專利名稱：抗opgl抗體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及與骨保護素(osteoprotegerin)配體(OPGL)結合的抗體。也描述了治療骨病例如骨質(zhì)疏松，關節(jié)炎骨損失，佩吉特氏病，和骨質(zhì)稀少的組合物和方法。
背景技術：
骨組織提供對身體的支持，并且包括礦物質(zhì)(包括鈣和磷)，膠原蛋白和非膠原蛋白基質(zhì)，和細胞。活組織在稱為沉積的骨形成和稱為再吸收的骨分解之間表現(xiàn)出動態(tài)平衡。在骨，骨細胞，成骨細胞和破骨細胞中發(fā)現(xiàn)的三種類型的細胞都涉及這種平衡。成骨細胞促進骨組織的形成，而破骨細胞與再吸收相關。與骨形成相比，骨基質(zhì)和礦物質(zhì)的再吸收或溶解是一個快速而有效的過程，并且能從骨釋放大量礦物質(zhì)。破骨細胞參與骨骼組織正常重塑的調(diào)節(jié)和激素誘導的再吸收。例如，反應于胞外液中鈣離子降低的濃度的甲狀旁腺激素的分泌刺激再吸收。相反，再吸收的抑制作用是降鈣素的功能。另外，維生素D的代謝物改變骨對甲狀旁腺激素和降鈣素的反應。骨保護素配體(OPGL)是細胞因子TNF家族的一員，通過與NF-K B (RANK，也稱作破骨細胞分化和激活受體，或0DAR)的受體激活劑結合而促進破骨細胞的形成。另一方面，骨保護素(OPG)，通過隔離OPGL并且阻止OPGL與ODAR締合而抑制破骨細胞的形成。因此，與ODAR締合的OPGL的量與骨沉積和再吸收之間的平衡相關。骨骼成熟之后，骨骼中骨的量反映骨形成和骨再吸收的平衡(或失衡)。在骨成熟之后第四個十年之前骨質(zhì)達到高峰。在第四和第五個十年之間，平衡轉(zhuǎn)移并且骨再吸收占優(yōu)勢。骨量隨著年齡不可避免的減少在女性要比男性開始得早，并且某些女性在絕經(jīng)期之后顯著加快(主要是高加索人和亞洲人血統(tǒng)的那些)。骨質(zhì)稀少是與一般骨質(zhì)低于正常水平的任何降低相關的狀況。這樣的狀況可以由骨合成速度減慢或者骨破壞速度加快或者這兩者而發(fā)生的一種狀況。骨質(zhì)稀少的一個常見形式是原發(fā)性骨質(zhì)疏松，也稱作絕經(jīng)后和老年骨質(zhì)疏松。這種骨質(zhì)疏松形式是隨著年齡骨普遍損失的結果，并且經(jīng)常是伴隨骨形成正常速度的骨再吸收加速的結果。在美國，很多白人女性發(fā)生有癥狀的骨質(zhì)疏松癥。骨質(zhì)疏松和45歲和更年老婦女髖部，股骨，頸和轉(zhuǎn)子間骨折的發(fā)生率之間存在直接關系。老年男性在50和70歲之間可能發(fā)生有癥狀的骨質(zhì)疏松。在某些情況下，骨質(zhì)疏松可能由OPGL提高的水平或活性而產(chǎn)生。因此，能調(diào)節(jié)破骨細胞生成中OPGL的活性的分子是有用的。已經(jīng)鑒定出 幾種因子，它們對絕經(jīng)后和老年骨質(zhì)疏松有作用。它們包括伴隨老化和歸于鈣和其他礦物質(zhì)降低的腸吸收的不適當鈣消耗的激素水平的改變。一些治療包括激素治療法或為了延遲該過程的飲食補充。最近，抗吸收劑例如雙磷酸鹽和選擇性雌激素受體修飾劑(SERMs)用于防止和治療減少的骨量。因此，將那些治療與能調(diào)節(jié)OPGL活性的分子結合在治療某些骨質(zhì)稀少疾病中是有用的。發(fā)明內(nèi)容
在一些實施方案中，本發(fā)明提供一種抗體，包括重鏈和輕鏈，其中重鏈包括SEQ IDNO:2所示的氨基酸序列或者其片段，輕鏈包括SEQID NO:4所示的氨基酸序列或者其片段。
在一些實施方案中，本發(fā)明提供一種抗體，包括重鏈和輕鏈，其中重鏈含有包括SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列或者其片段的可變區(qū)，其中輕鏈含有包括SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列或者其片段的可變區(qū)。
在一些實施方案中，本發(fā)明提供一種包括重鏈和輕鏈的抗體，其中重鏈包括SEQID NO:2所示的氨基酸序列或者其片段。
在一些實施方案中，本發(fā)明提供一種包括重鏈和輕鏈的抗體，其中重鏈含有包括SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列或者其片段的可變區(qū)。
在一些實施方案中，本發(fā)明提供一種包括重鏈和輕鏈的抗體，其中輕鏈包括SEQID NO:4所示的氨基酸序列或者其片段。
在一些實施方案中，本發(fā)明提供一種包括重鏈和輕鏈的抗體，其中輕鏈含有包括SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列或者其片段的可變區(qū)。
在一些實施方案中，本發(fā)明提供一種包括重鏈和輕鏈的抗體，(a)其中重鏈包括第一可變區(qū)，其中第一可變區(qū)包括與SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列具有至少90%同一性的序列，和(b)其中輕鏈包括第二可變區(qū)，其中第二可變區(qū)包括與SEQ ID N0:14所示的氨基酸序列具有至少90% 同一性的序列，和(c)其中所述抗體與骨保護素配體(OPGL)相互作用。
