一種雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)三價(jià)活疫苗及制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)三價(jià)活疫苗及其制備方法，該二聯(lián)三價(jià)活疫苗由抗原和凍干保護(hù)劑組成，其中抗原包括保藏編號(hào)為：CCTCC-V201320的雞腎型傳染性支氣管炎病毒K136株、雞呼吸型傳染性支氣管炎病毒H120株以及雞新城疫病毒La?Sota株。在制備抗原時(shí)優(yōu)選K136株和La?Sota株同胚接種，H120株單獨(dú)接種的模式，在此基礎(chǔ)上將培養(yǎng)產(chǎn)物按比例混合制成抗原后加入凍干保護(hù)劑凍干即得疫苗產(chǎn)品。本發(fā)明制備的二聯(lián)三價(jià)疫苗可同時(shí)預(yù)防雞新城疫和雞傳染性支氣管炎病，有效解決了現(xiàn)有疫苗對(duì)腎型IB只能提供部分保護(hù)或根本不保護(hù)的問題，達(dá)到了一針兩防的目的。
【專利說明】一種雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)三價(jià)活疫苗及制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】[0001]本發(fā)明屬于畜禽用生物新醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其是涉及一種雞傳染性支氣管炎和雞新城疫二聯(lián)三價(jià)活疫苗及其制備方法。【背景技術(shù)】[0002]傳染性支氣管炎病毒(IBV)屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬，能引起一種雞急性、高度接觸性呼吸道傳染病，其臨床癥狀主要表現(xiàn)為病雞呼吸困難、發(fā)出羅音、咳嗽、張口呼吸、打噴嚏等，死亡率一般很低，但對(duì)各種日齡、性別的雞均易感染。幼雛雞感染后常引起輸卵管永久性退化；成年肉雞感染后通常會(huì)引起飼料報(bào)酬降低、死淘率上升；產(chǎn)蛋雞感染后通常表會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)蛋量降低、蛋的品質(zhì)下降。另外，該病經(jīng)常并發(fā)或繼發(fā)大腸桿菌葡萄球菌、或霉形體感染，使死亡率大大增加，對(duì)養(yǎng)雞業(yè)造成嚴(yán)重危害。[0003]雞傳染性支氣管炎呈世界性分布，但對(duì)IBV致病型的劃分目前尚沒有明確標(biāo)準(zhǔn)， 主要是根據(jù)病毒對(duì)組織的親嗜性、損害的主要器官和引起的臨床癥狀來確定，其中包括呼吸型、生殖道型、腎型、腸型、腺胃型和變異型等，不同國家和不同地區(qū)IBV具有較為顯著的地域差異，我國的雞傳染性支氣管炎主要為呼吸型和腎型，目前在我國用于預(yù)防呼吸型IBV 的疫苗株主要包括H120株、M41株等；用于預(yù)防腎型IBV的疫苗株主要包括W93株、Ma5株坐寸ο[0004]雞新城疫病毒(NDV)屬于副粘病毒科副黏病毒屬，能引起一種雞的高度接觸性、急性、烈性傳染病。其病程中常呈現(xiàn)敗血癥，主要臨床特征表現(xiàn)為病雞呼吸困難，下痢，神經(jīng)機(jī)能紊亂，黏膜和漿膜出血等。各品種雞和各種年齡的雞都能感染，幼雞和中雞更易感染，死亡率極高，常對(duì)禽養(yǎng)殖業(yè)造成毀滅性打擊。新城疫病毒只有一個(gè)血清型，但不同亞群和毒株在毒力、抗原性和致病性等方面存在著明顯的差異，這種差異雖然不足于造成免疫失敗， 但有可能使一些致病毒株在免疫雞群持續(xù)存在，給雞養(yǎng)殖業(yè)帶來安全隱患，長期的生產(chǎn)實(shí)踐證明新城疫La Sota株疫苗對(duì)在我國流行的雞新城疫病毒有特異、廣譜的防治效果。