水溶性膜蛋白及其制備和使用方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及水溶性膜蛋白、其制備方法及其使用方法。
【專利說明】水溶性膜蛋白及其制備和使用方法
[0001]相關(guān)申請
[0002]本申請要求提交于2011年2月23日的美國臨時專利申請?zhí)?1/445，740的權(quán)益。上述申請的全部教導(dǎo)通過引用并入本文。
[0003]發(fā)明背景
[0004]膜蛋白在所有生命系統(tǒng)中起著重要作用。幾乎所有測序的基因組中大約-30%的所有基因編碼膜蛋白。然而，我們對于它們的結(jié)構(gòu)和功能的詳細了解遠遠落后于可溶性蛋白。截 lh 2012 年 2 月，在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.0rg/pdb/home/home.do)中有超過79，500種結(jié)構(gòu)，然而，存在具有包括8G-蛋白偶聯(lián)受體在內(nèi)的320種獨特結(jié)構(gòu)的952種膜蛋白結(jié)構(gòu)。雖然在人體中存在約400個功能性嗅覺受體，但沒有一個嗅覺受體得到確定。
[0005]在闡明嗅覺受體的結(jié)構(gòu)和功能及它們的識別和氣味結(jié)合性質(zhì)中有若干瓶頸，雖然它們受到很大的關(guān)注。最關(guān)鍵和具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)是制備毫克量的可溶性和穩(wěn)定性受體為極其困難的。廉價的大規(guī)模生產(chǎn)方法為迫切需要的，并因此已經(jīng)成為廣泛研究的焦點。一旦克服這些初步的障礙，才可能進行詳細的結(jié)構(gòu)研究。因此，本領(lǐng)域需要改進的方法研究G蛋白偶聯(lián)受體，包括嗅覺受體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明涉及水溶性膜肽、包含所述肽的組合物、其制備方法及其使用方法。
[0007]本發(fā)明涵蓋包含修飾性α -螺旋結(jié)構(gòu)域的水溶性多肽，其中所述修飾性α -螺旋結(jié)構(gòu)域包含氨基酸序列，其中天然膜蛋白的α -螺旋結(jié)構(gòu)域內(nèi)的一個或多個疏水性氨基酸殘基被一個或多個親水性氨基酸殘基替換。本發(fā)明還涵蓋制備水溶性多肽的方法，其包括用一個或多個親水性氨基酸 殘基替換天然膜蛋白的α-螺旋結(jié)構(gòu)域內(nèi)的一個或多個疏水性氨基酸殘基。本發(fā)明另外涵蓋通過用一個或多個親水性氨基酸殘基替換天然膜蛋白的α-螺旋結(jié)構(gòu)域內(nèi)的一個或多個疏水性氨基酸殘基制備的多肽。
[0008]本發(fā)明進一步涵蓋治療有需要的受試者中由膜蛋白活性介導(dǎo)的病癥或疾病的方法，其包括向所述受試者施用有效量的包含修飾性α-螺旋結(jié)構(gòu)域的水溶性多肽，其中所述修飾性α -螺旋結(jié)構(gòu)域包含一種氨基酸序列，其中膜蛋白的α -螺旋結(jié)構(gòu)域內(nèi)的一個或多個疏水性氨基酸殘基被一個或多個親水性氨基酸殘基替換。
[0009]在某些方面，水溶性多肽保留膜蛋白的配體結(jié)合活性?？赏ㄟ^施用本發(fā)明的水溶性多肽而治療的病癥和疾病的實例包括但不限于，癌癥(諸如，小細胞肺癌、黑色素瘤、三陰性乳腺癌)、帕金森病、心血管疾病、高血壓和支氣管哮喘。
[0010]本發(fā)明還涵蓋包含本發(fā)明水溶性多肽和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑的藥物組合物。
