含有可從機(jī)體組織中分離的ssea-3陽性的多能干細(xì)胞的同種異體移植用細(xì)胞治療用組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明的目的在于提供含有多能干細(xì)胞的同種異體移植用細(xì)胞治療用組合物，該同種異體移植用細(xì)胞治療用組合物含有可從機(jī)體組織分離的、SSEA-3陽性、不表達(dá)HLAII類抗原的多能干細(xì)胞。
【專利說明】含有可從機(jī)體組織中分離的SSEA-3陽性的多能干細(xì)胞的同種異體移植用細(xì)胞治療用組合物
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及含有機(jī)體組織來源的SSEA-3陽性的多能干細(xì)胞的同種異體移植用細(xì)胞治療用組合物。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來，可貢獻(xiàn)于組織再生的成人干細(xì)胞或組織干細(xì)胞受到關(guān)注。
[0003]作為由成體得到的具有分化能的細(xì)胞，有人報(bào)道了例如通過施加分化誘導(dǎo)得到的具有分化為骨、軟骨、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、骨骼肌等各種細(xì)胞的分化能的骨髓間充質(zhì)細(xì)胞部分(MSC:骨髓基質(zhì)細(xì)胞(Bone marrow stromal cell))(參照非專利文獻(xiàn)I和2)。但是，骨髓間充質(zhì)細(xì)胞部分是含有多個(gè)細(xì)胞種類的細(xì)胞群，施加誘導(dǎo)時(shí)的分化效率并不高?？梢酝茰yMSC中的一部分細(xì)胞承擔(dān)分化，但上述細(xì)胞本身尚不明確，這成為人們長時(shí)間討論的課題。另外，為了分化為特定的細(xì)胞，必須進(jìn)行特定化合物的刺激或基因?qū)氲?，必須?gòu)建分化誘導(dǎo)系統(tǒng)。
[0004]作為成體來源的多能干細(xì)胞，更有人報(bào)道了由體細(xì)胞人工制作的iPS細(xì)胞(誘導(dǎo)多能干細(xì)胞)(參照專利文獻(xiàn)1、專利文獻(xiàn)2、非專利文獻(xiàn)3等)。但是，iPS細(xì)胞的建立必須對作為間充質(zhì)細(xì)胞的皮膚成纖維細(xì)胞部分進(jìn)行使用特定物質(zhì)的誘導(dǎo)操作，將特定的基因或特定的化合物導(dǎo)入體細(xì)胞。
[0005]還有人報(bào)道了可由機(jī)體組織分離的階段特異性胚胎抗原-3 (SSEA-3)陽性多能干細(xì)胞，它是目前尚未了解的機(jī)體來源的干細(xì)胞(參照專利文獻(xiàn)3和非專利文獻(xiàn)4等)。
[0006]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)`
專利文獻(xiàn)1:日本特許第4183742號公報(bào)
專利文獻(xiàn)2:日本特開2008-307007號公報(bào)
專利文獻(xiàn)3:國際公開第W02011/007900號國際公開小冊子
非專利文獻(xiàn) 1:M.DEZAWA等人.，The Journal of Clinical Investigation, 113, 12,1701-1710 頁(2004)
非專利文獻(xiàn) 2:M.DEZAWA等人.，SCIENCE, 2005 July 8, 309, 314-317頁，(2005)非專利文獻(xiàn) 3:0kita K.等人.，SCIENCE, 2008 年11月7 日，322(5903)，949-953
頁
非專利文獻(xiàn) 4:Proc.Natl.Acad.Sci USA, 107(19):8639-43, 2010。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于提供含有SSEA-3陽性、不表達(dá)HLA II類抗原的多能干細(xì)胞的同種異體移植用細(xì)胞治療用組合物。
[0008]本發(fā)明人由皮膚或骨髓、以及皮膚成纖維細(xì)胞或骨髓間充質(zhì)細(xì)胞分離了一種SSEA-3陽性、且具有以往干細(xì)胞中未見到的抗原表達(dá)概況的干細(xì)胞，命名為Muse細(xì)胞(多譜系分化應(yīng)激持久細(xì)胞)(國際公開第W02011/007900號國際公開小冊子；Proc.Natl.Acad.Sci USA, 107(19):8639-43, 2010)。
[0009]本發(fā)明人等對所得Muse細(xì)胞的特性進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn):該細(xì)胞表達(dá)HLA抗原中的I類抗原，但并不表達(dá)II類抗原，并認(rèn)為在進(jìn)行同種異體移植時(shí)，即使不結(jié)合使用免疫抑制劑也可能不被排斥，進(jìn)行了深入的研究。
[0010]其結(jié)果發(fā)現(xiàn):可將Muse細(xì)胞用于同種異體移植，從而完成了本發(fā)明的含有Muse細(xì)胞的同種異體移植用細(xì)胞治療用組合物。
[0011]S卩，本發(fā)明如下所述。
[0012][I]同種異體移植用細(xì)胞治療用組合物，該組合物含有可從機(jī)體組織分離、具有以下(i)-(iv)的所有性質(zhì)、SSEA-3陽性、不表達(dá)HLA II類抗原的多能干細(xì)胞:
(i)端粒酶活性低或沒有；
(?)具有分化為三胚層中任意胚層的細(xì)胞的能力；
(iii)不顯示腫瘤性增殖；以及
(iv)具有自我復(fù)制能力(自我更新能力)。
[0013][2] [I]的同種異體移植用細(xì)胞治療用組合物，其中，多能干細(xì)胞可抑制由單核細(xì)胞向樹突細(xì)胞的誘導(dǎo)以及T細(xì)胞的活化。
[0014][3] [I]或[2]的同種異體移植用細(xì)胞治療用組合物，其中，多能干細(xì)胞為CD105陽
性。
[0015][4] [1]-[3]中任一項(xiàng)的同種異體移植用細(xì)胞治療用組合物，其中，多能干細(xì)胞為CDl 17陰性和CD 146陰性。
[0016][5] [1]-[3]中任一項(xiàng)的同種異體移植用細(xì)胞治療用組合物，其中，多能干細(xì)胞為⑶117陰性、⑶146陰性、NG2陰性、⑶34陰性、vWF陰性和⑶271陰性。
[0017][6] [1]-[3]中任一項(xiàng)的同種異體移植用細(xì)胞治療用組合物，其中，多能干細(xì)胞為CD34陰性、CD117陰性、CD146陰性、CD271陰性、NG2陰性、vWF陰性、SoxlO陰性、Snail陰性、Slug陰性、Tyrpl陰性和Dct陰性。
[0018][7] [1]-[6]中任一項(xiàng)的同種異體移植用細(xì)胞治療用組合物，其中，多能干細(xì)胞為應(yīng)激耐性的。
[0019][8] [1]-[6]中任一項(xiàng)的同種異體移植用細(xì)胞治療用組合物，其中，多能干細(xì)胞的吞曬能力聞。
[0020][9] [1]-[8]中任一項(xiàng)的同種異體移植用細(xì)胞治療用組合物，其中，多能干細(xì)胞來源于間充質(zhì)組織。
[0021][10] [1]-[8]中任一項(xiàng)的同種異體移植用細(xì)胞治療用組合物，其中，多能干細(xì)胞來源于臍帶或脂肪組織。
[0022]本說明書包含作為本申請的優(yōu)先權(quán)基礎(chǔ)的日本國專利申請2011-076643號說明書和/或附圖所記載的內(nèi)容。