[0005]隨著對(duì)這兩種疾病研究的不斷深入，防控措施也得到不斷完善，特別是相應(yīng)疫苗的成功運(yùn)用，使得這兩種疾病在一定程度上得到了有效控制。但是，在實(shí)際生產(chǎn)過程中，IB 并未得到有效控制，免疫失敗的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，其主要原因在于IBV基因組易發(fā)生點(diǎn)突變、 基因缺失、插入及重組，導(dǎo)致新的血清型和基因型病毒不斷出現(xiàn)，據(jù)報(bào)道，全世界已有30多個(gè)血清型,傳染性支氣管炎病毒血清型眾多,這給免疫帶來了很大的困難,單一血清型疫苗只能對(duì)同型的傳染性支氣管炎病毒產(chǎn)生免疫力，而對(duì)其他型的傳染性支氣管炎病毒只能提供部分保護(hù)或根本不保護(hù)，如傳統(tǒng)的H52、H120、M41等毒株制備的疫苗對(duì)很多地方流行的傳染性支氣管炎病毒已經(jīng)不能提供保護(hù)作用。迄今為止，市面上一直沒有交叉保護(hù)力好的傳染性支氣管炎疫苗，腎型IB幾乎得不到控制，目前國內(nèi)外用于預(yù)防腎型傳染性支氣管炎疫苗的研究較多，但獲得的以W93株為代表腎型經(jīng)典毒株也隨著病毒的變異逐漸喪失了對(duì)腎型IB的保護(hù)，且這些毒株的副反應(yīng)較大，已經(jīng)不適合對(duì)我國的流行株的防治，因此篩選獲得新的具有能有效防治腎型IB的毒株，用于制備多聯(lián)疫苗就顯得尤為重要。與IBV不同的是NDV血清型相對(duì)固定，目前我國新城疫預(yù)防常用I系、II系、III系等新城疫疫苗，其中La Sota株疫苗對(duì)ND的防治效果相對(duì)較好，在廣譜性上具備一定的優(yōu)勢，尤其是La Sota株疫苗在接種時(shí)受母源抗體的影響較低，同時(shí)在混合感染時(shí)一般不受IBV或其它病毒的干擾，因此常成為多聯(lián)疫苗制備過程中的最佳選擇。
[0006]在我國已有大量關(guān)于IBV和NDV 二聯(lián)疫苗的研究報(bào)道，但其中極少有關(guān)于二聯(lián)三價(jià)疫苗的制備方法的研究，針對(duì)腎型IBV和NDV 二聯(lián)三價(jià)疫苗的研究更是少之又少。2006年，崔保安(專利申請?zhí)?200610018069.2)利用IBV的呼吸型M41株、腎型HN99株以及NDV的La Sota株成功制備了 IB/ND 二聯(lián)三價(jià)滅活疫苗，但是其是利用甲醛滅活生產(chǎn)的滅活疫苗，其制劑存在著傳統(tǒng)滅活疫苗的固有不足，免疫效果較差；2012年，宋新宇(專利申請?zhí)?201210594755.X)利用IBV的腺胃型YB160株、呼吸型H120株以及NDV的La Sota株制備了 IB/ND 二聯(lián)三價(jià)活疫苗，其制品充分發(fā)揮了活疫苗的優(yōu)勢，成功的對(duì)目前中國流行的腺胃型、呼吸型雞傳染性支氣管炎病毒的攻擊和新城疫病毒的攻擊提供了良好的免疫保護(hù)力，但是由于雞傳染性支氣管炎存在不同型疫苗之間交叉保護(hù)力差的特性，所以該制品對(duì)雞腎型IB的保護(hù)能力仍無能為力。為滿足我國對(duì)腎型IB防治的需要，篩選獲得新的具有良好保護(hù)力的腎型IBV弱毒并用于制備多聯(lián)活疫苗就成為當(dāng)務(wù)之急。
[0007]傳統(tǒng)的多聯(lián)疫苗的制備過程中，常采用將不同病毒分別接種并擴(kuò)大培養(yǎng)的模式來制備抗原，在現(xiàn)有的IB/ND 二聯(lián)三價(jià)疫苗的制備工藝中沿用了這種抗原制備模式，其往往存在工藝繁瑣、成本高、易污染、不同批次間效價(jià)不穩(wěn)定等問題。在本發(fā)明中，我們將IBV、NDV采用同胚接種繁育，可達(dá)到操作簡便，污染率低，節(jié)約勞動(dòng)力等目的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是 提供一種可預(yù)防雞新城疫、腎型和呼吸型傳染性支氣管炎的二聯(lián)三價(jià)活疫苗，即利用經(jīng)典的新城疫病毒La Sota株、雞傳染性支氣管炎呼吸型H120株、以及本發(fā)明人自己分離的腎型雞傳染性支氣管炎弱毒疫苗株K136株作為抗原制備活疫苗，本發(fā)明的疫苗能有效防治我國目前流行的腎型、呼吸型雞傳染性支氣管炎和新城疫，實(shí)現(xiàn)一針兩防。