[0011]在一些方面，α-螺旋結(jié)構(gòu)域為7次跨膜α-螺旋結(jié)構(gòu)域。在另一實施方案中，天然膜蛋白為G-蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)。在本實施方案的一些方面，GPCR選自嘌呤受體(Ρ2Υρ P2Y2、P2Y4、P2Y6)、M1和M3毒蕈堿乙酰膽堿受體、針對凝血酶[蛋白酶激活受體(PAR)-1, PAR-2]的受體、血栓素(TXA2)、鞘氨醇1-磷酸(SlP2, S1P3、SlP4和SlP5)、溶血磷脂酸(LPArLPAyLPA3)、血管緊張素 II (AT1)、5_ 羥色胺(5_HT2。和 5_HT4)、生長抑素(sst5)、內(nèi)皮素伍1\和ETb)、膽囊收縮素(CCig、Vla加壓素受體、D5多巴胺受體、fMLP甲酰肽受體、GAL2甘丙肽受體、EP3前列腺素受體、A1腺苷受體、a j腎上腺素能受體、BB2娃皮素受體、B2緩激肽受體、鈣敏感受體、趨化因子受體、KSHV-0RF74趨化因子受體、NK1速激肽受體、促甲狀腺激素(TSH)受體、蛋白酶激活受體、神經(jīng)肽受體、腺苷A2B受體、P2Y嘌呤受體、代謝谷氨酸受體、GRK5、GPCR-30和CXCR4。在又一另外的實施方案中，天然膜蛋白或膜蛋白為整合膜蛋白。另一方面，天然膜蛋白為哺乳動物蛋白。在又一個方面，天然膜蛋白為嗅覺受體。在另外的實施方案中，嗅覺受體為m0R103-15。
[0012]在一些方面，親水性殘基(其替換天然膜蛋白的α -螺旋結(jié)構(gòu)域中的一個或多個疏水性殘基)選自谷氨酰胺(Q)、蘇氨酸(Τ)，酪氨酸(Y)及其任意組合。在另外的方面，選自亮氨酸(L)、異亮氨酸(I)、纈氨酸(V)和苯丙氨酸(F)的一個或多個疏水性殘基被替換。
[0013]在某些實施方案中，蛋白的α-螺旋結(jié)構(gòu)域中的一個或多個苯丙氨酸殘基被酪氨酸替換。在某些另外的實施方案中，蛋白的α-螺旋結(jié)構(gòu)域中的一個或多個異亮氨酸和/或纈氨酸殘基被蘇氨酸替換。在又一另外的方面，蛋白的α-螺旋結(jié)構(gòu)域中的一個或多個苯丙氨酸殘基被酪氨酸替換，且蛋白的α-螺旋結(jié)構(gòu)域的一個或多個異亮氨酸和/或纈氨酸殘基被替換為蘇氨酸。在另外的實施方案中，蛋白的α-螺旋結(jié)構(gòu)域中一個或多個亮氨酸殘基被谷氨酰胺替換。在又一另外的實施方案中，蛋白的α-螺旋結(jié)構(gòu)域中的一個或多個亮氨酸殘基被谷氨酰胺替換，且蛋白的一個或多個異亮氨酸和/或纈氨酸殘基被蘇氨酸替換。在其它實施方案中，蛋白的α-螺旋結(jié)構(gòu)域的一個或多個亮氨酸殘基被谷氨酰胺替換，且蛋白的α-螺旋結(jié)構(gòu)域的一個或多個苯丙氨酸殘基被酪氨酸替換。在又一另外的方面，蛋白的α -螺旋結(jié)構(gòu)域中的一個或多個亮氨酸殘基被谷氨酰胺替換，蛋白的α -螺旋結(jié)構(gòu)域的一個或多個苯丙氨酸殘基被 絡(luò)氨酸替換，且蛋白的α-螺旋結(jié)構(gòu)域的一個或多個異亮氨酸和/或纈氨酸殘基被蘇氨酸替換。
[0014]在另外的實施方案中，水溶性多肽保留了至少一些天然膜蛋白的生物學(xué)活性。在本實施方案的一個方面，水溶性多肽保留了結(jié)合配體的能力，所述配體通常結(jié)合于天然膜蛋白。在另一實施方案中，天然膜蛋白的潛在配體結(jié)合位點內(nèi)的一個或多個氨基酸不被替換。在本實施方案的一個方面，一個或多個氨基酸不被潛在配體結(jié)合位點替換的天然膜蛋白的實例為嘌呤受體、MJPM3毒蕈堿乙酰膽堿受體、針對凝血酶[蛋白酶激活受體(PAR)-l，PAR-2]的受體、血栓素(TXA2)、鞘氨醇1-磷酸(S1P2、S1P3、SlP4和SlP5)、溶血磷脂酸(LPApLPAyLPA3)、血管緊張素II (AT1)、5_羥色胺(5_HT2。和5_HT4)、生長抑素(SSt5)、內(nèi)皮素(ETa和ETb)、膽囊收縮素(CCK1)Jla加壓素受體、D5多巴胺受體、fMLP甲酰肽受體、GAL2甘丙肽受體、EP3前列腺素受體、A1腺苷受體、α !腎上腺素能受體、BB2蛙皮素受體、B2緩激肽受體、鈣敏感受體、趨化因子受體、KSHV-0RF74趨化因子受體、NK1速激肽受體、促甲狀腺激素(TSH)受體、蛋白酶激活受體、神經(jīng)肽受體、腺苷Α2Β受體、Ρ2Υ嘌呤受體、代謝谷氨酸受體、GRK5、GPCR-30和CXCR4。