[0023]附圖簡述
圖1是表示人骨髓間充質(zhì)細(xì)胞來源的SSEA-3陽性細(xì)胞的HLA I類和HLA II類抗原的表達(dá)的圖。
[0024]圖2是表示人成纖維細(xì)胞來源的SSEA-3陽性細(xì)胞的HLA I類和HLA II類抗原的表達(dá)的圖。
[0025]圖3是表示Muse細(xì)胞和非Muse細(xì)胞中的HLA I類的表達(dá)的圖。
[0026]圖4是表示Muse細(xì)胞和非Muse細(xì)胞中的HLA II類的表達(dá)的圖。
[0027]圖5是表示Muse細(xì)胞和非Muse細(xì)胞中的第二抗體_Alexa568的反應(yīng)性(陰性對照)的圖。
[0028]圖6是表示為了用于淋巴細(xì)胞試驗(yàn)而對采自人外周血的細(xì)胞用FACS進(jìn)行分析的結(jié)果的圖。
[0029]圖7是表示對進(jìn)行了由單核細(xì)胞向單核細(xì)胞來源的樹突細(xì)胞(MoDC)前體細(xì)胞的分化誘導(dǎo)后的細(xì)胞用FACS進(jìn)行分析的結(jié)果的圖。
[0030]圖8是表示Muse細(xì)胞抑制由單核細(xì)胞向單核細(xì)胞來源的樹突細(xì)胞(MoDC)前體細(xì)胞的分化誘導(dǎo)的圖。
[0031]圖9是表示對進(jìn)行了由單核細(xì)胞來源的樹突細(xì)胞(MoDC)前體細(xì)胞向樹突細(xì)胞的分化誘導(dǎo)后的細(xì)胞用FACS進(jìn)行分析的結(jié)果的圖。
[0032]圖10是表示Muse細(xì)胞抑制由單核細(xì)胞來源的樹突細(xì)胞(MoDC)前體細(xì)胞向樹突細(xì)胞的分化誘導(dǎo)的圖。
[0033]實(shí)施發(fā)明的方案 以下詳細(xì)說明本發(fā)明。
[0034]本發(fā)明是含有多能干細(xì)胞的用于同種異體移植的細(xì)胞治療用組合物或細(xì)胞治療劑。
[0035]Muse細(xì)胞是被稱為Muse細(xì)胞的多能干細(xì)胞。本發(fā)明中，提及Muse細(xì)胞時(shí)，也包括細(xì)胞部分，Muse細(xì)胞部分是指以至少一定量含有Muse細(xì)胞的細(xì)胞群。例如，Muse細(xì)胞部分是含有1%以上、10%以上、30%以上、50%以上、70%以上、90%以上或95%以上Muse細(xì)胞的細(xì)胞群，包括由Muse細(xì)胞的培養(yǎng)得到的細(xì)胞團(tuán)或?qū)use細(xì)胞濃縮而成的細(xì)胞群。有時(shí)也將上述Muse細(xì)胞部分稱為實(shí)質(zhì)上均勻的Muse細(xì)胞部分。
[0036]Muse細(xì)胞是可由機(jī)體組織分離的、SSEA-3陽性的多能干細(xì)胞。
[0037]機(jī)體是指哺乳動物的機(jī)體，是指發(fā)育到某種程度的動物體。本發(fā)明中，機(jī)體不包含發(fā)育階段在受精卵或囊胚期之前的胚胎，但包含囊胚期以后的發(fā)育階段的胚胎，包含胎兒和囊胚。哺乳動物不受限定，例如包含人、猴等靈長類，小鼠、大鼠、兔、豚鼠等嚙齒類，貓、狗、綿羊、豬、牛、馬、驢、山羊、雪貂等。由于可由機(jī)體組織直接獲得，Muse細(xì)胞可與胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)和胚胎生殖干細(xì)胞(EG細(xì)胞)明確區(qū)分開來。
[0038]中胚層組織是指在動物的早期發(fā)育過程中表現(xiàn)出的中胚層起源的組織，包含肌肉系統(tǒng)組織、結(jié)締組織、循環(huán)系統(tǒng)組織、排泄系統(tǒng)組織、生殖系統(tǒng)組織等。例如Muse細(xì)胞可由骨髓液或真皮結(jié)締組織等的皮膚組織獲得。
[0039]間充質(zhì)組織是指骨、軟骨、脂肪、血液、骨髓、骨骼肌、真皮、韌帶、肌腱、心臟等組織。例如Muse細(xì)胞可由骨髓或皮膚獲得。還可由臍帶或脂肪干細(xì)胞獲得。
[0040]細(xì)胞可由組織直接獲得，這是指可由組織直接分離，或者可暫時(shí)培養(yǎng)來自這些組織的間充質(zhì)細(xì)胞，再由其中分離，而不經(jīng)過外源基因或外源蛋白的導(dǎo)入或化合物的給予等的化合物處理等人工誘導(dǎo)操作即可獲得。這里，外源基因并沒有限定，例如是指可使體細(xì)胞的核重編程的基因，例如0ct3/4基因等的Oct家族基因、Klf基因等的Klf家族基因、c-Myc基因等的Myc豕族基因、Sox2基因等Sox豕族基因。另外，外源蛋白質(zhì)可舉出這些基因所編碼的蛋白質(zhì)或細(xì)胞因子。此外，化合物例如可舉出:誘導(dǎo)可使上述體細(xì)胞的核重編程的基因表達(dá)的低分子化合物或DMS0、發(fā)揮還原劑功能的化合物、DNA甲基化劑等。由于可由機(jī)體或組織直接獲得，Muse細(xì)胞可與iPS (誘導(dǎo)多能干細(xì)胞)細(xì)胞和ES細(xì)胞明確地區(qū)別開來。本發(fā)明中，人工誘導(dǎo)操作不包含細(xì)胞培養(yǎng)、以細(xì)胞的表面標(biāo)志為指標(biāo)來分離細(xì)胞或細(xì)胞部分、將細(xì)胞暴露于細(xì)胞應(yīng)激、以及對細(xì)胞給予物理性沖擊。Muse細(xì)胞的特征還在于:無需誘導(dǎo)重編程或去分化即可獲得。
[0041]可以認(rèn)為Muse細(xì)胞存在于機(jī)體的中胚層組織或間充質(zhì)組織等中，本發(fā)明中，將存在于這些組織中的細(xì)胞或細(xì)胞部分分離。Muse細(xì)胞例如可能存在于骨髓中，經(jīng)由血液等由骨髓供給到機(jī)體的各組織。因此，可由骨髓或皮膚等機(jī)體的各組織、進(jìn)一步由血液分離。
[0042]多能干細(xì)胞是指具有多能性的細(xì)胞，具有以下特性。
[0043](I)表達(dá) Nanog、0ct3/4、SSEA-3、PAR-4 和 Sox2 等多能性標(biāo)志。
[0044](2)具有由I個(gè)細(xì)胞進(jìn)行增殖、持續(xù)制作自身克隆的克隆性。
[0045](3)具有自我復(fù)制(自我更新)能力。
[0046](4)可體外和體內(nèi)分化成三胚層(內(nèi)胚層、中胚層和外胚層)。
[0047](5)移植到小鼠的睪丸或皮下時(shí)，不形成腫瘤。
[0048](6)堿性磷酸酶染色呈陽性。
[0049]Muse細(xì)胞具有多能性，由此可以與通常已知的神經(jīng)干細(xì)胞或造血干細(xì)胞等成人干細(xì)胞、組織干細(xì)胞明確區(qū)分開來。另外，由于可作為具有多能性的單個(gè)或多個(gè)細(xì)胞分離，Muse細(xì)胞可以與骨髓間充質(zhì)細(xì)胞、脂肪來源的間充質(zhì)細(xì)胞等常規(guī)的間充質(zhì)細(xì)胞部分明確區(qū)分開來。
[0050]此外，Muse細(xì)胞具有以下特性。
[0051](i)增殖速度比較緩慢，分裂周期為I天以上、例如1.2-1.5天。但不顯示ES細(xì)胞或iPS細(xì)胞所顯示的無限增殖。
[0052](ii)移植到免疫缺陷小鼠中時(shí)，顯示形成包含內(nèi)胚層、中胚層和外胚層的要素的畸胎瘤。ES細(xì)胞或iPS細(xì)胞在短期間內(nèi)形成畸胎瘤，與此相比，Muse細(xì)胞的特征是:半年以上也未形成畸胎瘤。
[0053](iii)通過懸浮培養(yǎng)，由I個(gè)細(xì)胞形成Muse來源的胚狀體樣細(xì)胞團(tuán)。
