一種檢測(cè)食品中過敏原的動(dòng)物模型的構(gòu)建方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種檢測(cè)食品中過敏原的動(dòng)物模型的構(gòu)建方法及該動(dòng)物模型的應(yīng)用。具體構(gòu)建方法為，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按體重隨機(jī)分為若干組，分別使用不同受試物對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行致敏反應(yīng)，其中一組受試物為陰性對(duì)照，每個(gè)組再分為兩小組，分別通過經(jīng)口灌胃和腹腔注射途徑，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行致敏，后通過檢測(cè)動(dòng)物的特異性免疫蛋白等指標(biāo)，對(duì)過敏原的致敏性進(jìn)行評(píng)價(jià)，得到動(dòng)物模型，再進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)對(duì)受試物致敏性進(jìn)行評(píng)價(jià)，比較兩種評(píng)價(jià)結(jié)果一致。本發(fā)明得到的動(dòng)物模型克服了體外評(píng)價(jià)方法不能完全模擬機(jī)體對(duì)外源蛋白產(chǎn)生的復(fù)雜免疫反應(yīng)?？蓱?yīng)用于評(píng)價(jià)食品原料及各種加工食品的致敏性，從根本上降低了食品過敏的風(fēng)險(xiǎn)。
【專利說明】一種檢測(cè)食品中過敏原的動(dòng)物模型的構(gòu)建方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明申請(qǐng)涉及醫(yī)療評(píng)價(jià)、檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說，涉及一種檢測(cè)食品中過敏原的動(dòng)物模型的構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著人們健康意識(shí)的提高，食品安全問題越來越受到人們的重視。食品安全指食品無毒、無害，符合應(yīng)當(dāng)有的營養(yǎng)要求，對(duì)人體健康不造成任何急性、亞急性或者慢性危害。食品過敏是過敏性疾病之一，可能會(huì)誘發(fā)某些嚴(yán)重過敏性疾病及其并發(fā)癥。因此，可導(dǎo)致過敏的食品，勢(shì)必存在著食品安全問題。
[0003]流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，近年來與過敏相關(guān)的疾病發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)，發(fā)達(dá)國家有10%~25%的人發(fā)生過IgE介導(dǎo)的過敏反應(yīng)，兒童食品過敏的發(fā)生率高于成人，3歲以下兒童的患病率高達(dá)5% I %。食品過敏的主要癥狀有惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉等，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致過敏性休克甚至危及生命。食品過敏與機(jī)體所有免疫反應(yīng)都有關(guān)系，其中關(guān)系最密切的為I型過敏反應(yīng)。除了食品本身的成分可引起致敏外，食品中含有的抗生素、食品添加劑、食品色素及保鮮劑等均有可能引發(fā)食品過敏。
[0004]1999年食品法典標(biāo)識(shí)委員會(huì)在第23次會(huì)議上列出了 8種主要的致敏性食品:花生、大豆、奶、蛋、魚、貝殼類、小麥和堅(jiān)果。盡管有超過160種食品與速發(fā)型過敏反應(yīng)有關(guān)，但這8種食品導(dǎo)致的過敏反應(yīng)占這160余種食品的90%以上。從理論上講，任何含有蛋白質(zhì)的食品都能激發(fā)機(jī)體的過敏反應(yīng)，但其激發(fā)過敏反應(yīng)的可能性和途徑不同，分子量大于
3.5kDa的多肽就能與肥大細(xì)胞IgE發(fā)生交聯(lián)并引發(fā)過敏反應(yīng)。