[0015]在另一實施方案中，天然膜蛋白的潛在氣味結(jié)合位點內(nèi)的一個或多個氨基酸不被替換。
[0016]在一個實施方案中，含有修飾性α-螺旋結(jié)構(gòu)域的水溶性多肽包含下列氨基酸序列 MERRNHTGRV SEFVLLGFPA PAPQRALQFF QSLQAYVQTL TENIQTITAI RNHPTLHKPMYYFLANMSFYL ETffYTTVTTP KMQAGYIGSE ENHGQLISFE ACMTQLYFFQ GLGCTECTLL AVMAYDRYVATCHPLHYPVI VSSRQCVQMA AGSffAGGFGT SMTVKVYQISR LSYCGPNTIN HFFCDVSPLLNLSCTDMSTA ELTDFILAIF ILLGPLSVTG ASYMAITGAV MRIPSAAGRH KAFSTCASHL TTVITYYAASIYTYARPKAL SAFDTNKLVS VLYAVIVPLL NPIIYCLRNQ EVKKALRRTL HLAQGDANT KKSSRDGGSSGTETSQVAPA (SEQ ID NO: 2)。在又一另外的實施方案中，含有修飾性7次-跨膜α -螺旋結(jié)構(gòu)域的水溶性多肽包含下述氨基酸序列中的一個或多個:
[0017]a.PQRALQFFQSLQAYVQTLTENIQTITAI R(SEQ ID NO:3)
[0018]b.M YYFLANMSFYLETffYTTVTTPKMQAGYI(SEQ ID NO:4)
[0019]c.CMTQLYFFQGLGCTECTLLAVMAYDRYVA TC(SEQ ID NO:5)
[0020]d.RQCVQMAAGSffAGGFGTSMTVKVYQ(SEQ ID NO:6)
[0021]e.LTDFILAIFILLGPLSVTGASYMAITGAV(SEQ ID NO:7)
[0022]f.HKAFSTCASHLTTVITYYAAS IYTY(SEQ ID NO:8)
[0023]g.TNKLVSVLYAVIVPLLNPIIYCLRN(SEQ ID NO:9)。
[0024]在本發(fā)明的某些方面，確定了水溶性肽的二級結(jié)構(gòu)。在一些實施方案中，使用圓二色性確定二級結(jié)構(gòu)。
[0025]在某些實施方案中，測量結(jié)合于水溶性多肽的配體。在一些方面，將水溶性多肽的配體結(jié)合親和力與天然蛋白的配體結(jié)合親和力進行比較。在另外的方面，使用微型熱泳、鈣流入測定法或其任意組合測量配體結(jié)合。
[0026]在又一另外的實施方案中，本發(fā)明涵蓋用包含修飾性α-螺旋結(jié)構(gòu)域的水溶性肽轉(zhuǎn)染的細胞。在某些實施方案中，所述細胞為哺乳動物細胞?？蛇M行轉(zhuǎn)染的哺乳動物細胞的一個實例是ΗΕΚ293細胞。
[0027]附圖簡述
[0028]本發(fā)明的上述和其它目的、特征和優(yōu)點將從本發(fā)明的以下更具體描述的優(yōu)選實施方案中顯而易見，如在附圖中表明，其中相同的參考符號是指貫穿不同的視圖的相同部分。附圖不一定按比例繪制，而是重點放在說明本發(fā)明的原理上。
[0029]圖1顯示天然m0R103_15的氨基酸序列和用谷氨酰胺、蘇氨酸和酪氨酸(QTY)替換而突變的m0R103-15的氨基酸序列。使用QTY替換以系統(tǒng)地突變在7次跨膜α -螺旋上的關(guān)鍵殘基以將不溶于水的嗅覺受體轉(zhuǎn)變成水溶性受體。我們僅用水溶性更大的殘基Q、Τ、Y改變了 b、c、f的位置。這些位置在螺旋的親水面上。我們保持在疏水面上的位置a、
d、e、g。很可能這些變化將保持單個的α-螺旋。突變以受體序列上側(cè)的大寫藍色字母標記。小寫字母，abcdefg，在螺旋輪位置處。加下劃線的位置是7次跨膜α-螺旋。數(shù)字(8、
7、3、5、4、5、4)是在每個α-螺旋中的突變。存在36個殘基變化，占總共340個殘基的-
10.5%。
