專利名稱：一種胰島素抵抗動(dòng)物模型的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種胰島素抵抗動(dòng)物模型的構(gòu)建方法，具體說(shuō)，是涉及一種大鼠胰島素抵抗模型的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
動(dòng)物模型的構(gòu)建是醫(yī)學(xué)研究中的一項(xiàng)很重要的技術(shù)。構(gòu)建與人類發(fā)病相似的疾病模型，可以克服人類本身發(fā)生疾病潛伏期長(zhǎng)、影響因素多、發(fā)生發(fā)展緩慢、發(fā)病機(jī)制復(fù)雜等因素的制約，更好地反應(yīng)疾病發(fā)生、發(fā)展的規(guī)律，并有利于研究不便于在人類本身進(jìn)行研究的疾病。常用的動(dòng)物模型主要包括自發(fā)性動(dòng)物模型、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型和實(shí)驗(yàn)性動(dòng)物模型。 自發(fā)性動(dòng)物模型、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型應(yīng)用價(jià)值較高，但其造模成本高、技術(shù)飼養(yǎng)條件要求高等特點(diǎn)限制了這些動(dòng)物模型的普遍應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)性動(dòng)物模型操作簡(jiǎn)單、成本低、成模率較高，目前，這類動(dòng)物模型被廣泛使用。近年來(lái)，隨著人們生活方式的轉(zhuǎn)變，糖尿病的發(fā)病率逐年增加。美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)推測(cè)，至2030年，全球?qū)⒂?5億人患有糖尿病及其并發(fā)癥。最近，我國(guó)的一項(xiàng)調(diào)查顯示，目前我國(guó)糖尿病患病人數(shù)已達(dá)9200萬(wàn)，僅次于印度。糖尿病對(duì)全球尤其是發(fā)展中國(guó)家的經(jīng)濟(jì)發(fā)展產(chǎn)生了巨大的壓力，據(jù)統(tǒng)計(jì)，發(fā)展中國(guó)家用于糖尿病方面的費(fèi)用支出超出了衛(wèi)生費(fèi)用預(yù)算的10%。糖尿病患者中90%以上是2型糖尿病患者，胰島素抵抗是2型糖尿病的基本特征。 胰島素抵抗是指肝、肌肉、脂肪等胰島素作用的靶組織，不能響應(yīng)胰島素導(dǎo)致胰島素的功能減弱甚至缺失的病理狀態(tài)。除2型糖尿病之外，胰島素抵抗還與高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、代謝綜合征的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。因此，對(duì)胰島素抵抗的發(fā)病機(jī)制及防治研究顯得尤為重要。 目前，胰島素抵抗的發(fā)病機(jī)制還不明確，但可以確定的是，氧化應(yīng)激在胰島素抵抗的發(fā)生中扮演著重要的角色。在正常的胰島素信號(hào)傳導(dǎo)中，胰島素與其受體結(jié)合啟動(dòng)胰島素信號(hào)，激活受體內(nèi)源性蛋白酪氨酸激酶活性，導(dǎo)致受體細(xì)胞質(zhì)一側(cè)的酪氨酸磷酸化。激活的受體，又募集并磷酸化一系列底物分子。進(jìn)而激活磷脂酰肌醇-3-激酶(Ph0Sph0in0Sitide-3-kinase，PI3K) /蛋白激酶B (Protein kinase B，Akt)。蛋白激酶B是胰島素信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中的一種重要的激酶，胰島素刺激條件下其磷酸化水平的高低常被用來(lái)作為胰島素信號(hào)傳導(dǎo)是否正常的指標(biāo)。胰島素抵抗發(fā)生時(shí)，胰島素刺激的蛋白激酶B磷酸化水平明顯降低。現(xiàn)有的胰島素抵抗動(dòng)物模型主要是以高脂飲食長(zhǎng)期喂養(yǎng)誘導(dǎo)，實(shí)驗(yàn)周期過(guò)長(zhǎng)，不適于進(jìn)行大量胰島素抵抗防治藥物的篩選。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種胰島素抵抗動(dòng)物模型的構(gòu)建方法成模率高，它造模周期短以及成本低的。為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種胰島素抵抗動(dòng)物模型的構(gòu)建方法，其特征在于尾靜脈注射葡萄糖氧化酶誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生氧化應(yīng)激，得到胰島素抵抗動(dòng)物模型。