[0005]目前國際上對(duì)于外源蛋白的致敏性評(píng)價(jià)方法主要有:生物信息學(xué)分析、模擬胃腸消化和血清學(xué)分析，血清學(xué)試驗(yàn)和胃蛋白酶抑制試驗(yàn)。這些方法為外源蛋白致敏性的評(píng)價(jià)提供了較全面的信息，但沒有一個(gè)方法與外源蛋白的致敏有直接關(guān)系。當(dāng)這些評(píng)價(jià)方法得到的結(jié)果為陰性時(shí)，待測(cè)蛋白質(zhì)仍有可能是一種強(qiáng)致敏原；當(dāng)結(jié)果為陽性時(shí)，也需要進(jìn)行進(jìn)一步試驗(yàn)來證實(shí)受試蛋白質(zhì)的潛在致敏性。但是，這些對(duì)食品過敏原的評(píng)價(jià)方法局限于體外實(shí)驗(yàn)，不能很好的模擬人體內(nèi)復(fù)雜的環(huán)境。因此，缺乏一種評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)致敏性最直接的方法，即建立一種被廣泛接受的檢測(cè)食品中過敏原的動(dòng)物評(píng)價(jià)模型。而且，動(dòng)物模型在了解食品過敏反應(yīng)發(fā)生和發(fā)展過程中所包含的復(fù)雜的免疫學(xué)及病理生理學(xué)機(jī)制等也是很研究?jī)r(jià)值的。
[0006]在利用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)食品致敏性的研究中，常用豚鼠、小鼠和大鼠3種嚙齒類動(dòng)物。目前研究較多的是大鼠，因?yàn)槿藗儗?duì)大鼠免疫系統(tǒng)比較了解，又是許多免疫相關(guān)研究的工具，而且大鼠作為食品安全性評(píng)價(jià)研究最常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，其他食品安全性研究的結(jié)果可作為蛋白質(zhì)致敏性研究的基礎(chǔ)。目前已經(jīng)有利用BN大鼠評(píng)價(jià)食品過敏性的報(bào)道，還未見有關(guān)于使用Wistar大鼠建立食品過敏原動(dòng)物模型的報(bào)道。
[0007]致敏性評(píng)價(jià)動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 中常用的致敏途徑有兩種:經(jīng)口灌胃和腹腔注射。腹腔注射可以研究蛋白質(zhì)的內(nèi)在致敏性，但該途徑不是人體攝入食品過敏原的天然途徑。而口服的優(yōu)點(diǎn)就是其暴露途徑與人類接觸食物過敏原最相關(guān)，其缺點(diǎn)是易產(chǎn)生口服耐受性。因此，最好的方法是結(jié)合二者的優(yōu)點(diǎn)建立一種綜合的動(dòng)物模型。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明申請(qǐng)的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種檢測(cè)食品中過敏原的動(dòng)物模型的構(gòu)建方法，包括下述步驟:
[0009]I)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，動(dòng)物按體重隨機(jī)分為若干組，自由飲水和進(jìn)食，每周進(jìn)行稱重；
[0010]2)在第1，14和15-42天，對(duì)每一組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分別使用不同受試物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其中一組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物接受陰性對(duì)照，每一組又根據(jù)致敏方式分為不同的小組；
[0011]3)在第0，14，28和42天，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行致敏處理30min后采血；
[0012]4)在第49天進(jìn)行大劑量刺激，之后在第1，3，5和7小時(shí)測(cè)定動(dòng)物的收縮壓，然后處死動(dòng)物，取肝臟、腎臟、肺、心臟、脾和胸腺，計(jì)算臟器指數(shù)，并進(jìn)行病理學(xué)檢測(cè)。
[0013]其中，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物優(yōu)選為，SPF級(jí)體重4(T60g的雌性Wistar大鼠。
[0014]進(jìn)一步地，將動(dòng)物按體重隨機(jī)分為4組，每組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物又分為經(jīng)口灌胃和腹腔注射兩個(gè)小組，所述受試物為轉(zhuǎn)人乳鐵蛋白、牛乳鐵蛋白、卵白蛋白和生理鹽水。
[0015]更進(jìn)一步地，上述受試物的使用劑量如下:!^1^和131^:灌胃劑量為0.018/1^體重，腹腔注射劑量為0.001g/kg體重；0VA:灌胃劑量為0.15g/kg體重，腹腔注射劑量為
0.015g/kg體重；生理鹽水:灌胃劑量和腹腔注射劑量均為8ml/kg體重。