[0030]圖2顯示QTY替換嗅覺受體m0R103_15的分子模型。在7次跨膜螺旋段中進行了總共36個突變(-10.5%)。這些突變不改變帶電殘基，因此變體受體質(zhì)量和pi大體保持不變。氨基酸Q、T和Y的分子形狀和尺寸非常類似于L、V/I和Y，因此存在最小的整體局部形狀變化。為清楚起見，C-末端處的20個氨基酸的區(qū)段未被建模。
[0031]圖3A-3C A)QTY替換的頂視圖和B)QTY替換的側(cè)視圖。注意，突變僅在螺旋的一側(cè)。無突變的天然受體具有類似于CI1腎上腺素能受體的折疊結(jié)構(gòu)，而在突變后，所述結(jié)構(gòu)類似于β2腎上腺素能受體。C)疊加的天然m0R103-15(紅色)和m0R103_15的設(shè)計QTY
突變(藍色)的模擬結(jié)構(gòu)。整體結(jié)構(gòu)差異為平均~0.8A。
[0032]圖4CXCR4和設(shè)計的QTY突變的CXCR4-QTY的圓二色光譜。
[0033]圖5SDS 凝膠顯示天然 CXCR4 與具有 QTY 突變的 CXCR4(SEQID NO: 10:CXCR4QTY)之間的分子量的比較。
[0034]圖6使用QTY替換以系統(tǒng)地突變在7次跨膜α -螺旋上的關(guān)鍵殘基和幾個其它疏水性殘基以將水不溶性膜形式CXCR4轉(zhuǎn)化成水溶性形式。Α)我們已經(jīng)用水溶性更大的殘基Q、T、Y改變了位置b、c、f。我們不改變位置a、d、e、g。這些位置被認為是保持各α -螺旋的特定的簇。B).將膜形式CXCR4(紅色)和QTY水溶性CRCR4(藍色)進行疊加。C)將天然殘基以紅色字母標記及D)將序列中的突變以藍色字母標記。在七次跨膜螺旋區(qū)段中352個殘基中進行了總共29個QTY突變(約8.2%)。這些突變不改變帶電殘基，因此變體受體質(zhì)量和pi大體保持不變。氨基酸Q、T和Y的分子形狀和尺寸非常類似于L、V/I和Y，因此存在最小的整體、局部形狀的變化。
[0035]發(fā)明詳述
[0036]本發(fā)明優(yōu)選實施方案的描述如下。
[0037]單詞“一”或“一個”意指涵蓋一個或多個，除非另有說明。
[0038]在一些方面，本發(fā)明涉及使用QTY(谷氨酰胺、蘇氨酸和酪氨酸)替換方法以將天然蛋白的7次跨膜α -螺旋的疏水性殘基亮氨酸(L)、異亮氨酸(I)、纈氨酸(V)和苯丙氨酸(F)系統(tǒng)地改變成親水性殘基谷氨酰胺(Q)、蘇氨酸(T)和酪氨酸(Y)。本發(fā)明將天然膜蛋白從水不溶性轉(zhuǎn)換至水溶性的對應(yīng)物。
[0039]本發(fā)明的另一項創(chuàng)新是將水不溶性的嗅覺受體m0R103_15轉(zhuǎn)換成具有約10.5%特定殘基變化(36aa/340aa)的水溶性受體。這將通過系統(tǒng)地和選擇性地改變α -螺旋位置
b、C、f處的通常面向親水表面的關(guān)鍵殘基，同時保持α -螺旋位置a、d、e、g處的疏水性殘基而實現(xiàn)。合成生物學(xué)設(shè)計方法是通用的并廣泛應(yīng)用于研究其它嗅覺受體和G蛋白偶聯(lián)受體。這種策略有潛能克服結(jié)晶嗅覺受體以及其它GPCR和其它膜蛋白的瓶頸。
[0040]我們使用合成生物學(xué)方法以將水不溶性的嗅覺受體轉(zhuǎn)換成具有~10.5%殘基變化(36aa/340aa)的水溶性受體(圖1和2)。我們已經(jīng)系統(tǒng)地和選擇性地改變α -螺旋位置b、c、f處(其通常形成親水表面)的關(guān)鍵殘基，但是保持^-螺旋位置8、(1、64處的疏水性殘基(圖1)。我們的合成生物學(xué)設(shè)計方法性質(zhì)上是通用的，因此它被廣泛用于研究其它嗅覺受體、趨化因子CXCR4以及其它G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)和其它膜蛋白。如果轉(zhuǎn)換后的水溶性膜蛋白保留生物學(xué)功能，那么這種簡易的策略可部分地克服嗅覺受體、GPCR和其它膜蛋白的結(jié)構(gòu)研究的瓶頸。