所述的胰島素抵抗動(dòng)物模型的構(gòu)建方法，它包括以下步驟
(1)選用SD大鼠，清潔級(jí)，雄性，體重180 士 220 g，動(dòng)物自由攝食飲水。(2)以400 U/kg體重的劑量尾靜脈注射葡萄糖氧化酶，連續(xù)給藥三天后，得到動(dòng)物模型。所述的選用SD大鼠，清潔級(jí)、雄性、體重180 士 220 g，分別標(biāo)記；尾靜脈注射葡萄糖氧化酶(400 U/kg)，對(duì)照組注射等量生理鹽水，自由攝食飲水。連續(xù)給藥3天后，進(jìn)行腹腔注射糖耐量和胰島素耐量試驗(yàn)，得到動(dòng)物模型。上述方法所得到的動(dòng)物模型的驗(yàn)證方法包括測(cè)定腹腔注射糖耐量、胰島素耐量水平以及胰島素刺激的蛋白激酶B的磷酸化水平。血糖水平采用常規(guī)方法進(jìn)行測(cè)定。腹腔注射葡萄糖耐量試驗(yàn)(Intraperitoneal glucose tolerance test, IPGTT)的試驗(yàn)方法為分別將正常對(duì)照組和模型組動(dòng)物禁食6 小時(shí)，測(cè)定空腹血糖值，以100mg/ml葡萄糖溶液腹腔注射，葡萄糖用量為lg/kg體重，分別于30分鐘、60分鐘、120分鐘測(cè)定各組動(dòng)物的血糖值。以各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血糖值做糖耐量曲線，對(duì)模型組和正常對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行t檢驗(yàn)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。胰島素耐量試驗(yàn)(Insulin tolerance test, ITT)的試驗(yàn)方法為分別將正常對(duì)照組和模型組動(dòng)物禁食4小時(shí)，測(cè)定空腹血糖值，腹腔注射胰島素，注射劑量為0. 75U/kg體重，分別于30分鐘、60分鐘、120分鐘測(cè)定各組動(dòng)物的血糖值。以各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血糖值做胰島素耐量曲線，對(duì)模型組和正常對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行t檢驗(yàn)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。胰島素刺激的蛋白激酶B磷酸化水平由Western blot進(jìn)行測(cè)定。本發(fā)明構(gòu)建的胰島素抵抗動(dòng)物模型的測(cè)定結(jié)果表明模型組動(dòng)物糖耐量和胰島素耐量與正常對(duì)照組動(dòng)物有顯著差異，模型組動(dòng)物胰島素刺激的蛋白激酶B磷酸化水平顯著降低，表明模型組動(dòng)物已經(jīng)發(fā)生明顯的胰島素抵抗，從而驗(yàn)證了本發(fā)明建立的胰島素抵抗動(dòng)物模型。本發(fā)明方法的特點(diǎn)為使用葡萄糖氧化酶在動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生過(guò)量自由基，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷，進(jìn)而誘導(dǎo)胰島素抵抗的發(fā)生。應(yīng)用本方法構(gòu)建的胰島素抵抗動(dòng)物模型具有與人類胰島素抵抗相似的特征表現(xiàn)，是研究胰島素抵抗和2型糖尿病發(fā)病機(jī)制以及進(jìn)行防治藥物篩選的理想模型。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明構(gòu)建的大鼠胰島素抵抗模型，具有造模方法簡(jiǎn)單、成模率高、成本低、周期短、及重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)。


下面結(jié)合實(shí)施例附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明
圖1腹腔注射葡萄糖耐量試驗(yàn)中，模型組與正常組相比，各時(shí)間點(diǎn)血糖顯示圖； 圖2胰島素耐量試驗(yàn)中，模型組與正常組相比，各時(shí)間點(diǎn)血糖顯示圖； 圖3與正常對(duì)照相比，模型組胰島素刺激的蛋白激酶B磷酸化顯示圖。
