專利名稱：組織分離方法
組織分離方法領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種用于非破壞性地對(duì)種子群體中的單粒種子進(jìn)行取樣的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及ー種用于從所希望的種子組織中去除不希望的種子組織的有效的、高通量的方法。在另ー個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括從種子中去除母體組織，以及針對(duì)感興趣的遺傳標(biāo)記或遺傳性狀或其他種子表型或基因型如油、淀粉、遺傳修飾性狀、DNA或RNA序列或蛋白質(zhì)對(duì)種子的剰余部分進(jìn)行分析。
背景技術(shù)：
如Chunwongse 等人的理論應(yīng)用遺傳學(xué)(Theoretical Applied Genetics)86:694-698(1993)所展示，來(lái)自種子的胚乳DNA的擴(kuò)增已為人知至少15年。對(duì)種子DNA進(jìn)行基因分型的高通量基因分型系統(tǒng)用于測(cè)試許多品種的種子，這些品種包括玉米、小麥、蔬菜、花卉、向日葵、甜菜、水稻、大豆以及其他品種。高通量種子切削裝置是有效的，因?yàn)榭梢澡b定并且拋棄所不希望的種子，并且可以鑒定并且保留所希望的種子。種子切片是適合于基因分型的種子DNA樣品并且可以是用于在植物育種計(jì)劃中使用的大多數(shù)育種過(guò)程的標(biāo)記輔助植物選擇的實(shí)驗(yàn)材料。在種植種子之前，在留下有活力的種子的同吋，對(duì)來(lái)自切下的種子的一部分的種子DNA進(jìn)行基因分型在許多方面是有益的。對(duì)于切下的種子部分的測(cè)試允許鑒定并且選擇具有優(yōu)選基因型的有活力的種子，并且它也允許鑒定和消除較不優(yōu)選的種子基因型。然而，由于存在像種皮這樣的母體組織，由種子切片來(lái)確定種胚的基因型可能是復(fù)雜的。這些組織增加了測(cè)試結(jié)果的不明確并且導(dǎo)致選擇不適當(dāng)?shù)姆N子。這種不明確可以通過(guò)在種子DNA測(cè)試之前去除母體組織來(lái)消除。從種子樣品中去除母體組織經(jīng)常是不容易的，因?yàn)樗笕コ夥N皮，即種子的果皮。大多數(shù)種子的相對(duì)較小的大小使得母體種皮的分離和去除是困難的，或者充其量也是費(fèi)時(shí)費(fèi)カ的。作為母體種子組織的實(shí)例的玉米果皮是種子的成熟子房雌株組織。種皮或果皮的功能是保護(hù)內(nèi)部胚乳以及胚免于疾病以及水分損失。為了實(shí)現(xiàn)這一功能，果皮通常是具有幾個(gè)細(xì)胞厚度并且緊密附著于種子的內(nèi)部的一個(gè)層。母體種皮的堅(jiān)硬保護(hù)性質(zhì)難以去除，從而使得分析種子材料的剰余部分是具有挑戰(zhàn)性的。例如，玉米以及大豆加工應(yīng)用時(shí)常去除種子的母體組織，這是因?yàn)楣さ臉?gòu)成會(huì)不利地影響最終產(chǎn)品的性質(zhì)和組成。因此，加工エ業(yè)已經(jīng)開發(fā)出許多化學(xué)溶劑和浸泡エ藝以便去除堅(jiān)韌的母體種皮組織。然而，這些エ業(yè)過(guò)程是費(fèi)時(shí)的并且并未被設(shè)計(jì)成保護(hù)種子胚乳DNA組織的完整性。因此，這些過(guò)程對(duì)于保存種子的非母體組織中的種子DNA并不是太理想。因此，對(duì)于一種自動(dòng)化的、高通量的、有效的方法仍然存在著需要，該方法用于非破壞性地從單粒種子或種子片中去除母體種子組織如種皮，同時(shí)以可測(cè)試形式保存種子。簡(jiǎn)要概述本發(fā)明的方法増加了在種子群體中選擇具有所希望的性狀或基因型或表型的種子的效率。本發(fā)明還涉及ー種用于測(cè)試種子材料的有效的、高通量的方法。本發(fā)明尤其適用于針對(duì)遺傳修飾性狀對(duì)純度標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測(cè)試。但是本發(fā)明還用于測(cè)試外來(lái)的遺傳修飾過(guò)的生物體(genetically modified organism)的存在、在育種中進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇、以及染色體型和數(shù)量以及胚質(zhì)的遺傳純度。在另ー個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種用于非破壞性地對(duì)種子群體中的單粒種子進(jìn)行取樣，然后基于測(cè)試結(jié)果從這個(gè)群體中選擇種子的方法?？梢葬槍?duì)特定等位基因、單倍型、基因位點(diǎn)或遺傳性狀、表型或基因型或感興趣的在種子中經(jīng)受檢測(cè)的其他種子成分對(duì)種子進(jìn)行分析。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種選擇具有某性狀的種子的方法，該方法包括(a)將種子涂覆以涂層，(b)以非破壞性的方式將涂覆的種皮的至少一部分從單粒種子分離，(b)將涂覆的種皮或其一部分從種子或其一部分分離；(C)針對(duì)至少ー種感興趣的性狀的存在或缺乏對(duì)無(wú)種皮種子或其種子部分進(jìn)行分析；以及(d)基于對(duì)所述無(wú)種皮種子或種子部分的分析來(lái)選擇種子。這些方法可以在不影響種子的發(fā)芽勢(shì)(germination viability)的情況下執(zhí)行。在一個(gè)實(shí)施方案中,涂覆的種子包括涂覆在金屬涂料、金屬或金屬覆蓋物中的種子。該方法可以針對(duì)至少ー種感興趣的性狀的存在或缺乏對(duì)無(wú)種皮種子或其種子部分的遺傳組分進(jìn)行分析。該方法可以分析遺傳物質(zhì)的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種選擇具有所希望的性狀的在群體中的種子的方法，該方法包括(a)對(duì)種子的至少一部分施用ー種涂層；(b)以非破壞性的方式將包含種皮的至少一部分的種子切片從涂覆的種子中去除；(C)將種皮從種子切片分離；(d)針對(duì)至少ー種感興趣的性狀的存在或缺乏對(duì)無(wú)種皮種子切片進(jìn)行分析；以及(e)基于至少ー種感興趣的性狀的存在或缺乏針對(duì)種子群體選擇種子。這些方法可以在不影響種子的發(fā)芽勢(shì)的情況下執(zhí)行。涂層被選擇成使得種子的發(fā)芽勢(shì)不受影響。在一個(gè)實(shí)施方案中，涂層對(duì)磁力有反應(yīng)。涂層可以是允許不需要的材料與所希望的材料分離的任何物質(zhì)，包括但是不限于金屬涂料、金屬、金屬涂層。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用包括但是不限于磁鐵、磁性板或磁性液體的吸引劑將種皮從種子切片分離。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及ー種分析種子的性狀的方法，該方法包括(a)將涂層施用至種子的至少一部分；(b)使涂覆的種皮從種子的至少一部分松開；(C)將涂覆的種皮從種子的這個(gè)部分分離；(d)針對(duì)至少ー種性狀的存在或缺乏對(duì)無(wú)種皮種子或種子部分進(jìn)行分析。此方法還可以具有基于至少一種感興趣的性狀的存在與否來(lái)選擇或取消選擇種子的步驟。在本發(fā)明的至少ー個(gè)實(shí)施方案中，采用吸引力來(lái)分離涂覆的種皮。該方法可以包括涂覆，其中所述涂覆是磁性涂覆。在將種皮從種子或其一部分分離的自動(dòng)化高通量系統(tǒng)中，分離涂覆的種皮的步驟采用吸引力。