劑量比。然后，表達為1g(DR-1)的劑量比可以在關于log[結合元件]的線性回歸中使用以產生Schild回歸。因此，對于結合元件的每個濃度存在相應的DR值；將這些值繪制為關于log[結合元件]上的1g(DR-1)的回歸。如果對抗作用是競爭性的，則根據方程式如下的Schild公式在1g(DR-1)和log[結合元件]之間具有線性關系:
[0392]Log (DR-1) =1g [A]-log Ka
[0393]在這些條件下，坐標的O值給出其中l(wèi)og[a] = log Ka的X軸的截距。因此，給出1g(DR-1)=O的結合元件濃度等于log Ka，結合元件-受體復合物的平衡分離常數。這是與系統(tǒng)無關的、對于每一個含該受體的細胞系統(tǒng)都精準的結合元件親和性定量方法。
[0394]因為Ka值由對數曲線獲得，因此其為log標準分布。該特定濃度的負對數被經驗地稱作PA2，產生激動劑劑量效應曲線的兩倍移動的拮抗劑濃度。拮抗效力可以通過以下公式由產生單一劑量比值的單一拮抗劑濃度計算PA2進行量化，其中
[0395]pA2=log (DR-1)-log [a]
[0396][a]=必須使拮抗劑濃度加倍以得到原始第二大反應的拮抗劑摩爾濃度。
[0397]DR=通過測量在有和無拮抗劑時測量的激動劑的等活性濃度的比值而定量的劑量比。
[0398]pA2可以從劑量效應試驗數據計算。
[0399]在集落形成試驗中GM-CSF介導的血細胞祖細胞體外分化的抑制
[0400]造血祖細胞富集的外周血單核細胞從進行祖細胞動員和脫落作為其標準臨床處理的部分的供者獲得。樣品進行去識別化(de-1dentified)，并且細胞在使用前不進行冷凍保藏。5X IO4單核細胞在終濃度為IOng / ml的人GM-CSF存在下在半固體瓊脂中培養(yǎng)[107]。測試的親和力成熟人mAb和已知的鼠抗體2B7以10、5、1、0.5、0.1或
0.05yg / ml的終濃度被加到瓊脂培養(yǎng)物內。親本的人mAb28G5和同種型匹配的陰性對照人mAb (CATOOl) WlOyg / ml的單一濃度進行測定。出于對照目的,mAb也測定其阻斷由SCF、IL-3和G-CSF組合(Croker等2004)所激發(fā)的集落形成的能力以及在無細胞因子存在時其對集落形成的影響。在具有10% C02的空氣中孵育14天后評估集落形成(>40個細胞的聚集)。集落用戊二醛固定，并且使用解剖顯微鏡以35倍放大率進行計數。
[0401 ] 人GM-CSFR α β轉基因小鼠中的GM-CSF體內生物活性的抑制
[0402]產生在MHC I類促進因子的調控下表達人GM-CSFR的α和β鏈兩者的轉基因(Tg)小鼠，并且已有文獻描述了對于給予huGM-CSF的體內脾和血細胞反應[108]。為對huGM-CSFRa特異性mAb拮抗劑活性進行體內分析，從Tg小鼠移植骨髓至野生型鼠體內可以產生嵌合型動物，從而轉基因huGM-CSFRa β表達被限于骨髓來源的造血細胞，并且因此更類似于內源受體的表達特征。在這些huGM-CSFR α β Tg嵌合小鼠中，給予huGM-CSF導致脾重量的增加和循環(huán)血單核細胞的邊緣化。
[0403]Tg嵌合小鼠的產生
[0404]供體Tg鼠的股骨和脛骨被去除，并且以無菌PBS加3%小牛血清(FCS)沖洗骨髓。然后通過23G針抽取骨髓塞以獲得單細胞懸浮液，然后用冷PBS+3% FCS清洗細胞一次，并且通過不銹鋼絲網。然后通過在0.168M氯化銨緩沖液中裂解去除紅細胞，之后用磷酸緩沖鹽水(PBS)+3%FCS再清洗細胞2次，然后再次通過不銹鋼絲網。為了進一步去除死細胞和細胞碎片，懸浮液通過FCS墊離心?；罴毎郧蛄；厥?，用PBS清洗一次，并且以
2.5X107 / ml在PBS中重懸。5-8周齡的接受體C57 / BL6小鼠以3小時間隔的550Rad兩次致死劑量進行照射。接受體小鼠被靜脈(1.V.)注射0.2ml細胞懸浮液(即5X 106細胞/小鼠)，并且隨后其飲用水中加入0.02M新霉素在帶蓋的盒中圈養(yǎng)3周。6周后，通過使用對huGM-CSFRa和β鏈特異性的mAb對外周血進行FACS分析以測定再造。
