一種從紅鳳菜新鮮莖葉中提取分離總黃酮的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種從紅鳳菜新鮮莖葉中提取分離總黃酮的方法，該方法包括以下主要步驟：(1)以粉碎的紅鳳菜新鮮莖葉為原料，用乙醇提??；(2)乙醇提取物用大孔樹脂柱層析，乙醇-水梯度洗脫；(3)將步驟(2)得到的黃酮類部分用聚酰胺柱層析，乙醇-水梯度洗脫；(4)將步驟(3)析出的結(jié)晶濾出，母液合并，得到不同純度的總黃酮提取物。經(jīng)HPLC檢測，結(jié)晶部分總黃酮含量＞90％，母液部分總黃酮含量＞80％。
【專利說明】一種從紅鳳菜新鮮莖葉中提取分離總黃酮的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及從植物中提取分離有效成分的一種方法，具體是從紅鳳菜的新鮮莖葉中提取分離總黃酮。
【背景技術(shù)】
[0002]紅鳳菜(Gynura bicolor DC.)為菊科菊三七屬植物,別名血皮菜、觀音菜、觀音莧、紫背天葵等，主要分布于我國南方各地，全草入藥，味苷、辛，性涼，具有涼血止血、清熱消腫的功效，治咳血、血崩、痛經(jīng)、血氣痛、支氣管炎、盆腔炎、中暑、阿米巴痢疾，外用治創(chuàng)傷出血、潰瘍久不收口、療瘡?fù)窗X、甲溝炎。紅鳳菜還可作為蔬菜食用，近年來我國多個地區(qū)有栽培和銷售。
[0003]紅鳳菜中含有黃酮類成分。卓敏等從紅鳳菜中分離得到6個黃酮類化合物:山柰酚、山柰酚-3_0-13-D-葡萄糖苷、高車前苷、山柰酚-3-0-13_D-吡喃葡萄糖基(6 — l)-a-L-鼠李糖苷、槲皮素-3-0-β-D-吡喃葡萄糖基(6 — D-Q-L-鼠李糖苷、槲皮素-雙-3-0- β -葡萄糖苷；呂寒等從紅鳳菜中分離得到5個黃酮類化合物:槲皮素、山柰酚、槲皮苷、異槲皮苷、蘆??；呂寒等采用高效液相與多級質(zhì)譜聯(lián)用法對紅鳳菜提取物中的黃酮類成分進行檢測，確定提取物中含有5個黃酮類化合物:槲皮素-3-0-β -D-吡喃葡萄糖基(6 — I) - a -L-鼠李糖苷、山柰酚-3-0- β -D-吡喃葡萄糖基(6 — I) - a -L-鼠李糖苷、槲皮素-3-0- β -D-吡喃葡萄糖、槲皮素-3-0-鼠李糖苷、山柰酚。
[0004]可見，紅鳳菜的黃酮類化合物主要是槲皮素、山柰酚及其苷類成分，這些成分多具有保護心血管、抗腫瘤、抗糖尿病、抗氧化、抗炎、抗病毒等作用，從紅鳳菜中提取黃酮類化合物具有重要意義。
[0005]裴詠萍等研究了紅鳳菜總黃酮的提取工藝，以紅鳳菜的干燥葉片為原料，確定的最佳提取工藝是依次以12倍量、10倍量70%乙醇提取2次，2h/次。
[0006]卓敏等用紅鳳菜地上部分干樣，分別用95^^75^^60%乙醇冷浸提取，浸膏混懸于水中，先后用石油醚、醋酸乙酯萃取，醋酸乙酯部分經(jīng)過反復(fù)硅膠柱、C18柱、SephadexLH-20柱等層析，最終分離得到山柰酚等黃酮類單體化合物。呂寒等用紅鳳菜干品粉末，用70%乙醇熱回流提取，減壓濃縮揮去乙醇，冷卻沉淀，取上清液用大孔樹脂柱層析，依次用10%,20%,50%,95%乙醇洗脫，合并50%乙醇洗脫部分，反復(fù)硅膠柱層析,再結(jié)合聚酰胺柱層析和S^hadex LH-20柱層析，得到槲皮素等黃酮類單體化合物。以上兩種紅鳳菜黃酮類物質(zhì)的提取分離方法都采用干燥的地上部分為原料，提取物經(jīng)過多次反復(fù)柱層析，采用氯仿、甲醇冼脫，步驟繁多，毒性較大。
[0007]呂寒等提供了一種紅鳳菜總黃酮提取物的制備方法(專利申請?zhí)?201010611189.X)，以干燥的紅鳳菜為原料，經(jīng)過醇提、加水冷沉、大孔吸附樹脂層析2次，以乙醇-水梯度洗脫，得到紅鳳菜總黃酮提取物。以蘆丁為對照品，用0.1mol -L-1AlCl3.6Η20顯色，比色法測定總黃酮含量，結(jié)果顯示該提取物中的總黃酮含量可達50%以上。該方法也以干燥的紅鳳菜為原料，經(jīng)過2次大孔吸附樹脂層析，方法簡便，但所得提取物中的總黃酮含量較低。