[0016]進(jìn)一步地，步驟3)的采血檢測(cè)步驟為:對(duì)動(dòng)物進(jìn)行眼部?jī)?nèi)眥采血，分別取抗凝血(EDTA-K2作為抗凝劑)和非抗凝血，血液樣本在5000r/min4°C下離心10min分別獲得血清和血漿。血清和血漿樣本保存在_20°C，用于特異性抗體和組胺水平的檢測(cè)。全血用于嗜酸性粒細(xì)胞的檢測(cè)。
[0017]上述特異性抗體為特異性IgE，特異性IgG和特異性IgG2a。
[0018]更進(jìn)一步地，特異性抗體的檢測(cè)步驟為:
[0019]I)包被
[0020]將受試蛋白分別用包被緩沖液稀釋至10mg/L，在96孔板上選擇需要包被的孔，每孔加入包被液100μ L，4°C過夜；
[0021]2)洗滌
[0022]倒掉孔內(nèi)液體，每孔加入洗滌液200 μ L，室溫放置3min，甩凈洗滌液，在吸水紙上拍打數(shù)次，至孔內(nèi)無明顯液滴，重復(fù)兩次；
[0023]3)封閉
[0024]每孔加入150 μ L封閉液，于37°C恒溫培養(yǎng)箱中溫育lh，洗滌三次；
[0025]4)加一抗
[0026]每孔加入100 μ L按1:50~100稀釋的待檢血清,每個(gè)測(cè)試血清做三個(gè)平行孔,每板做三個(gè)陰性對(duì)照，于37°C恒溫培養(yǎng)箱中溫育lh，洗滌六次；
[0027]5)加二抗
[0028]每孔加入100 μ L辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗大鼠IgE 二抗工作液，置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中溫育Ih,洗漆六次；[0029]6)顯色
[0030]每孔加入新鮮配制的底物工作液150 μ L，置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中，顯色5~15min,每孔加入50 μ L終止液；
[0031]7)測(cè)定
[0032]于終止顯色30min內(nèi)用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在450nm下的吸收值。
[0033]進(jìn)一步地，大劑量刺激的劑量為經(jīng)口灌胃/腹腔注射劑量的10倍。
[0034]本發(fā)明的另一目的是，上述動(dòng)物模型在檢測(cè)食品過敏原中的應(yīng)用。
[0035]為了驗(yàn)證本動(dòng)物模型對(duì)受試物的致敏評(píng)價(jià)的正確性，本實(shí)驗(yàn)還通過2001年FAO/WHO推薦的體外評(píng)價(jià)食品中外源蛋白 致敏性的主要方法進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，與動(dòng)物模型得到的結(jié)果進(jìn)行比較，以確認(rèn)評(píng)價(jià)結(jié)果的正確性。
[0036]體外實(shí)驗(yàn)主要分為3個(gè)部分，分別是:信息學(xué)分析，模擬胃液消化和血清學(xué)試驗(yàn)。
[0037](—)信息學(xué)分析
[0038]信息學(xué)分析是對(duì)食品過敏原的一級(jí)結(jié)構(gòu)，即氨基酸序列的評(píng)價(jià)。將潛在食品過敏原的氨基酸序列與過敏原數(shù)據(jù)庫中的已知陽性過敏原對(duì)比，來評(píng)價(jià)潛在食品過敏原是否具有致敏性。
[0039]在線致敏原數(shù)據(jù)庫提供了一系列過敏原列表及其序列的搜索數(shù)據(jù)庫，可用于對(duì)于存在潛在交叉反應(yīng)的蛋白之間的對(duì)比。同時(shí)這個(gè)數(shù)據(jù)庫可用于幫助檢測(cè)基因工程或食品加工后的食品過敏原的安全性。目前這個(gè)數(shù)據(jù)庫含有1603個(gè)過敏原序列，蛋白分類組603個(gè)。
[0040]將3種受試蛋白序列輸入AllergenOnline數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列同源性比較。主要進(jìn)行以下兩項(xiàng)比較:
[0041]80個(gè)氨基酸序列比對(duì):對(duì)比是否含有3條含有超過35%的序列與已知過敏原相同。
[0042]連續(xù)8個(gè)氨基酸比對(duì):對(duì)比是否含有3條含有連續(xù)8個(gè)氨基酸與已知過敏原相同。
[0043](二)模擬胃液消化
[0044]模擬胃液消化是在體外模擬人體的胃消化過程，并判斷潛在食品過敏原是否具有抗消化性。有文獻(xiàn)指出，食品過敏原大多都具有抗消化性，所以抗消化性也是評(píng)價(jià)潛在食品過敏原是否具有致敏性的一個(gè)指標(biāo)。