在一些實施方案中，第一可變區(qū)包括與SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列具有至少95%同一性的序列，并且第二可變區(qū)包括與SEQ IDNO: 14所示的氨基酸序列具有至少95%同一性的序列。
在一些實施方案中，第一可變區(qū)包括與SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列具有至少99%同一性的序列，并且第二可變區(qū)包括與SEQ IDNO:14所示的氨基酸序列具有至少99%同一'I"生的序列。
在一些實施方案中，本發(fā)明提供了重鏈，包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或者其片段。在一些實施方案中，本發(fā)明提供含有可變區(qū)和恒定區(qū)的重鏈，其中可變區(qū)包括SEQID NO:13所示的氨基酸序列或者其片段。
在一些實施方案中，本發(fā)明提供了輕鏈，包括SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列或者其片段。在一些實施方案中，本發(fā)明提供含有SEQ IDNO:14所示的氨基酸序列或者其片段的輕鏈。
在本發(fā)明的一些實施方案中，提供了單鏈抗體。在本發(fā)明的一些實施方案中，提供了單鏈Fv抗體。在本發(fā)明的一些實施方案中，提供了 Fab抗體。在本發(fā)明的一些實施方案中，提供了 Fab'抗體。在本發(fā)明的一些實施方案中，提供了(Fab' )2抗體。
在一些實施方案中，提供了含有本發(fā)明的抗體的藥物組合物。在一些實施方案中，提供了含有治療有效量的抗OPGL抗體的藥物組合物。在一些實施方案中，藥物組合物含有一種抗OPGL抗體和至少一種選自下組的治療劑:骨形態(tài)發(fā)生因子，轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)，白介素-1(IL-1)抑制劑，IL-lra，Kineret , anakinra, TNF α 抑制劑,可溶 TNFa 受體，EnbreI , etanercept,抗-TNF a 抗體，Remicade ，英夫單抗，D2E7抗體，甲狀旁腺素，甲狀旁腺素類似物，甲狀旁腺素相關蛋白，甲狀旁腺素相關蛋白類似物，前列腺素，雙磷酸鹽，阿侖特羅，氟化物，鈣，非留族抗炎藥(NSAID)，C0X-2抑制劑，Celebrex ，塞來西布，Vioxx ，羅非克西，免疫抑制劑，甲氨喋呤，來氟米特，絲氨酸蛋白酶抑制劑，分泌性白細胞蛋白酶抑制劑(SLPI)，IL-6抑制劑，抗IL-6抗體，IL-8抑制劑，抗IL-8抗體，IL-18抑制劑，IL-18結合蛋白，抗IL-18抗體，白介素-1轉(zhuǎn)化酶(ICE)調(diào)節(jié)劑，成纖維細胞生長因子(FGF)，F(xiàn)GF調(diào)節(jié)劑，PAF拮抗劑，角質(zhì)細胞生長因子(KGF)，KGF-相關分子，KGF調(diào)節(jié)劑；基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)調(diào)節(jié)劑，一氧化氮合酶(NOS)調(diào)節(jié)劑，糖皮質(zhì)激素受體調(diào)節(jié)劑，谷氨酸受體調(diào)節(jié)劑，脂多糖(LPS)水平調(diào)節(jié)劑，去甲腎上腺素，去甲腎上腺素模擬物，和去甲腎上腺素調(diào)節(jié)劑。在本發(fā)明的一些實施方案中，提供了治療骨質(zhì)稀少疾病的方法，包括施用藥學有效量的抗體。在一些實施方案中，提供了治療骨質(zhì)稀少疾病的方法，包括施用藥物組合物。在一些實施方案中，提供了治療患者中的伴隨骨損失的炎癥狀況的方法，包括施用藥物組合物。在一些實施方案中，提供了治療患者中的伴隨骨損失的自身免疫疾病的方法，包括施用藥物組合物。在一些實施方案中，提供了治療患者中的類風濕性關節(jié)炎的方法，包括施用本發(fā)明的藥物組合物。在本發(fā)明的實施方案中 ，提供了檢測生物樣品中OPGL水平的方法，包括使樣品接觸抗體。


圖1表示編碼a 0PGL-1抗體重鏈的cDNA序列(SEQ ID NO:1)。具體描述了在HindIII位點起始到SalI位點的重鏈表達質(zhì)粒的DNA序列，起始密碼子在ntl4開始，終止密碼子在ntl415開始.
圖2表示a 0PGL-1抗體重鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。其中，IgG2信號肽是加下劃線的，可變區(qū)是大寫字母但沒有下劃線，恒定區(qū)是小寫字母.
圖3表示編碼a 0PGL-1抗體輕鏈的cDNA序列(SEQ ID NO:3)。具體描述了從XbaI位點到Sal I位點的K鏈表達質(zhì)粒序列的DNA序列.起始密碼子在ntl2開始；終止密碼子在nt717開始.
