本發(fā)明涉及一種用于登革熱預(yù)防和/或治療的疫苗。

背景技術(shù)：
登革熱（DengueFever，DF）是由伊蚊傳播的病毒性急性傳染病。登革熱病毒（Denguevirus，DENV）呈球形，由胞膜、衣殼蛋白、非結(jié)構(gòu)蛋白及單股正鏈RNA組成。自然界中，登革熱病毒存在四種血清型（DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4）。登革熱病毒經(jīng)由伊蚊叮咬傳染人體后，經(jīng)2-3天潛伏即可表現(xiàn)出臨床癥狀。登革熱的臨床特征為高熱、骨骼及肌肉酸痛、出血傾向及白細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯減少。登革熱臨床表現(xiàn)較輕微，隨病程進(jìn)展大多數(shù)人自愈，致死率低.但少數(shù)人的病程會(huì)進(jìn)展到下一階段，即登革出血熱（DengueHemorrhagicFever,DHF）及登革休克綜合癥（DengueShockSyndrome,DSS），這是登革熱感染的一種嚴(yán)重類(lèi)型，臨床表現(xiàn)為各器官?lài)?yán)重出血、高熱、血小板計(jì)數(shù)明顯減少、血液濃縮、休克，造成該病程的死亡率極高。登革熱病毒主要由埃及伊蚊（Aedesaegypti）叮咬人體后感染傳播。目前認(rèn)為，登革熱病毒的自然宿主僅有人、低等靈長(zhǎng)類(lèi)及伊蚊。在自然界中，登革熱病毒主要在兩種模式中循環(huán)：1）城市循環(huán)（UrbanCycle）：在城市型的登革熱流行中，病毒在“人-伊蚊-人”之間傳播；2）叢林循環(huán)（SylvaticCycle）：主要是通過(guò)熱帶叢林中的伊蚊及低等靈長(zhǎng)類(lèi)之間傳播，此循環(huán)為登革熱病毒的原始循環(huán)。據(jù)研究，叢林型登革熱病毒與城市循環(huán)條件下的登革熱病毒差異較大,但是不能排除叢林循環(huán)的感染伊蚊將病毒擴(kuò)散至城市及鄉(xiāng)村的可能性。目前，全世界范圍內(nèi)已有100多個(gè)國(guó)家及地區(qū)出現(xiàn)登革熱的感染流行。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）估計(jì)，全世界大約由25億人生活在受登革熱感染威脅的區(qū)域，每年有5000萬(wàn)人被登革熱病毒初次感染或重復(fù)感染，有50萬(wàn)人入院治療，并導(dǎo)致大約25,000人的死亡。登革熱已經(jīng)成為世界上第一大病毒性蟲(chóng)媒傳染?。╤ttp://www.who.int/tdr/publications/publications/dengue）。近10年來(lái)，登革熱在全球范圍內(nèi)的流行趨勢(shì)加劇，已經(jīng)成為一個(gè)世界性的公共衛(wèi)生難題。C型凝集素（C-typeLectin,CTL）是一類(lèi)具有C型凝集素（C-typelectin）結(jié)構(gòu)域，可以與糖類(lèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)家族，它在于真核生物體內(nèi)廣泛存在。在哺乳動(dòng)物中C型凝集素家族中的多個(gè)基因在樹(shù)突狀細(xì)胞（Dendriticcell，DC）、巨噬細(xì)胞（Macrophage）及單核細(xì)胞（Monocytes）等免疫細(xì)胞中高量表達(dá)，并在激活宿主免疫反應(yīng)的過(guò)程中起到重要作用。C型凝集素在伊蚊中有多個(gè)亞型表達(dá)，并主要以分泌蛋白的形式存在。目前世界上尚無(wú)針對(duì)登革熱的特效藥物及疫苗。登革熱的致病機(jī)理特殊，低水平的登革熱抗體可以顯著地促進(jìn)不同血清型病毒的二次感染（抗體依賴(lài)增強(qiáng)效應(yīng)，Antibody-dependentEnhancement，ADE）。該現(xiàn)象被認(rèn)為是誘發(fā)登革出血熱的主要因素之一?？贵w依賴(lài)增強(qiáng)效應(yīng)使得傳統(tǒng)登革熱疫苗的安全性大為降低，嚴(yán)重阻礙了登革熱疫苗的研發(fā)。至此，尋找新的方法來(lái)“對(duì)抗”登革熱病毒的感染與傳播已經(jīng)迫在眉睫。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種用于登革熱預(yù)防和/或治療的疫苗。本發(fā)明提供了一種產(chǎn)品，其活性成分為抑制伊蚊體內(nèi)的C型凝集素的編碼基因表達(dá)的物質(zhì)；所述產(chǎn)品的用途為如下（a）或（b）或（c）：（a）抑制登革熱病毒在伊蚊體內(nèi)復(fù)制；（b） 預(yù)防和/或治療登革熱；（c）阻斷登革熱病毒的傳播。本發(fā)明還保護(hù)一種產(chǎn)品，其活性成分為與伊蚊體內(nèi)的C型凝集素結(jié)合從而抑制所述C型凝集素的活性的物質(zhì)；所述產(chǎn)品的用途為如下（a）或（b）或（c）：（a）抑制登革熱病毒在伊蚊體內(nèi)復(fù)制；（b）預(yù)防和/或治療登革熱；（c）阻斷登革熱病毒的傳播。所述“與伊蚊體內(nèi)的C型凝集素結(jié)合從而抑制所述C型凝集素的活性的物質(zhì)”為所述C型凝集素的抗體。本發(fā)明還保護(hù)一種產(chǎn)品，其活性成份為促使動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生與伊蚊體內(nèi)的C型凝集素結(jié)合從而抑制所述C型凝集素的活性的物質(zhì)的物質(zhì)；所述產(chǎn)品的用途為如下（a）或（b）或（c）：（a）抑制登革熱病毒在伊蚊體內(nèi)復(fù)制；（b）預(yù)防和/或治療登革熱；（c）阻斷登革熱病毒的傳播。所述“促使動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生與伊蚊體內(nèi)的C型凝集素結(jié)合從而抑制所述C型凝集素的活性的物質(zhì)的物質(zhì)”為C型凝集素。本發(fā)明還保護(hù)抑制伊蚊體內(nèi)的C型凝集素的編碼基因表達(dá)的物質(zhì)在制備產(chǎn)品中的應(yīng)用；所述產(chǎn)品的用途為如下（a）或（b）或（c）：（a）抑制登革熱病毒在伊蚊體內(nèi)復(fù)制；（b）預(yù)防和/或治療登革熱；（c）阻斷登革熱病毒的傳播。本發(fā)明還保護(hù)C型凝集素在制備產(chǎn)品中的應(yīng)用；所述產(chǎn)品的用途為如下（a）或（b）或（c）：（a）抑制登革熱病毒在伊蚊體內(nèi)復(fù)制；（b）預(yù)防和/或治療登革熱；（c）阻斷登革熱病毒的傳播。以上任一所述革熱病毒可為登革熱2型病毒，具體可為NewGuineaC株。