[0045]將模擬胃(腸)液與蛋白樣品溶液(對(duì)照樣品或受試蛋白)按照19:1 (v/v)的比例混合，快速振蕩混勻，置于37°C水浴中，開始計(jì)時(shí)。在Os，15s，2min，30min，60min時(shí)間點(diǎn)取樣，向模擬胃液中快速加入碳酸氫鈉溶液終止反應(yīng)，再加入5X上樣緩沖液，向模擬腸液中直接加入加入5X上樣緩沖液，沸水煮5min，進(jìn)行蛋白電泳。電泳結(jié)束后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色與脫色，并拍照。
[0046](三)血清學(xué)試驗(yàn)
[0047]血清學(xué)實(shí)驗(yàn)使用的是過敏患者的血清與過敏原在體外進(jìn)行Western實(shí)驗(yàn)，從而判斷潛在的食品過敏原是否可以與過敏患者的血清結(jié)合。若能結(jié)合，則可以認(rèn)為這種蛋白具有潛在的致敏性。
[0048]采用對(duì)牛奶或雞蛋過敏患者的血清，采用allergen specific Pharmacia UniCAPtests檢測(cè)血清中IgE分級(jí)應(yīng)大于III級(jí)，或者血清中抗原特異性IgE含量應(yīng)> 3.5KUA/L。采用健康人的血清作為陰性對(duì)照。[0049]I) SDS-PAGE電泳(與模擬胃腸消化中的SDS-PAGE步驟相同)。
[0050]2)轉(zhuǎn)膜:
[0051]根據(jù)蛋白電泳膠的大小裁剪6張濾紙和I張硝酸纖維素膜(使用前要用電轉(zhuǎn)緩沖液浸潤(rùn))。每側(cè)墊3張濾紙，膠靠近負(fù)極，硝酸纖維素膜靠近正極。80V，300mA條件下電轉(zhuǎn)1.5h。
[0052]3)封閉
[0053]使用含有4%脫脂奶粉或3%BSA的TBST溶液封閉2h，用TBST溶液洗3次，每次5min。
[0054]4)加一抗
[0055]使用合適稀釋度的血清室溫下孵育2h，再用TBST溶液洗6次，每次5min。
[0056]5)加二抗
[0057]使用1:4000稀釋度的生物素標(biāo)記的抗IgE抗體室溫下孵育Ih。使用TBST溶液洗6次,每次5min。
[0058]6)加三抗 [0059]使用1:8000稀釋的HRP-鏈霉親和素室溫下孵育lh。使用TBST溶液洗6次，每次5min。
[0060]7)曝光
[0061]加ECL(electrochemiluminescence),將膜放在X-光片夾中，在暗室中，將IX顯影液和定影液分別到入塑料盤中；在紅燈下取出X-光片，用切紙刀剪裁適當(dāng)大小(比膜的長(zhǎng)和寬均需大Icm);打開X-光片夾,把X-光片放在膜上，一旦放上，便不能移動(dòng)，關(guān)上X-光片夾，計(jì)時(shí)5min。打開X-光片夾，取出X-光片，迅速浸入顯影液中顯影，待出現(xiàn)明顯條帶后，即刻終止顯影。顯影結(jié)束后，馬上把X-光片浸入定影液中，定影時(shí)間一般為5~lOmin，以膠片透明為止；用自來水沖去殘留的定影液后，室溫下晾干。
[0062]8)照相
[0063]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果:
[0064]本發(fā)明得到的這個(gè)動(dòng)物模型克服了體外評(píng)價(jià)方法不能完全模擬機(jī)體對(duì)外源蛋白產(chǎn)生的復(fù)雜免疫反應(yīng)?？蓱?yīng)用于評(píng)價(jià)食品原料及各種加工食品的致敏性，從根本上降低了食品過敏的風(fēng)險(xiǎn)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0065]圖1為灌胃組各組特異性IgG檢測(cè)結(jié)果；
[0066]A 為:0VA, B 為:bLF, C 為:rhLF, D 為:生理鹽水。
[0067]圖2為灌胃組各組特異性IgG2a檢測(cè)結(jié)果；
[0068]A 為:0VA, B 為:bLF, C 為:rhLF, D 為:生理鹽水。
[0069]圖3為灌胃組各組嗜酸性粒細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果；
[0070]圖4為灌胃組各組收縮壓檢測(cè)結(jié)果；
[0071]圖5為腹腔注射組各組特異性IgG檢測(cè)結(jié)果；
[0072]A 為:0VA, B 為:bLF, C 為:rhLF, D 為:生理鹽水。
[0073]圖6為腹腔注射組各組特異性IgG2a檢測(cè)結(jié)果；[0074]A 為:0VA, B 為:bLF, C 為:rhLF, D 為:生理鹽水。
[0075]圖7為腹腔注射組各組嗜酸性粒細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果；
[0076]圖8為腹腔注射組各組收縮壓檢測(cè)結(jié)果；
[0077]圖9為OVA模擬胃液/腸液消化SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)果；
[0078]電泳圖上樣順序?yàn)?