圖4表示a 0PGL-1抗體輕鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)。其中，K信號肽是加下劃線的，可變區(qū)是大寫字母但沒有下劃線的，恒定區(qū)是小寫字母.
圖5表示a 0PGL-1 κ輕鏈表達質(zhì)粒a 0PGL-1- κ /pDSRal9的示意圖。圖6 表示 a OPGL-11 gG2 重鏈表達質(zhì)粒，a 0PGL_l_IgG2/pDSRal9 的示意圖。圖7表示a 0PGL-1與OPGL-包被的EIA板的劑量-依賴性結合。a 0PGL-1以劑量依賴方式與包被在EIA板上的可溶性OPG配體結合。
測量方法是:
用重組可溶性OPGL包被96-孔EIA板.向孔中加入不同濃度的a 0PGL-1并且室溫下溫育大約2小時.用山羊抗-人IgG(Fab')-辣根過氧化物酶檢測結合的抗體.讀取450nm和650nm處的吸光度。
圖8表示a 0PGL-1與膜-結合的OPGL的特異性結合。
a 0PGL-1以劑量依賴方式與轉(zhuǎn)染的CHO REN218-9細胞的細胞表面上表達的OPGL結合.這種結合與外源加入的人OPGL競爭但不與TNF-a，TNF-β，TRAIL或⑶40配體競爭.用各種濃度的可溶性OPGL或其它配體預先溫育a 0PGL-1 (100ng/ml)，然后用表面上表達OPGL的CHO REN218-9細胞溫育.細胞然后在2_8°C下用FITC-標記F(ab' )2山羊抗-人IgG，F(xiàn)cr片段特異性溫育30分鐘.離心并洗滌細胞表面之后，利用流式細胞術測定.
圖9表示可溶性OPGL對a OPGL-1結合OPGL-包被的EIA板的抑制作用。外源加入的可溶性OPGL競爭性減少a OPGL-1與EIA板上的OPGL結合。
圖10表示a OPGL-1與OPGL-包被的EIA板的特異性結合。
a OPGL-1 不結合 TNF 家族成員 TNF a，TNF β，TRAIL 或 CD40 配體。
外源加入的TNF- a，TNF- β，TRAIL或CD40配體不減少a OPGL-1與EIA板上的OPGL結合.
圖11表示aOPGL-Ι對破骨細胞形成的劑量-依賴性抑制作用。具體顯示a OPGL-1對未加工264.7細胞中OPG配體誘導的TRAP活性的劑量依賴性抑制作用。
圖12表示a OPGL-1對OPGL結合ODAR的劑量-依賴性抑制作用。具體顯示a OPGL-1對銪-標記OPG配體結合0PAR-FLAG/抗-FLAG-APC的劑量依賴性抑制作用。
圖13表示對獼猴施用單劑量a OPGL-1之后的平均血清濃度時間曲線。具體顯示:
以0.1，I 和 10.0mg/kgIV(n = 2/ 劑)和 1.0mg/kgSC(n = 6/ 劑)的劑量對獼猴單劑量施用a OPGL-1之后平均(土SD)血清-濃度時間曲線。
圖14表示對獼猴施用單劑量a OPGL-1之后血清中N-Tx濃度的平均變化百分率。具體顯示:
以0.1，I和10.0mg/kg劑量對獼猴單劑量IV (η = 2/劑)或
SC (η = 6)施用a OPGL-1之后血清N-TX濃度中平均(土SD)變化百分比。
圖15表示對·獼猴施用單劑量a OPGL-1之后尿液中N-Tx濃度的平均變化百分率。具體顯示:
以0.1，I和10.0mg/kg劑量對獼猴單劑量IV (η = 2/劑)或
SC (η = 6)施用a OPGL-1之后尿液中N-TX濃度平均(土 SD)變化百分比。
圖16表示對獼猴施用單劑量a OPGL-1之后抗體陽性和陰性血清-濃度時間曲線。具體顯示:
以0.lmg/kg劑量對獼猴IV施用單劑量a OPGL-1
之后抗體陽性(空心符號)和陰性(實心符號)動物血清-濃度時間曲線。
圖17表示a OPGL-1抗體重鏈可變區(qū)的氨基酸序列(SEQ ID NO:13)。
圖18表示a OPGL-1抗體輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列(SEQ ID NO:13)。
圖19表示生產(chǎn)a OPGL-1的細胞培養(yǎng)方法。圖20表示對獼猴施用單劑量a 0PGL-1之后從基線的平均血清鈣變化百分率。圖21表示對獼猴施用單劑量a 0PGL-1之后從基線的平均血清堿性磷酸酶變化百分率。
具體實施例方式這里使用的標題是為了組織的目的而不應理解為限制描述的主題。本申請中引述的所有的參考文獻特別在此為了任何目的引作參考。定義標準技術可以用于重組DNA，寡核苷酸合成，和組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化(例如電穿孔，脂轉(zhuǎn)染)。根據(jù)廠商說明或者本領域常規(guī)技術或者根據(jù)這里的描述，可以實施酶促反應和純化技術。根據(jù)本領域公知的常規(guī)方法和根據(jù)本說明書中引述和討論的各個一般性和更具體的參考文獻中的描述，一般可以實施上述技術和方法。參見，例如，SambiOOk等，分子克隆:實驗手冊(第二版，冷泉港實驗出版社，冷泉港，紐約(1989))，其在這里為了任何目的引作參考。