[0405]Tg嵌合小鼠的GM-CSF處理和后續(xù)分析:`[0406]Tg嵌合小鼠用500ng huGM-CSF經皮下途徑(s.c)每日處理2次，處理4天。對于抗體拮抗劑活性的分析，在開始GM-CSF處理之前，在第一天，5只小鼠構成的組經腹膜(1.p)途徑給予選擇劑量的mAb (參見下文)。在第5天，抽取0.2ml血液用于使用ADVIA?血液學系統(tǒng)(Bayer Diagnotics)對循環(huán)白細胞群(特別是血單核細胞)進行分析。然后，致死動物，取出脾以進行重量測量。
[0407]人外周血單核細胞內源表達人TNF α和IL_6的抑制
[0408]人血沉棕黃層(來自輸血服務的人血包裝)在histopaquel.077密度梯度(Sigma，貨號1077-1)頂上成層，并且細胞以400X g離心40分鐘。當停止離心時不施加制動。然后，由界面處收集PBMC細胞。細胞在PBS中清洗，并以300 X g離心10分鐘成球，然后通過在20ml冰水中重懸15秒，接著立即加入冰的1.6%氯化鈉裂解殘留的紅細胞。然后將細胞以1200rpm離心5分鐘成球，并且在10ml的10%FBS / RPMI和1 %青霉素鏈霉素中重懸。然后將細胞稀釋到5 X106 / ml濃度。每個孔分配110 μ 1的細胞(5.5Χ105 /孔)，并使細胞在5% C02中在37°C下放置1小時。以下試劑作為單一終濃度對照被加入:ΡΗΑ(5μ g /ml)、LPS(25yg / ml)、GM-CSF (10ng / ml)和同種型對照(50 μ g / ml)?？贵w 6 以最終起始濃度達到50μ g / ml的5倍稀釋系列加入。然后，將板在5% C02中、在37°C下孵育72小時。72小時后收集上清液，并且使用以下R&D ELISA試劑盒(hTNF-a R&D Duoset ELISAdevelopment system DY210和hIL_6R&D Duoset ELISA development system DY206)計算TNFa和IL-6的水平。根據供貨商的建議進行ELISA。[0409]表1:從28G5的優(yōu)化分離得到的IgG4非胚系抗體對GM-CSF誘導的TF-1細胞增殖的抑制。在存在濃度增加的IgG4抗體的情況下，以單一濃度的GM-CSF誘導TF-1細胞的增殖。氚標記的胸腺嘧啶的摻入被測量，并且計算抗體的IC50值。數據為η >3的代表數據。SEM(平均值的標準誤)被顯示。
【權利要求】
1.一種分離的人粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子受體α鏈(GM-CSFRa )的結合元件，其中，所述結合元件:抑制GM-CSF與GM-CSFR a的結合；和 在表面等離子共振試驗中，以低于5nM的KD結合人GM-CSFR a ；且其中所述結合元件包含:一組 VH 互補決定區(qū)(CDR):包含 SEQ ID NO:53 的 VH CDR1、包含 SEQ ID NO:54 的 VH⑶R2和包含SEQ ID NO:55的VH⑶R3，任選地在所述VH⑶R組中、在抗體VH域框架或蛋白質骨架中具有最多10個氨基酸取代，和任選地一組 VL 互補決定區(qū)(CDR):包含 SEQ ID NO:58 的 VL CDR1、包含 SEQ ID NO:59 的 VL⑶R2和包含SEQ ID NO:60的VL⑶R3，任選地在所述VL⑶R組中、在抗體VL域框架或蛋白質骨架中具有最多10個氨基酸取代。
2.根據權利要求1所述的結合元件，其中所述結合元件包含具有VHCDRUVH CDR2和VH CDR3的抗體VH域和具有VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的抗體VL域。
3.根據權利要求2所述的結合元件，其中所述VH域包含:在VH域框架的Kabat殘基H17處的S ;在VH CDR1的Kabat殘基H34處的I ;在VH CDR2的Kabat殘基H54處的E ;在VH CDR2的Kabat殘基H57處的I ;在VH域框架的Kabat殘基H94處的1、L、V、A或M;在VH CDR3的Kabat殘基H95處的V、Ν、A或L ;在VH CDR3的Kabat殘基H97處的S ;在 VH CDR3 的 Kabat 殘基 H99 處的 S、F、Η、P、T 或 W ;在 VH CDR3 的 Kabat 殘基 H100B 處的 A、T、P、S、V 或 H。