[0041]為了便于研究嗅覺受體的結(jié)構(gòu)方面和它們的結(jié)合特性，我們將使用QTY替換方法來設(shè)計水溶性7段螺旋束嗅覺受體m0R103-15(圖1-3)。已知七種氨基酸具有α螺旋形成趨勢(32):亮氨酸(L) (1.30)、谷氨酰胺(Q) (1.27)、苯丙氨酸(F) (1.07)、酪氨酸(Y)(0.72)、異亮氨酸(I) (0.97)、纈氨酸(V) (0.91)和蘇氨酸(T) (0.82)。我們也知道Q、Y和T側(cè)鏈均能與水形成氫鍵:Q可以形成4H-鍵(2H-供體得自-NH2, 2H-受體得自C=O)，且T和Y可以各自形成3H-鍵(_0H、1-H供體得自-H，且2受體得自-O)。Q、T、Y殘基比L、F、I或V更易溶于水，其不能與它們的側(cè)鏈形成任何氫鍵。所提出的取代將不會有任何正電荷或負電荷的變化。此外，對于成對的亮氨酸/谷氨酰胺、苯丙氨酸/酪氨酸、纈氨酸/蘇氨酸和異亮氨酸/蘇氨酸(33-34)，分子的形狀和尺寸是非常相似的。因此所提出的變化應(yīng)增加7次跨膜α -螺旋的溶解度同時保持整體螺旋結(jié)構(gòu)(圖3C)。
[0042]在本可溶性嗅覺受體設(shè)計中，我們進行了以下取代:苯丙氨酸至酪氨酸(F_>Y)、異亮氨酸/纈氨酸至蘇氨酸(I/V->T)和亮氨酸至谷氨酰胺(L->Q)?？梢詸z測水溶性嗅覺受體的二級結(jié)構(gòu)以及測量它的氣味結(jié)合能力。如果用QTY替換檢測氣味結(jié)合，那么有可能我們保留了原始結(jié)構(gòu)的重要組分。可以制備二級結(jié)構(gòu)和設(shè)計的水溶性嗅覺受體與天然的嗅覺受體的結(jié)合?？梢灾苽浜量肆康乃苄允荏w及在有和沒有氣味時可以設(shè)立晶體篩選。
[0043]在一個實施方案中，天然膜蛋白為G-蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)。在又一另外的實施方案中，天然膜蛋白為嗅覺受體。在一些實施方案中，嗅覺受體為哺乳動物受體。在又一另外的實施方案中，嗅覺受體為m0R103-15。在某些方面，水溶性多肽保留了天然膜蛋白的至少一些生物學(xué)活性。在又一另外的方面，膜蛋白為介導(dǎo)疾病或病癥的膜受體。
[0044]在另一實施方案中，所述天然膜蛋白是GPCR，選自嘌呤受體(P2Yp P2Y2、P2Y4、P2Y6)、M1和M3毒蕈堿乙酰膽堿受體、針對凝血酶[蛋白酶激活受體(PAR)-l，PAR-2]的受體、血栓素(TXA2)、鞘氨醇1-磷酸(51己、5卟3、51?4和SlP5)、溶血磷脂酸(LPA1、LPA2、LPA3)、血管緊張素II (AT1)、5_羥色胺(5-HT2。和5-HT4)、生長抑素(sst5)、內(nèi)皮素(ETa和ETb)、膽囊收縮素(CCK1)、Vla加壓素受體、D5多巴胺受體、fMLP甲酰肽受體、GAL2甘丙肽受體、EP3前列腺素受體、A1腺苷受體、a i腎上腺素能受體、BB2蛙皮素受體、B2緩激肽受體、鈣敏感受體、趨化因子受體、KSHV-0RF74趨化因子受體、NK1速激肽受體、促甲狀腺激素(TSH)受體、蛋白酶激活受體、神經(jīng)肽受體、腺苷A2B受體、P2Y嘌呤受體、代謝谷氨酸受體、GRK5、GPCR-30和CXCR4。在另一實施方案中，本發(fā)明涉及本文所述的藥物組合物或治療方法，其中所述天然膜蛋白為GPCR，選自嘌呤受體 (P2Yp P2Y2、P2Y4、P2Y6)、M1和M3毒蕈堿乙酰膽堿受體、針對凝血酶[蛋白酶激活受體(PAR)-l，PAR-2]的受體、血栓素(TXA2)、鞘氨醇1-磷酸(S1P2、S1P3、SlP4 和 SlP5)、溶血磷脂酸(LPAp LPA2、LPA3)、血管緊張素 II (ATI)、5_ 羥色胺(5_HT2c和5-HT4)、生長抑素(SSt5)、內(nèi)皮素(ETa和ETb)、膽囊收縮素(CCK1)、Vla加壓素受體、D5多巴胺受體、fMLP甲酰肽受體、GAL2甘丙肽受體、EP3前列腺素受體、A1腺苷受體、a j腎上腺素能受體、BB2蛙皮素受體、B2緩激肽受體、鈣敏感受體、趨化因子受體、KSHV-0RF74趨化因子受體、NK1速激肽受體、促甲狀腺激素(TSH)受體、蛋白酶激活受體、神經(jīng)肽受體、腺苷A2B受體、P2Y嘌呤受體、代謝谷氨酸受體、GRK5、GPCR-30、和CXCR4。