以上任一所述C型凝集素為如下（1）至（19）中任一所述的蛋白質(zhì)：（1）序列表的序列1自5’末端第21-168位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；（2）序列表的序列1所示的蛋白質(zhì)；（3）序列表的序列3自5’末端第17-174位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；（4）序列表的序列3所示的蛋白質(zhì)；（5）序列表的序列5自5’末端第18-191位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；（6）序列表的序列5所示的蛋白質(zhì)；（7）序列表的序列7自5’末端第26-154位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；（8）序列表的序列7所示的蛋白質(zhì)；（9）序列表的序列9自5’末端第20-158位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；（10）序列表的序列9所示的蛋白質(zhì)；（11）序列表的序列11自5’末端第17-153位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；（12）序列表的序列11所示的蛋白質(zhì)；（13）序列表的序列13自5’末端第26-154位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；（14）序列表的序列13所示的蛋白質(zhì)；（15）序列表的序列15自5’末端第22-173位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；（16）序列表的序列15所示的蛋白質(zhì)；（17）序列表的序列17自5’末端第26-160位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；（18）序列表的序列17所示的蛋白質(zhì)；（19）將（1）至（18）中任一所述蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的蛋白質(zhì)。以上任一所述C型凝集素還可為具有HIS標(biāo)簽的C型凝集素。以上任一所述C型凝集素的編碼基因?yàn)槿缦?）至（20）中任一所述的DNA分子：（1）序列表的序列2自5’末端第61-504位核苷酸所示的DNA分子；（2）序列表的序列2所示的DNA分子；（3）序列表的序列4自5’末端第49-522位核苷酸所示的DNA分子；（4）序列表的序列4所示的DNA分子；（5）序列表的序列6自5’末端第52-573位核苷酸所示的DNA分子；（6）序列表的序列6所示的DNA分子；（7）序列表的序列8自5’末端第76-462位核苷酸所示的DNA分子；（8）序列表的序列8所示的DNA分子；（9）序列表的序列10自5’末端第58-474位核苷酸所示的DNA分子；（10）序列表的序列10所示的DNA分子；（11）序列表的序列12自5’末端第49-459位核苷酸所示的DNA分子；（12）序列表的序列12所示的DNA 分子；（13）序列表的序列14自5’末端第76-462位核苷酸所示的DNA分子；（14）序列表的序列14所示的DNA分子；（15）序列表的序列16自5’末端第64-519位核苷酸所示的DNA分子；（16）序列表的序列16所示的DNA分子；（17）序列表的序列18自5’末端第76-480位核苷酸所示的DNA分子；（18）序列表的序列18所示的DNA分子；（19）在嚴(yán)格條件下與（1）至（18）中任一限定的DNA序列雜交且編碼具有相同功能的蛋白的DNA分子；（20）與（1）至（18）中任一限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼具有相同功能的蛋白的DNA分子。所述嚴(yán)格條件為在0.1×SSPE（或0.1×SSC）、0.1％SDS的溶液中，65℃條件下雜交并洗膜。以上任一所述“抑制伊蚊體內(nèi)的C型凝集素的編碼基因表達(dá)的物質(zhì)”具體可為如下①至⑨中任一所述的dsRNA：①序列表的序列2自5’末端第1至333位核苷酸所示的雙鏈DNA對(duì)應(yīng)的雙鏈RNA；②序列表的序列4自5’末端第31-381位核苷酸所示的雙鏈DNA對(duì)應(yīng)的雙鏈RNA；③序列表的序列6自5’末端第79至407位核苷酸所示的雙鏈DNA對(duì)應(yīng)的雙鏈RNA；④序列表的序列8自5’末端第118至452位核苷酸所示的雙鏈DNA對(duì)應(yīng)的雙鏈RNA；⑤序列表的序列10自5’末端第78至471位核苷酸所示的雙鏈DNA對(duì)應(yīng)的雙鏈RNA；⑥序列表的序列12自5’末端第1至389位核苷酸所示的雙鏈DNA對(duì)應(yīng)的雙鏈RNA；⑦序列表的序列14自5’末端第24至413位核苷酸所示的雙鏈DNA對(duì)應(yīng)的雙鏈RNA；⑧序列表的序列16自5’末端第38至415位核苷酸所示的雙鏈DNA對(duì)應(yīng)的雙鏈RNA；⑨序列表的序列18自5’末端第149至465位核苷酸所示的雙鏈DNA對(duì)應(yīng)的雙鏈RNA。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，抑制伊蚊C型凝集素（mosquitoGalactosespecificC-typeLectin,mosGCTL）蛋白的活性可以抑制登革熱病毒在伊蚊體內(nèi)的復(fù)制，切斷伊蚊在吸血過(guò)程中從宿主體內(nèi)獲取登革熱病毒的能力，從而顯著降低蚊蟲(chóng)的帶毒率、達(dá)到防治登革熱病毒的目的。在實(shí)際應(yīng)用中，阻斷疫苗不僅可以對(duì)單一亞型進(jìn)行免疫，也可以對(duì)多種亞型共同免疫形成復(fù)合疫苗，阻斷登革熱病毒的傳播。本發(fā)明對(duì)于登革熱的控制具有重大價(jià)值，對(duì)于人類(lèi)健康事業(yè)具有深遠(yuǎn)意義。附圖說(shuō)明圖1為實(shí)施例1至實(shí)施例9的步驟二的結(jié)果。圖2為實(shí)施例14的結(jié)果。具體實(shí)施方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買(mǎi)得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。Actin基因如序列表的序列20所示。埃及伊蚊（Aedesaegypti）：參考文獻(xiàn)：ColpittsTM,CoxJ,VanlandinghamDL,FeitosaFM,ChengG,etal.(2011)AlterationsintheAedesaegyptiTranscriptomeduringInfectionwithWestNile,DengueandYellowFeverViruses.PLoSPathog7(9):e1002189.doi:10.1371/journal.ppat.1002189.。實(shí)施例中所用的登革熱2型病毒（denguevirustype-2，DENV-2）均為登革熱2型病毒NewGuineaC株；參考文獻(xiàn)：ChaoYC,HuangCS,LeeCN,etal.Higherinfectionofdenguevirusserotype2inhumanmonocytesofpatientswithG6PDdeficiency[J].PloSone,2008,3(2):e1557.。質(zhì)粒pET-28a(+)：MerckMillipore公司（原Novagen公司，產(chǎn)品目錄號(hào)69864。大腸桿菌BL21(DE3)：MerckMillipore公司（原Novagen公司，產(chǎn)品目錄號(hào)69450）。Hemotek蚊蟲(chóng)喂養(yǎng)器（該系統(tǒng)可以恒溫37℃加熱飼喂樣本，模擬人體環(huán)境，吸引蚊子攝取樣品血液）：HemotekLIMITED公司（英國(guó)公司，產(chǎn)品目錄號(hào)6W1Hemotekmembranefeedingsystem）.MID50(50%mosquitoInfectiousdose)即半數(shù)蚊子感染劑量；MID50的數(shù)值含義為通過(guò)胸腔注射病毒稀釋液300nL使半數(shù)埃及伊蚊感染病毒的稀釋倍數(shù)；1MID50為將病毒原液稀釋其MID50數(shù)值倍數(shù)后，胸腔注射300nL可使半數(shù)埃及伊蚊感染。