[0009]本發(fā)明的目的還在于提供上述一種可預(yù)防雞新城疫、腎型和呼吸型傳染性支氣管炎的二聯(lián)三價(jià)活疫苗的制備方法，即將雞新城疫病毒La Sota株和雞傳染性支氣管炎病毒K136株同胚接種SPF雞胚，雞傳染性支氣管炎病毒H120株單獨(dú)接種雞胚，將大量擴(kuò)增的三種病毒液按比例混合后加入凍干保護(hù)劑制成。
[0010]為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，所采用的技術(shù)方案如下:
[0011]一種雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)三價(jià)活疫苗，該活疫苗由抗原和凍干保護(hù)劑組成，所述抗原包括雞腎型傳染性支氣管炎病毒、雞呼吸型傳染性支氣管炎病毒以及雞新城疫病毒。所述凍干保護(hù)劑其成分包括10%蔗糖和5%脫脂乳。
[0012]在上述二聯(lián)三價(jià)活疫苗中，所述抗原中包括的雞腎型傳染性支氣管炎病毒是指保藏編號(hào)為CCTCC-V201320的K136株；所述抗原中包括的雞呼吸型傳染性支氣管炎病毒是指H120株；所述抗原中包括的雞新城疫病毒是指La Sota株。
[0013]雞新城疫病毒La Sota株和雞傳染性支氣管炎病毒H120株均是經(jīng)典的疫苗抗原，用其制備的疫苗對(duì)我國流行的新城疫和雞呼吸型傳染性支氣管炎有良好的防治效果?？乖邪ǖ腒136株病毒是由發(fā)明人針對(duì)我國目前流行的雞腎型傳染性支氣管炎病毒連續(xù)雞胚傳代136代致弱的，其有效的克服了經(jīng)典腎型毒株W93株在疫苗制備過程中副反應(yīng)大、不適合我國流行株防治的缺點(diǎn)，本發(fā)明中用K136株做抗原制備疫苗尚屬首次。[0014]本發(fā)明還提供了一種雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)三價(jià)活疫苗的制備方法，所述制備方法的特征是在于將雞新城疫La Sota株和傳染性支氣管炎K136株或傳染性支氣管炎H120株同胚擴(kuò)大培養(yǎng)后，與單獨(dú)擴(kuò)大培養(yǎng)的傳染性支氣管炎H120株或傳染性支氣管炎K136株按比例混合制備成抗原，再將抗原與凍干保護(hù)劑按比例混合進(jìn)行冷凍干燥后制備成疫苗。在制備抗原的過程中，優(yōu)選將雞新城疫La Sota株和傳染性支氣管炎K136株同胚接種雞胚培養(yǎng)，將傳染性支氣管炎H120株單獨(dú)接種雞胚擴(kuò)大培養(yǎng)。[0015]一種上述二聯(lián)三價(jià)活疫苗的制備方法，其中包括以下步驟:[0016]I)將NDV-La Sota株和IBV-K136或IBV-H120積混合經(jīng)尿囊腔接種雞胚，進(jìn)行病毒擴(kuò)大培養(yǎng)；[0017]2)將IBV-H120株或IBV-K136株經(jīng)尿囊腔單獨(dú)接種雞胚，進(jìn)行病毒擴(kuò)大培養(yǎng)；[0018]3)分別收獲上述兩種病毒擴(kuò)大培養(yǎng)液，經(jīng)無菌處理并進(jìn)行病毒含量測定后，等體積混合均勻制備成本發(fā)明疫苗的抗原；[0019]4)將疫苗抗原與凍干保護(hù)劑等體積混合均勻后凍干，制備成本發(fā)明中的疫苗。