4.根據權利要求2或3所述的結合元件，其中所述VL域包含:在VL CDR1的Kabat殘基27A處的S ;在VL CDR1的Kabat殘基27B處的N ;在VL CDR1的Kabat殘基27C處的I ;在VL CDR1的Kabat殘基32處的D ;在VL CDR2的Kabat殘基51處的N ;在VL CDR2的Kabat殘基52處的N ;在VL CDR2的Kabat殘基53處的K ;在VL CDR3的Kabat殘基L90處的S、T或Μ ;在VL CDR3的Kabat殘基L92處的D、E、Q、S、Μ或T ;和/或在VL CDR3的Kabat殘基L96處的S、P、I或V。
5.根據權利要求2-4中任一項所述的結合元件，其中所述VHCDR組包含具有氨基酸序列 SEQ ID NO:3 或 SEQ ID NO:173 的 VH CDR1、具有氨基酸序列 SEQ ID NO:4 的 VH CDR2和具有選自 SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:65,SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO: 105,SEQ ID NO:.115、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:175, SEQ ID NO:185 和 SEQ ID NO:195 的氨基酸序列的 VH CDR3 ;且其中所述VL CDR組包含具有氨基酸序列SEQ ID勵:8的￥1^ CDR1、具有氨基酸序列SEQ ID勵:9的￥1 CDR2和具有選自 SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:60,SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO: 100,SEQ ID NO:110,SEQ ID NO: 120,SEQ ID NO: 130,SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO: 160、SEQID NO:170, SEQ ID NO:180、SEQ ID NO:190 和 SEQ ID NO:200 的氨基酸序列的 VL CDR3。
6.根據權利要求5所述的結合元件，包含選自以下的VH域和VL域:VH 域 SEQ ID NO:2 和 VL 域 SEQ ID NO:208 ；VH 域 SEQ ID NO:12 和 VL 域 SEQ ID NO:210 ；VH 域 SEQ ID NO:32 和 VL 域 SEQ ID NO:214 ；VH 域 SEQ ID NO:42 和 VL 域 SEQ ID NO:216 ；VH 域 SEQ ID NO:52 和 VL 域 SEQ ID NO:218 ；VH 域 SEQ ID NO:62 和 VL 域 SEQ ID NO:220 ；VH 域 SEQ ID NO:72 和 VL 域 SEQ ID NO:222 ；VH 域 SEQ ID NO:82 和 VL 域 SEQ ID NO:224 ；VH 域 SEQ ID NO:92 和 VL 域 SEQ ID NO:226 ；VH 域 SEQ ID NO:102 和 VL 域 SEQ ID NO:228 ；VH 域 SEQ ID NO:112 和 VL 域 SEQ ID NO:230 ；VH 域 SEQ ID NO:122 和 VL 域 SEQ ID NO:232 ；VH 域 SEQ ID NO:132 和 VL 域 SEQ ID NO:234 ；VH 域 SEQ ID NO:142 和 VL 域 SEQ ID NO:236 ；VH 域 SEQ ID NO:152 和 VL 域 SEQ ID NO:238 ；VH 域 SEQ ID NO:162 和 VL 域 SEQ ID NO:240 ；VH 域 SEQ ID NO:172 和 VL 域 SEQ ID NO:242 ；VH 域 SEQ ID NO:182 和 VL 域 SEQ ID NO:244 ;和VH 域 SEQ ID NO:192 和 VL 域 SEQ ID NO:246。