實(shí)施例1、抑制mosGCTL-3基因表達(dá)的物質(zhì)在抑制登革熱病毒復(fù)制中的應(yīng)用埃及伊蚊的C型凝集素亞型3又稱(chēng)mosGCTL-3蛋白，如序列表的序列1所示。編碼mosGCTL-3蛋白的基因又稱(chēng)mosGCTL-3基因，其cDNA的編碼區(qū)如序列表的序列2所示。一、設(shè)計(jì)dsRNA設(shè)計(jì)用于抑制mosGCTL-3基因表達(dá)的dsRNA（dsRNA-1），即序列表的序列2自5’末端第1至333位核苷酸所示的雙鏈DNA對(duì)應(yīng)的雙鏈RNA。設(shè)計(jì)用于抑制GFP基因表達(dá)的dsRNA（dsRNA-2），即序列表的序列19所示的雙鏈RNA。二、抑制mosGCTL-3基因表達(dá)的物質(zhì)在抑制登革熱2型病毒復(fù)制中的應(yīng)用1、將埃及伊蚊分成兩組，分別進(jìn)行如下處理：實(shí)驗(yàn)組：每只埃及伊蚊通過(guò)胸腔注射2微克dsRNA-1；對(duì)照組：每只埃及伊蚊通過(guò)胸腔注射2微克dsRNA-2；2、完成步驟1的注射3天后，給埃及伊蚊接種登革熱2型病毒（每只埃及伊蚊通過(guò)胸腔注射劑量為10MID50的DENV-2病毒，注射體積為300nL）。3、完成步驟2的接種6天后，利用TaqmanRT-QPCR檢測(cè)埃及伊蚊體內(nèi)的登革熱2型病毒量。用于TaqmanRT-QPCR檢測(cè)登革熱2型病毒的引物對(duì)如下：上游引物：5’-CATTCCAAGTGAGAATCTCTTTGTCA-3’；下游引物：5’-CAGATCTCTGATGAATAACCAACG-3’。用于TaqmanRT-QPCR檢測(cè)登革熱2型病毒的探針如下：5’-FAM-ATGCTGAAACGCGAGAGAAACCGC-TRAMA-3’。埃及伊蚊體內(nèi)的登革熱2型病毒量見(jiàn)圖1，縱坐標(biāo)的單位為“對(duì)于每含有1ngActin基因的mRNA來(lái)說(shuō)，含有的E基因的ng數(shù)”。實(shí)驗(yàn)組埃及伊蚊體內(nèi)的登革熱2型病毒量為0.109ng（20只平均值），對(duì)照組埃及伊蚊體內(nèi)的登革熱2型病毒量為0.494ng（22只平均值）。結(jié)果表明，導(dǎo)入用于抑制mosGCTL-3基因表達(dá)的dsRNA后，埃及伊蚊體內(nèi)的登革熱2型病毒的病毒量出現(xiàn)明顯下降，即抑制mosGCTL-3基因表達(dá)可以抑制登革熱2型病毒在埃及伊蚊體內(nèi)的復(fù)制，即mosGCTL-3基因可以促進(jìn)登革熱2型病毒在埃及伊蚊體內(nèi)的復(fù)制。實(shí)施例2、抑制mosGCTL-26基因表達(dá)的物質(zhì)在抑制登革熱病毒復(fù)制中的應(yīng)用埃及伊蚊的C型凝集素亞型26又稱(chēng)mosGCTL-26蛋白，如序列表的序列3所示。編碼mosGCTL-26蛋白的基因又稱(chēng)mosGCTL-26基因，其cDNA的編碼區(qū)如序列表的序列4所示。一、設(shè)計(jì)dsRNA設(shè)計(jì)用于抑制mosGCTL-26基因表達(dá)的dsRNA（dsRNA-3），即序列表的序列4自5’末端第 31-381位核苷酸所示的雙鏈DNA對(duì)應(yīng)的雙鏈RNA。二、抑制mosGCTL-26基因表達(dá)的物質(zhì)在抑制登革熱2型病毒復(fù)制中的應(yīng)用1、將埃及伊蚊分成兩組，分別進(jìn)行如下處理：實(shí)驗(yàn)組：每只埃及伊蚊通過(guò)胸腔注射2微克dsRNA-3；對(duì)照組：每只埃及伊蚊通過(guò)胸腔注射2微克dsRNA-2；2、完成步驟1的注射3天后，給埃及伊蚊接種登革熱2型病毒（每只埃及伊蚊通過(guò)胸腔注射劑量為10MID50的DENV-2病毒，注射體積為300nL）。3、完成步驟2的接種6天后，利用TaqmanRT-QPCR檢測(cè)埃及伊蚊體內(nèi)的登革熱2型病毒量。用于TaqmanRT-QPCR檢測(cè)登革熱2型病毒的引物對(duì)如下：上游引物：5’-CATTCCAAGTGAGAATCTCTTTGTCA-3’；下游引物：5’-CAGATCTCTGATGAATAACCAACG-3’。用于TaqmanRT-QPCR檢測(cè)登革熱2型病毒的探針如下：5’-FAM-ATGCTGAAACGCGAGAGAAACCGC-TRAMA-3’。采用“對(duì)于每含有1ngActin基因的mRNA來(lái)說(shuō)，含有的E基因的ng數(shù)”表征登革熱2型病毒量。實(shí)驗(yàn)組埃及伊蚊體內(nèi)的登革熱2型病毒量為0.252g（20只的平均值），對(duì)照組埃及伊蚊體內(nèi)的登革熱2型病毒量為0.494ng（22只的平均值）。結(jié)果表明，導(dǎo)入用于抑制mosGCTL-26基因表達(dá)的dsRNA后，埃及伊蚊體內(nèi)的登革熱2型病毒的病毒量出現(xiàn)明顯下降，即抑制mosGCTL-26基因表達(dá)可以抑制登革熱2型病毒在埃及伊蚊體內(nèi)的復(fù)制，即mosGCTL-26基因可以促進(jìn)登革熱2型病毒在埃及伊蚊體內(nèi)的復(fù)制。實(shí)施例3、抑制mosGCTL-15基因表達(dá)的物質(zhì)在抑制登革熱病毒復(fù)制中的應(yīng)用埃及伊蚊的C型凝集素亞型15又稱(chēng)mosGCTL-15蛋白，如序列表的序列5所示。編碼mosGCTL-15蛋白的基因又稱(chēng)mosGCTL-15基因，其cDNA的編碼區(qū)如序列表的序列6所示。一、設(shè)計(jì)dsRNA設(shè)計(jì)用于抑制mosGCTL-15基因表達(dá)的dsRNA（dsRNA-4），即序列表的序列6自5’末端第79至407位核苷酸所示的雙鏈DNA對(duì)應(yīng)的雙鏈RNA。二、抑制mosGCTL-15基因表達(dá)的物質(zhì)在抑制登革熱2型病毒復(fù)制中的應(yīng)用1、將埃及伊蚊分成兩組，分別進(jìn)行如下處理：實(shí)驗(yàn)組：每只埃及伊蚊通過(guò)胸腔注射2微克dsRNA-4；對(duì)照組：每只埃及伊蚊通過(guò)胸腔注射2微克dsRNA-2；2、完成步驟1的注射3天后，給埃及伊蚊接種登革熱2型病毒（每只埃及伊蚊通過(guò)胸腔注射劑量為10MID50的DENV-2病毒，注射體積為300nL）。3、完成步驟2的接種6天后，利用TaqmanRT-QPCR檢測(cè)埃及伊蚊體內(nèi)的登革熱2型病毒量。用于TaqmanRT-QPCR檢測(cè)登革熱2型病毒的引物對(duì)如下：上游引物：5’-CATTCCAAGTGAGAATCTCTTTGTCA-3’；下游引物：5’-CAGATCTCTGATGAATAACCAACG-3’。用于TaqmanRT-QPCR檢測(cè)登革熱2型病毒的探針如下：5’-FAM-ATGCTGAAACGCGAGAGAAACCGC-TRAMA-3’。采用“對(duì)于每含有1ngActin基因的mRNA來(lái)說(shuō)，含有的E基因的ng數(shù)”表征登革熱2型病毒量。實(shí)驗(yàn)組埃及伊蚊體內(nèi)的登革熱2型病毒量為0.182ng（23只的平均值），對(duì)照組埃及伊蚊體內(nèi)的登革熱2型病毒量為0.494ng（22只的平均值）。結(jié)果表明，導(dǎo)入用于抑制mosGCTL-15基因表達(dá)的dsRNA后，埃及伊蚊體內(nèi)的登革熱2型病毒的病毒量出現(xiàn)明顯下降，即抑制mosGCTL-15基因表達(dá)可以抑制登革熱2型病毒在埃及伊蚊體內(nèi)的復(fù)制，即mosGCTL-15基因可以促進(jìn)登革熱2型病毒在埃及伊蚊體內(nèi)的復(fù)制。