[0054](iv)通過懸浮培養(yǎng)形成胚狀體樣細(xì)胞團(tuán)，10-14天左右增殖停止。之后通過轉(zhuǎn)移至貼壁培養(yǎng)進(jìn)行再增殖。
[0055](V)增殖時(shí)伴隨有不對稱分裂。
[0056](vi)核型正常。
[0057](vii)端粒酶活性沒有或低。這里端粒酶活性沒有或低是指例如使用TRAPEZE XL端粒酶檢測試劑盒(Millipore社)檢測端粒酶活性時(shí)，無法檢測或低。端粒酶活性低例如是指具有與人成纖維細(xì)胞相同程度的端粒酶活性，或者與Hela細(xì)胞相比，具有1/5以下、優(yōu)選1/10以下的端粒酶活性。
[0058](viii)關(guān)于甲基化的狀態(tài)，對于由Muse細(xì)胞誘導(dǎo)的iPS細(xì)胞，Nanog和0ct3/4的啟動子區(qū)域的去甲基化高。
[0059](ix)吞曬能力高。[0060](χ)不顯示腫瘤性增殖。這里，不顯示腫瘤性增殖是指進(jìn)行懸浮培養(yǎng)時(shí)，如果達(dá)到一定大小的細(xì)胞團(tuán)(簇)則增殖停止，不無限增殖。另外即使移植到免疫缺陷小鼠的睪丸中也不形成畸胎瘤。上述(i)-(iv)等也與不顯示腫瘤性增殖有關(guān)。
[0061]S卩，本發(fā)明的細(xì)胞例如是以下的多能干細(xì)胞。
[0062](A)多能干細(xì)胞，該多能干細(xì)胞是由機(jī)體的中胚層組織或間充質(zhì)組織等獲得的細(xì)胞，無需向該細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入化學(xué)物質(zhì)、外源基因或外源蛋白質(zhì)即可直接獲得。
[0063](B)具有上述(I)的特性的多能干細(xì)胞，其中，機(jī)體的中胚層組織或間充質(zhì)組織等選自骨髓、皮膚、血液、臍帶、脂肪等。
[0064](C)上述㈧或⑶的多能干細(xì)胞，其中，無需誘導(dǎo)重編程或去分化即可獲得。
[0065](D)上述㈧或⑶的多能干細(xì)胞，其中，在移植到睪丸中時(shí)，至少半年內(nèi)不形成腫瘤。
[0066](E)上述㈧或⑶的多能干細(xì)胞，其不顯示如ES細(xì)胞、iPS細(xì)胞那樣的無限增殖。
[0067](F)多能干細(xì)胞，其是機(jī)體的中胚層組織或間充質(zhì)組織等來源的多能干細(xì)胞，在對機(jī)體的中胚層組織或間充質(zhì)組織等細(xì)胞用蛋白酶進(jìn)行處理時(shí)存活，對蛋白酶具有抗性。
[0068]Muse細(xì)胞可以利用在Muse細(xì)胞表面大量表達(dá)的細(xì)胞表面標(biāo)志進(jìn)行分離，例如可以以SSEA-3的表達(dá)為指標(biāo)進(jìn)行分離。也將Muse細(xì)胞稱為SSEA-3陽性Muse細(xì)胞。并且Muse細(xì)胞表達(dá)間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志CD105，為SSEA-3陽性，為CD105陽性。因此，可以以SSEA-3和CD105兩者的表達(dá)為指標(biāo)進(jìn)行分離。通過利用這些細(xì)胞表面標(biāo)志，可以將Muse細(xì)胞以單一細(xì)胞的形式分離，可通 過培養(yǎng)使分離的單一細(xì)胞增殖。本發(fā)明也包含可通過與SSEA-3相當(dāng)?shù)臉?biāo)志從人以外的哺乳動物的機(jī)體組織中分離的多能干細(xì)胞。
[0069]另一方面，Muse細(xì)胞是NG2、CD34、vFW(血管假性血友病因子)、c_kit (CD117)、CD146、CD271 (NGFR)陰性。并且是 SoxlO、Snail、Slug、Tyrpl、Dct 陰性。
[0070]NG2、⑶34、vWF、⑶117、⑶146、⑶271等表面抗原是否為陰性、是否弱表達(dá)，是對這些抗原的抗體反應(yīng)，通過使用顯色酶、熒光化合物等標(biāo)記的抗體，顯微鏡觀察細(xì)胞是否染色等來確定。例如使用這些抗體對細(xì)胞進(jìn)行免疫染色，可以確定是否有表面抗原。還可以使用與該抗體結(jié)合的磁性珠來確定。還可以使用FACS或流式細(xì)胞儀，確定是否有表面抗原。流式細(xì)胞儀例如可以使用FACSAria(卜 > 于? > 乂 >社制造)、FACS vantage (夕卜 > 〒W W V >社制造)、FACS CalibuH?夕卜 > 〒D W ” >社制造)、MACS (磁式細(xì)胞分離法)等。
[0071]關(guān)于SoxlO、Snai1、Slug、Tyrpl、Dct等的轉(zhuǎn)錄因子,可以通過RT-PCR等方法研究
其表達(dá)。
[0072]這些表面抗原為陰性，是指在如上所述使用FACS進(jìn)行分析時(shí)，不會以陽性細(xì)胞的形式被分選出，或者通過RT-PCR研究其表達(dá)時(shí)，未見表達(dá)，即使存在無法通過這些方法檢測出的程度的表達(dá)，在本發(fā)明中也視為陰性。另外，雖然上述標(biāo)志為陽性，但是與公知的造血干細(xì)胞等細(xì)胞同時(shí)測定，與這些陽性細(xì)胞比較，如果幾乎未檢出或者表達(dá)量顯著低，則可視為陰性。
[0073]Muse細(xì)胞可以根據(jù)這些細(xì)胞表面的抗原特性進(jìn)行分離。
[0074]如上所述，Muse細(xì)胞可以以SSEA-3陽性為指標(biāo)分離，并且可以以SSEA-3和⑶105的共表達(dá)為指標(biāo)進(jìn)行分離，還可以以選自NG2、⑶34、vWF(血管假性血友病因子)、c-kit (CDl 17)、CD146、CD271 (NGFR)、SoxlO、Snai1、Slug、TyrpI 和 Dct 的 11 個(gè)標(biāo)志中的至少I個(gè)、例如2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)或11個(gè)標(biāo)志的不表達(dá)為指標(biāo)進(jìn)行分離。例如可以以⑶117和⑶146的不表達(dá)為指標(biāo)進(jìn)行分離，還可以進(jìn)一步以⑶117、⑶146、NG2、⑶34、vffF和⑶271的不表達(dá)為指標(biāo)進(jìn)行分離，還可進(jìn)一步以上述11個(gè)標(biāo)志的不表達(dá)為指標(biāo)進(jìn)行分離。
[0075]使用表面標(biāo)志進(jìn)行分離時(shí)，無需經(jīng)過培養(yǎng)等即可以直接由機(jī)體組織分離I個(gè)或多個(gè)的Muse細(xì)胞。另外，除上述標(biāo)志之外，Muse細(xì)胞還有其它特定因子的高表達(dá)的特征。
[0076]通過培養(yǎng)Muse細(xì)胞，可得到Muse細(xì)胞來源的胚狀體(EB)樣細(xì)胞團(tuán)。通過對在Muse細(xì)胞、作為Muse細(xì)胞的來源群的間充質(zhì)細(xì)胞、Muse來源的胚狀體樣細(xì)胞團(tuán)以及人ES細(xì)胞中表達(dá)的因子進(jìn)行比較研究，可以了解在Muse細(xì)胞中高表達(dá)的因子。這里，因子包含基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖。
[0077]在Muse細(xì)胞中，以下的18個(gè)因子高表達(dá)。
[0078](i) SSEA-3
(ii)v-fosFBJ鼠骨肉瘤病毒癌基因同源物
(iii)溶質(zhì)載體家族16，成員6(—元羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白7)