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)實(shí)例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，其目的在于更好的理解本發(fā)明的內(nèi)容，而非限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
實(shí)施例1
(1)選用SD大鼠，清潔級(jí)，雄性，體重180 士 220 g，動(dòng)物自由攝食飲水。(2)以400 U/kg體重的劑量尾靜脈注射葡萄糖氧化酶，連續(xù)給藥三天后，得到動(dòng)物模型。所述的選用SD大鼠，清潔級(jí)、雄性、體重180 士 220 g，分別標(biāo)記；尾靜脈注射葡萄糖氧化酶(400 U/kg)，對(duì)照組注射等量生理鹽水，自由攝食飲水。連續(xù)給藥3天后，進(jìn)行腹腔注射糖耐量和胰島素耐量試驗(yàn)，得到動(dòng)物模型。上述方法所得到的動(dòng)物模型的驗(yàn)證方法包括測(cè)定腹腔注射糖耐量、胰島素耐量水平以及胰島素刺激的蛋白激酶B的磷酸化水平。血糖水平采用常規(guī)方法進(jìn)行測(cè)定。腹腔注射葡萄糖耐量試驗(yàn)(Intraperitoneal glucose tolerance test, IPGTT)的試驗(yàn)方法為分別將正常對(duì)照組和模型組動(dòng)物禁食6 小時(shí)，測(cè)定空腹血糖值，以100mg/ml葡萄糖溶液腹腔注射，葡萄糖用量為lg/kg體重，分別于30分鐘、60分鐘、120分鐘測(cè)定各組動(dòng)物的血糖值。以各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血糖值做糖耐量曲線，對(duì)模型組和正常對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行t檢驗(yàn)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)施例2
1.實(shí)驗(yàn)儀器
血糖測(cè)定儀(美國(guó)強(qiáng)生公司)、精密電子天平、Iml注射器等。2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料
2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
SD大鼠，清潔級(jí)，雄性，體重180 士 220 g，有第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。2.2實(shí)驗(yàn)材料
葡萄糖氧化酶、生理鹽水、苦味酸、血糖試紙、胰島素、葡萄糖。3.實(shí)驗(yàn)方法
30只SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組和模型組，各15只。以400U/kg的劑量尾靜脈注射葡萄糖氧化酶(生理鹽水溶解，600U/ml)，對(duì)照組注射相同體積生理鹽水。連續(xù)給藥三天后， 于第4天，正常對(duì)照組和模型組各取10只動(dòng)物，進(jìn)行腹腔注射葡萄糖耐量試驗(yàn)和胰島素耐量試驗(yàn)。腹腔注射葡萄糖耐量試驗(yàn)(Intraperitoneal glucose tolerance test, IPGTT) 的試驗(yàn)方法為分別將正常對(duì)照組和模型組動(dòng)物禁食6小時(shí)，測(cè)定空腹血糖值，以100mg/ml 葡萄糖溶液腹腔注射，葡萄糖用量為lg/kg體重，分別于30分鐘、60分鐘、120分鐘測(cè)定各組動(dòng)物的血糖值。以各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血糖值做糖耐量曲線，對(duì)模型組和正常對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行t檢驗(yàn)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。胰島素耐量試驗(yàn)(Insulin tolerance test, ITT)的試驗(yàn)方法為分別將正常對(duì)照組和模型組動(dòng)物禁食4小時(shí)，測(cè)定空腹血糖值，腹腔注射胰島素，注射劑量為0. 75U/kg體重，分別于30分鐘、60分鐘、120分鐘測(cè)定各組動(dòng)物的血糖值。以各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血糖值做胰島素耐量曲線，對(duì)模型組和正常對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行t檢驗(yàn)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。正常對(duì)照組和模型組各取5只動(dòng)物，以10IU/kg的劑量腹腔注射胰島素，45分鐘后，處死動(dòng)物，取肝臟進(jìn)行Western blot試驗(yàn)，檢測(cè)蛋白激酶B的磷酸化水平。4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