實(shí)施例4、抑制mosGCTL-19基因表達(dá)的物質(zhì)在抑制登革熱病毒復(fù)制中的應(yīng)用埃及伊蚊的C型凝集素亞型19又稱(chēng)mosGCTL-19蛋白，如序列表的序列7所示。編碼mosGCTL-19蛋白的基因又稱(chēng)mosGCTL-19基因，其cDNA的編碼區(qū)如序列表的序列8所示。一、設(shè)計(jì)dsRNA設(shè)計(jì)用于抑制mosGCTL-19基因表達(dá)的dsRNA（dsRNA-5），即序列表的序列8自5’末端第118至452位核苷酸所示的雙鏈DNA對(duì)應(yīng)的雙鏈RNA。二、抑制mosGCTL-19基因表達(dá)的物質(zhì)在抑制登革熱2型病毒復(fù)制中的應(yīng)用1、將埃及伊蚊分成兩組，分別進(jìn)行如下處理：實(shí)驗(yàn)組：每只埃及伊蚊通過(guò)胸腔注射2微克dsRNA-5；對(duì)照組：每只埃及伊蚊通過(guò)胸腔注射2微克dsRNA-2；2、完成步驟1的注射3天后，給埃及伊蚊接種登革熱2型病毒（每只埃及伊蚊通過(guò)胸腔注射劑量為10MID50的DENV-2病毒，注射體積為300nL）。3、完成步驟2的接種6天后，利用TaqmanRT-QPCR檢測(cè)埃及伊蚊體內(nèi)的登革熱2型病毒量。用于TaqmanRT-QPCR檢測(cè)登革熱2型病毒的引物對(duì)如下：上游引物：5’-CATTCCAAGTGAGAATCTCTTTGTCA-3’；下游引物：5’-CAGATCTCTGATGAATAACCAACG-3’。用于TaqmanRT-QPCR檢測(cè)登革熱2型病毒的探針如下：5’-FAM-ATGCTGAAACGCGAGAGAAACCGC-TRAMA-3’。采用“對(duì)于每含有1ngActin基因的mRNA來(lái)說(shuō)，含有的E基因的ng數(shù)”表征登革熱2型病毒量。實(shí)驗(yàn)組埃及伊蚊體內(nèi)的登革熱2型病毒量為0.194ng（15只的平均值），對(duì)照組埃及伊蚊體內(nèi)的登革熱2型病毒量為0.494ng（22只的平均值）。結(jié)果表明，導(dǎo)入用于抑制mosGCTL-19基因表達(dá)的dsRNA后，埃及伊蚊體內(nèi)的登革熱2型病毒的病毒量出現(xiàn)明顯下降，即抑制mosGCTL-19基因表達(dá)可以抑制登革熱2型病毒在埃及伊蚊體內(nèi)的復(fù)制，即mosGCTL-19基因可以促進(jìn)登革熱2型病毒在埃及伊蚊體內(nèi)的復(fù)制。實(shí)施例5、抑制mosGCTL-20基因表達(dá)的物質(zhì)在抑制登革熱病毒復(fù)制中的應(yīng)用埃及伊蚊的C型凝集素亞型20又稱(chēng)mosGCTL-20蛋白，如序列表的序列9所示。編碼mosGCTL-20蛋白的基因又稱(chēng)mosGCTL-20基因，其cDNA的編碼區(qū)如序列表的序列10所示。一、設(shè)計(jì)dsRNA設(shè)計(jì)用于抑制mosGCTL-20基因表達(dá)的dsRNA（dsRNA-6），即序列表的序列10自5’末端第78至471位核苷酸所示的雙鏈DNA對(duì)應(yīng)的雙鏈RNA。二、抑制mosGCTL-20基因表達(dá)的物質(zhì)在抑制登革熱2型病毒復(fù)制中的應(yīng)用1、將埃及伊蚊分成兩組，分別進(jìn)行如下處理：實(shí)驗(yàn)組：每只埃及伊蚊通過(guò)胸腔注射2微克dsRNA-6；對(duì)照組：每只埃及伊蚊通過(guò)胸腔注射2微克dsRNA-2；2、完成步驟1的注射3天后，給埃及伊蚊接種登革熱2型病毒（每只埃及伊蚊通過(guò)胸腔注射劑量為10MID50的DENV-2病毒，注射體積為300nL）。3、完成步驟2的接種6天后，利用TaqmanRT-QPCR檢測(cè)埃及伊蚊體內(nèi)的登革熱2型病毒量。用于TaqmanRT-QPCR檢測(cè)登革熱2型病毒的引物對(duì)如下：上游引物：5’-CATTCCAAGTGAGAATCTCTTTGTCA-3’；下游引物：5’-CAGATCTCTGATGAATAACCAACG-3’。用于TaqmanRT-QPCR檢測(cè)登革熱2型病毒的探針如下：5’-FAM-ATGCTGAAACGCGAGAGAAACCGC-TRAMA-3’。采用“對(duì)于每含有1ngActin基因的mRNA來(lái)說(shuō)，含有的E基因的ng數(shù)”表征登革熱2型病毒量。實(shí)驗(yàn)組埃及伊蚊體內(nèi)的登革熱2型病毒量為0.268ng（15只的平均值），對(duì)照組埃及伊蚊體內(nèi)的登革熱2型病毒量為0.494ng（22只的平均值）。結(jié)果表明，導(dǎo)入用于抑制mosGCTL-20基因表達(dá)的dsRNA后，埃及伊蚊體內(nèi)的登革熱2型病毒的病毒量出現(xiàn)明顯下降，即抑制mosGCTL-20基因表達(dá)可以抑制登革熱2型病毒在埃及伊蚊體內(nèi)的復(fù)制，即mosGCTL-20基因可以促進(jìn)登革熱2型病毒在埃及伊蚊體內(nèi)的復(fù)制。實(shí)施例6、抑制mosGCTL-22基因表達(dá)的物質(zhì)在抑制登革熱病毒復(fù)制中的應(yīng)用埃及伊蚊的C型凝集素亞型22又稱(chēng)mosGCTL-22蛋白，如序列表的序列11所示。編碼mosGCTL-22蛋白的基因又稱(chēng)mosGCTL-22基因，其cDNA的編碼區(qū)如序列表的序列12所示。一、設(shè)計(jì)dsRNA設(shè)計(jì)用于抑制mosGCTL-22基因表達(dá)的dsRNA（dsRNA-7），即序列表的序列12自5’末端第1至389位核苷酸所示的雙鏈DNA對(duì)應(yīng)的雙鏈RNA。二、抑制mosGCTL-22基因表達(dá)的物質(zhì)在抑制登革熱2型病毒復(fù)制中的應(yīng)用1、將埃及伊蚊分成兩組，分別進(jìn)行如下處理：實(shí)驗(yàn)組：每只埃及伊蚊通過(guò)胸腔注射2微克dsRNA-7；對(duì)照組：每只埃及伊蚊通過(guò)胸腔注射2微克dsRNA-2；2、完成步驟1的注射3天后，給埃及伊蚊接種登革熱2型病毒（每只埃及伊蚊通過(guò)胸腔注射劑量為10MID50的DENV-2病毒，注射體積為300nL）。3、完成步驟2的接種6天后，利用TaqmanRT-QPCR檢測(cè)埃及伊蚊體內(nèi)的登革熱2型病毒量。用于TaqmanRT-QPCR檢測(cè)登革熱2型病毒的引物對(duì)如下：上游引物：5’-CATTCCAAGTGAGAATCTCTTTGTCA-3’；下游引物：5’-CAGATCTCTGATGAATAACCAACG-3’。用于TaqmanRT-QPCR檢測(cè)登革熱2型病毒的探針如下：5’-FAM-ATGCTGAAACGCGAGAGAAACCGC-TRAMA-3’。采用“對(duì)于每含有1ngActin基因的mRNA來(lái)說(shuō)，含有的E基因的ng數(shù)”表征登革熱2型病毒量。實(shí)驗(yàn)組埃及伊蚊體內(nèi)的登革熱2型病毒量為0.227ng（17只的平均值），對(duì)照組埃 及伊蚊體內(nèi)的登革熱2型病毒量為0.494ng（22只的平均值）。結(jié)果表明，導(dǎo)入用于抑制mosGCTL-22基因表達(dá)的dsRNA后，埃及伊蚊體內(nèi)的登革熱2型病毒的病毒量出現(xiàn)明顯下降，即抑制mosGCTL-22基因表達(dá)可以抑制登革熱2型病毒在埃及伊蚊體內(nèi)的復(fù)制，即mosGCTL-22基因可以促進(jìn)登革熱2型病毒在埃及伊蚊體內(nèi)的復(fù)制。