[0079]8:預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)蛋白，從上到下依次是:170kD、130kD、95kD、72kD、55kD、43kD、34kD、26kD、17kD、10kD ；
[0080]1，9:目的蛋白對(duì)照；
[0081 ] 7:胃蛋白酶對(duì)照；15:胰蛋白酶對(duì)照。
[0082]2-6:為目的蛋白在模擬胃液中分別消化0s、15s、2min、30min、60min的情況；
[0083]10-14:為目的蛋白在模擬腸液中分別消化Os、15s、2min、30min、60min的情況。
[0084]圖10為bLF模擬胃液/腸液消化SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)果；
[0085]電泳圖上樣順序?yàn)? [0086]8:低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白，從上到下依次是:97.4kD、66.2kD、43kD、31kD、20kD、14.4kD ；
[0087]2，10:目的蛋白對(duì)照；
[0088]1:胃蛋白酶對(duì)照；9:胰蛋白酶對(duì)照。
[0089]3-7:為目的蛋白在模擬胃液中分別消化0s、15s、2min、30min、60min的情況；
[0090]11-15:為目的蛋白在模擬腸液中分別消化Os、15s、2min、30min、60min的情況。[0091 ] 圖11為rhLF模擬胃液/腸液消化SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)果；
[0092]電泳圖上樣順序?yàn)?
[0093]8:低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白，從上到下依次是:97.4kD、66.2kD、43kD、31kD、20kD、14.4kD ；
[0094]1,9:目的蛋白對(duì)照；7:胃蛋白酶對(duì)照；15:胰蛋白酶對(duì)照。
[0095]2-6:為目的蛋白在模擬胃液中分別消化0s、15s、2min、30min、60min的情況；
[0096]10-14:為目的蛋白在模擬腸液中分別消化Os、15s、2min、30min、60min的情況。
[0097]圖12為OVA免疫印跡血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果；
[0098]圖13為bLF免疫印跡血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果；
[0099]圖14為rhLF免疫印跡血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果；
[0100]A圖中泳道1:標(biāo)準(zhǔn)奶粉蛋白提取物(IOug) ；2:標(biāo)準(zhǔn)蛋粉蛋白提取物(IOug) ；3:重組人乳鐵蛋白(40ng) ；4:人乳鐵蛋白(40ng) ；5:牛乳鐵蛋白(40ng)。所用血清為健康人血清。B圖中泳道1:標(biāo)準(zhǔn)蛋粉蛋白提取物(IOug) ；2:重組人乳鐵蛋白(40ng) ；3:人乳鐵蛋白(40ng)；4:牛乳鐵蛋白(40ng)。共檢測(cè)了 12例對(duì)雞蛋過敏患者的血清，上圖所用血清為26號(hào)對(duì)雞蛋過敏患者血清。C圖中泳道1:標(biāo)準(zhǔn)奶粉蛋白提取物(IOug) ；2:重組人乳鐵蛋白(40ng)；3:人乳鐵蛋白(40ng);4:牛乳鐵蛋白(40ng)。共檢測(cè)了 21例對(duì)牛奶過敏的患者血清,上圖所用血清為85號(hào)對(duì)牛奶過敏患者血清。
【具體實(shí)施方式】
[0101]以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。[0102]實(shí)施例1
[0103]動(dòng)物模型的構(gòu)建
[0104]1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
[0105]SPF級(jí)體重40~60g的雌性Wistar大鼠。
[0106]2.受試物
[0107]轉(zhuǎn)人乳鐵蛋白(rhLF)，牛乳鐵蛋白(bLF)，卵白蛋白0VA，生理鹽水(陰性對(duì)照)。
[0108]3.動(dòng)物分組
[0109]實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按照體重隨機(jī)分為4組(每組兩小組)，分別是:rhLF灌胃組/腹腔注射組，bLF灌胃組/腹腔注射組，OVA灌胃組/腹腔注射組和生理鹽水灌胃組/腹腔注射組。每小組8只動(dòng)物。
[0110]4.劑量
[0111]rhLF和bLF:灌胃劑量為0.01g/kg體重，腹腔注射劑量為0.001g/kg體重。
[0112]OVA:灌胃劑量為0.15g/kg體重，腹腔注射劑量為0.015g/kg體重。