[0045]在另一實施方案中，水溶性多肽保留膜蛋白的至少一些配體結(jié)合活性。在一些實施方案中，GPCR是哺乳動物受體。
[0046]在另一實施方案中，天然膜蛋白的潛在配體結(jié)合位點內(nèi)的一個或多個氨基酸不被替換。在本實施方案的一個方面，具有一個或多個氨基酸不被替換的帶有潛在配體結(jié)合位點的天然膜蛋白的實例為嘌呤受體(P2Yp P2Y2、P2Y4、P2Y6)、M1和M3毒蕈堿乙酰膽堿受體、針對凝血酶[蛋白酶激活受體(PAR)-l，PAR-2]的受體、血栓素(TXA2)、鞘氨醇1-磷酸(SlP2, S1P3、SlP4 和 SlP5)、溶血磷脂酸(LPA1' LPA2' LPA3)、血管緊張素 II (AT1)、5_ 羥色胺(5-HT2c和5-HT4)、生長抑素(sst5)、內(nèi)皮素(ETa和ETb)、膽囊收縮素(CCK1)、Vla加壓素受體、D5多巴胺受體、fMLP甲酰肽受體、GAL2甘丙肽受體、EP3前列腺素受體'A1腺苷受體、α ι腎上腺素能受體、BB2蛙皮素受體、B2緩激肽受體、鈣敏感受體、趨化因子受體、KSHV-0RF74趨化因子受體、NK1速激肽受體、促甲狀腺激素(TSH)受體、蛋白酶激活受體、神經(jīng)肽受體、腺苷A2B受體、P2Y嘌呤受體、代謝谷氨酸受體、GRK5、GPCR-30和CXCR4。
[0047]本發(fā)明還涵蓋治療由膜蛋白活性介導(dǎo)的病癥或疾病的方法，其包括使用水溶性多肽以治療所述病癥和疾病，其中所述水溶性多肽包含修飾性α-螺旋結(jié)構(gòu)域，且其中所述水溶性多肽保留了天然膜蛋白的配體結(jié)合活性。此類病癥和疾病的實例包括但不限于癌癥、小細胞肺癌、黑素瘤、乳腺癌、帕金森病、心血管病、高血壓和哮喘。
[0048]如本文所述，本文所述的水溶性肽可用于治療由膜蛋白活性介導(dǎo)的病患或疾病。在某些方面，水溶性肽可充當針對膜受體的“誘餌”并結(jié)合于活化所述膜受體的配體。因此，本文所述的水溶性肽可用于降低膜蛋白的活性。這些水溶性肽可保留在循環(huán)中并結(jié)合于特定配體，從而降低了膜結(jié)合受體的活性。例如，GPCR CXCR4在小細胞肺癌中過度表達并促進腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移。通過諸如本文所述的水溶性肽結(jié)合這種配體可顯著減少轉(zhuǎn)移。
[0049]趨化因子受體，CXCR4，在病毒研究中被認為是T細胞系向性HIV進入的主要共同受體(Feng,等人(1996) Science272:872-877; Davis,等人(1997) J ExpMedl86:1793-1798; Zaitseva,等人(1997) Nat Med3:1369-1375; Sanchez,等人(1997) JBiol Chem272:27529-27531)。T基質(zhì)細胞衍生因子I (SDF-1)為與CXCR4特異相互作用的趨化因子。當SDF-1結(jié)合于CXCR4時，CXCR4激活Ga i蛋白介導(dǎo)的信號(百日咳毒素敏感的)(Chen，等人(1998)Mol Pharmacol 53:177-181)，包括下游激酶途徑，諸如Ras/MAP激酶和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/淋巴細胞、巨核細胞和造血干細胞中的Akt (Bleul，等人(1996)Nature382:829-833;Deng，等人(1997)Nature388:296-300;Kijowski，等人(2001)Stem CelIs19:453-466;Majka,等人(2001)Folia.Histochem.Cytobiol.39:235-244; Sotsios,等人(1999) J.1mmunol.163:5954-5963; Vlahakis,等人