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種選擇在群體中的種子的方法，其中至少ー些種子具有至少ー種感興趣的性狀，該方法包括(a)將涂層施用至種子的至少一部分；(b)以非破壞性的方式將包含涂覆的種皮的至少一部分的種子切片從涂覆的種子去除；(C)將種皮從種子切片分離；(d)針對(duì)至少ー種性狀的存在或缺乏對(duì)無(wú)種皮種子切片進(jìn)行分析；以及(f)基于至少一種感興趣的性狀的存在或缺乏從所述種子群體選擇種子。在另ー個(gè)實(shí)施方案中，這些方法包括種植所選擇的種子。本發(fā)明的這些方法包括用所選擇的種子栽培植物。在又另ー個(gè)實(shí)施方案中，可以從所栽培的植物收獲種子。本發(fā)明的方法的產(chǎn)物包括種子或沒(méi)有種皮的種子的一部分。該方法的另ー種產(chǎn)物是包含種皮部分以及非種皮部分的涂覆的有活力的種子，其中該非種皮部分也缺乏涂層。該方法的另ー種產(chǎn)物是具有內(nèi)表面以及外表面的種皮，其中該外表面用磁性材料涂覆。該方法的另ー種產(chǎn)物是具有內(nèi)表面的種皮的一部分，其中所述種皮內(nèi)表面被適配成與種子的不是種皮的至少一部分接合，并且其中所述種皮內(nèi)表面的所述部分從所述種子部分脫離并且所述種皮外表面被涂覆。在另ー個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種用于在自動(dòng)化過(guò)程中將種皮的至少一部分從種子的至少一部分去除的方法。本發(fā)明涉及一種用于將種皮的至少一部分從種子的至少一部分去除的方法，包括(a)將涂層施用至種子的至少一部分；(b)使種皮從至少該涂覆的種子部分松開；(C)將涂覆的種皮的至少一部分去除；以及(d)保留在去除涂覆的種皮之后的種子的剰余部分。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是用于選擇具有感興趣的性狀的種子的快速的、有效的、任選地自動(dòng)化的、高通量的方法。 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是在沒(méi)有種皮混淆該分析的情況下對(duì)種子的基因型進(jìn)行精準(zhǔn)的分析。對(duì)基因型的這種分析對(duì)于種子生活力是非破壞性的，并且分析在種植種子之前發(fā)生，從而只種植所選擇的種子，導(dǎo)致減少與產(chǎn)生具有所希望的性狀的種子相關(guān)聯(lián)的時(shí)間、成本以及勞動(dòng)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是使用不破壞DNA的涂層來(lái)去除污染組織，如母體種皮或果皮，并且提高了種子的遺傳分析的準(zhǔn)確性。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是它可以產(chǎn)生用于測(cè)試、基因分型或測(cè)試與基因分型的三種種子成分，即種子、種子切片以及種皮。可以使用ー種方法測(cè)試或基因分型過(guò)程來(lái)給出所有三種類型的種子成分樣品的有效而準(zhǔn)確的分析。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是種皮的保存，該種皮可以用于對(duì)其DNA進(jìn)行測(cè)試、基因分型或測(cè)試與基因分型以便確定母本的基因型。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是它允許分離種子成分樣品。這允許在去除脫離的種皮之后通過(guò)從種子材料中提取淀粉、粗粉、胚芽、粉末、こ醇、油、蛋白質(zhì)來(lái)測(cè)試種子或種子切片。附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明圖I是具有對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)并非清晰可辨的純合以及雜合等位基因的等位基因鑒別圖；并且這個(gè)等位基因鑒別圖的自動(dòng)化分析是不可能的。圖2是使用與圖I中顯示的等位基因鑒別圖中所使用的樣品相同的樣品的等位基因鑒別圖，除了是在沒(méi)有將種皮從所測(cè)試的樣品中排除的情況下測(cè)試種子之外。圖3顯示了三組大豆種子，ー組是未涂覆的對(duì)照(左側(cè))，下一組種子用磁性涂料輕微地涂覆(中間)，最后ー組種子用磁性涂料厚重地涂覆(右側(cè))。圖4是ー個(gè)96孔塊(96 well block)，顯示為每一孔含有脫離的種皮和子葉組織(呈現(xiàn)為種子切片)，已經(jīng)通過(guò)將種子材料暴露于高溫而使種皮和子葉組織分離。圖5顯示了 96叉磁鐵(96 prong magnet),姆個(gè)磁鐵具有附接至ー個(gè)軸的擴(kuò)大的頭部。每個(gè)磁鐵被適配成配合在單個(gè)孔之內(nèi)。圖6顯示插入在含有種皮和子葉組織的96孔塊中的96叉磁鐵(種皮和組織未顯示)。
圖7顯示了從含有子葉組織的孔塊(well block)中提取的涂覆的種皮，該涂覆的種皮通過(guò)吸引カ而保持在磁叉(magnetic prongs)上。圖8顯示了與磁叉磁性接合的涂覆的種皮的特寫照片。圖9顯不了在將圖7和圖8中顯不的磁叉引入含有種子材料以及涂覆的脫尚種皮的孔中之后的圖6的96孔塊。這些叉展示附著于叉上的被吸引的涂覆的種皮。這種叉已經(jīng)與被吸引的涂覆的種皮一起從孔中去除，同時(shí)留下未涂覆的脫離子葉組織保持在96孔中。


圖10顯示了另ー種類型的叉磁鐵的另ー種設(shè)計(jì)，該叉磁鐵具有不同叉數(shù)目和不同叉形狀，但是仍然被適配成從被涂覆以及未涂覆的種子材料的混合物中選擇性地吸引涂覆的種子材料。
圖11顯示了采用叉磁鐵的另ー種方法。叉磁鐵被放置于96孔塊的孔的下方。每個(gè)叉將被磁性涂覆的種子顆粒從超過(guò)ー個(gè)孔吸引至孔塊底部的磁叉上；可以將孔塊倒置以便通過(guò)頂部開ロ去除未涂覆的種子材料，同時(shí)通過(guò)種子上的涂層與磁鐵的磁性吸引強(qiáng)度將涂覆的種子材料保持在閉合的孔底部。
圖12顯示了具有吸引涂覆的種子材料的足夠強(qiáng)度的塊狀或平坦磁鐵。
圖13顯示了置于96孔塊之上以便緊鄰磁鐵固定所吸引的涂覆的種子材料的平坦磁鐵。詳細(xì)說(shuō)明定義本披露中的數(shù)值范圍是近似值，并且因此可以包括范圍之外的值，除非另外指明。數(shù)值范圍包括在下限值與上限值(包括在內(nèi))之間的所有值，這些值以ー個(gè)單位遞增，條件是在任何下限值與任何上限值之間存在至少兩個(gè)単位的間隔。作為ー個(gè)實(shí)例，如果組成、物理或其他特性(例如像分子量、粘度、熔融指數(shù)等)為100至1，000，g在清楚地列舉所有單獨(dú)的值，如100、101、102等，以及子范圍，如100至144、155至170、197至200等。對(duì)于含有小于I的值或含有大于I的分?jǐn)?shù)(例如I. 1、1. 5等)的范圍，在適當(dāng)時(shí)，一個(gè)單位被考慮為