(iv)酪氨酸酶相關(guān)蛋白I
(V)鈣通道，電壓依賴的，P/Q型，a IA亞基
(vi)染色體16開放閱讀框81` (vii)幾丁質(zhì)酶-3樣I(軟骨糖蛋白-39)
(viii)蛋白酶，絲氨酸，35
(ix)犬尿氨酸酶(L-犬尿氨酸水解酶)
(X)溶質(zhì)載體家族16，成員6 (—元羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白7)
(xi)載脂蛋白E
(xii)突觸結(jié)合蛋白樣5
(xiii)幾丁質(zhì)酶-3樣I(軟骨糖蛋白-39)
(xiv)ATP結(jié)合盒，亞家族A(ABCl)，成員13 (XV)血管生成素樣4
(xvi)前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2(前列腺素G/Η合酶和環(huán)氧合酶)
(xvii)司腺I丐蛋白I
(xviii)含卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域的102B
Muse細(xì)胞或多能干細(xì)胞部分的特征是:上述因子的至少2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)、11個(gè)、12個(gè)、13個(gè)、14個(gè)、15個(gè)、16個(gè)、17個(gè)或18個(gè)高表達(dá)，可以以至少2
個(gè)因子高表達(dá)作為指標(biāo)進(jìn)行分離。
[0079]以下的20個(gè)因子中，本發(fā)明的Muse細(xì)胞相對于人ES細(xì)胞的表達(dá)量之比高。
[0080](a)基質(zhì)金屬肽酶I (間質(zhì)膠原酶)
(b)上皮調(diào)節(jié)蛋白
(c)幾丁質(zhì)酶-3樣I(軟骨糖蛋白-39)
(d)轉(zhuǎn)錄基因座(Transcribedlocus)(e)幾丁質(zhì)酶-3樣I(軟骨糖蛋白-39)
(f)絲甘蛋白
(g)MRNA 全長插入片段 cDNA 克隆 EUROIMAGE 1913076
(h)Ras和Rab相互作用因子2
(i)腔蛋白聚糖
(j) CLCA家族成員2,氯離子通道調(diào)節(jié)蛋白
(k)白細(xì)胞介素8
(I)類似于 L0C166075
(m)皮連蛋白(dermatopontin)
(n)EGF, Iatrophilin和含七跨膜結(jié)構(gòu)域的I
(ο)胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白I
(P)溶質(zhì)載體家族16,成員4 ( 一元羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白5)
(q)絲甘蛋白
(r) gremlin 2,半胱氨 酸結(jié)超家族，同源物(非洲爪蟾)
(s)胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白5 (t)硫化物醌還原酶樣(酵母)
Muse細(xì)胞的特征是:上述因子的至少2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)、11個(gè)、12個(gè)、13個(gè)、14個(gè)、15個(gè)、16個(gè)、17個(gè)、18個(gè)、19個(gè)或20個(gè)高表達(dá)，可以以至少2個(gè)因
子高表達(dá)作為指標(biāo)進(jìn)行分離。
[0081]此外，Muse細(xì)胞可以是上述(i)-(xviii)的因子的至少2個(gè)與上述(a)-(t)的因子的至少2個(gè)同時(shí)高表達(dá)，可以以這些基因高表達(dá)作為指標(biāo)進(jìn)行分離。
[0082]此外，Muse細(xì)胞的特征是:表達(dá)多能性標(biāo)志以外的氣味受體(嗅覺受體)群以及趨化因子受體群的因子，即，為特定的氣味受體或趨化因子受體陽性。
[0083]在Muse細(xì)胞中表達(dá)的氣味受體例如可舉出以下22個(gè)受體。
[0084]嗅覺受體，家族8，亞家族G，成員2 (0R8G2)；
嗅覺受體，家族7，亞家族G，成員3 (0R7G3)；
嗅覺受體，家族4，亞家族D，成員5 (0R4D5)；
嗅覺受體，家族5，亞家族AP，成員2 (0R5AP2)；
嗅覺受體，家族10，亞家族H，成員4 (0R10H4)；
嗅覺受體，家族10，亞家族T，成員2 (0R10T2)；
嗅覺受體，家族2，亞家族M，成員2 (0R2M2)；
嗅覺受體，家族2，亞家族T，成員5 (0R2T5)；
嗅覺受體，家族7，亞家族D，成員4 (0R7D4)；
嗅覺受體，家族I，亞家族L，成員3 (0R1L3)；
嗅覺受體，家族4，亞家族N，成員4 (0R4N4)；
嗅覺受體，家族2，亞家族A，成員7 (0R2A7)；
鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白(G蛋白)，α激活活性多肽，嗅覺型(GNAL)；
嗅覺受體，家族6，亞家族Α，成員2 (0R6A2)；
嗅覺受體，家族2，亞家族B，成員6 (0R2B6)；嗅覺受體，家族2，亞家族C，成員I (0R2C1)；
嗅覺受體，家族52，亞家族A，成員I (0R52A1)；
嗅覺受體，家族10，亞家族H，成員3 (0R10H3)；
嗅覺受體，家族10，亞家族H，成員2 (0R10H2)；
嗅覺受體，家族51，亞家族E，成員2 (OR51E2)；
嗅覺受體，家族5，亞家族P，成員2 (OR5P2);和 嗅覺受體，家族10，亞家族P，成員I (ORlOPl)
作為在Muse細(xì)胞中表達(dá)的趨化因子受體，可舉出以下的5個(gè)受體。
[0085]趨化因子(C-C基序)受體5 (CCR5)；
趨化因子(C-X-C基序)受體4(CXCR4)；
趨化因子(C-C基序)受體I(CCRl)；
達(dá)菲血型，趨化因子受體(DARC);以及
趨化因子(C-X-C基序)受體7 (CXCR7)
Muse細(xì)胞表達(dá)上述嗅覺受體的至少I個(gè)，或者表達(dá)上述趨化因子受體的至少I個(gè)。
[0086]通過這些氣味受體或趨化因子受體和與受體結(jié)合的趨化因子的作用，作為多能干細(xì)胞的Muse細(xì)胞可以趨 化至損傷組織并存活，根據(jù)情形分化。例如肝臟、皮膚、脊髓、肌肉損傷時(shí)，通過特定的趨化因子和在細(xì)胞表面表達(dá)的氣味受體的作用，趨化至各組織中，存活，分化為肝臟(內(nèi)胚層)、皮膚(外胚層)、脊髓(外胚層)、肌肉(中胚層)細(xì)胞，可以使組織再生。
[0087]并且，在Muse 細(xì)胞中可見 Rexl、Sox2、KLF-4、c_Myc、DPPA2、ERAS、GRB7、SPAG9、TDGFl等的表達(dá)升高，在Muse細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)中，可見DAZL、DDX4、DPPA4、Stella、HoxbUPRDMl、SPRY2等的表達(dá)升高。
[0088]另外，在Muse細(xì)胞中未見作為造血干細(xì)胞標(biāo)志的⑶34和⑶117的表達(dá)或表達(dá)極低。