實(shí)施例7、抑制mosGCTL-23基因表達(dá)的物質(zhì)在抑制登革熱病毒復(fù)制中的應(yīng)用埃及伊蚊的C型凝集素亞型23又稱(chēng)mosGCTL-23蛋白，如序列表的序列13所示。編碼mosGCTL-23蛋白的基因又稱(chēng)mosGCTL-23基因，其cDNA的編碼區(qū)如序列表的序列14所示。一、設(shè)計(jì)dsRNA設(shè)計(jì)用于抑制mosGCTL-23基因表達(dá)的dsRNA（dsRNA-8），即序列表的序列14自5’末端第24至413位核苷酸所示的雙鏈DNA對(duì)應(yīng)的雙鏈RNA。二、抑制mosGCTL-23基因表達(dá)的物質(zhì)在抑制登革熱2型病毒復(fù)制中的應(yīng)用1、將埃及伊蚊分成兩組，分別進(jìn)行如下處理：實(shí)驗(yàn)組：每只埃及伊蚊通過(guò)胸腔注射2微克dsRNA-8；對(duì)照組：每只埃及伊蚊通過(guò)胸腔注射2微克dsRNA-2；2、完成步驟1的注射3天后，給埃及伊蚊接種登革熱2型病毒（每只埃及伊蚊通過(guò)胸腔注射劑量為10MID50的DENV-2病毒，注射體積為300nL）。3、完成步驟2的接種6天后，利用TaqmanRT-QPCR檢測(cè)埃及伊蚊體內(nèi)的登革熱2型病毒量。用于TaqmanRT-QPCR檢測(cè)登革熱2型病毒的引物對(duì)如下：上游引物：5’-CATTCCAAGTGAGAATCTCTTTGTCA-3’；下游引物：5’-CAGATCTCTGATGAATAACCAACG-3’。用于TaqmanRT-QPCR檢測(cè)登革熱2型病毒的探針如下：5’-FAM-ATGCTGAAACGCGAGAGAAACCGC-TRAMA-3’。采用“對(duì)于每含有1ngActin基因的mRNA來(lái)說(shuō)，含有的E基因的ng數(shù)”表征登革熱2型病毒量。實(shí)驗(yàn)組埃及伊蚊體內(nèi)的登革熱2型病毒量為0.199ng（15只的平均值），對(duì)照組埃及伊蚊體內(nèi)的登革熱2型病毒量為0.494ng（22只的平均值）。結(jié)果表明，導(dǎo)入用于抑制mosGCTL-23基因表達(dá)的dsRNA后，埃及伊蚊體內(nèi)的登革熱2型病毒的病毒量出現(xiàn)明顯下降，即抑制mosGCTL-23基因表達(dá)可以抑制登革熱2型病毒在埃及伊蚊體內(nèi)的復(fù)制，即mosGCTL-23基因可以促進(jìn)登革熱2型病毒在埃及伊蚊體內(nèi)的復(fù)制。實(shí)施例8、抑制mosGCTL-24基因表達(dá)的物質(zhì)在抑制登革熱病毒復(fù)制中的應(yīng)用埃及伊蚊的C型凝集素亞型24又稱(chēng)mosGCTL-24蛋白，如序列表的序列15所示。編碼mosGCTL-24蛋白的基因又稱(chēng)mosGCTL-24基因，其cDNA的編碼區(qū)如序列表的序列16所示。一、設(shè)計(jì)dsRNA設(shè)計(jì)用于抑制mosGCTL-24基因表達(dá)的dsRNA（dsRNA-9），即序列表的序列16自5’末端第38至415位核苷酸所示的雙鏈DNA對(duì)應(yīng)的雙鏈RNA。二、抑制mosGCTL-24基因表達(dá)的物質(zhì)在抑制登革熱2型病毒復(fù)制中的應(yīng)用1、將埃及伊蚊分成兩組，分別進(jìn)行如下處理：實(shí)驗(yàn)組：每只埃及伊蚊通過(guò)胸腔注射2微克dsRNA-9；對(duì)照組：每只埃及伊蚊通過(guò)胸腔注射2微克dsRNA-2；2、完成步驟1的注射3天后，給埃及伊蚊接種登革熱2型病毒（每只埃及伊蚊通過(guò)胸腔注射劑量為10MID50的DENV-2病毒，注射體積為300nL）。3、完成步驟2的接種6天后，利用TaqmanRT-QPCR檢測(cè)埃及伊蚊體內(nèi)的登革熱2型病毒量。用于TaqmanRT-QPCR檢測(cè)登革熱2型病毒的引物對(duì)如下：上游引物：5’-CATTCCAAGTGAGAATCTCTTTGTCA-3’；下游引物：5’-CAGATCTCTGATGAATAACCAACG-3’。用于TaqmanRT-QPCR檢測(cè)登革熱2型病毒的探針如下：5’-FAM-ATGCTGAAACGCGAGAGAAACCGC-TRAMA-3’。采用“對(duì)于每含有1ngActin基因的mRNA來(lái)說(shuō)，含有的E基因的ng數(shù)”表征登革熱2型病毒量。實(shí)驗(yàn)組埃及伊蚊體內(nèi)的登革熱2型病毒量為0.191ng（15只的平均值），對(duì)照組埃及伊蚊體內(nèi)的登革熱2型病毒量為0.494ng（22只的平均值）。結(jié)果表明，導(dǎo)入用于抑制mosGCTL-24基因表達(dá)的dsRNA后，埃及伊蚊體內(nèi)的登革熱2型病毒的病毒量出現(xiàn)明顯下降，即抑制mosGCTL-24基因表達(dá)可以抑制登革熱2型病毒在埃及伊蚊體內(nèi)的復(fù)制，即mosGCTL-24基因可以促進(jìn)登革熱2型病毒在埃及伊蚊體內(nèi)的復(fù)制。實(shí)施例9、抑制mosGCTL-32基因表達(dá)的物質(zhì)在抑制登革熱病毒復(fù)制中的應(yīng)用埃及伊蚊的C型凝集素亞型32又稱(chēng)mosGCTL-32蛋白。如序列表的序列17所示。編碼mosGCTL-32蛋白的基因又稱(chēng)mosGCTL-32基因，其cDNA的編碼區(qū)如序列表的序列18所示。一、設(shè)計(jì)dsRNA設(shè)計(jì)用于抑制mosGCTL-32基因表達(dá)的dsRNA（dsRNA-10），即序列表的序列18自5’末端第149至465位核苷酸所示的雙鏈DNA對(duì)應(yīng)的雙鏈RNA。二、抑制mosGCTL-32基因表達(dá)的物質(zhì)在抑制登革熱2型病毒復(fù)制中的應(yīng)用1、將埃及伊蚊分成兩組，分別進(jìn)行如下處理：實(shí)驗(yàn)組：每只埃及伊蚊通過(guò)胸腔注射2微克dsRNA-10；對(duì)照組：每只埃及伊蚊通過(guò)胸腔注射2微克dsRNA-2；2、完成步驟1的注射3天后，給埃及伊蚊接種登革熱2型病毒（每只埃及伊蚊通過(guò)胸腔注射劑量為10MID50的DENV-2病毒，注射體積為300nL）。3、完成步驟2的接種6天后，利用TaqmanRT-QPCR檢測(cè)埃及伊蚊體內(nèi)的登革熱2型病毒量。用于TaqmanRT-QPCR檢測(cè)登革熱2型病毒的引物對(duì)如下：上游引物：5’-CATTCCAAGTGAGAATCTCTTTGTCA-3’；下游引物：5’-CAGATCTCTGATGAATAACCAACG-3’。用于TaqmanRT-QPCR檢測(cè)登革熱2型病毒的探針如下：5’-FAM-ATGCTGAAACGCGAGAGAAACCGC-TRAMA-3’。采用“對(duì)于每含有1ngActin基因的mRNA來(lái)說(shuō)，含有的E基因的ng數(shù)”表征登革熱2型病毒量。實(shí)驗(yàn)組埃及伊蚊體內(nèi)的登革熱2型病毒量為0.180ng（16只的平均值），對(duì)照組埃及伊蚊體內(nèi)的登革熱2型病毒量為0.494ng（22只的平均值）。結(jié)果表明，導(dǎo)入用于抑制mosGCTL-32基因表達(dá)的dsRNA后，埃及伊蚊體內(nèi)的登革熱2型 病毒的病毒量出現(xiàn)明顯下降，即抑制mosGCTL-32基因表達(dá)可以抑制登革熱2型病毒在埃及伊蚊體內(nèi)的復(fù)制，即mosGCTL-32基因可以促進(jìn)登革熱2型病毒在埃及伊蚊體內(nèi)的復(fù)制。實(shí)施例10、mosGCTL-3蛋白成熟肽的制備1、提取埃及伊蚊的總RNA并反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。