除了指出具體定義，使用的相關的術語，這里描述的分析化學，合成有機化學，和醫(yī)學和藥物化學額實驗方法和技術是本領域公知的和通用的。標準技術可以用于化學合成，化學分析，藥物制備，配方和送遞，和對患者的治療。根據(jù)本發(fā)明公開中使用的，下面的術語，除非另有說明，應該理解為具有下面的定乂:這里使用的術語“分離 的多核苷酸”應該指基因組多核苷酸，cDNA，或合成來源的或者它們的組合，根據(jù)其來源，“分離的多核苷酸”(I)與“分離的多核苷酸”是在自然界發(fā)現(xiàn)的多核苷酸的全部或部分沒有締合，(2)與不與自然界中的相連的多核苷酸連接，或(3)作為較大序列的部分，自然界中不存在。術語“分離的蛋白質(zhì)”在這里指cDNA，重組RNA，或合成來源的或者它們的組合編碼的蛋白質(zhì)，其(I)沒有正常發(fā)現(xiàn)的至少一些蛋白質(zhì)，(2)基本上沒有相同來源例如來自相同物種的其他蛋白質(zhì)，(3)由來自不同物種的細胞表達，或(4)自然界中不存在。這里使用的術語“多肽”作為遺傳術語指天然蛋白質(zhì)，或者具有天然序列的一個或多個氨基酸缺失，添加和/或取代的序列。術語“多肽”還包括a 0PGL-1 (如下所述，SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:4)，或a 0PGL-1的一個或多個氨基酸缺失，添加和/或取代的序列。根據(jù)一些實施方案，本發(fā)明包括圖2表示的人重鏈免疫球蛋白分子(SEQ ID NO:2)和圖4表示的人輕鏈免疫球蛋白分子(SEQ ID NO:4)或者其片段或類似物。這里使用的對于一種物質(zhì)使用的術語“天然存在的”指物質(zhì)能在自然界中發(fā)現(xiàn)的事實。例如，能從自然界來源中分離的并且人們在實驗中或者其他情況下還沒有意向改變的生物體(包括病毒)中存在的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。這里使用的術語“可操作性連接”指允許它們以它們想要的方式發(fā)揮功能的關系中的成分。例如，與編碼序列“可操作性連接”的調(diào)控序列以在與調(diào)控序列相容的條件下實現(xiàn)編碼序列的表達的方式連接。這里使用的術語“調(diào)控序列”指可以使它們連接的編碼序列表達和加工的多核苷酸序列。這樣的調(diào)控序列的性質(zhì)根據(jù)宿主生物而不同。根據(jù)一些實施方案,原核生物的調(diào)控序列可以包括啟動子，核糖體結合位點，和轉(zhuǎn)錄終止序列。根據(jù)一些實施方案，真核生物的調(diào)控序列可以包括啟動子和轉(zhuǎn)錄終止序列。在一些實施方案中，“調(diào)控序列”可以包括前導序列和/或融合配偶體序列。
這里提到的術語“多核苷酸”意思是長度至少10個堿基的核苷酸的多聚體形式。在一些實施方案中，堿基可以是核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸或這兩種類型核苷酸的修飾形式。該術語包括單鏈和雙鏈形式的DNA。
這里提到的術語“寡核苷酸”包括天然存在的，和由天然存在的和/或非天然存在的寡核苷酸鍵連接在一起的修飾的核苷酸。寡核苷酸是一般包括200個堿基或更短長度的多核苷酸子集。在一些實施方案中，寡核苷酸長度是10-60個堿基。在一些實施方案中，寡核苷酸長度是12，13，14，15，16，17，18，19或20-40個堿基。寡核苷酸可以是單鏈或雙鏈的，例如用于構建基因突變體。本發(fā)明的寡核苷酸可以是有義或反義寡核苷酸。
術語“天然存在的核苷酸”包括脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。術語“修飾的核苷酸”包括帶有被修飾或被取代糖基等的核苷酸。術語“寡核苷酸鍵”包括如硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，硒代磷酸酯，二硒代磷酸酯，phosphoroani lothioate, phosphoroani Iadate,氨基磷酸酯等這樣的寡核苷酸鍵。參見，例如LaPlanche等，Nucl.Acids Res.14:9081(1986) ；Stec 等，J.Am.Chem.Soc.106:6077(1984) ；Stein 等，Nucl.Acids Res.16:3209(1988) ;Zon 等，Ant1-Cancer Drug Design6:539 (1991) ;Zon 等，Oligonucleotidesand Analogues:A Practical Approach, pp87_108(F.Eckstein, Ed., Oxford UniversityPress, Oxford England(1991)) ；Stec 等，美國專利 N0.5151510 ；Uhlmann and PeymanChemical Reviews90:543 (1990)，這些文獻的公開內(nèi)容為任何目的在此引作參考。寡核苷酸可以包括檢測標記。