O.0001,0. 001,0. 01或O. I。對(duì)于含有小于10的單個(gè)數(shù)字的范圍(例如I至5)，一個(gè)單位典型地被考慮為O. I。這些只是特殊預(yù)期的實(shí)例，并且在所列舉的最低值與最高值之間的數(shù)值的所有可能的組合將有待考慮清楚地陳述在本披露中。尤其對(duì)于混合物中的成分的相對(duì)量以及在方法中引述的不同溫度和其他參數(shù)范圍的數(shù)值范圍提供在本披露中。術(shù)語(yǔ)“吸引劑”是指以足以允許所希望的物質(zhì)或成分分離的ヵ來(lái)吸引所希望的物質(zhì)或成分的任何物質(zhì)或成分。術(shù)語(yǔ)“污染組織”是指不希望用于特定分析的組織。術(shù)語(yǔ)“涂覆”或“涂覆的”是指單獨(dú)或以成分混合物形式添加至種子的任何物質(zhì)或成分，其中該物質(zhì)或成分具有吸引或結(jié)合至ー種吸引劑的特征。術(shù)語(yǔ)“植物”包括單子葉植物、雙子葉植物以及轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明涉及用于測(cè)試種子材料的有效的、高通量的方法。本發(fā)明尤其有用于要求高純度標(biāo)準(zhǔn)的研究，例如像對(duì)于遺傳修飾性狀的研究。所要求的種子包裝中的種子純度近似地為95%的種子純度。這要求95%或更多的植物是該品種并且不能為非正常型。限制種子為非正常型對(duì)于最終用戶是非常重要的。當(dāng)種子攜帯重要性狀，如對(duì)于害蟲、除草劑或病原體的耐受性或抗性時(shí)，純度是尤其重要的。因此，如果種子攜帶抗昆蟲GM性狀，那么95%或更多的種子必須含有有效量的這種性狀。如果該性狀是殺蟲劑耐受性，那么雜質(zhì)的負(fù)面后果對(duì)于最終種植者是高度可見的，因?yàn)槭褂脷⑾x劑噴霧劑會(huì)導(dǎo)致雜質(zhì)的消除。因此，嚴(yán)格地測(cè)試了種子純度水平。針對(duì)所希望的概貌(profile)使用測(cè)定法來(lái)測(cè)試從種子生長(zhǎng)的幼苗，不論這種特征是基因型、表型或遺傳工程化性狀。使用非正常型幼苗(沒(méi)有所希望的概貌的幼苗)的檢測(cè)數(shù)目來(lái)外推種子批(seed lot)中可能為非正常型的種子的總百分比。雖然當(dāng)雜質(zhì)隨機(jī)分布遍及種子批時(shí)這個(gè)系統(tǒng)可能是非常準(zhǔn)確的，但是如果雜質(zhì)不是隨機(jī)散布遍及該種子批，那么所確定的純度的準(zhǔn)確度是有問(wèn)題的?？傮w上，本發(fā)明提供了改進(jìn)的種子切片測(cè)試，該測(cè)試對(duì)于較大取樣或者在種子批中的所有種子具有快速的結(jié)果(如果總體測(cè)試是所希望的話)。本發(fā)明的改進(jìn)有助于消除以前測(cè)試方法的ー些潛在不準(zhǔn)確性。與使用幼苗相比，使用種子切片可能導(dǎo)致針對(duì)測(cè)定的更少的可檢測(cè)化學(xué)品或化合物。并且與幼苗不同，種子含有更為多祥化的DNA混合物。例如，玉米種子在如胚、胚乳以及種皮的不同種子部分中具有不同的倍性。種皮完全是母體的，胚同時(shí)是母體與父體的，并且胚乳具有兩個(gè)用量的母體以及ー個(gè)用量的父體，使它的倍性成為三倍體。如果測(cè)定所檢測(cè)的特征是在父本上，那么胚和胚乳具有相同的等位基因，并且胚乳中的表達(dá)不會(huì)使結(jié)果偏移。然而，如果特征是在母本上，那么如果等位基因在種皮中 表達(dá)，則可能獲得不準(zhǔn)確或不清楚的測(cè)定結(jié)果。如果種子來(lái)自于自交種類，那么由于雜合體的自交，負(fù)面性狀可能是不引人注意的，并且當(dāng)性狀發(fā)生這種分離時(shí)，那么檢測(cè)更高的性狀純度是實(shí)際的。性狀測(cè)試經(jīng)常是復(fù)雜的，因?yàn)槎嘀匦誀钊缧誀畹娜?四重疊加可能是常見的。在沒(méi)有由額外的種皮信息増加的混淆復(fù)雜性的情況下，能夠測(cè)試來(lái)自同一種子切片的所有性狀將是有用的。如果在測(cè)試之前去除種皮是簡(jiǎn)單的，那么就將它去除。然而，種皮難以從用于測(cè)試的種子材料上脫離并且然后分離。本發(fā)明提供了用于將種皮從其他種子材料分離的自動(dòng)化高通量方法。本發(fā)明提供了無(wú)種皮種子或種子部分，該無(wú)種皮種子或種子部分對(duì)干與鑒定種子材料的事件、標(biāo)記輔助選擇和育種以及遺傳純度相關(guān)的測(cè)試方法是有用的。本發(fā)明還提供了用于對(duì)于種子群體中的沒(méi)有種皮的單粒種子進(jìn)行非破壞性地取樣的自動(dòng)化的、有效的方法。非破壞性的種子取樣方法可以使種子和種子樣品相關(guān)聯(lián)，藉此在一個(gè)高通量平臺(tái)中將種皮去除。這個(gè)平臺(tái)針對(duì)某ー個(gè)或多個(gè)的特征來(lái)測(cè)試已經(jīng)從它的種皮分離的種子樣品，并且選擇相關(guān)聯(lián)的具有這ー個(gè)或多個(gè)特征如事件、標(biāo)記或基因型的種子的種子群體以供進(jìn)一歩使用。借助于無(wú)種皮種子切片測(cè)試結(jié)果的準(zhǔn)確性，可以迅速地選擇并且膨脹種子。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括從種子的所希望的組織中去除污染種子組織。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括從種子樣品中的胚乳衍生組織中去除母體種子組織污染物。在又另ー個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了ー種用于將母體種皮DNA從種子DNA自動(dòng)分離，進(jìn)而對(duì)種子DNA進(jìn)行分析以及基因分型的方法。并且任選地包括ー種用于對(duì)母體種皮DNA進(jìn)行分析以及基因分型的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及ー種用于從所希望的種子組織去除污染或不需要的材料的自動(dòng)化的、高通量的方法。在這個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括從種子組織提取果皮/種皮DNA的步驟。從所得到的組織中提取的DNA的分析提供了未來(lái)植物的明確的基因型。改進(jìn)的種子遺傳特征的基因分型允許改進(jìn)的、更有效的標(biāo)記輔助育種計(jì)劃。
種子可以衍生自單子葉植物或雙子葉植物。單子葉植物的非限制性實(shí)例是草皮、草坪草、谷物、玉米、水稻、燕麥、小麥、大麥、高粱、蘭花、鳶尾(iris)、百合、洋蔥、香蕉、甘蔗、高粱以及棕桐。雙子葉植物的非限制性實(shí)例是鱷梨、馬鈴薯、煙草、番茄、甜菜、綠花椰菜、木薯、甘薯、胡椒、油菜、油菜籽、棉花、瓜類、黃瓜、一品紅、豆類、苜蓿、大豆、胡蘿卜、草莓、萵苣、橡樹、楓樹、胡桃、玫瑰、薄荷、南瓜、雛菊以及仙人掌。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種用于非破壞性地對(duì)種子群體中的單粒種子進(jìn)行取樣的方法，包括從種子中去除污染組織；篩查從在污染組織去除之后得到的種子提取的DNA ;根據(jù)所得到的種子或其一部分的DNA篩查結(jié)果選擇種子；以及利用所選擇的種子來(lái)栽培植物。在一個(gè)實(shí)施方案中，污染組織是母體組織，包括但不限于種皮或果皮。在另ー個(gè)實(shí)施方案中，從種子去除污染組織并不影響種子的發(fā)芽勢(shì)。在另ー個(gè)實(shí)施方案中，去除污染組織是以ー種使得保持種子的剩余組織免受害蟲以及病毒影響的方式來(lái)進(jìn)行的。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及ー種選擇具有所希望的性狀的在群體中的種子的方法，該方法包括(a)以非破壞性的方式將包含涂覆的種子的至少一部分的種子切片從種子群體中的單粒種子去除，(b)將涂覆的種皮從種子切片分離；(c)針對(duì)至少ー種感興趣的性狀的存在或缺乏對(duì)無(wú)種皮種子切片進(jìn)行分析；以及(d)基于至少一種感興趣的性狀的存或缺乏針對(duì)種子群體選擇種子。這些方法可以在不影響種子的發(fā)芽勢(shì)的情況下進(jìn)行，如果這是所希望的話。