[0113]生理鹽水:8ml/kg體重。
[0114]大刺激劑量為灌胃/注射劑量的10倍。
[0115]5.動(dòng)物處理
[0116]實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)I周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物按體重隨機(jī)分為4組(每組兩小組)，自由飲水和進(jìn)食，每周進(jìn)行稱重。
[0117]在第1，14和15~42天對(duì)動(dòng)物進(jìn)行灌胃/腹腔注射處理。
[0118]在第0，14，28和42天，動(dòng)物灌胃/腹腔注射30min后，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行眼部?jī)?nèi)眥采血，分別取抗凝血(EDTA-K2作為抗凝劑)和非抗凝血,在5000r/min4°C下離心10min分別獲得血清和血漿。血清和血漿樣本保存在_20°C，用于特異性抗體和組胺水平的檢測(cè)。全血用于嗜酸性粒細(xì)胞的檢測(cè)。
[0119]在第49天進(jìn)行大劑量刺激，之后在第1，3，5和7小時(shí)測(cè)定動(dòng)物的收縮壓，然后處死動(dòng)物，取肝臟，腎臟，肺，心臟，脾和胸腺等臟器，計(jì)算臟器指數(shù)，并進(jìn)行病理學(xué)檢測(cè)。
[0120]實(shí)施例2
[0121]反應(yīng)指標(biāo)的檢測(cè)
[0122]1.特異性IgE的檢測(cè)
[0123]I)包被
[0124]將受試蛋白分別用包被緩沖液稀釋至10mg/L，在96孔板上選擇需要包被的孔，每孔加入包被液100μ L，4°C過夜；
[0125]2)洗滌
[0126]倒掉孔內(nèi)液體，每孔加入洗滌液200 μ L，室溫放置3min，甩凈洗滌液，在吸水紙上拍打數(shù)次，至孔內(nèi)無明顯液滴，重復(fù)兩次；
[0127]3)封閉
[0128]每孔加入150 μ L封閉液，于37°C恒溫培養(yǎng)箱中溫育lh，洗滌三次；
[0129]4)加一抗
[0130]每孔加入100 μ L按1:50~100稀釋的待檢血清,每個(gè)測(cè)試血清做三個(gè)平行孔,每板做三個(gè)陰性對(duì)照。于37°C恒溫培養(yǎng)箱中溫育lh，洗滌六次；[0131]5)加二抗
[0132]每孔加入100 μ L辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗大鼠IgE 二抗工作液，置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中溫育Ih,洗漆六次；
[0133]6)顯色
[0134]每孔加入新鮮配制的底物工作液150μ L，置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中，顯色5~15min,每孔加入50 μ L終止液；
[0135]7)測(cè)定
[0136]于終止顯色30min內(nèi)用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在450nm下的吸收值(A)。
[0137]2.特異性IgG的檢測(cè)
[0138]編號(hào)同上包被:將受試蛋白分別用包被緩沖液稀釋至10mg/L，在96孔板上選擇需要包被的孔，每孔加入包被液100μ L,4°C過夜；
[0139]洗滌:倒掉孔內(nèi)液體，每孔加入洗滌液200 μ L，室溫放置3min，甩凈洗滌液，在吸水紙上拍打數(shù)次，至孔內(nèi)無明顯液滴，重復(fù)兩次；
[0140]封閉:每孔加入150 μ L封閉液，于37°C恒溫培養(yǎng)箱中溫育lh，洗滌三次；
[0141]加一抗:每孔加入100μ L按1:50~100稀釋的待檢血清，每個(gè)測(cè)試血清做三個(gè)平行孔，每板做三個(gè)陰 性對(duì)照。于37°C恒溫培養(yǎng)箱中溫育lh，洗滌六次；
[0142]加二抗:每孔加入100μ L辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗大鼠IgG 二抗工作液，置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中溫育lh，洗滌六次；
[0143]顯色:每孔加入新鮮配制的底物工作液150 μ L，置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中，顯色5~15min,每孔加入50 μ L終止液；
[0144]測(cè)定:于終止顯色30min內(nèi)用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在450nm下的吸收值(A)。
[0145]3.特異性IgG2a的檢測(cè)