2、以步驟1得到的cDNA為模板，用F1和R1組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。F1：5’-tctctaGCTAGCCAGCCCATATGCAGTGAT-3’；R1：5’-tatccgCTCGAGAAACTCCTGGATTGAAT-3’。3、用限制性內(nèi)切酶NheI和XhoI雙酶切步驟2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。4、用限制性內(nèi)切酶NheI和XhoI雙酶切質(zhì)粒pET-28a(+)，回收約5290bp的載體骨架。5、將步驟3的酶切產(chǎn)物和步驟4的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒（重組質(zhì)粒中，外源片段與載體上的His標(biāo)簽的編碼序列融合，表達(dá)具有His標(biāo)簽的mosGCTL-3蛋白成熟肽（mosGCTL-3蛋白成熟肽由序列表的序列1自5’末端第21-168位氨基酸殘基組成，His標(biāo)簽位于成熟肽的N端和C端；N端His標(biāo)簽和mosGCLT-3成熟肽中間間隔了如下13個(gè)氨基酸殘基“SerSerGlyLeuValProArgGlySerHisMetAlaSer”；C端His標(biāo)簽和成熟肽中間間隔XhoI酶切識(shí)別序列編碼的兩個(gè)氨基酸）。6、將步驟5得到的重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)，得到重組菌。7、將步驟6得到的重組菌的單克隆菌落接種至5mlLB液體培養(yǎng)基中（含25μg/ml卡那霉素），37℃、220rpm震蕩培養(yǎng)16小時(shí)；然后按1:100的體積比接種至新鮮的LB液體培養(yǎng)基（含25μg/ml卡那霉素），總體積為500ml，37℃、220rpm震蕩培養(yǎng)4小時(shí)；然后加入IPTG并使其濃度為1mM，37℃、220rpm震蕩培養(yǎng)6小時(shí)；室溫、4000rpm離心10min，收集菌體。8、取步驟7得到的菌體，用包涵體洗滌液（溶劑為pH8.0、50mM的Tris-HCl緩沖液，含有100mMNaCl、5mMEDTA、0.1%NaN3、0.5%Triton-X100,用前加入終濃度為0.1mM的PMSF和1mM的DTT）懸浮菌體，冰上超聲破碎（60%功率，超聲3s，停止9s，總超聲處理時(shí)間5min），6000rpm離心15min，收集沉淀（包涵體）。9、用包涵體洗滌液懸浮步驟8得到的沉淀，加入過(guò)量的MgSO4以中和包涵體洗滌液中的EDTA，然后加入終濃度為0.01mg/ml的DNA酶(Sigma公司目錄號(hào)DN25)和終濃度為0.1mg/ml的溶菌酶（Sigma公司目錄號(hào)L6876），室溫處理20分鐘，6000rpm離心15min，收集包涵體；然后，用包涵體洗滌液懸浮步驟8得到的沉淀，加入過(guò)量的MgSO4以中和包涵體洗滌液中的EDTA，室溫處理20分鐘，6000rpm離心15min，收集包涵體；然后，用包涵體洗滌液懸浮步驟8得到的沉淀，加入過(guò)量的MgSO4以中和包涵體洗滌液中的EDTA，室溫處理20分鐘，6000rpm離心15min，收集包涵體。將收集的包涵體進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，顯示清晰的目的條帶（約18kD）。10、使用蛋白純化液（溶劑為pH8.0、100mM的Tris緩沖液，含有50mM甘氨酸和8M尿素）溶解步驟9得到的包涵體，得到粗蛋白溶液。11、使用TALONpurificationKit(Clontech公司目錄號(hào)635515)，從粗蛋白溶液中純化mosGCTL-3蛋白成熟肽。將1mlResin和50ml粗蛋白溶液4℃共孵育2小時(shí)，然后轉(zhuǎn)移至濾柱中，用20ml洗滌液甲（TALON試劑盒中的1X平衡液加入8M尿素）進(jìn)行洗滌，再用20ml洗滌液乙（TALON試劑盒中的1X平衡液加入8M尿素和20mM咪唑）進(jìn)行洗滌，最后用5ml洗 脫液丙（TALON試劑盒中的1X平衡液加入8M尿素和150mM咪唑）洗滌并收集過(guò)柱后溶液，即為含有mosGCTL-3蛋白成熟肽的溶液（蛋白純度大于95%，濃度大于1mg/ml），簡(jiǎn)稱(chēng)mosGCTL-3成熟肽溶液。實(shí)施例11、兔抗mosGCTL-3蛋白血清在抑制登革熱2型病毒復(fù)制中的應(yīng)用一、兔抗mosGCTL-3血清的制備實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為新西蘭大耳兔：金斯瑞（Genescript）公司。具體流程如下：第0天，取兔子血清，即為對(duì)照血清。第1天（初次免疫），每只兔子皮下注射實(shí)施例10制備的mosGCTL-3成熟肽溶液與弗氏完全佐劑的等體積混合物（含1mgmosGCTL-3成熟肽）。第14天（第一次加強(qiáng)免疫），每只兔子皮下注射實(shí)施例10制備的mosGCTL-3成熟肽溶液與弗氏完全佐劑的等體積混合物（含0.5mgmosGCTL-3成熟肽）。第24天，每只兔子取100血清，ELISA檢測(cè)確認(rèn)免疫應(yīng)答正常。第35天（第二次加強(qiáng)免疫），每只兔子皮下注射實(shí)施例10制備的mosGCTL-3成熟肽溶液與弗氏完全佐劑的等體積混合物（含0.5mgmosGCTL-3成熟肽）。第56天（第三次加強(qiáng)免疫），每只兔子皮下注射實(shí)施例10制備的mosGCTL-3成熟肽溶液與弗氏完全佐劑的等體積混合物（含0.5mgmosGCTL-3成熟肽）。第70天，每只兔子采集40ml血清，即為兔抗mosGCTL-3血清。二、兔抗mosGCTL-3蛋白血清在抑制登革熱2型病毒復(fù)制中的應(yīng)用1、使用肝素采血管抽取正常健康人（知情同意的志愿者）的血液，4℃、1000g離心10min，分離血漿和血細(xì)胞。2、取步驟1得到的血細(xì)胞，使用預(yù)冷PBS緩沖液洗滌3次，以去除殘留吸附在血細(xì)胞表面的肝素（肝素會(huì)影響蚊子的正常生理功能）。3、取步驟1得到的血漿，55℃水浴處理1小時(shí)，以滅活血漿中補(bǔ)體系統(tǒng)的活性（補(bǔ)體會(huì)殺滅病毒，抑制病毒感染活性）。4、將步驟2得到的血細(xì)胞和步驟3得到的血漿混合，冰上放置備用。5、混合飼喂樣本的制備混合飼喂樣本一：將490μl步驟4得到的混合血液、500μlDENV-2病毒液混合（病毒滴度為2×107pfu/ml）和10μl兔抗mosGCTL-3血清（稀釋100倍）混合均勻備用。混合飼喂樣本二：將499μl步驟4得到的混合血液、500μlDENV-2病毒液混合（病毒滴度為2×107pfu/ml）和1μl兔抗mosGCTL-3血清（稀釋1000倍）混合均勻備用?；旌巷曃箻颖救簩?99.8μl步驟4得到的混合血液、500μlDENV-2病毒液混合（病毒滴度為2×107pfu/ml）和0.2μl兔抗mosGCTL-3血清（稀釋5000倍）混合均勻備用?；旌巷曃箻颖舅模簩?90μl步驟4得到的混合血液、500μlDENV-2病毒液混合（病毒滴度為2×107pfu/ml）和10μl對(duì)照血清（稀釋100倍）混合均勻備用。混合飼喂樣本五：將499μl步驟4得到的混合血液、500μlDENV-2病毒液混合（病毒滴度為2×107pfu/ml）和1μl對(duì)照血清（稀釋1000倍）混合均勻備用?；旌巷曃箻颖玖簩?99.8μl步驟4得到的混合血液、500μlDENV-2病毒液混合（病毒滴度為2×107pfu/ml）和0.2μl對(duì)照血清（稀釋5000倍）混合均勻備用。