通過公知的方法容易計算相關多肽的同一性和相似性。這樣的方法包括但不限于下面文獻中描述的那些:
Computational Molecular Biology, Lesk, A.M.,編著，Oxford UniversityPress, New York(1988) ;Biocomputing:1nformatics 和 Genome Projects, Smith,D.W.,編著，Academic Press, New York (1993) ；Computer Analysis of Sequence Data,Part I, Griffin, A.M.,和 Griffin, H.G.,編著，Humana Press, New Jersey (1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press (1987)；Sequence Analysis Primer, Gribskov, M.和 Devereux, J.,編著，M.Stockton Press, NewYork (1991);和 Carillo 等，SIAM J.Applied Math.，48:1073 (1988)。
設計測定同一性的優(yōu)選方法，所示分析的序列之間最大匹配性。在公眾能得到的計算機程序中描述了測定同一性的方法。測定兩個序列之間的同一性的優(yōu)選的計算機程序方法包括但不限于GCG程序包，包括GAP (Devereux等，Nucl.Acids Res.12:387 (1984)；Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI, BLASTP, BLASTN,和FASTA (Altschul 等，J.Mol.Biol.,215:403-410 (1990))。BLASTX 程序公眾能從生物技術信息國家中心(NCBI)和其他來源獲得(BLAST Manual ,Altschul 等，NCB/NLM/NIH Bethesda,MD20894 ；Altschul等,上文(1990))。公知的SmithWaterman算法也可以用來測定同一性。
一些用于比對兩個氨基酸序列的比對系統(tǒng)可能導致兩個序列只有短的區(qū)域匹配，即使兩個全長序列之間沒有顯著相 關性，這個小的比對的區(qū)可能具有非常高的序列同一性。因此，在一些實施方案中，選擇的比對方法(GAP程序)會導致跨越靶多肽的至少50個連續(xù)氨基酸的比對。例如，使用計算機算法GAP (Genetics Computer Group, University ofWisconsin, Madison, WI),對要測定序列同一'I"生百分比的兩個多肽進行它們各自氨基酸最佳匹配的比對(“匹配跨度”，根據(jù)算法測定)。在一些實施方案中，空位開放罰分(計算為3X平均對角線；“平均對角線”是比較使用的比較矩陣的對角線的平均值；“對角線”是通過特定比較矩陣對各完美氨基酸匹配賦予的分值或數(shù))和空位延伸罰分(其通常是空位開放罰分的1/10倍)，以及比較矩陣例如PAM250或BL0SUM62與算法結合使用。在一些實施方案中，算法也使用標準比較矩陣(有關PAM250比較矩陣,參見Dayhoff等,Atlas of ProteinSequence and Structure, 5 (3) (1978);有關 BL0SUM62 比較矩陣，參見 Henikoff 等，Proc.Natl.Acad.SciUSA,89: 10915-10919(1992))。在一些實施方案中，多肽序列比較的參數(shù)包括如下: 算法:Needleman等，J.Mol.Biol., 48:443-453 (1970)； 比較矩陣:Henikoff等的 BL0SUM62，上文(1992)；空位罰分:12空位長度罰分:4相似性閾值:0GAP程序采用上面的參數(shù)是有用的。在一些實施方案中，對于使用GAP算法的多肽比較是默認參數(shù)(對于末端空位沒有罰分)。根據(jù)這里使用的，二十種常見氨基酸和它們的縮寫常規(guī)用法如下。參見Immunology-A Synthesis (第二版，E.S.Golub 和 D.R.Gren,編著，SinauerAssociates,Sunderland,Mass (1991))，在這里為了任何目的引作參考。二十種常見氨基酸，非天然氨基酸例如α-，α-二取代氨基酸，N-烷基氨基酸，乳酸，和其他不是常見的氨基酸的立體異構體(例如D-氨基酸)也可以是本發(fā)明多肽的合適的成分。不是常見的氨基酸的例子包括:4-羥基脯氨酸，Y -羧基谷氨酸，ε -N, N, N-三甲基賴氨酸，ε -N-乙酰基賴氨酸，O-磷酸絲氨酸，N-乙酰基絲氨酸，N-甲酰基甲硫氨酸，3-甲基組氨酸，5-羥基賴氨酸，σ -N-甲基精氨酸，和其他類似氨基酸和亞氨基酸(例如4-羥基脯氨酸)。根據(jù)標準用法和習慣，在這里使用的多肽符號中，左手方向是氨基末端方向，右手方向是羧基末端方向。類似地，除非另外具體說明，單鏈多核苷酸序列的左手末端是5’端；雙鏈多核苷酸序列的左手方向稱作5’方向。新生的RNA轉(zhuǎn)錄物5’至3’添加的方向稱作轉(zhuǎn)錄方向；具有和RNA —樣的序列并且是RNA轉(zhuǎn)錄物的5’至5’端的DNA鏈上的序列區(qū)稱作“上游序列”;具有和RNA —樣的序列并且是RNA轉(zhuǎn)錄物的3’至3’端的DNA鏈上的序列區(qū)稱作“下游序列”。保守氨基酸取代可以包括非天然存在的氨基酸殘基，其一般通過化學肽合成插入而不是通過生物系統(tǒng)合成插入。這些包括肽模擬物和氨基酸部分的其他反向或倒置形式。根據(jù)共同側鏈性質(zhì)可以將天然存在的殘基分為幾類:I)疏水性:正亮氨酸，Met, Ala, Val, Leu, He ；2)中性親水性:Cys, Ser, Thr, Asn, Gln ；3)酸性:Asp, Glu ；