[0020]上述制備方法具體包括以下步驟:[0021]I)將La Sota株和K136株或H120株分別用生理鹽水稀釋100-1000倍等體積混合后，接種10日齡雞胚，收集72小時(shí)后死亡的雞胚胚液作為病毒擴(kuò)大培養(yǎng)液I ;[0022]2)同時(shí)將H120株或K136株用生理鹽水稀釋50-100倍，單獨(dú)接種10日齡雞胚， 37°C孵育50-60小時(shí)后收獲全部雞胚胚液作為病毒擴(kuò)大培養(yǎng)液II ；[0023]3)其次對(duì)收獲的病毒擴(kuò)大培養(yǎng)液I和II分別進(jìn)行無菌處理并分別測病毒含量后， 將兩種病毒擴(kuò)大培養(yǎng)液I和II按照體積比1:1混合作為本發(fā)明疫苗的抗原，即為半成品；[0024]4)將疫苗 抗原與凍干保護(hù)劑按照體積比1:1進(jìn)行配比，經(jīng)冷凍干燥后36_48h后即得疫苗，即為成品。[0025]本發(fā)明制備的二聯(lián)三價(jià)疫苗可同時(shí)預(yù)防雞新城疫和雞傳染性支氣管炎病，實(shí)現(xiàn)了一針兩防的目的，尤其是IBV腎型株K136株的成功分離、減毒和使用，顯著提升了我國雞腎型傳染性支氣管炎的防治幾率，符合當(dāng)前我國雞腎型傳染性支氣管炎的防治需求，而且有效克服了現(xiàn)有雞腎型傳染性支氣管炎病毒作為抗原生產(chǎn)的疫苗制品所產(chǎn)生的副作用?！揪唧w實(shí)施方式】[0026]為能進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容、特點(diǎn)及功效，茲例舉以下實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的前提下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。[0027]實(shí)施例1:雞傳染性支氣管炎腎型株K136株的篩選[0028]本公司從2003年-2005年分別在我國不同雞場采集疑似雞傳染性支氣管炎病毒分離毒株。病雞主要表現(xiàn)為精神不振、咳嗽，常聽到呼嚕聲，病理剖檢發(fā)現(xiàn)除氣管環(huán)有小出血點(diǎn)外腎臟還有明顯病變，經(jīng)過初步鑒定獲得4株腎型傳染性支氣管炎病毒毒株，分別命名為 CK/IBV/QD03 株、CK/IBV/ZC03 株、CK/IBV/YT04 株和 CK/IBV/SD05 株。使用 10 曰齡SPF雞胚對(duì)四株毒株進(jìn)行連續(xù)傳代致弱，每代通過尿囊腔接種4枚雞胚，37°C孵育，接種后36h凍死雞胚，收獲尿囊液用于下一代接種，連傳至136代。期間進(jìn)行致弱評(píng)價(jià)，其評(píng)價(jià)方法是取第 2、20、40、50、60、70、80、90、100、110、120、124、128、132、134、136、140 代的毒株感染I日齡雛雞，觀察雛雞發(fā)病情況。
[0029]結(jié)果見表1:
[0030]表14種分離株不同代次對(duì)SPF雞的致病結(jié)果
[0031]
【權(quán)利要求】
1.一種雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)三價(jià)活疫苗，該活疫苗由抗原和凍干保護(hù)劑組成，其特征在于所述抗原包括雞腎型傳染性支氣管炎病毒、雞呼吸型傳染性支氣管炎病毒以及雞新城疫病毒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)三價(jià)活疫苗，其特征在于所述抗原中包括的雞腎型傳染性支氣管炎病毒是指保藏編號(hào)為CCTCC-V201320的K136株；所述抗原中包括的雞呼吸型傳染性支氣管炎病毒是指H120株；所述抗原中包括的雞新城疫病毒是指La Sota株。