Lj-RGD3全RGD模體缺失突變體Lj-112重組蛋白在制備抗真菌藥物中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種Lj-RGD3全RGD模體缺失突變體Lj-112的重組蛋白（rLj-112）可阻止真菌細胞膜麥角固醇的合成，從而破壞了真菌細胞的完整性，使真菌細胞膜破壞、膜通透性增高、細胞內容物質釋放、細胞破裂溶解，從而殺死真菌，即能夠劑量依賴性的抑制真菌而對細菌無抑制作用，發(fā)明了Lj-RGD3全RGD模體缺失突變體Lj-112重組蛋白在制備抗真菌藥物中的應用。
【專利說明】LJ-RGD3全RGD模體缺失突變體L_j-112重組蛋白在制備抗
真菌藥物中的應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及Lj-RGD3全RGD模體缺失突變體Lj_112重組蛋白(r Lj-112)的新用途，尤其是一種Lj-RGD3全RGD模體缺失突變體Lj-112重組蛋白在制備抗真菌藥物中的應用。
【背景技術】
[0002]自發(fā)現(xiàn)第一個抗真菌抗生素灰黃霉素以來，抗真菌藥物領域已取得了長足的進展?，F(xiàn)有抗真菌藥物根據作用機制可分為:①作用于真菌細胞膜，干擾真菌細胞膜麥角固醇的合成(如唑類、丙烯胺類和嗎啉類)以及損害細胞膜脂質結構及其功能的藥物(如多烯類)；②影響真菌細胞壁合成的藥物(如卡泊芬凈);③干擾真菌核酸合成的藥物(如5-氟胞嘧啶，灰黃霉素);④作用機制尚未明確的藥物(如碘化鉀等)。但是，現(xiàn)有藥物由于存在著療效、安全性、耐藥性等問題而遠遠不能滿足需要。
[0003]LJ-RGD3為來源于日本七鰓鰻口腔腺分泌物的RGD毒素蛋白，由118個氨基酸殘基組成，Lj-RGD3的一級結構除具有三個RGD模體和一對半胱氨酸這一典型的RGD毒素蛋白特征外，還含有17個組氨酸，17個精氨酸，是一類HRG的堿性蛋白。中國專利申請?zhí)枮?01110094370.2、名稱為“類HRG的七鰓鰻Lj-RGD3全RGD模體缺失突變體Lj-112在抗腫瘤藥物中的應用”的發(fā)明專利，公開了 Lj-RGD3的三個RGD模體全缺失突變體Lj-112基因。Lj-112基因人工合成序列324bp長，其蛋白質由108個氨基酸組成，其中含有17個組氨酸殘基，組氨酸所占比例為15.7%，Lj-112蛋白分子量為1.2KDa。Lj-112基因可克隆于載體，獲得Lj-112重組蛋白(r Lj-112)并可在大腸桿菌等進行了高效誘導表達等。Lj-112重組蛋白(r Lj-112)具有抑制血管新生、抗腫瘤功能。但是，迄今為止并沒有關于Lj-112重組蛋白在制備抗真菌藥物中的應用。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明是發(fā)現(xiàn)了 Lj_RGD3全RGD模體缺失突變體Lj-112重組蛋白具有抑制真菌的作用，從而發(fā)明了 Lj-RGD3全RGD模體缺失突變體Lj-112重組蛋白
在制備抗真菌藥物中的應用。
[0005]本發(fā)明的技術解決方案是一種Lj-RGD3全RGD模體缺失突變體Lj-112的重組蛋白(rLj-112)在制備抗真菌藥物中的應用。
[0006]本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了 Lj-RGD3全RGD模體缺失突變體Lj-112的重組蛋白(rLj-112)可阻止真菌細胞膜麥角固醇的合成，從而破壞了真菌細胞的完整性，使真菌細胞膜破壞、膜通透性增高、細胞內容物質釋放、細胞破裂溶解，從而殺死真菌，即能夠劑量依賴性的抑制真菌而對細菌無抑制作用，發(fā)明了 Lj-RGD3全RGD模體缺失突變體Lj-112重組蛋白在制備抗真菌藥物中的應用?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0007]圖1是rLj-112的最小殺菌濃度(MBC)及抑制率測試結果圖。
[0008]圖2牛津杯法檢測rLj-112的抑菌活性的效果圖。
[0009]圖3白色念珠菌經rLj-112處理后的掃描電鏡圖。
【具體實施方式】[0010]可按現(xiàn)有技術方法獲得本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了 Lj-RGD3全RGD模體缺失突變體Lj-112的重組蛋白(rLj-112)。
[0011]實驗:
1.最小殺菌濃度(MBC)及抑菌率的測定
(O菌液制備:將甘油保菌復蘇，30°C孵育過夜(18_24h)，用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基校正菌液濃度至l_2X108CFU/ml ;所述菌為白色念珠菌，AS2.2086，產品貨號:BZW23170，供應商:南京康恩特有限公司。