[0008]李法慶等提供了一種從新鮮紅鳳菜中提取紫色素及總黃酮的方法(專利申請?zhí)?01110218685.3)，以新鮮紅鳳菜為原料，用乙醇溫浸提取，提取液經(jīng)過超濾系統(tǒng)超濾一納濾系統(tǒng)濃縮一離子交換樹脂層析一大孔吸附樹脂層析等步驟，獲得總黃酮結(jié)晶物，濾出干燥后得到總黃酮。該方法以新鮮紅鳳菜為原料，得到總黃酮結(jié)晶產(chǎn)物，但該法用到超濾系統(tǒng)和納濾系統(tǒng)，設(shè)備條件要求高，操作步驟多。
[0009]本發(fā)明以紅鳳菜新鮮莖葉為原料，無需干燥加工，既節(jié)省勞力又降低能耗；本發(fā)明僅需2次柱層忻，工藝簡單，操作方便；本發(fā)明可得到高含量的總黃酮提取物，采用高效液相(HPLC)技術(shù)檢測，析出的結(jié)晶部分總黃酮含量達到90%以上，母液部分總黃酮含量達到80%以上；本發(fā)明層析分離所采用的填料為大孔樹脂和聚酰胺，方便易得、價格便宜且可再生，洗脫液采用乙醇和水，生產(chǎn)成本低廉；本發(fā)明在總黃酮提取分離的整個流程中，涉及的溶劑僅有乙醇和水，操作安全，產(chǎn)品無殘毒，對環(huán)境無污染。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明的目的是提供一種工藝簡單、成本低廉、操作安全、能耗低、對環(huán)境無污染、可用于工廠化生產(chǎn)的方法，從紅鳳菜的新鮮莖葉中提取分離高純度總黃酮。
[0011]本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的:以紅鳳菜的新鮮莖葉為原料，乙醇提取，依次經(jīng)過大孔樹脂柱層析和聚酰胺柱層析，最終得到紅鳳菜總黃酮提取物。經(jīng)高效液相(HPLC)檢測，洗脫液的總黃酮含量達到80%以上，洗脫液中析出的結(jié)晶物總黃酮含量達到90%以上。具體操作過程如下:
[0012](I)提取:以紅鳳 菜新鮮莖葉為原料，粉碎后用乙醇冷浸2-3次，所用乙醇的體積分數(shù)為70% -95%，料液比(W:V)為1:3-5，合并濾液，減壓濃縮至原體積的1/3-1/5，得到濃縮液；
[0013](2)冷沉:將步驟(I)得到的濃縮液在冰箱中放置3-5天冷沉，去雜質(zhì)，取上清液；
[0014](3)大孔樹脂柱層析:將步驟(2)得到上清液用大孔樹脂進行柱層析，大孔樹脂為NKA、DlOU HPD-100, X_5、AB-8中的一種，上樣量為50_100g/L柱床體積，樣品濃度為0.02-0.05g/ml，水-乙醇梯度洗脫所用的乙醇體積分數(shù)依次為0，30 %，50 %，70 %，95 %，洗脫體積均為2倍柱床體積，收集50%乙醇洗脫部分，濃縮除去乙醇，得到濃縮液；
[0015](4)聚酰胺柱層析:將步驟(3)得到的濃縮液進行聚酰胺柱層析，所用聚酰胺為60-100目粉末，上樣量為5-10g/L柱床體積，上樣溶液的濃度為0.002-0.005g/ml，水-乙醇梯度洗脫所用的乙醇體積分數(shù)依次為0，30%，50%，70%，95%，洗脫體積均為2倍柱床體積。收集30% -70%乙醇洗脫部分，收集的每份體積為1/10柱床體積，濃縮到小體積，放置至析出結(jié)晶；
[0016](5)過濾、干燥:將步驟(4)中析出的結(jié)晶分別濾出，母液部分合并，結(jié)晶和母液分別干燥，得到
[0017]不同純度的紅鳳菜總黃酮。
【具體實施方式】
[0018]實施例1:不同濃度乙醇對紅鳳菜總黃酮的提取效果[0019]稱取紅鳳菜鮮葉20g共4份，分別加入體積分數(shù)為O、50 %、70 %、95 %的乙醇水溶液100ml，用電動攪拌機勻漿，超聲波提取Ih (設(shè)定溫度50°C，功率90% )，過濾，得到提取液。
[0020]采用比色法測定總黃酮含量。精密稱取槲皮素對照品12.lmg，用80%乙醇溶解并定容到50mL，即配成濃度為0.242g. 1的溶液。精密吸取槲皮素對照品溶液0.0，1.0，
1.5,2.0,2.5,3.0,4.0mL至7只試管中，每濃度重復(fù)3次，分別加入0.3mL5% NaNO2，搖勻，6min后加入0.3mL10% Al (NO3) 3，搖勻，放置6min，加4% NaOH4.0mL,以水定容到10mL，放置10-15min，在510nm處測定吸光值(A51tl)，以加入的槲皮素含量(mg)為縱坐標，測得的A51tl為橫坐標，計算線性相關(guān)方程。