4)堿性:His, Lys, Arg ；
5)影響鏈取向的殘基:Gly，Pro ;和
6)芳香的:Trp, Tyr, Phe。
例如，非保守性取代可以包括用這些類中的一個的成員交換另一類的成員?？梢詫⑦@樣的取代的殘基導入與非人抗體同源的人抗體的區(qū)中，或者到該分子的非同源區(qū)中。
根據(jù)一些實施方案，進行這樣的變化，要考慮氨基酸的親水指數(shù)。以疏水性和電荷特征為基礎對每一個氨基酸標定親水指數(shù)。它們是:異亮氨酸(+4.5);纈氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8);苯丙氨酸(+2.8);半胱氨酸/胱氨酸(+2.5);甲硫氨酸(+1.9);丙氨酸(+1.8);甘氨酸(-0.4);蘇氨酸(-0.7);絲氨酸(-0.8);色氨酸(-0.9);酪氨酸(-1.3);脯氨酸(-1.6);組氨酸(-3.2);谷氨酸(-3.5);谷氨酰胺(-3.5);天冬氨酸(-3.5);天冬酰胺(-3.5);賴氨酸(-3.9);和精氨酸(-4.5) ο
氨基酸親水指數(shù)在對蛋白質(zhì)賦予相互作用生物學功能中的重要性在本領域是公知的。Kyte等，J.Mol.Biol.157:105-131 (1982)。已知一些氨基酸可以取代具有相似親水性指數(shù)或分數(shù)而且仍然保留相似的生物學活性的其他氨基酸。以親水指數(shù)為基礎進行改變，在一些實施方案中，包括其親水指數(shù)在±2之內(nèi)的氨基酸的取代。在一些實施方案中，包括其親水指數(shù)在± I之內(nèi)的那些，在一些實施方案中，包括其親水指數(shù)在±0.5之內(nèi)的那些。
本領域還知道，以親水性為基礎可以有效進行相似氨基酸的取代，特別是在這樣產(chǎn)生的生物功能蛋白質(zhì)或肽是為了在免疫實施方案中使用的情況下，如本申請情況下。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)的最大局部平均親水性，根據(jù)其相鄰氨基酸的親水性所支配的，與其免疫原性和抗原性相關，即與蛋白質(zhì)的生物學性質(zhì)相關。
對這些氨基酸殘基標定下面的親水性值:精氨酸(+3.0);賴氨酸(+3.0);天冬氨酸(+3.0±1);谷氨酸(+3.0±1);絲氨酸(+0.3);天冬酰胺(+0.2);谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(O);蘇氨酸(-0.4);脯氨酸(_0.5±1);丙氨酸(-0.5);組氨酸(-0.5);半胱氨酸(-1.0);甲硫氨酸(-1.3);纈氨酸(-1.5);亮氨酸(-1.8);異亮氨酸(-1.8);酪氨酸(-2.3);苯丙氨酸(-2.5);和色氨酸(-3.4)。以相似親水值為基礎進行改變，在一些實施方案中，包括其親水指數(shù)在±2之內(nèi)的氨基酸的取代，在一些實施方案中，包括其親水指數(shù)在±1之內(nèi)的那些，在一些實施方案中，包括其親水指數(shù)在±0.5之內(nèi)的那些。人們根據(jù)親水性還可以從一級氨基酸序 列鑒定表位。這些區(qū)也稱作“表位核心區(qū)”。
表I所示例示的氨基酸取代作用。
表1:氨基酸取代作用
權利要求
1.一種抗體，包括重鏈和輕鏈，其中: a)重鏈包括SEQID NO:13的氨基酸序列所示的可變區(qū)；并且 b)輕鏈包括SEQID NO:14的氨基酸序列所示的可變區(qū)；并且 其中所述抗體與骨保護素配體(OPGL)相互作用。
2.權利要求1的抗體，其包括重鏈，所述重鏈包括SEQID NO:2的從殘基20到殘基467的氨基酸序列。
3.權利要求1的抗體，其包括重鏈，所述重鏈由SEQID NO:2的從殘基20到殘基467的氨基酸序列組成。
4.權利要求1-3中任一項的抗體，其包括輕鏈，所述輕鏈包括SEQID NO:4的從殘基21到殘基235的氨基酸序列。
5.權利要求1-3中任一項的抗體，其包括輕鏈，所述輕鏈由SEQID NO:4的從殘基21到殘基235的氨基酸序列組成。
6.權利要求1的抗體，其包括重鏈和輕鏈，其中所述重鏈包括SEQID NO:2的從殘基20到殘基467的氨基酸序列，并且其中所述輕鏈包括SEQ ID NO:4的從殘基21到殘基235的氨基酸序列。
