一種雞傳染性支氣管炎活疫苗、耐熱保護(hù)劑及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種雞傳染性支氣管炎活疫苗、耐熱保護(hù)劑及其制備方法，該活疫苗由抗原和耐熱保護(hù)劑組成，其中抗原是保藏編號為：CCTCC-V201320的雞腎型傳染性支氣管炎病毒K136株。其具體的制備方法是，首先用雞胚對傳染性支氣管炎病毒K136株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)并配置耐熱保護(hù)劑，然后將K136株擴(kuò)大培液與耐熱保護(hù)劑混合，將得到的混合液凍干制成疫苗。本發(fā)明中制備的活疫苗，能夠緩解我國目前對流行的雞腎型傳染性支氣管炎的疫苗防治工作幾乎面臨無藥可用的窘境，同時(shí)填補(bǔ)我國制備雞腎型傳染性支氣管炎耐熱型活疫苗的空白。與現(xiàn)有活疫苗相比本發(fā)明中的疫苗在有效期內(nèi)保存在2-8℃條件下，便于儲存、運(yùn)輸和使用。
【專利說明】一種雞傳染性支氣管炎活疫苗、耐熱保護(hù)劑及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于畜禽用生物新醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其是涉及一種雞傳染性支氣管炎活疫苗、耐熱保護(hù)劑及其制備方法
【背景技術(shù)】
[0002]雞傳染性支氣管炎(Avian Infectious Bronchitis, IB)是雞的一種急性、高度接觸性傳染病，它主要侵害呼吸系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)和消化系統(tǒng)。本病最早由美國Schalk和Hawn報(bào)道，臨床以患雞咳嗽、噴嚏和氣管啰音的呼吸道癥狀為主，之后陸續(xù)在世界各國發(fā)生，1936年Beach和Schalm確定病原為病毒(呼吸型IBV)，后命名為雞傳染性支氣管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus, IBV),歸入冠狀病毒科,是冠狀病毒的代表株。
[0003]腎型傳染性支氣管炎是雞傳染性支氣管炎的一種病理表現(xiàn)形式。我國于1972年由鄺榮祿首次報(bào)道在廣東省有傳染性支氣管炎存在，隨后絕大多數(shù)省份都有該病發(fā)生的報(bào)道，在此期間發(fā)生的傳染性支氣管炎也主要為呼吸型。1962年，Winterfied等在美國發(fā)現(xiàn)了致腎病變型傳染性支氣管炎病毒，并將其命名為Holte株，該型的代表毒株有Holte株、Gray株、CV56b株、Wolgemuth株等，其中Gray株是緩和型毒株。同年，Cumming在澳大利亞分離出N1/62(T株)，該病毒被認(rèn)為是嗜腎型傳染性支氣管炎病毒的代表株。20世紀(jì)90年代以來，腎型傳染性支氣管炎在國內(nèi)也相繼爆發(fā)，流行十分廣泛。尤其是最近幾年，腎型傳染性支氣管 炎在我國肉雞群中大面積流行，給養(yǎng)雞生產(chǎn)帶來了嚴(yán)重的損失。
[0004]疫苗接種是防治IB的有效手段，但是由于IBV基因組核酸RNA復(fù)制的不連續(xù)機(jī)制及RNA聚合酶的不完全校對機(jī)制，使得病毒RNA在復(fù)制過程中易發(fā)生基因點(diǎn)突變、插入、缺失或重組，因此造成大量IBV變異株的出現(xiàn)。目前世界上已分離到的IB血清型已達(dá)30種之多，不同血清型毒株疫苗之間僅有部分或無交叉保護(hù)作用，IB的多血清型性為其免疫預(yù)防增加了難度。隨著IBV基因變異的加速，我國目前對流行的雞腎型傳染性支氣管炎的疫苗防治工作，幾乎面臨無藥可用的窘境。因此篩選獲得新的保護(hù)力好的腎型IB毒株并用于制備針對目前中國流行的腎型傳染性支氣管炎病毒活疫苗就顯得尤為重要。
[0005]弱毒活疫苗是預(yù)防畜禽傳染病的主要疫苗之一，在我國動物用疫苗中，活疫苗占相當(dāng)大的比例。國內(nèi)疫苗企業(yè)常用的保護(hù)劑主要是蔗糖、牛奶、明膠等，組方簡單，保護(hù)性能差。如果在2°C~8°C條件下，保存期只有3~6個(gè)月，多需要在-15°C以下保存。而國內(nèi)傳統(tǒng)的動物用疫苗保護(hù)劑的研制相對滯后，使疫苗的長期保存和長途運(yùn)輸受到很大限制，加上基層防疫部門缺乏必要的冷凍和冷藏設(shè)施，容易因免疫失敗而造成疫病流行。國際上發(fā)達(dá)國家的耐熱保護(hù)技術(shù)已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用，凍干疫苗大多數(shù)都實(shí)現(xiàn)了 2-8°C保存，大大降低了疫苗的保存條件，提高了疫苗的穩(wěn)定性和使用效果，但未見其配方的詳細(xì)報(bào)道。加之耐熱保護(hù)劑的效用與微生物的種類和其本身的結(jié)構(gòu)差異密切相關(guān)，決定了不同種類疫苗的保護(hù)劑的配方也應(yīng)不同。因此通過對疫苗耐熱技術(shù)的研究，開發(fā)出適合我國疫情特性的耐熱型活疫苗便成為當(dāng)務(wù)之急。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是在于提供一種耐熱型雞腎型傳染性支氣管炎活疫苗及其制備方法，以緩解我國目前對流行的雞腎型傳染性支氣管炎的疫苗防治工作幾乎面臨無藥可用的窘境，同時(shí)填補(bǔ)我國制備雞腎型傳染性支氣管炎耐熱型活疫苗的空白。