[0089]并且，通過對機(jī)體的中胚層組織或間充質(zhì)組織等的細(xì)胞施加細(xì)胞應(yīng)激，回收存活的細(xì)胞，可以提高M(jìn)use細(xì)胞含有率。這里，細(xì)胞應(yīng)激是指外部應(yīng)激，是指通過蛋白酶處理、低氧條件下的培養(yǎng)、低磷酸條件下的培養(yǎng)、血清饑餓狀態(tài)下的培養(yǎng)、糖饑餓狀態(tài)下的培養(yǎng)、放射線暴露下的培養(yǎng)、熱休克暴露下的培養(yǎng)、有害物質(zhì)存在下的培養(yǎng)、活性氧存在下的培養(yǎng)、機(jī)械刺激下的培養(yǎng)、壓力處理下培養(yǎng)等來暴露于應(yīng)激。其中，優(yōu)選蛋白酶處理，即蛋白酶存在下的培養(yǎng)。蛋白酶沒有限定，可以使用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等的絲氨酸蛋白酶，胃蛋白酶等的天冬氨酸蛋白酶，木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶等的半胱氨酸蛋白酶，嗜熱菌蛋白酶等的金屬蛋白酶，谷氨酸蛋白酶、N-末端蘇氨酸蛋白酶等。將蛋白酶添加到培養(yǎng)中時(shí)的添加濃度并沒有限定，通?？梢砸栽谂囵B(yǎng)皿等中培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞剝離時(shí)所使用的濃度使用。本發(fā)明的多能干細(xì)胞Muse細(xì)胞可以稱作對上述外部應(yīng)激具有耐性的干細(xì)胞、例如對胰蛋白酶具有耐性的細(xì)胞。
[0090]機(jī)體中的中胚層組織或間充質(zhì)組織等沒有限定，包含骨髓單核細(xì)胞、皮膚細(xì)胞等成纖維細(xì)胞部分，牙髓組織、眼球組織、毛根組織等。作為細(xì)胞，也可以使用培養(yǎng)細(xì)胞或從組織采集的細(xì)胞。其中，優(yōu)選骨髓細(xì)胞、皮膚細(xì)胞，例如可舉出:人骨髓間充質(zhì)細(xì)胞(MSC)部分或人皮膚成纖維細(xì)胞部分。骨髓間充質(zhì)細(xì)胞部分可通過將骨髓穿刺液培養(yǎng)2-3周獲得。[0091]經(jīng)受了上述各種應(yīng)激的組織的細(xì)胞大部分死亡，存活的細(xì)胞中含有本發(fā)明的多能干細(xì)胞Muse細(xì)胞。對細(xì)胞施加應(yīng)激后，必須除去死細(xì)胞，使用蛋白酶時(shí)，這些死細(xì)胞可被蛋白酶的作用分解。
[0092]還可以在對細(xì)胞施加應(yīng)激后再對細(xì)胞給予物理沖擊，除去容易破碎的細(xì)胞。物理沖擊例如可通過劇烈的吸移液、劇烈攪拌、渦旋等給予。
[0093]對細(xì)胞施加細(xì)胞應(yīng)激、根據(jù)需要給予物理沖擊后，將細(xì)胞群離心，以沉淀的形式獲得并回收存活的細(xì)胞，由此可提高本發(fā)明的多能干細(xì)胞Muse細(xì)胞的含有率。還可以以下述表面標(biāo)志為指標(biāo)，進(jìn)一步由這樣得到的細(xì)胞中分離Muse細(xì)胞或多能細(xì)胞部分。
[0094]另外，培養(yǎng)經(jīng)受了外傷或火傷等應(yīng)激的機(jī)體的中胚層組織或間充質(zhì)組織等，回收趨化的細(xì)胞，也可以分離Muse細(xì)胞。受到了傷害的組織的細(xì)胞暴露于應(yīng)激，因此，本發(fā)明中，培養(yǎng)受到了傷害的機(jī)體的中胚層組織或間充質(zhì)組織等，這也稱為對機(jī)體的中胚層組織或間充質(zhì)組織細(xì)胞等施加細(xì)胞應(yīng)激。
[0095]作為一個(gè)例子，就對這些細(xì)胞進(jìn)行胰蛋白酶處理的方法進(jìn)行說明。此時(shí)的胰蛋白酶濃度沒有限定，例如在貼壁細(xì)胞的常規(guī)培養(yǎng)中，只要是以將貼壁于培養(yǎng)容器的貼壁培養(yǎng)物剝離時(shí)所使用的濃度范 圍使用即可，可例舉0.1-1%，優(yōu)選0.1-0.5%。例如，將含有10-50萬個(gè)細(xì)胞的、機(jī)體的中胚層組織或間充質(zhì)組織等來源的細(xì)胞在5ml上述濃度的胰蛋白酶溶液中進(jìn)行孵育，由此可以暴露于外部應(yīng)激。胰蛋白酶處理時(shí)間是5-24小時(shí),優(yōu)選5-20小時(shí)左右。本發(fā)明中，將8小時(shí)以上胰蛋白酶處理、例如8小時(shí)或16小時(shí)的處理稱為長時(shí)間胰蛋白酶處理。
[0096]胰蛋白酶處理后，優(yōu)選如上所述，通過吸移液、攪拌、渦旋等施加物理沖擊。這是為了破壞除去已死亡的細(xì)胞或即將死亡的細(xì)胞。
[0097]胰蛋白酶處理后的懸浮培養(yǎng)時(shí)，為了防止細(xì)胞之間的聚集，例如優(yōu)選在甲基纖維素凝膠等凝膠中進(jìn)行孵育。另外，為了防止細(xì)胞與培養(yǎng)容器的貼壁以保持懸浮狀態(tài)，優(yōu)選用聚(甲基丙烯酸2-羥乙基酯)等涂布容器。
[0098]將暴露于外部應(yīng)激的細(xì)胞通過離心收集，進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，則形成細(xì)胞團(tuán)(細(xì)胞簇)。該細(xì)胞團(tuán)的大小是直徑25μπι至150μπι左右。Muse細(xì)胞在暴露于該外部應(yīng)激并存活下來的細(xì)胞群中是以濃縮的狀態(tài)含有。將該細(xì)胞群稱為富Muse細(xì)胞部分(富Msue群)。富Muse細(xì)胞部分中Muse細(xì)胞的存在比例根據(jù)應(yīng)激處理的方法而不同。
[0099]如上所述，Muse細(xì)胞在施加應(yīng)激后也存活,這顯示了 Muse細(xì)胞的應(yīng)激耐性。
[0100]機(jī)體的中胚層組織或間充質(zhì)組織等來源的細(xì)胞的培養(yǎng)中使用的培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件可采用在常規(guī)的動物細(xì)胞的培養(yǎng)中使用的培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件。還可以使用公知的干細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中可以適當(dāng)添加胎牛血清等血清或青霉素、鏈霉素等抗生素以及各種生理活性物質(zhì)。
[0101]并且，Muse細(xì)胞也包含作為Muse細(xì)胞的衍生細(xì)胞或誘導(dǎo)細(xì)胞的多能干細(xì)胞。衍生細(xì)胞或誘導(dǎo)細(xì)胞是指培養(yǎng)Muse細(xì)胞得到的細(xì)胞或細(xì)胞群、或者對Muse細(xì)胞進(jìn)行外源基因的導(dǎo)入等人工誘導(dǎo)操作得到的細(xì)胞，也包含后代細(xì)胞。本發(fā)明時(shí)報(bào)道的iPS細(xì)胞是通過向皮膚成纖維細(xì)胞等的機(jī)體組織的分化了的細(xì)胞中導(dǎo)入外源基因等來進(jìn)行重編程的結(jié)果，稱為是被誘導(dǎo)成多能干細(xì)胞的細(xì)胞，而對本發(fā)明的可由組織直接獲得、已經(jīng)具有多能干細(xì)胞的性質(zhì)的細(xì)胞進(jìn)行外源基因的導(dǎo)入等人工誘導(dǎo)操作所得到的細(xì)胞是與iPS細(xì)胞不同的。[0102]Muse細(xì)胞也包含通過將Muse細(xì)胞懸浮培養(yǎng)得到的胚狀體樣細(xì)胞團(tuán)。胚狀體是將Muse細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，由此形成細(xì)胞團(tuán)的形式。