在一個(gè)實(shí)施方案中，涂覆的種子包括以材料如金屬涂料、磁性涂料、金屬或金屬覆蓋物涂覆的種子。在又另ー個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及選擇具有所希望的性狀的在群體中的種子的方法，該方法包括(a)將涂層施用至種子的至少一部分；(b)以非破壞性的方式將包含涂覆的種皮的至少一部分的種子切片去除，(C)將涂覆的種皮從種子切片分離；(d)針對(duì)至少一種感興趣的性狀的存在或缺乏對(duì)無(wú)種皮種子切片進(jìn)行分析；以及(e)基于至少一種感興趣的性狀的存或缺乏針對(duì)種子群體選擇種子。如果種子的發(fā)芽勢(shì)是重要的，那么可以選擇涂覆，使得種子的發(fā)芽勢(shì)不受影響。在另ー個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括從種子的至少一部分(如種子切片)去除污染組織的至少一部分。種子切片可以使用手工方法獲得，包括但不限于手術(shù)刀、刀或美エ刀。在另ー個(gè)實(shí)施方案中，種子切片可以使用自動(dòng)方法獲得，包括但不限于鉆機(jī)、研磨機(jī)或種子切削裝置。在一些實(shí)施方案中，涂覆在種子上的材料可能會(huì)負(fù)面地影響種子的發(fā)芽勢(shì)。例如，當(dāng)去除種皮并且在破壞類型的測(cè)試參數(shù)方面測(cè)試種子內(nèi)容物吋，那么涂覆對(duì)于發(fā)芽勢(shì)的影響并不是ー個(gè)問(wèn)題。然而，對(duì)于許多方法來(lái)說(shuō)，選擇用于涂覆的材料以避免負(fù)面地影響剩余種子的種子切片生活力。如果用于涂覆的具體材料沒(méi)有負(fù)面地影響種子生活力并且需要種子生活力但是不需要種子切片生活力，那么可以將涂層僅僅施用至作為種子切片的種子部分。在另ー個(gè)實(shí)施方案中，種子切片和種子彼此相關(guān)聯(lián)，使得來(lái)自種子切片的組織、DNA、蛋白質(zhì)、油、淀粉等等的分析的結(jié)果可以歸因于相關(guān)聯(lián)的種子。例如，種子切片可以被標(biāo)示為“SCI”并且種子可以被標(biāo)示為“SE1”，從而允許來(lái)自“SCI”的分析的結(jié)果可以歸因于具體的種子“SE1”。種子切片和種子可以儲(chǔ)存在微量滴定板的相應(yīng)孔中(例如種子切片可以儲(chǔ)存在第一塊板的Al中并且種子可以儲(chǔ)存在第二塊板的Al中)。發(fā)芽勢(shì)表示在取樣之后保持有活力的所取樣的種子的優(yōu)勢(shì)數(shù)目(即所有取樣種子的50%以上)。在具體的實(shí)施方案中，至少大約75%的取樣種子并且在一些實(shí)施方案中至少大約85%的取樣種子保持有活力。應(yīng)當(dāng)指出的是，在某些情況下或者對(duì)于某些應(yīng)用來(lái)說(shuō)，較低比率的發(fā)芽勢(shì)可能是可容忍的，例如，隨著基因分型成本的降低，對(duì)于相同的基因分型成本，可以對(duì)更大數(shù)目的種子進(jìn)行取樣。在一個(gè)實(shí)施方案中，從種子去除污染組織包括將涂層施用至種子并且使用該涂層將所希望的組織從所不希望的組織分離。這種涂覆的污染組織是種皮或果皮。涂層可以施用在整個(gè)種子、3/4種子、1/2種子、1/3種子、1/4種子或僅用于測(cè)試的種子的一部分或甚至將被測(cè)試的種子的一部分的亞群上。必須施用涂層以允許污染組織被吸引并且將其從種子材料的剰余部分去除。取決于在下游如何進(jìn)ー步處理種子，種子的部分涂覆可能是足夠的或者完全涂覆可能是必需的?？梢栽诎l(fā)生種子的任何分隔之前或之后施用涂層?？梢允┯猛繉右淮位蛞淮我陨?。還可以使用超過(guò)ー種類型的涂層。 該涂層可以是可以用來(lái)將所希望的材料從所不希望的材料分離的任何物質(zhì)，包括但不限于金屬涂料、磁性涂層、磁性涂料、基于金屬的涂層、金屬涂層、帶有正電荷的涂層或帶有負(fù)電荷的涂層。金屬涂料的非限制性實(shí)例是Krylon，磁性涂料的非限制性實(shí)例是RustOleum Metallic 底漆(Vermon Hills, IL)、液體壤嵌壁磁性涂料(liquid mosaic wallmagnetic paint； (Scientifics, Tonawanda, Njf=l Kling Magnetics (Chatham, NJ)的神奇壁磁性涂料(magic wall magnetic paint)。涂層可以是順磁性材料，包括但不限于鋁、銅、鋰、鎂、鑰、鉬以及鉭。涂層可以是鐵磁性材料，包括但不限于鈷、鐵、鎳、釓、鋼?；蛘呖梢杂米鞔呕饘俚娜魏位衔?。涂層可以以允許從種子材料的剰余部分中去除污染組織的任何方式進(jìn)行施用，這些方式包括但不限于噴涂、刷涂、浸涂、電噴涂、浸泡或浸潰。在一個(gè)實(shí)施方案中，將ー種金屬涂料涂層施用于種子。然后將種子置于種子切削裝置中，如顯示于美國(guó)專利號(hào)7，502, 113中的裝置或在美國(guó)申請(qǐng)公布2010/0050300中的裝置，這些申請(qǐng)通過(guò)引用以其全部?jī)?nèi)容進(jìn)行結(jié)合。將種子切片以及被連接并且被涂抹的種皮安放于容器，如微量滴定板的孔之中。通過(guò)緊鄰?fù)繉臃胖美缦翊盆F的吸引力來(lái)手工或自動(dòng)地將種皮從種子切片迅速去除?？梢允褂萌魏晤愋偷奈齽?，只要吸引劑對(duì)于涂層具有足夠的親和力以允許去除涂覆的材料即可。吸引劑可以采用任何形式，包括固體、液體或氣體。吸引劑與涂層可以直接接觸或間接接觸。可以一次或一次以上施用吸引劑來(lái)去除涂覆的材料。吸引劑的多輪施用可能有助于去除涂覆的材料。只要例如遺傳分析的測(cè)試的效率和準(zhǔn)確度得到提高，就可以去除任何量的涂覆的材料，這種提高包括但不限于從大約1%提高直至100%提高，或從大約5%直至95%的任何一點(diǎn)的提高，或大約10%直至90%的任何一點(diǎn)的提高，或大約20%直至80%的任何一點(diǎn)的提高，或大約30%直至70%的任何一點(diǎn)的提高，或大約40%直至60%的任何一點(diǎn)的提高，或大約50%至大約55%。如果粘附的組合物足夠強(qiáng)地被磁化以便用金屬來(lái)提取，ー種有用的吸引劑是金屬片。如果種子用磁性或金屬組合物涂覆，另ー種有用的吸引劑是磁鉄。這可以是塊磁鐵，參見
圖12。吸引劑可以是由電磁鐵產(chǎn)生的磁力，因此該吸引劑能夠被接通和斷開。具有N48、N50以及N52等級(jí)的的磁鐵，如釹(NdFeB)磁鐵，足以吸引被輕微涂覆的松開的種皮。總體上，磁鐵強(qiáng)度與“ N”數(shù)相關(guān)聯(lián)，但不總是這樣。N52是磁鐵材料。磁鐵的強(qiáng)度來(lái)自于它被磁化的充分程度，希望達(dá)到飽和。這類釹磁鐵(又稱為NdFeB、NIB或Neo磁鐵)是稀土磁鐵。這些被歸類為永久磁鐵，并且由形成四方晶體結(jié)構(gòu)Nd2Fel4B的釹、鐵以及硼的合金制成。這是最強(qiáng)的、容易找到的永久磁鐵。但是也可以使用由不同合金或電磁鐵制成的其他磁鐵。如果磁鐵足夠強(qiáng)以便吸引涂覆的種皮并且將它從靠近其他種子組織的位置提取出，那么就可以在本發(fā)明的范圍內(nèi)使用這種磁鐵。打開或關(guān)閉吸引力的能力允許較容易地重新安置所吸引的種皮材料。通過(guò)關(guān)閉吸引力，可以將涂覆的種皮從磁鐵排出至新的位置中，例如在用于測(cè)試的不同的孔塊中，或者在與從中提取出種皮的切片/或種子相關(guān)聯(lián)的另ー個(gè)位置中，或者如果不需要種皮時(shí)排出至廢物容器中。圖5顯示了作為分叉磁鐵的磁鐵。這種磁鐵的叉被適配成下降至定位或儲(chǔ)存種子切片和涂覆的種皮的孔區(qū)域之中。種皮上的磁性涂料被吸引至磁鐵。