使用Hemotek蚊蟲(chóng)喂養(yǎng)器分別將以上六種樣本飼喂埃及伊蚊30分鐘（每種樣本飼喂約50只埃及伊蚊）。將確認(rèn)吸入混合血液的蚊子挑選出來(lái)放入特定容器在標(biāo)準(zhǔn)條件（70%濕度，28℃）用含有1%蔗糖溶液的脫脂棉球進(jìn)行飼喂。飼養(yǎng)8天后處死，抽取蚊子的總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用TaqmanRT-QPCR檢測(cè)埃及伊蚊體內(nèi)的登革熱2型病毒量，并計(jì)算感染率（以登革熱病毒ng數(shù)和內(nèi)部對(duì)照Actin基因ng數(shù)的比值比值大于0.0002的記為陽(yáng)性）。用于TaqmanRT-QPCR檢測(cè)登革熱2型病毒的引物對(duì)如下：上游引物：5’-CATTCCAAGTGAGAATCTCTTTGTCA-3’；下游引物：5’-CAGATCTCTGATGAATAACCAACG-3’。用于TaqmanRT-QPCR檢測(cè)登革熱2型病毒的探針如下：5’-FAM-ATGCTGAAACGCGAGAGAAACCGC-TRAMA-3’。結(jié)果見(jiàn)表1。表1血餐不同濃度的兔抗mosGCTL-3血清對(duì)埃及伊蚊登革熱病毒感染率的影響感染率混合飼喂樣本四39%混合飼喂樣本一22%混合飼喂樣本五41%混合飼喂樣本二31%混合飼喂樣本六41%混合飼喂樣本三32%實(shí)施例12、多種蛋白成熟肽的制備用于擴(kuò)增mosGCTL-26基因的引物對(duì)如下F#：5’-TCTCTAGCTAGCACACATTTTTGCTCCC-3’；R#:5’-TATTCGAAGCTTCGACCAGTTTGGAGTGAC-3’。用于擴(kuò)增mosGCTL-15基因的引物對(duì)如下：F3：5’-ctgccgGCTAGCCAACGTATCACCACAATCC-3’；R3：5’-tataccCTCGAGCCCCTGCGCCGACGA-3’；用于擴(kuò)增mosGCTL-19基因的引物對(duì)如下：F4：5’-cgcctaGCTAGCCAATTCAACTTCCAT-3’；R4：5’-tcaccgCTCGAGGATGCAATACCTCAAT-3’。用于擴(kuò)增mosGCTL-20基因的引物對(duì)如下：F5：5’-tcatcgGCTAGCTCATCGACTAAACCAAAAT-3’；R5：5’-ttatccCTCGAGAAACTCCTCTATGCACGTC-3’。用于擴(kuò)增mosGCTL-22基因的引物對(duì)如下：F6：5’-cgcctaGCTAGCATAAGCGAATACTTTATTCCT-3’；R6：5’-tcaccgCTCGAGCCGAAATTCACTAATGCA-3’。用于擴(kuò)增mosGCTL-23基因的引物對(duì)如下：F7：5’-cgcctaGCTAGCGATAGACGATTCTTCATACCCA-3’；R7：5’-ttatccCTCGAGCAGACATTGTCGTTCGA-3’。用于擴(kuò)增mosGCTL-24基因的引物對(duì)如下：F8：5’-tcatcgGCTAGCGATCCCCTAAGAAATCAGAC-3’；R8：5’-ttatccCTCGAGGTTCAACCTTTCACAAA-3’。用于擴(kuò)增mosGCTL-32基因的引物對(duì)如下：F9：5’-cgcctaGCTAGCCAATCCAAGTATCAAAT-3’；R9：5’-tatccgCTCGAGAAACTCTTGGATGC-3’。mosGCTL-26蛋白成熟肽由序列表的序列3自5’末端第17-174位氨基酸殘基組成。mosGCTL-15蛋白成熟肽由序列表的序列5自5’末端第18-191位氨基酸殘基組成。mosGCTL-19蛋白成熟肽由序列表的序列7自5’末端第26-154位氨基酸殘基組成。mosGCTL-20蛋白成熟肽由序列表的序列9自5’末端第20-158位氨基酸殘基組成。mosGCTL-22蛋白成熟肽由序列表的序列11自5’末端第17-153位氨基酸殘基組成。mosGCTL-23蛋白成熟肽由序列表的序列13自5’末端第26-154位氨基酸殘基組成。mosGCTL-24蛋白成熟肽由序列表的序列15自5’末端第22-173位氨基酸殘基組成。mosGCTL-32蛋白成熟肽由序列表的序列17自5’末端第26-160位氨基酸殘基組成。其它操作步驟完全同實(shí)施例10（其中mosGCTL-26C端His標(biāo)簽和成熟肽中間間隔7個(gè)氨基酸，為L(zhǎng)ysLeuAlaAlaAlaLeuGlu，其它完全相同），分別得到mosGCTL-26成熟肽溶液、mosGCTL-15成熟肽溶液、mosGCTL-19成熟肽溶液、mosGCTL-20成熟肽溶液、mosGCTL-22成熟肽溶液、mosGCTL-23成熟肽溶液、mosGCTL-24成熟肽溶液和mosGCTL-32成熟肽溶液，純度均大于90%。實(shí)施例13、混合血清在抑制登革熱病毒復(fù)制中的應(yīng)用一、各個(gè)血清的制備按照實(shí)施例11中的方法，分別制備得到兔抗mosGCTL-26血清、兔抗mosGCTL-15血清、兔抗mosGCTL-19血清、兔抗mosGCTL-20血清、兔抗mosGCTL-22血清、兔抗mosGCTL-23血清、兔抗mosGCTL-24血清和兔抗mosGCTL-32血清。將實(shí)施例11制備的兔抗mosGCTL-3血清和以上制備的8種血清等體積混合，得到混合血清，命名為mosGCTLMIX9抗血清。將實(shí)施例11中的對(duì)照血清和以上8種血清各自的對(duì)照血清等體積混合，得到混合血清，命名為PreMIX9對(duì)照血清。二、混合血清在抑制登革熱病毒復(fù)制中的應(yīng)用步驟1至4同實(shí)施例11的步驟1至4。5、混合飼喂樣本的制備混合飼喂樣本一：將490μl步驟4得到的混合血液、500μlDENV-2病毒液混合（病毒滴度為2×107pfu/ml）和10μlmosGCTLMIX9抗血清（稀釋100倍）混合均勻備用?；旌巷曃箻颖径簩?99μl步驟4得到的混合血液、500μlDENV-2病毒液混合（病毒滴度為2×107pfu/ml）和1μlmosGCTLMIX9抗血清（稀釋1000倍）混合均勻備用?；旌巷曃箻颖救簩?99.8μl步驟4得到的混合血液、500μlDENV-2病毒液混合（病毒滴度為2×107pfu/ml）和0.2μlmosGCTLMIX9抗血清（稀釋5000倍）混合均勻備用?；旌巷曃箻颖舅模簩?90μl步驟4得到的混合血液、500μlDENV-2病毒液混合（病毒滴度為2×107pfu/ml）和10μlPreMIX9對(duì)照血清（稀釋100倍）混合均勻備用。混合飼喂樣本五：將499μl步驟4得到的混合血液、500μlDENV-2病毒液混合（病毒滴度為2×107pfu/ml）和1μlPreMIX9對(duì)照血清（稀釋1000倍）混合均勻備用?；旌巷曃箻颖玖簩?99.8μl步驟4得到的混合血液、500μlDENV-2病毒液混合（病毒滴度為2×107pfu/ml）和0.2μlPreMIX9對(duì)照血清（稀釋5000倍）混合均勻備用。使用Hemoteck血液飼喂系統(tǒng)分別將以上兩種樣本飼喂埃及伊蚊30分鐘（每種樣本飼喂約100只埃及伊蚊）。將確認(rèn)吸入混合血液的蚊子挑選出來(lái)放入特定容器在標(biāo)準(zhǔn)條件（70%濕度，28℃）下用含有1%蔗糖溶液的脫脂棉球進(jìn)行飼喂。飼養(yǎng)8天后處死，抽取蚊子的總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用TaqmanRT-QPCR檢測(cè)埃及伊蚊體內(nèi)的登革熱2型病毒量，并計(jì)算感染率（方法與實(shí)施例11的步驟二中的相應(yīng)方法相同）。結(jié)果見(jiàn)表2。