7.一種用于產生前述權利要求任一項的結合元件的方法，包括培養(yǎng)包含核酸分子的宿主細胞，該核酸分子包含編碼結合元件的核苷酸序列；然后純化所述結合元件。
8.一種組合物，包含分離的抗體分子和藥學上可接受的賦形劑，其中所述抗體分子包含抗體VH域和抗體VL域，該抗體VH域包含重鏈決定區(qū)(⑶R) HCDR1、HCDR2和HCDR3和該抗體VL域包含輕鏈⑶R IXDR1、IXDR2和IXDR3，其中所述⑶R的序列為:HCDR1SEQ ID NO:53 ;HCDR2SEQ ID NO:54 ;HCDR3SEQ ID NO:55 ;LCDR1SEQ ID NO:58 ;LCDR2SEQ ID NO:59 ;和LCDR3SEQ ID NO:60。
9.根據權利要求8所述的組合物，其中所述抗體分子是人抗體分子或人源化抗體分子。
10.根據權利要求8或9的所述的組合物，其中所述抗體分子包含抗體VH域氨基酸序列 SEQ ID NO:52o
11.根據權利要求8-10中任一項所述的組合物，其中所述抗體分子包含抗體VL域氨基酸序列 SEQ ID NO:218o
12.根據權利要求8-11中任一項所述的組合物，其中所述抗體分子是IgG4。
13.根據權利要求12所述的組合物，其中所述抗體分子是人IgG4抗體分子，其包含VH域氨基酸序列SEQ ID NO:52和VL域氨基酸序列SEQ ID NO:218。
14.根據權利要求8-13中任一項所述的組合物在制備用于治療風濕性關節(jié)炎、哮喘、過敏反應、多發(fā)性硬化、髓系白血病、動脈硬化、慢性阻塞性肺疾病或吸煙誘導的氣道炎癥的藥物中的用途。
15.根據權利要求14所述的用途，其中所述治療包括與以下的一種或多種藥物結合或在以下的一種或多種藥物基礎上額外施用所述組合物:NSAID、皮質留醇和緩解疾病的抗風濕藥(DMARD)。
16.根據權利要求15所述的用途，其中所述治療包括與以下的一種或多種藥物結合施用所述組合物:cox抑制劑、強的松、阿達木單抗、氨甲蝶呤、來氟米特、依那西普、英利昔單抗、阿那白滯素、利妥昔單抗、阿巴他塞、氯金酸鈉、抗瘧藥、柳氮磺胺吡啶、D-青霉胺、環(huán)孢菌素A、雙氯芬酸、環(huán)磷酰胺和咪唑硫嘌呤。
17.根據權利要求16所述的用途，其中所述治療包括與氨甲蝶呤結合施用所述組合物。
18.—種產生抗體分子的方法，包括培養(yǎng)包含編碼所述抗體分子的核酸的宿主細胞，然后純化所述抗體分子，其中所述抗體分子與具有VH域SEQ ID NO:52和VL域SEQ ID NO:218的抗體分子競爭結合GM-CSFRa的細胞外域。
19.根據權利要求16所述的方法，其中所述抗體分子在表面等離子共振試驗中以低于5nM的親和性(KD)結合人GM-CSFR a的細胞外域。
20.一種產生人GM-CSFRa的抗體分子的方法，該方法包括通過包括HCDR1、HCDR2和HCDR3的親本VH域的氨基酸序列中一個或多個氨基酸的插入、缺失或取代的方式提供為親本VH域的氨基酸序列變異體的VH域，其中所述親本VH CDR1具有SEQ ID NO:53的氨基酸序列；所述親本VH CDR2具有SEQ ID NO:54的氨基酸序列；和所述親本VH CDR3具有SEQ ID NO:55的氨基酸序列；且組合如此提供的VH域和一個或多個VL域，從而提供一個或多個VH / VL組合；其中所述一個或多個VL域通過在包括IXDR1、IXDR2和IXDR3的親本VL域的氨基酸序列中一個或多個氨基酸的插入、缺失或取代而提供，其中所述親本VL CDR1具有SEQ ID NO:58的氨基酸序列；所述親本VL CDR2具有SEQ ID NO:59的氨基酸序列；和所述親本VL⑶R3具有SEQ ID NO:60的氨基酸序列；以及測試一個或多個所述VH / VL組合以識別人GM-CSFRa的抗體分子。
【文檔編號】A61P29/00GK103641915SQ201310558011
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2007年3月27日 優(yōu)先權日:2006年3月27日
【發(fā)明者】E·S·科漢, R·R·明特, P·R·哈里森, M·A·斯利曼, A·D·納什, L·J·法布里 申請人:醫(yī)學免疫有限公司, 深思操作有限公司