這種吸引允許涂覆的種皮組織從未涂覆的種子組織的位置的提取。圖5的磁鐵具有與這種塊所具有的孔的數(shù)目相同的叉數(shù)目。取決于種子組織的儲(chǔ)存容器，磁鐵可以被適配成具有不同的叉數(shù)目、形狀、強(qiáng)度、大小以及長(zhǎng)度。磁鐵可以具有任何數(shù)目的叉。當(dāng)從所希望的種子組織自動(dòng)去除涂覆的污染種子組 織時(shí)，具有與塊中的孔數(shù)目相對(duì)應(yīng)的磁鐵叉將是有用的?？商娲兀盆F可以具有與孔塊中的一行或一列的數(shù)目或?qū)挾认嚓P(guān)聯(lián)的叉。另外，磁鐵可以具有足以同時(shí)處理超過(guò)ー個(gè)孔塊的叉，或者它可以是被適配成在個(gè)別化基礎(chǔ)上提取種皮的單ー叉磁鐵。如在圖6中所示，磁鐵被下降至孔中并且被脫離的涂覆的種皮被吸引到磁鐵叉上。如在圖7和8中所示，當(dāng)磁鐵叉離開孔時(shí)，種皮粘附到磁鐵上。圖9顯示了現(xiàn)在僅含沒(méi)有種皮污染物的種子切片的孔。然而，具有未涂覆的対照的孔將保留于孔中，并且不會(huì)粘附至吸引劑，因此不會(huì)由磁鐵提取出。圖7和8的磁鐵叉各自保持単獨(dú)的污染種子組織，在這種情況下即涂覆的種皮。可以以使種子組織污染物與它的相對(duì)應(yīng)的種子切片/種子相關(guān)聯(lián)的方式將污染種子組織重新安置于分開的微孔之中。這允許采用種子污染物來(lái)測(cè)試如種子母體基因型這樣的信息?？梢杂枚喾N方式來(lái)完成涂覆的種皮的去除。原則是使可能含有種皮的涂覆的種子部分從所希望的組織分離。一種簡(jiǎn)單方法是用磁鐵覆蓋整個(gè)微量滴定板，參見
圖12和圖
13。使微量滴定板(或其他收集裝置)翻轉(zhuǎn)倒置數(shù)次。以與微量滴定板的孔中的相關(guān)聯(lián)的種子切片相同的型式將涂覆的種皮定位在磁鐵上。為了促進(jìn)污染種子組織與所希望的種子組織的關(guān)聯(lián)，可以將孔型式(well pattern)放置于磁鐵之上，使污染物與所希望的種子組織的關(guān)聯(lián)更加直觀?？商娲?，可以將單獨(dú)的磁鐵插入許多孔之中，參見
圖10和11或者插入孔中的每ー個(gè)之中，參見圖5?？商娲兀梢詫ⅸ`個(gè)微量滴定板倒置于容納種子組織的微量滴定板頂部，并且可以將污染種子組織以及磁鐵施加于該板頂部，從而將污染種子組織抽吸至第二微量滴定板之中。也有可能通過(guò)在原始種子切片收集裝置的底部用磁鐵捕獲種皮，同時(shí)將所希望的種子組織傾倒至新的容納裝置中，從而將所希望的組織轉(zhuǎn)移至新的容納裝置中。這些類型的種子污染物處理程序尤其適合于高通量自動(dòng)化操作。這個(gè)過(guò)程包括使種皮從種子切片上脫離，同時(shí)將種皮從多個(gè)種子切片分離，然后將這些種子切片定位于測(cè)試設(shè)備之內(nèi)。ー種同時(shí)將種皮從多個(gè)種子切片分離的方法采用機(jī)械臂緊鄰種子組織容納裝置而定位吸引劑。污染種子組織被抽出，該臂使所抽出的污染組織移動(dòng)至新的位置，并且種子切片被進(jìn)ー步處理。容納裝置中的沒(méi)有污染種子組織的種子切片可以被處理用于測(cè)試這種種子組織的基因型或表型特征。測(cè)試經(jīng)常涉及使用來(lái)自用于遺傳測(cè)試的種子組織的DNA。然后將結(jié)果進(jìn)行分析并且用于各種育種選擇之中。在另ー個(gè)實(shí)施方案中，該方法進(jìn)ー步包括在去除污染組織之前將污染組織從種子切片上松開。取決于種子的類型、種子的年齡以及收獲種子的方法，可能需要或者可能不需要松開污染組織。一種用于松開污染種子組織的過(guò)程顯示于美國(guó)專利7，141，260中，該專利披露了一種對(duì)玉米種子進(jìn)行超聲處理以便將果皮從剩余種子組織上松開的方法。超聲處理機(jī)制用來(lái)產(chǎn)生超聲能量并且賦予將污染種子組織(如果皮)松開的超聲波能量。然后使用摩擦式研磨機(jī)(frictional mill)來(lái)研磨經(jīng)過(guò)超聲處理的種子以便將松開的污染組織(如種皮)從胚乳分離，而不破壞胚乳DNA。在另ー個(gè)實(shí)施方案中，可在使種子經(jīng)受污染組織的松開之前或之后施用涂層。如果在松開步驟之前施用涂層，就要選擇能夠經(jīng)受住松開過(guò)程的涂層，使得涂層保留在松開的種皮上。 在另ー個(gè)實(shí)施方案中，含有污染組織(如種皮)的涂覆的種子切片可以直接被抽吸至微量滴定板的新的孔中。DNA可以從污染組織中提取出并且進(jìn)行分析以便確定母體植物的基因型。可替代地，可簡(jiǎn)單地拋棄污染組織(如種皮/果皮)，或者可以測(cè)試它的其他基因型性狀。在另ー個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括從所希望的組織提取DNA?？梢允褂脼楸绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的提供足夠DNA產(chǎn)量、DNA質(zhì)量以及擴(kuò)增的任何DNA提取方法。適合的DNA提取方法的非限制性實(shí)例是使用離心的基于SDS的提取。另外，可以使用已知的擴(kuò)增方法(包括但不限于PCR以及定量PCR)來(lái)擴(kuò)增提取的DNA。在另ー個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括針對(duì)所希望的性狀或遺傳標(biāo)記來(lái)篩查DNA。標(biāo)記的非限制性實(shí)例包括但不限于基因、內(nèi)含子、外顯子、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)、單核苷酸多態(tài)性(SNP)、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)、隨機(jī)擴(kuò)增DNA多態(tài)性(Rapd)、確定基因的存在和/或拷貝數(shù)(包括GMO以及倍性數(shù))的實(shí)時(shí)PCR以及簡(jiǎn)單重復(fù)序列(SSR)。另外的標(biāo)記為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知并且描述于分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(Molecular CloningiALaboratory Manua)(弟三版，Cold Spring Harbor Press)中。通過(guò)去除污染組織(如種皮或果皮)，剩余種子材料的遺傳分析更加準(zhǔn)確，導(dǎo)致增加了適當(dāng)選擇的種子的數(shù)目。另外，容易地排除了不具有感興趣的遺傳標(biāo)記或性狀的種子，并且因此通過(guò)不種植缺乏所希望的概貌的種子而節(jié)約資源，如時(shí)間、資金以及勞動(dòng)。通過(guò)實(shí)施在此披露的方法，可以增加具有感興趣的所希望的遺傳標(biāo)記、基因型、表型或性狀的種子的鑒定。所希望的性狀可以是完整的遺傳概貌?？商娲兀梢允亲鳛轱@性或隱性等位基因而存在的表型或基因位點(diǎn)。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，基因位點(diǎn)賦予例如以下性狀例如像雄性不育、蠟質(zhì)淀粉、抗蟲性、除草劑抗性、昆蟲抗性，對(duì)于細(xì)菌、真菌、線蟲或病毒疾病的抗性，收率、抗倒伏性、高度、成熟度、水分利用效率、淀粉酶、對(duì)養(yǎng)分缺乏的抗性、籽粒組成，以及改變的脂肪酸、肌醇六磷酸或碳水化合物代謝?；蛭稽c(diǎn)可以是通過(guò)回交而引入該品種的親本基因組中的自然存在的基因、自然或誘導(dǎo)突變，或通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)引入的轉(zhuǎn)基因。