[0007]本發(fā)明的目的還在于提供上述耐熱型雞腎型傳染性支氣管炎活疫苗的耐熱保護(hù)劑及其制備方法，該耐熱保護(hù)劑可使本發(fā)明中的疫苗在有效期內(nèi)保存在2-8°C條件下，便于儲存、運(yùn)輸和使用，同時(shí)該耐熱保護(hù)劑具有制備簡單、經(jīng)濟(jì)，適合于大規(guī)模生產(chǎn)的特點(diǎn)。
[0008]為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，所采用的技術(shù)方案如下:
[0009]一種耐熱型雞腎型傳染性支氣管炎活疫苗，該活疫苗由抗原和耐熱保護(hù)劑組成，所述抗原是指雞腎型傳染性支氣管炎病毒K136株，保藏編號為CCTCC-V201320。
[0010]K136株病毒是由發(fā)明人針對我國目前流行的雞腎型傳染性支氣管炎病毒連續(xù)雞胚傳代136代致弱獲得的，其有效的克服了經(jīng)典腎型毒株W93株在疫苗制備過程中副反應(yīng)大、不適合我國流行株防治的缺點(diǎn)，本發(fā)明中用K136株做抗原制備耐熱型活疫苗尚屬首次。所述耐熱保護(hù)劑包括海藻糖，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，丙氨酸，組氨酸，谷氨酸鈉。
[0011]一種上述耐熱型雞腎型傳染性支氣管炎活疫苗的制備方法，其中包括以下步驟:
[0012]1)經(jīng)雞胚尿囊腔接種雞傳染性支氣管炎弱毒K136株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；
[0013]2)收獲擴(kuò)大培養(yǎng)病毒液，經(jīng)效價(jià)測定、無菌處理制備成疫苗抗原；
[0014]3)將疫苗抗原與耐熱保護(hù)劑按比例混合均勻后冷凍干燥制備成疫苗。
[0015]上述制備方法具體包括以下步驟:
[0016]1、將K136毒株的基礎(chǔ)種毒利用無菌生理鹽水稀釋100倍，在無菌條件下接種10日齡SPF雞胚，每個(gè)雞胚接種0.1mL于尿囊腔中，石蠟封口后置37°C孵化箱內(nèi)進(jìn)行孵化，棄去24小時(shí)內(nèi)死亡的雞胚，以后每隔4-8小時(shí)照蛋一次，死亡的雞胚挑出置于4°C，36小時(shí)將剩余雞胚置于4°C冰箱內(nèi)8-12小時(shí)，然后在無菌條件下收獲雞胚尿囊液；
[0017]2、收獲的雞胚尿囊液經(jīng)無菌檢驗(yàn)合格后利用10日齡SPF雞胚測定病毒效價(jià)，將病毒效價(jià)高于106_5EID5tlA).1mL的尿囊液備用，即為疫苗抗原；
[0018]3、將疫苗抗原與凍干保護(hù)劑按照體積比1:1進(jìn)行配比，經(jīng)冷凍干燥后36_48h后即得疫苗，即為成品。
[0019]本發(fā)明還提供了一種耐熱型雞腎型傳染性支氣管炎活疫苗的耐熱保護(hù)劑，所述耐熱保護(hù)劑包括:海藻糖10-12%，聚乙烯吡咯烷酮(PVP) 1_2%，丙氨酸0.1%-0.5%，組氨酸0.2-0.5%，谷氨酸鈉 1-2%。
[0020]一種上述耐熱保護(hù)劑的制備方法，其中包括以下步驟:
[0021 ] I)將海藻糖，丙氨酸，組氨酸，谷氨酸鈉，溶解于1/2總量的去離子水中，充分溶解后用0.22 y m的濾膜進(jìn)行過濾除菌；
[0022]2)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)充分溶解于1/2總量的去離子水中，116°C高壓30min除菌，
[0023]3)兩者充分混勻后即得耐熱保護(hù)劑。
[0024]本發(fā)明制備的活疫苗能有效防治我國當(dāng)前流行的雞腎型傳染性支氣管炎，降低因腎型傳染性支氣管炎在我國養(yǎng)殖雞群中大面積流行帶給雞養(yǎng)殖業(yè)的極大損失。而且，因?yàn)槟蜔岜Ｗo(hù)劑的添加和使用，可使本發(fā)明中的疫苗在有效期內(nèi)保存在2-8°C條件下，便于儲存、運(yùn)輸和使用。
【具體實(shí)施方式】