[0146]編號(hào)同上包被:將樣品蛋白及陽性對(duì)照蛋白分別用包被緩沖液稀釋至10mg/L，在96孔板上選擇需要包被的孔,每孔加入包被液100μ L,4°C過夜；
[0147]洗滌:倒掉孔內(nèi)液體，每孔加入洗滌液200 μ L，室溫放置3min，甩凈洗滌液，在吸水紙上拍打數(shù)次，至孔內(nèi)無明顯液滴，重復(fù)兩次；
[0148]封閉:每孔加入150 μ L封閉液，于37°C恒溫培養(yǎng)箱中溫育lh，洗滌三次；
[0149]加一抗:每孔加入100μ L按1:50~100稀釋的待檢血清，每個(gè)測(cè)試血清做三個(gè)平行孔，每板做三個(gè)陰性對(duì)照。于37°C恒溫培養(yǎng)箱中溫育lh，洗滌六次；
[0150]加二抗:每孔加入100 μ L辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗大鼠IgG2a 二抗工作液，置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中溫育lh，洗滌六次；
[0151]顯色:每孔加入新鮮配制的底物工作液150 μ L，置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中，顯色5~15min,每孔加入50 μ L終止液；
[0152]測(cè)定:于終止顯色30min內(nèi)用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在450nm下的吸收值(A)。
[0153]4.嗜酸性粒細(xì)胞的檢測(cè)
[0154]在第0，14，28和42天，動(dòng)物灌胃/腹腔注射30min后，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行眼部?jī)?nèi)眥采血，收集血液的離心管中含有EDTA-K2抗凝劑。使用血細(xì)胞分析儀對(duì)全血中的嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)。
[0155]5.組胺水平的檢測(cè)[0156]血漿中組胺的檢測(cè)選用大鼠組胺ELISA試劑盒。將試劑盒在室溫下放置至少平衡室溫半小時(shí)后，取出試劑盒中反應(yīng)板，加入IOOyL已稀釋標(biāo)本于相應(yīng)反應(yīng)板孔中。輕輕混勻30秒，20-25°C溫育20分鐘。甩盡板內(nèi)液體，用洗滌液洗滌反應(yīng)板(每孔內(nèi)加入350 μ L洗漆液)，并去除水滴(在厚吸水紙上拍干)，反復(fù)洗漆3次。每孔加入100μ L Biotin anti ratHistamine。輕輕混勻30秒，20-25°C溫育20分鐘。重復(fù)洗滌步驟。每孔加入100 μ LI XHRP。輕輕混勻30秒,20_25°C溫育10分鐘。重復(fù)上述洗板過程。每孔加入100 μ L TMB顯色液，輕輕混勻30秒；15分鐘內(nèi)在450nm處讀OD值。
[0157]6.臟器指數(shù)
[0158]解剖動(dòng)物，取肝、脾、腎、心、肺和胸腺等臟器，肉眼觀察其大體變化并稱重，計(jì)算各臟器的臟器指數(shù)[(臟器質(zhì)量/體重)X100%]。
[0159]7.數(shù)據(jù)處理
[0160]結(jié)果均以平均值土標(biāo)準(zhǔn)差表示。
[0161]使用SPSS的單因素方差分析進(jìn)行顯著性分析，當(dāng)P < 0.05認(rèn)為具有顯著性差異。
[0162]實(shí)施例3
[0163]試驗(yàn)結(jié)果及分析
[0164]1.日常狀況
[0165]在試驗(yàn)期間，各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物狀態(tài)良好，營養(yǎng)狀況正常，未出現(xiàn)死亡等任何中毒現(xiàn)象。
[0166]2.灌胃組結(jié)果
[0167]I)特異性IgE結(jié)果
[0168]表1為灌胃組各組特異性IgE檢測(cè)結(jié)果:從結(jié)果中可以看出，OVA組在第28天和42天要顯著性高于bLF組(P〈0.05)，在第42天要顯著性高于生理鹽水對(duì)照組(P〈0.05)。而rhLF幾乎沒有誘發(fā)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)生IgE應(yīng)答。
[0169]表1灌胃組各組特異性IgE檢測(cè)結(jié)果(平均值土標(biāo)準(zhǔn)差，n=8)
[0170]
【權(quán)利要求】