當(dāng)通過(guò)轉(zhuǎn)化引入時(shí)，基因位點(diǎn)可包括整合在単一染色體位置處的ー個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)基因或者整合在多個(gè)染色體位置處的ー個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，種子的概貌、基因位點(diǎn)或基因標(biāo)記是通過(guò)選自下組的方法檢測(cè)的，該組包括等位基因特異性PCR、凝膠電泳、毛細(xì)管電泳、微通道電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、熒光檢測(cè)、熒光偏振、DNA序列測(cè)定、桑格雙脫氧測(cè)序法、ELISA、質(zhì)譜法、飛行時(shí)間質(zhì)譜法、四極桿質(zhì)譜法、扇形磁場(chǎng)質(zhì)譜法、扇形電場(chǎng)質(zhì)譜法、熒光測(cè)定法、紅外光譜測(cè)定法、紫外光譜測(cè)定法、恒電勢(shì)電流測(cè)定法(palentiostatic amperometry)、DNA雜交、DNA微陣列、GeneChip陣列、HuSNP陣列、BeadArrays、MassExtencU SNP-IT、適用于等位基因確定的TaqMan測(cè)定以及實(shí)時(shí)PCR、Invader測(cè)定、MassCleave、DNA印跡、狹線印跡(slot blot)以及斑點(diǎn)印跡等等。轉(zhuǎn)向
圖1，這個(gè)圖顯示了來(lái)自具有種子組織污染物的大豆種子切片的等位基因鑒別圖。從具有種皮材料的種子切片中提取DNA。純合以及雜合等位基因不是清晰可辨的。由于雜合型的幅寬(breadth)，不清楚哪些種子系(seed line)實(shí)際上是純合的?；诖藞D，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員不能夠鑒定圖上的與所有真實(shí)純合測(cè)試結(jié)果以及所有雜合測(cè)試 結(jié)果相對(duì)應(yīng)的點(diǎn)。污染種子組織的母體DNA使這個(gè)圖的結(jié)果發(fā)生偏斜；并且自動(dòng)化分析是不可能的。圖I曲線可以與圖2曲線相比較。圖2的圖是如圖I中顯示的樣品等位基因鑒別圖，然而，這個(gè)圖涉及到在DNA提取之前污染種子組織(大豆種皮)從其去除的種子切片DNA。用缺乏種皮的種子切片所獲得的這個(gè)圖顯示了哪些種子是純合材料與哪些種子是雜合的之間的清楚區(qū)分。圖I和圖2中的這些圖，分別具有母體DNA和沒(méi)有母體DNA，顯示了種皮所產(chǎn)生的偏斜效應(yīng)。通過(guò)將種子涂覆以涂層并且在必要時(shí)通過(guò)冷凍干燥、超聲處理或加熱來(lái)使種皮松開，本發(fā)明的這些方法以高通量、自動(dòng)化的方式消除了這種DNA污染物。一旦種皮被松開，通過(guò)應(yīng)用ー種吸引劑來(lái)去除顯示在圖2中的涂覆的母體組織。在這種情況下，該涂層是磁性涂料并且該吸引劑是磁鉄。無(wú)種皮種子切片以及被去除的種皮兩者都具有可以測(cè)試并且使用的DNA。種子切片中的遺傳物質(zhì)對(duì)于篩查植物倍性、在回交育種計(jì)劃中的復(fù)現(xiàn)親本等位基因、在批量育種群體中的純合性，選擇或檢測(cè)轉(zhuǎn)基因、天然等位基因或親本等位基因是有用的。在種植之前對(duì)種子基因型或表型的鑒定允許鑒定并且選擇攜帶所希望的性狀的種子，并且因此允許淘汰不需要的種子。通過(guò)在PCR測(cè)試之前使用本發(fā)明的方法從種子切片中去除母體組織，測(cè)試結(jié)果更加準(zhǔn)確并且改進(jìn)了種子的選擇。去除種皮并且因此去除種皮DNA使得胚乳的分析更加容易。該方法允許在無(wú)種皮的偏斜效應(yīng)的情況下確定準(zhǔn)確的種子胚乳接合性(seedendosperm zygosity)。準(zhǔn)確地檢測(cè)所希望的種子的能力導(dǎo)致在育種計(jì)劃中所種植的姆ー群體的種子的行數(shù)減少。因?yàn)檩^少種子被錯(cuò)誤鑒定，種植較少的所希望的種子，更有效地利用了時(shí)間以及大田空間，并且育種或轉(zhuǎn)換計(jì)劃使大田空間增加測(cè)試的群體數(shù)量。這種測(cè)試準(zhǔn)確性的提高導(dǎo)致土地利用提高、土地需求減少以及勞動(dòng)成本降低等?？梢赃M(jìn)ー步應(yīng)用本發(fā)明的這些方法來(lái)鑒定用于轉(zhuǎn)基因測(cè)試的雜交種子。例如，在BCnFl階段中的近交系的轉(zhuǎn)化中，雜交種子批針對(duì)感興趣的性狀是50%半合子的并且針對(duì)缺乏的性狀是50%純合的。為了產(chǎn)生用于測(cè)試的雜交種子，應(yīng)當(dāng)篩查不具有果皮污染種子組織的這種材料以便鑒定作為半合子的Fl種子。這種種子污染組織分離方法的有利之處在于可以選擇并且分析僅僅來(lái)自具有正確性狀接合性遺傳學(xué)的雜種的產(chǎn)量數(shù)據(jù)。可以在具有種子之前獲得此數(shù)據(jù)，這些種子可以產(chǎn)生能夠產(chǎn)生這種接合性的大田植物。本發(fā)明提供了ー種允許對(duì)具有或不具有特定的所希望的性狀、標(biāo)記或基因型的適當(dāng)種子塊進(jìn)行種子切片測(cè)試和鑒定的設(shè)備和方法。種子切片，尤其是玉米、甜瓜、南瓜或大豆種子切片，允許以高通量方式從種子切片去除種皮組織。在本發(fā)明方法的操作中，種子是輕微涂覆的。這種涂層可以用吸引劑覆蓋整個(gè)種子表面或僅僅種子表面的一部分。容易獲得的ー種涂層是磁性涂料?？梢圆捎萌魏畏绞綄⑼苛系谋邮┯弥练N子外表面的一部分。例如，可以使種子在涂料中滾轉(zhuǎn)，用涂層材料刷涂、輕觸或噴涂種子。在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，將Krylon磁性涂料如此薄地噴涂于種子外表面上，使得大豆的種臍保持可見。磁性涂料的這種薄涂層是足以允許發(fā)生種子組織分離的 涂層。允許種子的被涂抹的表面干燥，然后將種子材料的小切片去除，留下種子的有活力的剰余部分。種子切片含有種子材料以及附著至切片的外部種子表面的輕微涂抹的種皮。用于從較大種子片切削小的種子片的設(shè)備是已知的。多年以來(lái)，通過(guò)切割、鋸切、鉆孔、切片、剪裁手工地切削種子，可以用指甲鉗、裁紙刀、剪刀、刀子、鉆機(jī)、鋼絲鉗、鋸子等等的任何ー種來(lái)切削種子?？梢圆捎媚軌蛉コN子片的任何儀器。這些手工種子切削方法已變得自動(dòng)化，因?yàn)榉N子測(cè)試變得更快速而有效。例如，如在WO 2010/022286中顯示的自動(dòng)激光切削裝置，以及在EP1991043及其美國(guó)副本中顯示的自動(dòng)織錦鋸裝置已經(jīng)使先前的手工種子切削程序自動(dòng)化。通過(guò)使用高速鋸、電動(dòng)刀、鉆機(jī)或激光器的自動(dòng)切削經(jīng)常在切片中產(chǎn)生高溫，導(dǎo)致種子和種皮組織變得彼此緊緊地成型在一起。因?yàn)榉N皮組織可能使種子測(cè)試的結(jié)果偏斜，在種子切片測(cè)試之前種皮的脫離和去除是所希望的。自動(dòng)切削產(chǎn)生的高溫成型使得種皮從種子切片上松開或脫離是有問(wèn)題的。松開種皮的已知方法包括將種子暴露于升高的烘箱溫度、延長(zhǎng)的在水中的浸泡、以及種子的超聲處理。使種皮從種子切片組織上脫離的另ー種已知的方法是通過(guò)將切片(或如果種子本身不是被保存為用于發(fā)芽，將種子)放置于液氮之中。