[0025]為能進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容、特點(diǎn)及功效，茲例舉以下實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的前提下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0026]實(shí)施例1:雞傳染性支氣管炎腎型株K136株的篩選
[0027]本公司從2003年-2005年分別在我國不同雞場采集疑似雞傳染性支氣管炎病毒分離毒株。病雞主要表現(xiàn)為精神不振、咳嗽，常聽到呼嚕聲，病理剖檢發(fā)現(xiàn)除氣管環(huán)有小出血點(diǎn)外腎臟還有明顯病變，經(jīng)過初步鑒定獲得4株腎型傳染性支氣管炎病毒毒株，分別命名為 CK/IBV/QD03 株、CK/IBV/ZC03 株、CK/IBV/YT04 株和 CK/IBV/SD05 株。使用 10 日齡SPF雞胚對四株毒株進(jìn)行連續(xù)傳代致弱，每代通過尿囊腔接種4枚雞胚，37°C孵育，接種后36h凍死雞胚，收獲尿囊液用于下一代接種，連傳至136代。期間進(jìn)行致弱評價(jià)，其評價(jià)方法是取第 2、20、40、50、60、70、80、90、100、110、120、124、128、132、134、136、140 代的毒株感染I日齡雛雞，觀察雛雞發(fā)病情況。
[0028]結(jié)果見表1:
[0029]表1 4種分離株不同代次對SPF雞的致病結(jié)果
[0030]
【權(quán)利要求】
1.一種耐熱型雞腎型傳染性支氣管炎活疫苗，該活疫苗由抗原和耐熱保護(hù)劑組成，其特征在于所述抗原是指雞腎型傳染性支氣管炎病毒K136株，保藏編號為CCTCC-V201320。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種耐熱型雞腎型傳染性支氣管炎活疫苗，其特征在于所述抗原K136株病毒是由發(fā)明人針對我國目前流行的雞腎型傳染性支氣管炎病毒連續(xù)雞胚傳代136代致弱獲得的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種耐熱型雞腎型傳染性支氣管炎活疫苗，其特征在于所述抗原中包括的K136株病毒在傳代致弱評價(jià)中，傳至第80代病毒株受試雞開始無死亡，第100代病毒株受試雞開始無眼觀病變，第120代病毒株開始受試雞開始無組織學(xué)病變。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的一種耐熱型雞腎型傳染性支氣管炎活疫苗，其特征在于所述抗原中包括的K136株病毒在免疫評價(jià)中，傳至第136代病毒株免疫組分毒率為.0/10，對照組分毒率為10/10。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種耐熱型雞腎型傳染性支氣管炎活疫苗，其特征在于所述耐熱保護(hù)劑包括:海藻糖10-12%，聚乙烯吡咯烷酮(PVP) 1-2%，丙氨酸0.1%-0.5%，組氨酸.0.2-0.5%，谷氨酸鈉 1-2%。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種耐熱型雞腎型傳染性支氣管炎活疫苗的制備方法，其特征在于包括以下步驟: 1)經(jīng)雞胚尿囊腔接種雞傳染性支氣管炎弱毒K136株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)； 2)收獲擴(kuò)大培養(yǎng)病毒液，經(jīng)效價(jià)測定、無菌處理制備成疫苗抗原； 3)將疫苗抗原與耐熱保護(hù)劑按比例混合均勻后冷凍干燥制備成疫苗。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的一種耐熱型雞腎型傳染性支氣管炎活疫苗耐熱保護(hù)劑的制備方法，其特征在于包括以下步驟: 1)將海藻糖，丙氨酸，組氨酸，谷氨酸鈉，溶解于1/2總量的去離子水中，充分溶解后用.0.22um的濾膜進(jìn)行過濾除菌； 2)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)充分溶解于1/2總量的去離子水中，116°C高壓30min除菌， 3)兩者充分混勻后即得耐熱保護(hù)劑。
【文檔編號】A61K47/36GK103599531SQ201310438189
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年9月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月23日
【發(fā)明者】孫美玉, 何召慶, 吳全忠, 楊保收, 陳冰, 邢婧珉, 李云霞, 梁武, 李守軍 申請人:天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司