表2血餐混合血清對(duì)埃及伊蚊登革熱病毒感染率的影響感染率混合飼喂樣本四38%混合飼喂樣本一6.1%混合飼喂樣本五36%混合飼喂樣本二16%混合飼喂樣本六35%混合飼喂樣本三20%實(shí)施例14、機(jī)理分析一、真核S2果蠅細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)mosGCTL-3蛋白1、提取埃及伊蚊的總RNA并反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。2、以步驟1得到的cDNA為模板，用F10和R10組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。F10：5’-tataggGGTACCtCAGCCCATATGCAGTGAT-3’；R10：5’-cgctgcTCTAGAAAACTCCTGGATTGAATC-3’。3、用限制性內(nèi)切酶KpnI和XbaI雙酶切步驟2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。4、用限制性內(nèi)切酶KpnI和XbaI雙酶切載體質(zhì)粒pMT/Bip/V5/HisA（Invitrogen公司，產(chǎn)品目錄號(hào)V4130-20），回收約4200bp的載體骨架。5、將步驟3的酶切產(chǎn)物和步驟4的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒（重組質(zhì)粒中，外源片段與載體上的頭端Bip分泌信號(hào)肽的編碼序列和尾端V5His標(biāo)簽的編碼序列融合，表達(dá)具有信號(hào)肽和His標(biāo)簽的mosGCTL-3蛋白成熟肽）。6、將步驟5得到的重組質(zhì)粒和pCohygro質(zhì)粒（含有抗性篩選基因；Invitrogen公司，產(chǎn)品目錄號(hào)K413001）使用Effectene轉(zhuǎn)染試劑(QIAGEN公司目錄號(hào)301425)，轉(zhuǎn)染入果蠅S2細(xì)胞（購(gòu)自Invitrogen公司，產(chǎn)品目錄號(hào)R69007），通過(guò)潮霉素B進(jìn)行篩選（潮霉素B的終濃度為300ng/ul,細(xì)胞培養(yǎng)基為含有10%FBS的Sigma公司產(chǎn)品目錄號(hào)為S9865的斯內(nèi)德果蠅S2細(xì)胞培養(yǎng)基；每四天更換一次細(xì)胞培養(yǎng)基），約1個(gè)月后獲得可以穩(wěn)定表達(dá)mosGCTL-3蛋白的S2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。7、將S2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系加入無(wú)血清培養(yǎng)基ExpressFiveSFM（Invitrogen公司目錄號(hào)10485），用2L的大培養(yǎng)瓶懸浮擴(kuò)大培養(yǎng)（約500ml培養(yǎng)體系），3天后，加入終濃度為500μM的CuSO4誘導(dǎo)蛋白表達(dá)（pMT/Bip/V5HisA載體可以在Cu離子存在的情況下表達(dá)外源蛋白并分泌入上清液）。8、加入Cu離子誘導(dǎo)表達(dá)3天后，4℃、4000rpm離心5min，收集上清液，采用0.22um 濾膜去除殘留的細(xì)胞碎片，以5KD大小微孔膜作為擋板，將500ml的上清液濃縮至約50ml終體積。9、使用TALONPurificationKit(Clontech公司貨號(hào)635515)對(duì)獲得的蛋白濃縮液進(jìn)行純化。將1mlResin和50ml步驟8得到的濃縮液4℃冰箱旋轉(zhuǎn)2小時(shí)，然后轉(zhuǎn)移至濾柱中，用20ml1X平衡液進(jìn)行洗滌，再用20ml含20mM咪唑的1X平衡液進(jìn)行洗滌，最后用5ml含150mM咪唑的1X平衡液洗滌并收集過(guò)柱后溶液。10、轉(zhuǎn)移過(guò)柱后溶液到10kD大小的超濾管，4℃、4000rpm離心15min，將5ml濾液濃縮至約1ml，加入4ml無(wú)菌PBS緩沖液至超濾管，4℃、4000rpm離心15min（去除殘留的咪唑），替換蛋白的溶劑為PBS緩沖液并分裝（即為mosGCTL-3成熟肽溶液），-80度冰箱凍存，分光光度計(jì)測(cè)定蛋白濃度并用SDSPAGE電泳及WesternBlot鑒定蛋白濃度及純度。mosGCTL-3蛋白液的蛋白濃度約為300ng/ul，純度大于85%。二、使用ELISA實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)mosGCTL-3成熟肽和DENV-2病毒的表面E蛋白及DENV-2病毒顆粒的相互作用。1、取mosGCTL-3成熟肽溶液，以1μg/well的蛋白量鋪到酶標(biāo)板孔中，對(duì)照組鋪1μg/well的BSA，背景孔同樣鋪BSA蛋白。使用的鋪板液為KPL公司的10XcoatingBuffer（目錄號(hào)50-84-00），每孔體系量為100ul。將酶標(biāo)板放置于4度過(guò)夜。2、使用0.05%PBST溶液（PH7.4PBS溶液中加入0.05%Tween20）洗滌樣品孔3次，加入100μl2%BSA（KPL公司目錄號(hào)50-61-00）室溫封閉1小時(shí)。3、使用0.05%PBST溶液洗滌樣品孔3次，向mosGCTL-3成熟肽孔和BSA對(duì)照孔中分別加入DENV-2病毒的表面E蛋白（購(gòu)買(mǎi)自L2Diagnostic,NewHaven,theUnitedStates）和滅活的DENV-2病毒顆粒（購(gòu)買(mǎi)自Microbix,Canada,貨號(hào)EL-22-02-001），使用1%BSA作為稀釋液。這里分為兩個(gè)平行組，一組在反應(yīng)液中加入終濃度為5mM的Ca離子，另一組加入終濃度為5mMEDTA（mosGCTL-3蛋白和病毒顆粒的相互作用需要Ca離子的輔助，EDTA可以螯合2價(jià)離子，作為Ca組的對(duì)照組）。室溫孵育2小時(shí)（背景孔中加入的是BSA蛋白，同樣也分為Ca組和EDTA組）。4、使用0.05%PBST溶液洗滌樣品孔5次，向每孔中加入用1%BSA稀釋的抗DENV-2病毒的表面E蛋白的單克隆抗體4G2（購(gòu)買(mǎi)自L2Diagnostic,NewHaven,theUnitedStates），1:3000稀釋?zhuān)覝胤跤?小時(shí)。5、使用0.05%PBST溶液洗滌樣品孔5次，向每孔中加入1%BSA稀釋的HRP偶聯(lián)的抗小鼠IgG山羊多克隆抗體（MBL公司目錄號(hào)M330），1:5000稀釋?zhuān)覝胤跤?小時(shí)。6、使用0.05%PBST溶液洗滌樣品孔7次，向每孔中加入SureBlueTMB底物顯色液（KPL公司目錄號(hào)52-00-01），室溫顯色約15min后，使用TMB終止液終止反應(yīng)（KPL公司目錄號(hào)50-95-05）。7、最后使用酶標(biāo)板讀板機(jī)獲取各孔在450nm的OD值，并根據(jù)樣品孔和對(duì)照孔的數(shù)值作圖，結(jié)果見(jiàn)圖2。mosGCTL-3成熟肽和DENV-2病毒的表面E蛋白以及DENV-2病毒顆粒有直接的結(jié)合，同時(shí)mosGCTL-3成熟肽和DENV-2病毒顆粒的結(jié)合是Ca離子依賴(lài)性的，但是mosGCTL-3成熟肽和DENV-2病毒的表面E蛋白的結(jié)合可以不借助Ca離子的輔助。根據(jù)mosGCTL-3蛋白可以與登革熱病毒顆粒相互結(jié)合。證明伊蚊C型凝集素家族是登革熱病毒感染埃及伊蚊的關(guān)鍵輔助因子。