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)三價(jià)活疫苗，其特征在于所述抗原中包括的K136株病毒是由發(fā)明人針對(duì)我國目前流行的雞腎型傳染性支氣管炎病毒連續(xù)雞胚傳代136代致弱獲得的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的一種雞傳染性支氣管炎二價(jià)活疫苗，其特征在于所述抗原中包括的K136株病毒在傳代致弱評(píng)價(jià)中，傳至第80代病毒株受試雞開始無死亡，第100代病毒株受試雞開始無眼觀病變，第120代病毒株受試雞開始無組織學(xué)病變。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的一種雞傳染性支氣管炎二價(jià)活疫苗，其特征在于所述抗原中包括的K136株病毒在免疫評(píng)價(jià)中，傳至第136代病毒株免疫組分毒率為0/10，對(duì)照組分毒率為10/10。
6.一種雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)三價(jià)活疫苗的制備方法，其特征是在于將雞新城疫La Sota株和傳染性支氣管炎K136株或傳染性支氣管炎H120株同胚接種雞胚擴(kuò)大培養(yǎng)后，與單獨(dú)接種雞胚擴(kuò)大培養(yǎng)的傳染性支氣管炎H120株或傳染性支氣管炎K136株按比例混合制備成抗原，再將抗原與凍干保護(hù)劑按比例混合進(jìn)行冷凍干燥后制備成疫苗。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)三價(jià)活疫苗的制備方法，其特征在于包括以下步驟:1)將NDV-LaSota株和IBV-K136或IBV-H120積混合經(jīng)尿囊腔接種雞胚，進(jìn)行病毒擴(kuò)大培養(yǎng)；2)將IBV-H120株或IBV-K136株經(jīng)尿囊腔單獨(dú)接種雞胚，進(jìn)行病毒擴(kuò)大培養(yǎng)；3)分別收獲上述兩種病毒擴(kuò)大培養(yǎng)液，經(jīng)無菌處理并進(jìn)行病毒含量測定后，等體積混合均勻制備成本發(fā)明疫苗的抗原；4)將疫苗抗原與凍干保護(hù)劑等體積混合均勻后凍干，制備成本發(fā)明中的疫苗。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的一種雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)三價(jià)活疫苗的制備方法，其特征在于在制備抗原的過程中，優(yōu)選將雞新城疫La Sota株和傳染性支氣管炎K136株同胚接種雞胚培養(yǎng)，將傳染性支氣管炎H120株單獨(dú)接種雞胚擴(kuò)大培養(yǎng)。
9.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的一種雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)三價(jià)活疫苗的制備方法，其特征在于在抗原制備過程中兩種病毒的擴(kuò)大培養(yǎng)液是等體積混合的。
10.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的一種雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)三價(jià)活疫苗的制備方法，其特征在于在疫苗制備過程中抗原和凍干保護(hù)劑是等體積混合的。
【文檔編號(hào)】A61K39/215GK103599533SQ201310438190
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年9月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月23日
【發(fā)明者】陳冰, 何召慶, 楊保收, 孫美玉, 邢婧珉, 李云霞, 梁武, 李守軍 申請人:天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司