[0021]精密吸取不同濃度乙醇的提取液3ml，代替槲皮素對照品，以相同方法測定樣品的A51tl，同時分別取不同濃度乙醇的提取液3ml，用70%乙醇定容到10ml，作為不同提取液的空白。根據(jù)標準曲線計算樣品中的總黃酮含量。每樣品重復(fù)2次。
[0022]測得槲皮素與吸光值(A51tl)的線性相關(guān)方程為:y = 2.2157x-0.2511，r =
0.9991 (η = 3)，x為吸光值，y為槲皮素的質(zhì)量(mg)。根據(jù)線性相關(guān)方程，計算不同濃度乙醇對紅鳳菜新鮮莖葉的總黃酮提取效果，結(jié)果如表1所示:
[0023]表1不同濃度乙醇對紅鳳菜新鮮莖葉中總黃酮的提取效果:
【權(quán)利要求】
1.一種紅鳳菜總黃酮的提取分離方法，以紅鳳菜的新鮮莖葉為原料，乙醇提取，經(jīng)過2次柱層析，獲得紅鳳菜總黃酮。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的紅鳳菜總黃酮的提取分離方法，所述的2次柱層析依次為大孔樹脂柱層析和聚酰胺柱層析。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的紅鳳菜總黃酮的提取分離方法，其特征包括以下步驟: (1)提取:以紅鳳菜的新鮮莖葉為原料，用乙醇冷浸提取2-3次，合并濾液，減壓濃縮至原體積的1/3-1/5，得到濃縮液； (2)冷沉:將步驟(I)得到的濃縮液在冰箱中放置3-5天冷沉，取上清液； (3)大孔樹脂柱層析:將步驟(2)得到上清液用大孔樹脂進行柱層析，水-乙醇梯度洗脫，收集洗脫液，濃縮除去乙醇，得到濃縮液； (4)聚酰胺柱層析:將步驟(3)得到的濃縮液用聚酰胺柱層析，水-乙醇梯度洗脫，收集洗脫液，濃縮到小體積，放置，忻出結(jié)晶； (5)過濾、干燥:將步驟(4)析出的結(jié)晶濾出，母液合并，結(jié)晶與母液分別干燥，得到不同純度的紅鳳菜總黃酮提取物，用高效液相(HPLC)方法檢測，其中結(jié)晶部分總黃酮含量達90%以上，母液部分總黃酮含量達80%以上。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的紅鳳菜總黃酮的提取分離方法，其特征為步驟(I)用乙醇提取，所用乙醇的體積分數(shù)為70% -95%，料液比(W:V)為1:3-5。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的紅鳳菜總黃酮的提取分離方法，其特征為步驟(3)大孔樹脂柱層析所用的大孔樹脂為NKA、AB-8、HPD-100, X_5、DlOl中的一種，上樣量為50_100g/L柱床體積,樣品濃度為0.02-0.05g/ml，水-乙醇梯度洗脫所用的乙醇體積分數(shù)依次為0，30%,50%,70%,95%,洗脫體積均為2倍柱床體積。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的紅鳳菜總黃酮的提取分離方法，其特征為步驟(3)大孔樹脂柱層析所收集的洗脫液為50%乙醇洗脫部分。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的紅鳳菜總黃酮的提取分離方法，其特征在于步驟(4)聚酰胺柱層析所用的聚酰胺為60-100目粉末，上樣量為5-10g/L柱床體積，樣品濃度為0.002-0.005g/ml，水-乙醇梯度洗脫所用的乙醇體積分數(shù)依次為O，30 %，50 %，70 %，95 %，洗脫體積均為2倍柱床體積。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的紅鳳菜總黃酮的提取分離方法，其特征在于步驟(4)聚酰胺柱層析,收集洗脫液為收集30-50%乙醇洗脫部分，收集的每份體積為1/10柱床體積。
【文檔編號】A61K135/00GK103463159SQ201310423000
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月17日
【發(fā)明者】任冰如, 李維林, 陳劍, 呂寒, 梁呈元, 吳菊蘭, 趙磊 申請人:江蘇省中國科學(xué)院植物研究所