7.權利要求1的抗體，其包括重鏈和輕鏈，其中所述重鏈由SEQID NO:2的從殘基20到殘基467的氨基酸序列組成，并且其中所述輕鏈由SEQ ID NO:4的從殘基21到殘基235的氨基酸序列組成。
8.一種分離的抗體，其通過培養(yǎng)包含第一多核苷酸和第二多核苷酸的哺乳動物宿主細胞產(chǎn)生，其中所述第一多核苷酸編碼重鏈并且第二多核苷酸編碼輕鏈，其中: a)所述重鏈包括SEQID NO:13的氨基酸序列所示的可變區(qū)；并且 b)所述輕鏈包括SEQID NO:14的氨基酸序列所示的可變區(qū)；并且 其中所述抗體結合骨保護素配體(OPGL)并且抑制OPGL與破骨細胞分化和激活受體(ODAR)的結合。
9.權利要求8的抗體，其中第一多核苷酸編碼包括SEQID NO:2的氨基酸序列的重鏈，第二多核苷酸編碼包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列的輕鏈。
10.權利要求8的抗體，其中第一多核苷酸編碼由SEQID NO:2的氨基酸序列組成的重鏈，第二多核苷酸編碼·由SEQ ID NO:4的氨基酸序列組成的輕鏈。
11.權利要求8的抗體，其中第一多核苷酸編碼包括SEQID NO:2的從殘基20到殘基467的氨基酸序列的重鏈，并且其中第二多核苷酸編碼包括SEQ ID NO:4的從殘基21到殘基235的氨基酸序列的輕鏈。
12.權利要求11的抗體，其中第一多核苷酸編碼由SEQID NO:2的從殘基20到殘基467的氨基酸序列組成的重鏈，并且其中第二多核苷酸編碼由SEQ ID NO:4的從殘基21到殘基235的氨基酸序列組成的輕鏈。
13.權利要求8-12中任一項的抗體，其中所述第一和第二多核苷酸是分開的核酸分子的部分。
14.一種抗體，包括重鏈和輕鏈， (a)其中所述重鏈包括與SEQ ID NO: 13所示的氨基酸序列具有至少90%同一性的第一可變區(qū)；并且(b)其中所述輕鏈包括與SEQ ID NO: 14所示的氨基酸序列具有至少90%同一性的第二可變區(qū)；并且 其中所述重鏈包括SEQ ID NO: 13的三個⑶Rs，并且其中所述輕鏈包括SEQ ID NO: 14的三個CDRs，并且其中所述抗體結合人骨保護素配體(OPGL)并且抑制OPGL與破骨細胞分化和激活受體(ODAR)的結合。
15.權利要求14的抗體，其中所述第一可變區(qū)與SEQID NO: 13所示的氨基酸序列具有至少95%同一性，并且其中第二可變區(qū)與SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列具有至少95%同一I"生。
16.權利要求14的抗體，其中所述第一可變區(qū)與SEQID NO:13所示的氨基酸序列具有至少99%同一性，并且其中第二可變區(qū)與SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列具有至少99%同一I"生。
17.一種抗體，包括重鏈和輕鏈， (a)其中所述重鏈 包括具有一個氨基酸缺失、添加和/或取代的SEQID N0:2的可變區(qū)和恒定區(qū)；其中所述輕鏈包括具有一個氨基酸缺失、添加和/或取代的SEQ ID N0:4的可變區(qū)和恒定區(qū)；或 (b)其中所述重鏈包括具有一個氨基酸缺失、添加和/或取代的SEQID N0:2的可變區(qū)和恒定區(qū)；其中所述輕鏈包括SEQ ID N0:4的可變區(qū)和恒定區(qū)； 其中所述重鏈包括SEQ ID NO: 2的三個⑶Rs，并且其中所述輕鏈包括SEQ ID NO:4的三個CDRs，并且其中所述抗體結合人骨保護素配體(OPGL)并且抑制OPGL與破骨細胞分化和激活受體(ODAR)的結合。
18.權利要求17的抗體，其中所述重鏈包括具有一個氨基酸缺失、添加和/或取代的SEQ ID NO: 2的可變區(qū)和恒定區(qū)；并且其中所述輕鏈包括具有一個氨基酸缺失、添加和/或取代的SEQ ID N0:4的可變區(qū)和恒定區(qū)。
19.權利要求18的抗體，其中所述重鏈包括具有一個羧基末端氨基酸缺失的SEQIDNO:2的可變區(qū)和恒定區(qū)；并且其中所述輕鏈包括具有一個羧基末端氨基酸缺失的SEQ IDNO:4的可變區(qū)和恒定區(qū)。
20.權利要求17的抗體，其中所述重鏈包括具有一個氨基酸缺失、添加和/或取代的SEQ ID NO:2的可變區(qū)和恒定區(qū)；并且其中所述輕鏈包括SEQ ID N0:4的可變區(qū)和恒定區(qū)。
21.權利要求20的抗體，其中所述重鏈包括具有一個羧基末端氨基酸缺失的SEQIDNO:2的可變區(qū)和恒定區(qū)。
22.權利要求1、2、4、6、9-12和14-21中任一項的抗體，其中所述重鏈和所述輕鏈來自單鏈抗體。
23.權利要求22的抗體，其是單鏈Fv抗體。
24.權利要求1、2、4、6、9-12和14-21中任一項的抗體，其中所述抗體是Fab、Fab’或(Fab，) 2。
25.權利要求1-21中任一項的抗體，其是完全的人抗體。
26.權利要求1-7中任一項的抗體，其中所述抗體抑制骨保護素配體(OPGL)與破骨細胞分化和激活受體(ODAR)的結合。