1.一種檢測(cè)食品中過敏原的動(dòng)物模型的構(gòu)建方法，包括下述步驟: 1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，動(dòng)物按體重隨機(jī)分為若干組，自由飲水和進(jìn)食，每周進(jìn)行稱重； 2)在第1，14和15-42天，對(duì)每一組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分別使用不同受試物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其中一組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物接受陰性對(duì)照，每一組又根據(jù)致敏方式分為不同的小組； 3)在第O，14，28和42天，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行致敏處理30min后采血； 4)在第49天進(jìn)行大劑量刺激，之后在第1，3，5和7小時(shí)測(cè)定動(dòng)物的收縮壓，然后處死動(dòng)物，取肝臟、腎臟、肺、心臟、脾和胸腺，計(jì)算臟器指數(shù)，并進(jìn)行病理學(xué)檢測(cè)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為SPF級(jí)體重4(T60g的雌性Wistar大鼠，動(dòng)物按體重隨機(jī)分為4組，每組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物又分為經(jīng)口灌胃和腹腔注射兩個(gè)小組，所述受試物為轉(zhuǎn)人乳鐵蛋白、牛乳鐵蛋白、卵白蛋白和生理鹽水。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述受試物的劑量如下:轉(zhuǎn)人乳鐵蛋白和牛乳鐵蛋白:灌胃劑量為0.01g/kg體重，腹腔注射劑量為0.001g/kg體重；卵白蛋白:灌胃劑量為0.15g/kg體重，腹腔注射劑量為0.015g/kg體重；生理鹽水:灌胃劑量和腹腔注射劑量均為8ml/kg體重。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述采血檢測(cè)步驟為:對(duì)動(dòng)物進(jìn)行眼部?jī)?nèi)目此采血，分別為抗凝血和非抗凝血，血液樣本在5000r/min4°C下離心10min分別獲得血清和血漿，血清和血漿樣本保存在-20°C，用于特異性抗體和組胺水平的檢測(cè)，全血用于嗜酸性粒細(xì)胞的檢測(cè)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述特異性抗體的檢測(cè)為特異性IgE，特異性IgG和特異性IgG2a的檢測(cè)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述特異性抗體的檢測(cè)步驟為: (1)包被 將受試物分別用包被緩沖液稀釋至10mg/L，在96孔板上選擇需要包被的孔，每孔加入包被液100yL，4°C過夜； (2)洗滌 倒掉孔內(nèi)液體，每孔加入洗滌液200 μ L，室溫放置3min，甩凈洗滌液，在吸水紙上拍打數(shù)次，至孔內(nèi)無明顯液滴，重復(fù)兩次； (3)封閉 每孔加入150 μ L封閉液,于37°C恒溫培養(yǎng)箱中溫育Ih,洗漆三次； (4)加一抗 每孔加入100 μ L按1:50~100稀釋的待檢血清，每個(gè)測(cè)試血清做三個(gè)平行孔,每板做三個(gè)陰性對(duì)照，于37°C恒溫培養(yǎng)箱中溫育lh，洗滌六次； (5)加二抗 每孔加入100 μ L辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗大鼠IgE二抗工作液，置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中溫育Ih，洗滌六次； (6)顯色 每孔加入新鮮配制的底物工作液150 μ L，置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中，顯色5~15min，每孔加入50 μ L終止液；(7)測(cè)定 于終止顯色30min內(nèi)用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在450nm下的吸收值。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于，大劑量刺激的劑量為經(jīng)口灌胃/腹腔注射劑量的10倍。
8.權(quán)利要求1或2 所述方法構(gòu)建的動(dòng)物模型在檢測(cè)食品過敏原中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K38/38GK104001160SQ201310059155
【公開日】2014年8月27日 申請(qǐng)日期:2013年2月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年2月25日
【發(fā)明者】車會(huì)蓮, 王靜, 周催, 孫娜, 王翠燕, 賀曉云 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)