使用液氮使種子與種皮材料脫離是昂貴的并且要求特殊化學(xué)儲(chǔ)存和處理。使用氮的方法顯示于W. John Mullin等人，J. Agric. Food Chem.，2001，49 (11)，第 5331 - 5335 頁(yè)中。本發(fā)明包括促進(jìn)污染種子組織從種子組織上松開的新發(fā)現(xiàn)的實(shí)驗(yàn)方案。將幾微升的100%こ醇施用至附著在一起的污染種子組織與種子組織，使兩種組織松開。當(dāng)切片在微孔中時(shí)，足以覆蓋這些切片的僅少量こ醇迅速與成型的種子切片和種皮相互作用，以便使種皮與子葉組織脫離并松開。出人意料地發(fā)現(xiàn)通過(guò)添加像醇這樣的揮發(fā)性液體誘導(dǎo)了種皮從種子組織上脫離?？梢杂玫驼魵鈮旱囊后w(例如70%こ醇)稀釋這種揮發(fā)性液體。并且可使用許多不同類型的醇，只要這些化學(xué)品沒(méi)有負(fù)面地影響待處理和/或測(cè)試的所希望的種子組織的能力即可?？梢栽跊](méi)有過(guò)度實(shí)驗(yàn)的情況下使用揮發(fā)性液體，如丙酮、異丙醇、丙醇、甲醇、丁醇等等。在使污染種子組織從種子組織上松開的本發(fā)明方法中，こ醇在室溫下在護(hù)罩下從容納種子組織的微孔中蒸發(fā)。更有效的過(guò)程可以采用在高溫下的烘箱以便促進(jìn)こ醇從微孔中的更有效去除。こ醇有效地將種皮從種子切片上松開，在微孔中留下兩個(gè)分開的種子組織部分存在于種皮部分中的母體DNA、以及由子葉組織構(gòu)成的種子切片部分。另ー種實(shí)驗(yàn)方案采用水使種皮與子葉組織脫離。此不是優(yōu)選的過(guò)程，因?yàn)閮蓚€(gè)種子組織傾向于膨脹，使得它們更大并且更重。污染組織中的水的重量要求涂層是更厚的，使用更多磁性涂料和更強(qiáng)的磁鐵來(lái)升高污染種子組織的重量。然而，水重量問(wèn)題的ー個(gè)部分解決方案是使水從孔和種皮中蒸發(fā)。本發(fā)明在操作中用磁鐵來(lái)捕獲磁化的污染種子組織。這允許將污染種子組織定位干與所希望的種子組織不同的位置處。最初，將種子用磁性涂料厚重地涂覆，但是已發(fā)現(xiàn)輕微地涂覆的種子是非常有用的并且更輕。切削用磁性涂料涂覆的大豆種子，并且將切片轉(zhuǎn)移至96孔塊。然后可將該塊放置于65° C的烘箱中以便將種皮組織從子葉組織分離。用磁性涂料磁化的種子在烘箱加熱過(guò)程中使它們的種皮松開，然后松開的種皮經(jīng)受處于磁鐵形式的吸引力。可替代地，松開可以通過(guò)本發(fā)明的こ醇實(shí)驗(yàn)方案來(lái)進(jìn)行，不管松開兩個(gè)種子組織的過(guò)程如何，在一個(gè)組織上的涂層允許種子組織分離。 顯示在這些圖中的種子組織分離涉及具有被適配成在微孔的開放部分之內(nèi)滑動(dòng)的単獨(dú)的叉的磁鐵。在種皮組織上的磁性或金屬涂料被吸引到磁鐵上，當(dāng)然，缺乏涂料的內(nèi)部種子切片組織未被吸引到該磁鐵上。因此，與磁鐵或金屬磁性接合的脫離的種皮然后可以從96孔塊中提升出，將子葉種子組織留在孔中。圖6顯示了與脫離的種子組織分離之后的磁性接合的種皮。涂覆的種皮附著至磁鐵；參見圖8，處于與孔中的相關(guān)聯(lián)的種子切片相同的型式。這允許所分離的種子組織材料彼此相關(guān)聯(lián)或與從其取得該材料的剩余種子相關(guān)聯(lián)?？傮w上，圖3-9顯示了用本發(fā)明的磁化系統(tǒng)來(lái)分離大豆污染組織與子葉種子組織的步驟。如果緊鄰ー個(gè)第二相關(guān)聯(lián)器皿定位具有種皮的磁鐵的同時(shí)釋放該磁鐵的磁力，則可以將這些污染組織釋放到該器皿中。該器皿可為第二微孔滴定板。這些圖顯示了可以在這個(gè)系統(tǒng)中采用替代性的板樣磁鐵而不是分叉磁鐵。可以用覆蓋整個(gè)板的大磁鐵來(lái)分離果皮，該大磁鐵充當(dāng)該孔板的蓋子?？蓪⒖装宓怪靡员銓⑼扛驳墓ぞo密靠近磁鐵板來(lái)放置。然后可以將具有大蓋子樣磁鐵的微孔滴度板扶正。涂覆的果皮材料將粘附到磁鐵上并且種子切片將處于孔中。僅出于說(shuō)明目的而提供了這些實(shí)例并且本發(fā)明絕不應(yīng)當(dāng)理解為限制于這些實(shí)例，而是應(yīng)當(dāng)理解為涵蓋由于在此提供的傳授內(nèi)容而變得明顯的任何以及所有變化形式。實(shí)例實(shí)例I :處理大豆將大豆種子用磁性涂料在整個(gè)種子表面上輕微地涂覆。在種子與噴嘴之間大約15英寸的距離下施用Krylon磁性涂料噴霧劑的非常薄的涂層。在涂料干燥之后，從每ー個(gè)種子去除小切片。種子切片或樣品的選擇可以通過(guò)將種子放置于如在美國(guó)專利7，502，113中展示的自動(dòng)種子切割裝置中來(lái)實(shí)現(xiàn)，該專利全部通過(guò)引用結(jié)合在此。將種子切片收集于微孔滴定板中。I.涂覆的種子切片可以具有彼此粘附的種皮與種子組織，但是在這種情況下采用剃刀將種子切片從種子分離。通過(guò)將孔/塊(或所采用的其他收集裝置)放置于65° C-75° C的烘箱中來(lái)分離這些材料。通過(guò)這些高溫將大豆種子脫皮是由食品加工行業(yè)使用的標(biāo)準(zhǔn)程序。涂覆的種子切片還可以在稍微高于或低于65° C-75° C的溫度下干燥，條件是它使外皮或種皮脫離。2.在使用激光器來(lái)切割種子的其他實(shí)驗(yàn)中，將種子放置于烘箱或冷凍干燥機(jī)/食物加工機(jī)中，以便使涂覆的種皮從其余種子組織脫離。高溫或冷凍干燥機(jī)的使用在大約70%的所有樣品上發(fā)生作用，將種皮從種子切片切開。3.如果子葉與種皮組織仍然彼此附著，可以將高溫與冷凍干燥機(jī)過(guò)程結(jié)合。另外，這些種皮脫離過(guò)程的任何一個(gè)或兩個(gè)可以與振動(dòng)步驟結(jié)合或隨后進(jìn)行振動(dòng)步驟。微孔滴定板可以放置在振動(dòng)器中用于使種皮另外地從切片上剝離。為了實(shí)現(xiàn)兩個(gè)組織的更有效地切開，可以采用這些步驟中的所有三個(gè)和/或?qū)⑺鼈兘M合而使種子和種皮脫離。4.如果在使用冷凍干燥機(jī)或烘箱之后，將微孔垂直振動(dòng)，則兩個(gè)組織的稍微更高 程度的切開是有可能的。然而，使用這種切開過(guò)程可能導(dǎo)致ー些損失(escape)。步驟2 :用磁鐵捕獲磁化的種皮并且將它們從種子切片位置去除通過(guò)施用吸引劑將用磁性涂料磁化并且松開的種皮從塊的孔中去除。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，種皮上的磁性涂料被磁鐵吸引?？梢杂酶鞣N方式來(lái)進(jìn)行涂覆的種皮的去除一種簡(jiǎn)單的方法是用磁鐵覆蓋整個(gè)塊。將這個(gè)塊(或其他收集裝置)翻轉(zhuǎn)倒置幾次。這樣以與微孔中的相關(guān)聯(lián)的種子切片相同的型式將涂覆的種皮定位于磁鐵上。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，將顯示在圖6中的單獨(dú)的磁鐵插入每個(gè)孔中。圖6顯示了可以在此實(shí)驗(yàn)中使用的許多磁鐵叉。圖6-13顯示了構(gòu)成本發(fā)明的不同實(shí)施方案的不同形式的磁鉄。這些類型的磁鐵中的每ー個(gè)可以如圖中所示那樣使用。這種磁鐵被良好適配成在自動(dòng)化系統(tǒng)中使用。磁鐵可以通過(guò)機(jī)械方式下降至孔中并且將脫離的種皮吸引到磁鐵叉上。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，將這些叉手工地下降至孔中，到達(dá)孔底部的極小距離范圍之內(nèi)。當(dāng)這些磁鐵叉從単獨(dú)的孔中抽出時(shí)，種皮粘附到磁鐵上，而種子切片保持在這些孔中。