4. 1如圖1所示，腹腔注射葡萄糖耐量試驗(yàn)中，模型組與正常組相比，各時(shí)間點(diǎn)血糖水平差異顯著。
4. 2如圖2所示，胰島素耐量試驗(yàn)中，模型組與正常組相比，各時(shí)間點(diǎn)血糖水平差異顯著。4.3如圖3所示，與正常對(duì)照相比，模型組胰島素刺激的蛋白激酶B磷酸化水平明顯降低。可見(jiàn)，本發(fā)明利用尾靜脈注射葡萄糖氧化酶誘導(dǎo)胰島素抵抗動(dòng)物模型是可行的， 該模型可作為胰島素抵抗以及2型糖尿病的發(fā)病機(jī)制和藥物作用機(jī)理研究模型。
權(quán)利要求
1.一種胰島素抵抗動(dòng)物模型的構(gòu)建方法，其特征在于尾靜脈注射葡萄糖氧化酶誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生氧化應(yīng)激，得到胰島素抵抗動(dòng)物模型。
2.根據(jù)權(quán)利要求書(shū)1所述的一種胰島素抵抗動(dòng)物模型的構(gòu)建方法，其特征在于包括以下步驟1)選用SD大鼠，清潔級(jí)，雄性，體重180士 220 g，動(dòng)物自由攝食飲水；2)以400U/kg體重的劑量尾靜脈注射葡萄糖氧化酶，連續(xù)給藥三天后，得到動(dòng)物模型。
3.根據(jù)權(quán)利要求書(shū)2所述的一種胰島素抵抗動(dòng)物模型的構(gòu)建方法，其特征在于所述的選用SD大鼠，清潔級(jí)、雄性、體重180 士 220 g，分別標(biāo)記；尾靜脈注射葡萄糖氧化酶 (400 U/kg)，對(duì)照組注射等量生理鹽水，自由攝食飲水；連續(xù)給藥3天后，進(jìn)行腹腔注射糖耐量和胰島素耐量試驗(yàn)，得到動(dòng)物模型。
4.根據(jù)權(quán)利要求書(shū)1所述的一種胰島素抵抗動(dòng)物模型的構(gòu)建方法，其特征在于上述方法所得到的動(dòng)物模型的驗(yàn)證方法包括測(cè)定腹腔注射糖耐量、胰島素耐量水平以及胰島素刺激的蛋白激酶B的磷酸化水平。
5.根據(jù)權(quán)利要求書(shū)1所述的一種胰島素抵抗動(dòng)物模型的構(gòu)建方法，其特征在于血糖水平采用常規(guī)方法進(jìn)行測(cè)定，即腹腔注射葡萄糖耐量試驗(yàn)的試驗(yàn)方法為分別將正常對(duì)照組和模型組動(dòng)物禁食6小時(shí)，測(cè)定空腹血糖值，以100mg/ml葡萄糖溶液腹腔注射，葡萄糖用量為lg/kg體重，分別于30分鐘、60分鐘、120分鐘測(cè)定各組動(dòng)物的血糖值；以各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血糖值做糖耐量曲線，對(duì)模型組和正常對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行t檢驗(yàn)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種胰島素抵抗動(dòng)物模型的構(gòu)建方法，具體指利用SD大鼠，尾靜脈注射葡萄糖氧化酶(400U/kg體重)誘導(dǎo)產(chǎn)生胰島素抵抗。對(duì)糖耐量和胰島素耐量的統(tǒng)計(jì)分析以及胰島素信號(hào)傳導(dǎo)的測(cè)定表明本發(fā)明利用葡萄糖氧化酶構(gòu)建的胰島素抵抗大鼠模型是可行的，可作為胰島素抵抗以及2型糖尿病的發(fā)病機(jī)制和藥物作用機(jī)理的研究模型。與現(xiàn)有的模型構(gòu)建技術(shù)相比，本發(fā)明構(gòu)建的胰島素抵抗大鼠模型具有造模方法簡(jiǎn)單、成模率高、成本低、周期短、及重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N33/66GK102228700SQ20111017593
公開(kāi)日2011年11月2日 申請(qǐng)日期2011年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月28日
發(fā)明者海春旭, 王欣 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)