(2002)J.1mmunol.169:5546-5554)。在移植有人淋巴結(jié)的小鼠中，SDF-1誘導(dǎo)CXCR4-陽性細胞遷移至移植的淋巴結(jié)(Bla des，等人.(2002) J.1mmunol.168:4308-4317)。
[0050]最近，研究已經(jīng)表明CXCR4相互作用可調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)移細胞的遷移。缺氧、部分氧分壓的減少是在大多數(shù)實體腫瘤中出現(xiàn)的微環(huán)境的變化且是腫瘤血管生成和治療抗性的主要誘導(dǎo)物。缺氧增加CXCR4的水平(Staller，等人(2003)Nature425:307-311)。對得自骨轉(zhuǎn)移模型具有升高的轉(zhuǎn)移活性的細胞亞群體上的微陣列分析表明在轉(zhuǎn)移表型中增加的基因中的一者為CXCR4。此外，分離細胞中過度表達的CXCR4顯著增加了轉(zhuǎn)移活性(Kang，等人
(2003)Cancer Cel 13:537-549)。在采集自不同乳腺癌患者的樣本中，MulIer等人(Muller,等人(2001)Nature410:50-56)發(fā)現(xiàn)相對于正常乳腺細胞或上皮細胞而言，CXCR4的表達水平在原發(fā)性腫瘤中更高。而且，當與所有轉(zhuǎn)移至淋巴結(jié)和肺的對照同種型相比時，CXCR4抗體治療已表明抑制向局部淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移(Muller，等人.(2001))。因此誘餌治療模型適合治療CXCR4介導(dǎo)的疾病和病癥。
[0051]本發(fā)明的另一實施方案涉及治療包括CXCR4依賴性趨化的疾病或病癥，其中所述疾病與異常白細胞的募集或活化相關(guān)。所述疾病選自關(guān)節(jié)炎、銀屑病、多發(fā)性硬化、潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩氏病、過敏病、哮喘、AIDS相關(guān)的腦炎、AIDS相關(guān)的斑丘疹皮疹、AIDS相關(guān)的間質(zhì)性肺炎、AIDS相關(guān)的腸病、AIDS相關(guān)的門靜脈周肝炎和AIDS相關(guān)的腎小球腎炎。
[0052]另一方面，本發(fā)明涉及治療選自關(guān)節(jié)炎、淋巴瘤、非小細胞肺癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、多發(fā)性硬化、中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育疾病、癡呆、帕金森氏病、阿爾茨海默氏病、腫瘤、纖維瘤、星形細胞瘤、骨髓瘤、膠質(zhì)母細胞瘤、炎性疾病、器官移植排斥、AIDS、HIV感染或血管生成的疾病或病癥。
[0053]本發(fā)明還涵蓋包含所述水溶性多肽和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑的藥物組合物。
[0054]該組合物還可包含，取決于所需的制劑，藥學(xué)上可接受的、無毒的載體或稀釋劑，它們被定義為通常用于配制針對動物或人體施用的藥物組合物的媒介物。選擇稀釋劑以便不影響藥理劑或組合物的生物學(xué)活性。這些稀釋劑的實例為蒸餾水、生理磷酸鹽緩沖鹽水、林格溶液(Ringer’ s solutions)、葡萄糖溶液和漢克溶液(Hank’ s solution)。此外,藥物組合物或制劑也可以包括其他載體、佐劑或無毒、非治療、無免疫原性穩(wěn)定劑等。藥物組合物還可以包含大的、代謝緩慢的大分子諸如蛋白質(zhì)、多糖諸如殼聚糖、聚乳酸、聚乙醇酸和共聚物(諸如乳膠功能化的SEPHAR0SE?、瓊脂糖、纖維素等)、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和脂質(zhì)聚集體(諸如油滴或脂質(zhì)體)。