此時(shí)，可將通過培養(yǎng)Muse細(xì)胞得到的胚狀體稱為Muse細(xì)胞來源的胚狀體樣細(xì)胞團(tuán)(也稱為M簇)。用于形成胚狀體樣細(xì)胞團(tuán)的懸浮培養(yǎng)方法可舉出:使用含有甲基纖維素等的水溶性聚合物的培養(yǎng)基進(jìn)行的培養(yǎng)(Nakahata, T.等人.，Blood 60, 352-361 (1982))或懸滴培養(yǎng)(Keller, J.Physiol.(Lond) 168:131-139, 1998)等。并且Muse細(xì)胞還包含由上述胚狀體樣細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行自我更新得到的胚狀體樣細(xì)胞團(tuán)、以及包含在胚狀體樣細(xì)胞團(tuán)中的細(xì)胞和多能干細(xì)胞。這里，自我更新是指培養(yǎng)胚狀體樣細(xì)胞團(tuán)中所含的細(xì)胞，再次形成胚狀體樣細(xì)胞團(tuán)。自我更新可以反復(fù)進(jìn)行1-多個(gè)周期。另外，Muse細(xì)胞也包含上述任意的胚狀體樣細(xì)胞團(tuán)和由包含在胚狀體樣細(xì)胞團(tuán)中的細(xì)胞分化所得的細(xì)胞和組織。
[0103]同種異體移植是指移植他人(其他個(gè)體)的組織或細(xì)胞。
[0104]Muse細(xì)胞在表面表達(dá)HLA (人淋巴細(xì)胞抗原)中的HLA I類抗原，但不表達(dá)HLA II類抗原。同種異體移植具有HLA II類抗原的組織或細(xì)胞時(shí)，由于供體組織或細(xì)胞的HLA II類抗原的抗原呈遞，細(xì)胞介導(dǎo)的免疫被激活，發(fā)生排斥。因此，即使將不表達(dá)HLA II類抗原的Muse細(xì)胞進(jìn)行同種異體移植時(shí)，也難以發(fā)生排斥反應(yīng)，可以存活。因此移植時(shí)無需使用免疫抑制劑。
[0105]Muse細(xì)胞還具有免疫抑制效果。即，抑制機(jī)體內(nèi)由單核細(xì)胞向單核細(xì)胞來源的樹突細(xì)胞(MoDC)前體細(xì)胞的分化誘導(dǎo)，還抑制由單核細(xì)胞來源的樹突細(xì)胞(MoDC)前體細(xì)胞向樹突細(xì)胞的分化誘導(dǎo)。這顯示:在將Muse細(xì)胞進(jìn)行同種異體移植時(shí)，Muse細(xì)胞抑制供體的免疫活性，從而不會因所移植的供體的免疫系統(tǒng)而發(fā)生排斥，可以存活、分化。
[0106]Muse細(xì)胞具有多能性，可分化為所有的組織。因此，Muse細(xì)胞可以用于再生醫(yī)療等，通過對功能受損的組織等實(shí)施補(bǔ)充Muse細(xì)胞的細(xì)胞治療，組織可再生。例如可用于各種組織、各種器官等的再生。具體可舉`出皮膚、腦脊髓、肝臟、肌肉等。通過將Muse細(xì)胞直接或給予到受到損傷或損害的組織、器官等的附近，Muse細(xì)胞侵入該組織、器官內(nèi)，分化成該組織特有的細(xì)胞，可貢獻(xiàn)于組織、器官的再生、重建。還可以通過靜脈給予等進(jìn)行全身給予。這種情況下，Muse細(xì)胞例如通過歸巢等定向于受損的組織或器官，到達(dá)并侵入該處，然后分化為該組織或器官的細(xì)胞，可貢獻(xiàn)于組織、器官的再生、重建。
[0107]BP, Muse細(xì)胞可在用于再生醫(yī)療的同種異體移植用的細(xì)胞治療中使用。
[0108]給予例如可通過皮下注射、靜脈注射、肌肉注射、腹腔內(nèi)注射等非口服給予或口服給予，或者通過對胚胎的子宮內(nèi)注射等進(jìn)行。可以局部給予也可以全身給予。局部給予例如可利用導(dǎo)管進(jìn)行。給予量可根據(jù)要再生的器官、組織的種類或尺寸適當(dāng)確定。
[0109]要再生的器官并沒有限定，包含骨髓、脊髓、血液、脾臟、肝臟、肺、腸道、眼、腦、免疫系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、骨、結(jié)締組織、肌肉、心臟、血管、胰臟、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、末梢神經(jīng)系統(tǒng)、腎臟、膀胱、皮膚、上皮附屬器、乳房-乳腺、脂肪組織、角膜、以及包含口腔、食道、陰道、肛門在內(nèi)的粘膜等。另外作為治療對象的疾病可舉出:癌癥、心血管疾病、代謝疾病、肝臟疾病、糖尿病、肝炎、血友病、血液系統(tǒng)疾病、脊髓損傷等的退行性或外傷性神經(jīng)疾病、自身免疫疾病、遺傳缺陷、結(jié)締組織疾病、貧血、感染癥、移植排斥、貧血、炎癥、皮膚或肌肉的損傷等。
[0110]細(xì)胞可以與作為藥學(xué)上可接受的基料一起給予。該基料例如是由膠原等制成的生物相容性高的物質(zhì)、或由生物降解性的物質(zhì)制成，可以制成顆粒狀、板狀、筒狀、容器狀等形狀，可以將細(xì)胞與該基料結(jié)合或收納于該基料中進(jìn)行給予。
[0111]還可以對Muse細(xì)胞進(jìn)行體外分化誘導(dǎo)，進(jìn)一步使用分化的細(xì)胞構(gòu)建組織，也可以將該分化的細(xì)胞或該組織進(jìn)行同種異體移植。Muse細(xì)胞不形成腫瘤，因此，即使所移植的上述分化的細(xì)胞或該組織中含有未分化狀態(tài)的Muse細(xì)胞，癌化的可能性也低，安全。
[0112]還可進(jìn)一步將Muse細(xì)胞用于病因?yàn)榻M織的退化或功能缺陷的疾病的治療。這種情況下，例如可以將Muse細(xì)胞離體濃縮，增殖，或者使其分化，再返回體內(nèi)，例如還可以使Muse細(xì)胞分化為特定的組織的細(xì)胞，再將該細(xì)胞移植到要治療的組織中。還可以通過細(xì)胞的移植進(jìn)行原位細(xì)胞治療。這種情況下，對象細(xì)胞的例子可舉出:肝臟細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞，皮膚細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞等肌肉細(xì)胞，還可以使Muse細(xì)胞分化為這些細(xì)胞并移植，進(jìn)行原位治療。通過該治療，可治療例如帕金森病、腦梗塞、脊髓損傷、肌肉退行性疾病等。Muse細(xì)胞不形成腫瘤，因此，即使用于這樣的治療，癌化的可能性也低，安全。
[0113]通過使Muse細(xì)胞分化，形成血液或血液成分，可以離體、體外形成血液或血液成分。血液成分可舉出:紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板等?？梢詫⑦@樣形成的血液或血液成分用于異體輸血。
[0114]如上所述，將Muse細(xì)胞用于治療時(shí)，可以離體、體內(nèi)或體外進(jìn)行分化。Muse細(xì)胞例如可分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、骨髓間質(zhì)、骨骼肌、平滑肌、心肌、目艮、內(nèi)皮、上皮、肝臟、胰臟、造血、神經(jīng)膠質(zhì)、神經(jīng)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞等。Muse細(xì)胞的分化可在分化因子的存在下通過培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)。分化因子可舉出:堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、二甲基亞砜(DMSO)和異丙腎上腺素；或者成纖維細(xì)胞生長因子4(FGF4)、肝細(xì)胞生長因子(HGF)等。