將種皮重新安置干與切片或種子位置分開的位置。可以將種皮定位在具有孔的另一個(gè)微孔板中，這些孔與種皮自其脫離的種子切片/種子相關(guān)聯(lián)。這些種皮然后可以用于進(jìn)ー步測(cè)試。或者如同在這種情況下，可以通過(guò)從磁鐵叉的尖端擦掉并且拋棄而重新安置種皮?？商娲?，可以將96孔板放置在種皮/種子切片容納板的頂部，并且可以將磁鐵施用至頂部孔的底部，將涂覆的種皮從種子切片上吸走進(jìn)入第二孔板中。通過(guò)在原始種子切片收集裝置的底部用磁鐵捕獲種皮也將是可能的，從而將子葉組織轉(zhuǎn)移至新的容納裝置中。然后將具有種子切片并且不具有混淆性種皮的微量滴定板放置在自動(dòng)PCR系統(tǒng)中以便進(jìn)行基因型測(cè)試。將遺傳分析的結(jié)果計(jì)分并且選擇與具有所希望的基因型結(jié)果的種子切片相關(guān)聯(lián)的種子，以便進(jìn)一歩培育和收獲。實(shí)驗(yàn)2可以采用實(shí)驗(yàn)ー的步驟。來(lái)自這個(gè)實(shí)驗(yàn)的種皮可以用于確定磁性涂料的輕微涂覆是否會(huì)消除將種皮用于測(cè)試目的的能力。一種測(cè)試將用于查明是否在用吸引劑涂覆之后DNA提取會(huì)變得復(fù)雜。所分離的種皮可以放置在自動(dòng)PCR系統(tǒng)中以便確定是否可以針對(duì)母本上的信息或來(lái)自母本的性狀對(duì)母體DNA進(jìn)行測(cè)定。種皮DNA在它被測(cè)試時(shí)應(yīng)當(dāng)提供預(yù)期的母本DNA基因型，盡管具有磁性涂料的輕微涂覆。實(shí)驗(yàn)3這些種子處于三個(gè)組中一個(gè)是未被涂抹的種子對(duì)照，ー個(gè)種子組用磁性涂料輕微噴涂，并且另ー個(gè)種子組用金屬涂料輕微噴涂。用剃刀刀片從種子上切割種子切片。將具有三個(gè)切片的第二組用激光器切削并且將種子種植于溫室中以確定涂料對(duì)于種子產(chǎn)生有活力的植物的生活力的影響。檢查植物以確定是否存在由切割并且涂覆的種子所產(chǎn)生的正常幼苗。與未被涂抹的種子對(duì)照組的出苗和生長(zhǎng)相比，這些幼苗的出苗和生長(zhǎng)并沒(méi)有顯著不同。雖然已經(jīng)在此說(shuō)明并且描述了具體實(shí)施方案，但是將由本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到的是，可以用被推測(cè)為實(shí)現(xiàn)相同目的的任何安排來(lái)替代所展示的具體實(shí)施方案。本申 請(qǐng)旨在涵蓋根據(jù)所描述的本發(fā)明的原理起作用的任何改變或變化形式。因此，預(yù)期的是本發(fā)明僅僅由權(quán)利要求書以及其等同物限制。
權(quán)利要求
1.一種選擇具有所希望的性狀的在群體中的種子的方法，該方法包括 (a)將涂層施用至種子群體中的種子的至少一部分上； (b)以非破壞性的方式將包含種皮的至少一部分的種子切片從該涂覆的種子上去除； (C)將該種皮從該種子切片分離； (d)針對(duì)至少ー種感興趣的性狀的存在或缺乏對(duì)該無(wú)種皮種子切片進(jìn)行分析；以及 (e)基于至少一種感興趣的性狀的存在或缺乏選擇種子。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其中以非破壞性的方式將包含種皮的至少一部分的種子切片從單粒種子上去除不影響發(fā)芽勢(shì)。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其中該種子是大豆或玉米種子。
4.如權(quán)利要求I所述的方法，其中該涂層對(duì)磁力有反應(yīng)。
5.如權(quán)利要求I所述的方法，其中該涂層是磁性涂料。
6.如權(quán)利要求I所述的方法，其中將該種皮從該種子切片分離包括使用結(jié)合至該涂層的吸引劑。
7.如權(quán)利要求I所述的方法，其中對(duì)該無(wú)種皮種子切片進(jìn)行分析包括從所述無(wú)種皮種子切片提取DNA。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中從所述無(wú)種皮種子切片提取DNA產(chǎn)生了DNA，與該種子切片相比，該DNA具有顯著更少的母體DNA。
9.如權(quán)利要求I所述的方法，其中將該種皮從該種子切片分離包括將許多種子切片定位在測(cè)試設(shè)備中并且同時(shí)將種皮從多個(gè)種子切片分離。
10.如權(quán)利要求I所述的方法，包括在去除該種子切片之前將該種皮從該種子上松開。
11.如權(quán)利要求I所述的方法，包括在分尚該種皮之前將該種皮從該種子切片上松開。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中將該種皮松開包括對(duì)該種子切片進(jìn)行超聲處理。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，進(jìn)ー步包括以不顯著改變所測(cè)試的性狀的水平來(lái)施加熱量。
14.如權(quán)利要求I所述的方法，進(jìn)ー步包括用所選擇的種子來(lái)培育植物并且任選地包括從所培育的植物收獲種子。
15.一種用于將種子污染組織從種子組織的至少一部分中分離的方法，包括(a)將涂層施用至種子的至少一部分；(b)將種子污染組織從該種子組織的至少該部分上松開；(C)將該涂覆的種子污染組織從所述種子組織的至少一部分上分離；以及(d)在去除該涂覆的種子污染組織之后，保留該種子的剰余部分以供進(jìn)一歩使用。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中松開包括將種子污染物和種子組織浸潰于液體中的步驟。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中去除該涂覆的種子污染組織包括使用吸引劑。
18.如權(quán)利要求18所述的方法，其中該吸引劑是磁鉄。
19.如權(quán)利要求15所述的方法，其中將該種子污染組織從該種子組織上松開采用以下至少ー個(gè)步驟超聲處理、高溫暴露、醇接觸、氮接觸或振動(dòng)。
20.ー種分析從其種皮脫離的種子材料的基因型或表型特征的方法，該方法包括(a)涂覆種子，(b)以非破壞性的方式將涂覆的種皮的至少一部分從種子材料上松開，(b)通過(guò)使用吸引力將該涂覆的種皮或其一部分從該種子材料分離；(c)針對(duì)至少ー種基因型或表型特征的存在或缺乏對(duì)該無(wú)種皮種子材料 進(jìn)行分析。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于非破壞性地對(duì)種子群體中的單粒種子進(jìn)行取樣的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種用于將污染組織從其他種子材料中去除的有效的、高通量的方法。本發(fā)明的方法對(duì)于確定種子的基因型以及檢測(cè)遺傳標(biāo)記或遺傳性狀是有用的。本發(fā)明的方法包括將母體組織(如種皮或果皮)從種子去除，并且對(duì)種子的剩余部分進(jìn)行分析。因?yàn)橐呀?jīng)去除了復(fù)雜的母體組織，本發(fā)明的方法降低了在遺傳測(cè)試中的不明確程度。
文檔編號(hào)A01C1/06GK102821593SQ201180016041
公開日2012年12月12日 申請(qǐng)日期2011年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月26日
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