[0012](2)蛋白的制備:用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基將蛋白(rLj_112)2倍依次稀釋，廣8管蛋白濃度依次為90.4,45.2,22.6,11.3,5.6,2.8,1.4,0.7,0.35 μ M ;然后在每管內加入等量上述菌液，使每管最終菌液濃度約為5Χ 105CFU/ml。第I管至第8管蛋白濃度分別為45.2、22.6,11.3,5.6,2.8,1.4,0.7,0.35,0.175 μ M0
[0013](3)陽性對照酮康唑的制備:用甲醇將酮康唑10倍依次稀釋，1-5管藥物濃度為94,9.4,0.94,0.094,0.0094 μ M0然后在每管內加入等量上述菌液，使每管最終菌液濃度約為 5 X 105CFU/ml。第 I 管至第 5 管藥物濃度分別為 47,4.7,0.47、0.047、0.0047 μ Μ。
[0014](4)孵育:將接種好的稀釋管放入30°C培養(yǎng)箱中孵育16-24h。
[0015](5)酶標儀檢測:與陽性對照管比較能夠抑制99%以上活菌生長管藥物濃度為受
試囷MBC ;存活百分率(％)= OD (抗菌藥+釀)一0D(抗菌藥+液體培養(yǎng)基)/ OD(水+菌夜)一OD(水+液體培養(yǎng)基)XlOOo
[0016]結果如圖1所示:橫坐標為受試蛋白或對照藥濃度，單位為μ M ;縱坐標為真菌存活百分率(％)。Α，陽性對照，酮康唑；B，rLj-112。結果表明rLj-112的MBC值為7.7 μ M，陽性對照酮康唑(ketoconazole)的MBC值為15 μ Μ。
[0017]2.用牛津杯法檢測rLj-112的抑菌活性 具體操作方法如下:
(1)指示菌培養(yǎng)基:牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，用0.1MPa壓力滅菌20 min ;固體培養(yǎng)基中加入2.0%的瓊脂；
(2)指示菌菌懸液:白色念珠菌(出處同上)接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，30°C搖床培養(yǎng) 24h ；
(3)檢測平板的制備，牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基用0.1MPa壓力滅菌20 min，5冷卻至60°C左右，取一定量倒入已滅菌的培養(yǎng)皿中，使其凝固，待用；
(4)涂布:取0.2^0.5ml, 106CFU/ml白念珠菌均勻涂布在培養(yǎng)皿中，涂布后以平板無可見水滴為準；
(5)加待測蛋白:用鑷子將無菌的牛津杯輕輕放入培養(yǎng)皿中，將待測的蛋白rLj-112加入牛津杯中(牛津杯最大容量200ul)；(6)4°C擴散:將平皿放置到4°C冰箱中擴散數(shù)小時，使待測蛋白均勻擴散到培養(yǎng)基中；
(7)培養(yǎng):將平皿放置到30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16、24h，拍照。
[0018]所拍照片如圖2所示:A，陽性對照，酮康唑；B, rLj-112 (30 μ I) ；C, rLj-112(60 μ I); D,rLj-112 (90 μ I)；E,rLj-112 (120 μ I); F,rLj-112 (150 μ I); G,rLj-112(180μ I) ； H，陰性對照，Tris。結果表明:隨著rLj-112劑量的增加，牛津杯抑菌環(huán)增大，即rLj-112劑量依賴性的抑制白念珠菌的生長。
[0019]3.rLj-112處理后白色念珠菌的掃描電鏡觀察
(1)菌液制備:將甘油保菌(白色念珠菌，出處同上)復蘇，30°C孵育過夜(18-24h)，用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基校正濃度至f2X108CFU/ml ；
(2)孵育:將rLj-112 (2.6 μ Μ)與上述菌 1:1 孵育 16_24h ；
(3)固定:用PBS(pH7.2)沖洗3次，用體積分數(shù)3%戊二醛室溫下固定2_4 h ；
(4)逐級脫水:PBS(pH6.8)沖洗2-3次，每次間隔20 min，后經系列乙醇(體積分數(shù)為 30%、50%、70%、80%、90%、100%)脫水，每次 20 min,其中 100% 乙醇脫水 2 次；
(5)干燥、黏樣、鍍膜后，在掃描電鏡下觀察。
[0020]電鏡圖如圖3所示:A，PBS對照；B，rLj-112。用PBS處理的對照組，白念珠菌細胞形態(tài)完整，細胞膜表面光滑；而rLj-112處理過的白念珠菌顯示出了明顯的細胞膜破裂，細胞內容物外滲現(xiàn)象。
【權利要求】
1.一 種Lj-RGD3全RGD模體缺失突變體Lj-112的重組蛋白在制備抗真菌藥物中的應 用。
【文檔編號】A61K38/17GK103536902SQ201310487361
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2013年10月17日 優(yōu)先權日:2013年10月17日
【發(fā)明者】李慶偉, 王繼紅, 武彩萍, 呂莉 申請人:遼寧師范大學