[0115]將Muse細(xì)胞用于 具有治療藥物的遞送功能。上述物質(zhì)例如可舉出抗血管生成藥。
[0116]本發(fā)明包含同種異體移植用細(xì)胞治療用組合物或同種異體移植用細(xì)胞治療用組合物，其包含Muse細(xì)胞、由Muse細(xì)胞形成的胚狀體樣細(xì)胞團(tuán)以及由Muse細(xì)胞或上述胚狀體樣細(xì)胞團(tuán)分化得到的細(xì)胞或組織、器官。可以將它們稱作同種異體移植用再生醫(yī)療用材料或同種異體移植用再生醫(yī)療用組合物。該組合物除Muse細(xì)胞、由Muse細(xì)胞形成的胚狀體樣細(xì)胞團(tuán)或者由Muse細(xì)胞或上述胚狀體樣細(xì)胞團(tuán)分化得到的細(xì)胞或組織、器官之外,還包含藥學(xué)上可接受的緩沖液或稀釋液等。
[0117]通過以下實(shí)施例具體說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受這些實(shí)施例的限定。
[0118]實(shí)施例1 Muse細(xì)胞中的HLA抗原的表達(dá)
通過流式細(xì)胞儀確認(rèn)人骨髓間充質(zhì)細(xì)胞來源的SSEA-3陽性細(xì)胞的HLA I類和HLA II類抗原的表達(dá)。圖1表示結(jié)果。如圖1所示，在人骨髓間充質(zhì)細(xì)胞中，HLAl為陽性，但HLA2為陰性。
[0119]同樣確認(rèn)人成纖維細(xì)胞來源的SSEA-3陽性細(xì)胞的HLA I類和HLA II類抗原的表達(dá)。圖2表示結(jié)果。如圖2所示，在人成纖維細(xì)胞中，HLAl為陽性，HLA2為陰性。
[0120]實(shí)施例2
通過使用抗人HLA-ABC抗體(eBioscience)的免疫細(xì)胞化學(xué)染色(第二抗體使用抗小鼠IgG抗體(使用Alexa568標(biāo)記)，研究Muse細(xì)胞(SSEA-3陽性)和非Muse細(xì)胞(SSEA-3陰性)中的HLA I類的表達(dá)。結(jié)果如圖3所示。如圖3所示,在Muse細(xì)胞和非Muse細(xì)胞中均可見HLA I類的表達(dá)。
[0121]通過使用抗人HLA-DR抗體(eBioscience)的免疫細(xì)胞化學(xué)染色(第二抗體使用抗小鼠IgG抗體(使用Alexa568標(biāo)記)，研究Muse細(xì)胞(SSEA-3陽性)和非Muse細(xì)胞(SSEA-3陰性)中的HLA II類的表達(dá)。結(jié)果如圖4所示。如圖4所示，在Muse細(xì)胞和非Muse細(xì)胞中均未見HLA II類的表達(dá)。
[0122]圖5是表示上述試驗(yàn)中的非特異性反應(yīng)的圖。如圖5所示，未見第二抗體-Alexa568產(chǎn)生的熒光。這顯示沒有非特異性反應(yīng)。
[0123]實(shí)施例3通過淋巴細(xì)胞刺激試驗(yàn)研究Muse細(xì)胞的免疫抑制效果
Muse細(xì)胞是否具有免疫抑制效果,可通過樹突細(xì)胞的誘導(dǎo)試驗(yàn)確認(rèn)。即，由人外周血分離單核細(xì)胞，與Muse細(xì)胞共培養(yǎng)，研究是否由單核細(xì)胞誘導(dǎo)了樹突細(xì)胞。
[0124]使用以SSEA-3陽性為指標(biāo)從人成纖維細(xì)胞分離的Muse細(xì)胞(以下稱為Muse細(xì)胞)、人成纖維細(xì)胞中的SSEA-3陰性細(xì)胞(以下稱為非Muse細(xì)胞)、以及采集自外周血的人單核細(xì)胞。
[0125]對于培養(yǎng)基，將a - MEM(+10%FBS、2mM L-谷氨酰胺、卡那霉素)用于從人成纖維細(xì)胞分離的Muse細(xì)胞和非Muse細(xì)胞，將RPM1-1640 (+10%FBS)用于人單核細(xì)胞，將RPM1-1640 (+10%FBS,2mM L-谷氨酰胺、2mM丙酮酸鈉、40ng/mL GM_CSF、20ng/mL IL-4、卡那霉素)用于樹突細(xì)胞誘導(dǎo)。
[0126]詳細(xì)的方法如下所示。
[0127](I)單核細(xì)胞的 采集
采集健康人的外周血，使用Lymphoprep Tubes (Axis-Shield PoC AS),只分離單核細(xì)胞成分，接著懸浮于RPMI培養(yǎng)基(+10%FBS)中，接種于IOcm培養(yǎng)皿中。第2天，將培養(yǎng)皿洗滌2次，除去未貼壁的細(xì)胞。
[0128]使用0.25%胰蛋白酶/2mM EDTA，從培養(yǎng)皿中剝離貼壁的細(xì)胞。用抗人⑶14(人單核細(xì)胞的標(biāo)志)抗體染色，用FACS分析。結(jié)果如圖6所示?？纱_認(rèn)約90%為⑶14陽性。
[0129](2)由單核細(xì)胞向單核細(xì)胞來源的樹突細(xì)胞(MoDC)前體細(xì)胞的分化誘導(dǎo)
在GM-CSF和IL-4的存在下，將單核細(xì)胞培養(yǎng)數(shù)天，單核細(xì)胞分化為MoDC前體細(xì)胞，然后通過TNF-α形成成熟樹突細(xì)胞。
[0130]培養(yǎng)(I)中采集的單核細(xì)胞。用于培養(yǎng)單核細(xì)胞、誘導(dǎo)單核細(xì)胞來源的樹突細(xì)胞(MoDC)前體細(xì)胞的培養(yǎng)基是RPM1-1640(+10% FBS、2mM L-谷氨酰胺、2mM丙酮酸鈉、40 ng/mL GM-CSF、20 ng/mL IL-4、卡那霉素)。此時(shí)，改變細(xì)胞因子的有無、有否與Muse細(xì)胞或非Muse細(xì)胞的共培養(yǎng)等條件，在以下四種條件下進(jìn)行培養(yǎng):(A)只有單核細(xì)胞，沒有細(xì)胞因子的誘導(dǎo)，陰性對照(只有單核細(xì)胞(無細(xì)胞因子));(B)只有單核細(xì)胞，有細(xì)胞因子的誘導(dǎo)，陽性對照(只有單核細(xì)胞(有細(xì)胞因子))；(C)單核細(xì)胞+Muse細(xì)胞，有細(xì)胞因子的誘導(dǎo)(單核細(xì)胞+SSEA-3 (+)細(xì)胞)；(D)單核細(xì)胞+非Muse細(xì)胞、有細(xì)胞因子的誘導(dǎo)(單核細(xì)胞+SSEA-3(_)細(xì)胞)(“單核細(xì)胞+Muse細(xì)胞”表示單核細(xì)胞與Muse細(xì)胞共培養(yǎng))。5天后，使用0.25%胰蛋白酶/2mM EDTA剝離細(xì)胞，用抗CDla(人單核細(xì)胞來源的樹突細(xì)胞(MoDC)前體細(xì)胞的標(biāo)志)抗體或抗CD14(人單核細(xì)胞標(biāo)志)抗體染色，然后用FACS分析。結(jié)果如圖7所示。圖7A、B、C、D分別表示上述條件(A)、(B)、(C)和(D)的FACS分析結(jié)果。各圖中，左上(Ql)表示單核細(xì)胞的存在，右上(Q2)表示中分化細(xì)胞的存在，左下(Q3)表示其它細(xì)胞的存在，右下(Q4)表示MoDC前體細(xì)胞的存在(參照圖7E)。圖8表示在各條件下培養(yǎng)后的CDla陽性細(xì)胞(MoDC前體細(xì)胞)相對于CD14陽性細(xì)胞(單核細(xì)胞)的比例。如圖所示，在細(xì)胞因子不存在下培養(yǎng)單核細(xì)胞時(shí)(A)，幾乎不出現(xiàn)MoDC前體細(xì)胞，但在單核細(xì)胞和細(xì)胞因子存在下培養(yǎng)時(shí)(條件(B))，MoDC前體細(xì)胞出現(xiàn)。在單核細(xì)胞與非Muse細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)(條件(D))，MoDC前體細(xì)胞與條件(B)相比略少。而單核細(xì)胞與Muse細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)(條件(C))，MoDC前體細(xì)胞的出現(xiàn)與條件(B)相比顯著受到抑制。該結(jié)果顯示，Muse細(xì)胞抑制了由單核細(xì)胞向單核細(xì)胞來源的樹突細(xì)胞(MoDC)前體細(xì)胞的分化誘導(dǎo)。Muse細(xì)胞和非Muse細(xì)胞均可見抑制效果,但Muse細(xì)胞的抑制效果更大。