27.含有權利要求1一 26中任一項的抗體的藥物組合物。
28.—種體外檢測生物樣品中骨保護素配體(OPGL)水平的方法，包括使樣品接觸權利要求1-26中任一項的抗體。
29.權利要求1-26中任一項的抗體或權利要求27的藥物組合物在制備用于治療患者中的骨損失的藥物中的用途。
30.權利要求1-26中任一項的抗體或權利要求27的藥物組合物在治療患者中的骨損失中的用途。
31.權利要求29或權利要求30的用途，其中所述骨損失與選自下組的至少一種狀況相關:骨質(zhì)疏松癥、佩吉特氏病、骨髓炎、高鈣血癥、骨質(zhì)稀少、骨壞死、炎癥狀況、自身免疫狀況、類風濕性關節(jié)炎和癌癥。
32.權利要求31的用途，其中所述癌癥選自乳房癌、前列腺癌、甲狀腺癌、腎癌、肺癌、食道癌、直腸癌、膀胱癌、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、胃腸道癌、多發(fā)性骨髓瘤、淋巴瘤和何杰金氏病。
33.權利要求1-26中任一項的抗體或權利要求27的藥物組合物在制備用于與放療和化療中的至少一種一起施用從而用于治療與癌癥相關的骨損失的藥物中的用途。
34.權利要求1-26中任一項的抗體或權利要求27的藥物組合物在與放療和化療中的至少一種一起施用從而用于治療與癌癥相關的骨損失中的用途。
35.權利要求33或34的用途，其中所述化療涉及用至少一種選自蒽環(huán)霉素，紫杉醇，他莫西芬，阿霉素，5-氟尿嘧啶和黃體激素釋放激素(LHRH)拮抗劑的藥劑治療。
36.權利要求33-35中任一項的用途，其中所述癌癥選自乳房癌、前列腺癌、甲狀腺癌、腎癌、肺癌、食道癌、直腸癌、膀胱癌、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、胃腸道癌、多發(fā)性骨髓瘤、淋巴瘤和何杰金氏病。
37.一種分離的組合物，其包含第一多核苷酸和第二多核苷酸，其中所述第一多核苷酸編碼重鏈并且第二多核苷酸編碼輕鏈，并且其中第一和第二多核苷酸編碼權利要求1-26中任一項的抗體。
38.權利要求37的組合物，其中第一多核苷酸編碼包括SEQID N0:13的氨基酸序列的重鏈，第二多核苷酸編碼包括SEQ ID NO: 14的氨基酸序列的輕鏈。
39.權利要求37的組合物，其中第一多核苷酸編碼包括SEQID NO:2的氨基酸序列的重鏈，第二多核苷酸編碼包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列的輕鏈。
40.權利要求37的組 合物，其中第一多核苷酸編碼由SEQID NO:2的氨基酸序列組成的重鏈，第二多核苷酸編碼由SEQ ID NO:4的氨基酸序列組成的輕鏈。
41.權利要求37的組合物，其中第一多核苷酸編碼包括SEQID NO:2的從殘基20到殘基467的氨基酸序列的重鏈，第二多核苷酸編碼包括SEQ ID NO:4的從殘基21到殘基235的氨基酸序列的輕鏈。
42.權利要求37的組合物，其中第一多核苷酸編碼由SEQID NO:2的從殘基20到殘基467的氨基酸序列組成的重鏈，第二多核苷酸編碼由SEQ ID NO:4的從殘基21到殘基235的氨基酸序列組成的輕鏈。
43.權利要求37的組合物，其中第一多核苷酸包括SEQID NO:1的核苷酸序列，第二多核苷酸包括SEQ ID NO:3的核苷酸序列。
44.權利要求37-43的任一項的組合物，其中所述第一和第二多核苷酸是相同核酸分子的部分。
45.權利要求37-43的任一項的組合物，其中所述第一和第二多核苷酸是分開的核酸分子的部分。
46.權利要求44的組合物，其中所述核酸分子是載體。
47.權利要求45的組合物，其中所述第一多核苷酸是第一載體的部分，第二多核苷酸是第二載體的部分。
48.權利要求46的組合物，其中所述載體是病毒載體。
49.權利要求47的組合物，其中第一載體和第二載體中的至少一種是病毒載體。
50.分離的宿主細胞，其包含權利要求37-49的任一項的組合物。
51.權利要求50的宿主細胞，其是原核宿主細胞或真核宿主細胞。
52.權利要求51的宿主細胞，其是哺乳動物宿主細胞。
53.權利要求52的宿主細胞，其中所述宿主細胞選自中國倉鼠卵巢細胞，HeLa細胞，小倉鼠腎細胞，猴腎細胞和人肝細胞癌細胞。
54.制備與骨保護素配體(OPGL)相互作用的抗體的方法，其包括培養(yǎng)權利要求50-53的任一項的宿主細胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及抗OPGL抗體。具體地，本申請描述了與骨保護素配體(OPGL)相互作用的抗體。描述了通過施用藥學有效量的抗OPGL抗體治療骨質(zhì)稀少疾病的方法。描述了使用抗OPGL抗體檢測樣品中OPGL量的方法。
文檔編號A61K31/519GK103232539SQ201310052370
公開日2013年8月7日 申請日期2002年6月25日 優(yōu)先權日2001年6月26日
發(fā)明者W.J.博伊爾, F.H.馬丁, J.R.科爾瓦蘭, G.C.達維斯 申請人:安姆根弗里蒙特公司, 安姆根有限公司