[0131](3)由單核細(xì)胞來源的樹突細(xì)胞(MoDC)前體細(xì)胞向樹突細(xì)胞的分化誘導(dǎo) 通過使用上述⑴的RPM1-1640 (+10% FBS、2mM L-谷氨酰胺、2mM丙酮酸鈉、40 ng/
mL GM-CSF、20 ng/mL IL-4、卡那霉素)培養(yǎng)，對單核細(xì)胞來源的樹突細(xì)胞(MoDC)前體細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)，單核細(xì)胞培養(yǎng)開始5天后，向培養(yǎng)基中添加10ng/ml人TNF- α。此時(shí)，改變細(xì)胞因子的有無、有否與Muse細(xì)胞或非Muse細(xì)胞的共培養(yǎng)的條件，并且，由于環(huán)孢菌素A抑制樹突細(xì)胞的成熟，因此使用加入了 I μ g/ml環(huán)孢菌素A的培養(yǎng)基作為對照。7天后(TNF-a處理開始2天后)，進(jìn)一步用抗人CD86(樹突細(xì)胞中強(qiáng)表達(dá))抗體進(jìn)行染色，用FACS分析。結(jié)果如圖9所示。圖9(i)_圖9(vii)分別表示以下條件的結(jié)果:(i)只有MoDC前體細(xì)胞(未添加細(xì)胞因子誘導(dǎo))(只有MoDC祖細(xì)胞(無細(xì)胞因子))；(ii)只有MoDC前體細(xì)胞(有細(xì)胞因子添加)(只有MoDC祖細(xì)胞(有細(xì)胞因子))；(iii)只有MoDC前體細(xì)胞(有細(xì)胞因子和環(huán)孢菌素添加)(只有MoDC祖細(xì)胞(有細(xì)胞因子+環(huán)孢菌素A)) ;(iv)MoDC前體細(xì)胞+Muse細(xì)胞(MoDC祖細(xì)胞+SSEA-3 (+)細(xì)胞)；(v) MoDC前體細(xì)胞+Muse細(xì)胞，有環(huán)孢菌素A添加(MoDC祖細(xì)胞+SSEA-3(+)細(xì)胞+環(huán)孢菌素A) ; (vi)MoDC前體細(xì)胞+非Muse細(xì)胞(MoDC祖細(xì)胞+SSEA-3 (-)細(xì)胞)；(vii) MoDC前體細(xì)胞+非Muse細(xì)胞，有環(huán)孢菌素A添加(MoDC祖細(xì)胞+SSEA-3 (-)細(xì)胞+環(huán)孢菌素A)。圖10中示出在上述條件(ii)-(vii)下培養(yǎng)后的⑶86的表達(dá)。即，自左起表示以下(ii)-(vii)的結(jié)果:(ii)只有MoDC前體細(xì)胞(陽性對照)；(iii)加入抑制劑環(huán)孢菌素A (陰性對照)；(iv) MoDC前體細(xì)胞+Muse細(xì)胞；(V)向其中加入抑制劑環(huán) 孢菌素A ; (vi) MoDC前體細(xì)胞+非Muse細(xì)胞；(vii)向其中加入抑制劑環(huán)孢菌素A。
[0132]如圖所示，在將Muse細(xì)胞與MoDC前體細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，⑶86的表達(dá)降低。該結(jié)果顯示=Muse細(xì)胞抑制了由單核細(xì)胞來源的樹突細(xì)胞(MoDC)前體細(xì)胞向樹突細(xì)胞的分化誘導(dǎo)。Muse細(xì)胞和非Muse細(xì)胞均可見抑制效果,但Muse細(xì)胞的抑制效果更大。
[0133]產(chǎn)業(yè)實(shí)用性
作為由機(jī)體組織得到的、SSEA-3陽性、具有以往的干細(xì)胞中未見的抗原表達(dá)概況的多能干細(xì)胞，Muse細(xì)胞不表達(dá)HLA II類抗原。因此，即使將細(xì)胞進(jìn)行同種異體移植，也不會被排斥。因此，含有Muse細(xì)胞的同種異體移植用細(xì)胞治療用組合物可在用于再生醫(yī)療的細(xì)胞治療中使用。
[0134]本說明書中引用的所有出版物、專利和專利申請均直接作為參考結(jié)合到本說明書中。
【權(quán)利要求】
1.同種異體移植用細(xì)胞治療用組合物，該組合物含有可從機(jī)體組織分離、具有以下(i)-(iv)的所有性質(zhì)、SSEA-3陽性、不表達(dá)HLA II類抗原的多能干細(xì)胞: (i)端粒酶活性低或沒有； (?)具有分化為三胚層中任意胚層的細(xì)胞的能力； (iii)不顯示腫瘤性增殖；以及 (iv)具有自我更新能力。
2.權(quán)利要求1的同種異體移植用細(xì)胞治療用組合物，其中，多能干細(xì)胞可抑制由單核細(xì)胞向樹突細(xì)胞的誘導(dǎo)。
3.權(quán)利要求1或2的同種異體移植用細(xì)胞治療用組合物，其中，多能干細(xì)胞為CD105陽性。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的同種異體移植用細(xì)胞治療用組合物，其中，多能干細(xì)胞為CDl 17陰性和CD 146陰性。
5.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的同種異體移植用細(xì)胞治療用組合物，其中，多能干細(xì)胞為⑶117陰性、⑶146陰性、NG2陰性、⑶34陰性、vWF陰性和⑶271陰性。
6.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的同種異體移植用細(xì)胞治療用組合物，其中，多能干細(xì)胞為CD34陰性、CD117陰性、CD146陰性、CD271陰性、NG2陰性、vWF陰性、SoxlO陰性、Snail陰性、Slug陰性、Tyrpl陰性和Dct陰性。
7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的同種異體移植用細(xì)胞治療用組合物，其中，多能干細(xì)胞為應(yīng)激耐性。
8.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的同種異體移植用細(xì)胞治療用組合物，其中，多能干細(xì)胞的吞曬能力聞。
9.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的同種異體移植用細(xì)胞治療用組合物，其中，多能干細(xì)胞來源于間充質(zhì)組織。
10.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的同種異體移植用細(xì)胞治療用組合物，其中，多能干細(xì)胞來源于臍帶或脂肪組織。
【文檔編號】A61K35/28GK103442724SQ201280016538
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2012年3月30日 優(yōu)先權(quán)日:2011年3月30日
【發(fā)明者】出澤真理, 吉田正順, 黑田康勝 申請人:株式會社克里奧