[0055]這些組合物可以腸胃外施用，諸如，通過靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、鞘內(nèi)或皮下注射。腸胃外施用可以通過將組合物摻入至溶液或懸浮液而實現(xiàn)。這些溶液或懸浮液還可包括無菌稀釋劑諸如注射用水、鹽水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶劑。腸胃外制劑還可包括抗菌劑諸如，例如，苯甲醇或?qū)αu基苯甲酸甲酯，抗氧化劑諸如，例如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉和螯合劑諸如EDTA。也可以加入緩沖液諸如醋酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽和張力調(diào)節(jié)劑諸如氯化鈉或葡萄糖。腸胃外制劑可以封裝在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多劑量小瓶中。
[0056]另外，輔助物質(zhì)，諸如濕潤劑或乳化劑、表面活性劑、pH緩沖物質(zhì)等可存在于組合物中。藥物組合物的其它組分為石油、動物、植物，或合成來源的那些，例如，花生油、大豆油和礦物油。通常，優(yōu)選的液體載體為二醇類諸如丙二醇或聚乙二醇，特別是對于可注射溶液。
[0057]可注射制劑可以 液體溶液或懸浮液制備；也可制備注射前適于液體媒介物的溶液或懸浮液的固體形式。也可以將所述制劑乳化或密封在脂質(zhì)體或微粒中諸如聚丙交酯、聚乙交酯或共聚物以增強佐劑的效果，如上論述。Langer，SCienCe249:1527，1990和Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews28:97-119, 1997。本文所述的組合物和藥理劑可以以儲庫注射或植入制劑的形式施用，其可以以這樣的方式配制，以便允許活性成分的持續(xù)釋放或脈沖釋放。
[0058]透皮施用包括組合物穿過皮膚的經(jīng)皮吸收。透皮制劑包括貼劑、軟膏、乳膏、凝膠、藥膏等。透皮遞送可通過使用皮膚貼劑或使用轉(zhuǎn)移體而實現(xiàn)。[Paul等人，Eur.J.1mmunol.25:3521-24，1995; Cevc 等人,Biochem.Biophys.Actal368:201-15，1998]。
[0059]“處理”或“治療”包括預(yù)防或延遲疾病發(fā)作的癥狀、并發(fā)癥或生化指標，緩解或改善癥狀或阻止或抑制疾病、病患或病癥的進一步發(fā)展?！盎颊摺睘樾枰委煹娜祟愂茉囌?。
[0060]“有效量”是指足以改善一種或多種病癥的癥狀和/或防止病癥的進展、引起病癥的消退和/或獲得所需效果的治療劑的量。
[0061]結(jié)合以下實施例將更好的理解本發(fā)明，所述實施例僅旨在作為說明而并非限制本發(fā)明的范圍。公開實施方案的各種變化和修改對本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的且在不偏離本發(fā)明的精神和附加權(quán)利要求范圍的情況下進行此類變化。
實施例
[0062]實施例1:嗅覺受體的配體結(jié)合特性的系統(tǒng)分析
[0063]Q (谷氨酰胺)T (蘇氨酸)Y (酪氨酸)QTY替換用于將水不溶性的嗅覺受體轉(zhuǎn)換成水溶性的嗅覺受體用于生化、生理和結(jié)構(gòu)分析。我們的具體目標是:
[0064]I)使用QTY(谷氨酰胺、蘇氨酸和酪氨酸)替換方法以將7次跨膜α-螺旋的疏水性殘基亮氨酸(L)、異亮氨酸(I)、纈氨酸(V)和苯丙氨酸(F)系統(tǒng)地改變成親水性殘基谷氨酰胺(Q)、蘇氨酸(T)和酪氨酸(Y)。這種方法將水不溶性的嗅覺受體蛋白轉(zhuǎn)換成水溶性的嗅覺受體受體蛋白。
[0065]2)使用商購的無細胞體外翻譯系統(tǒng)(Invitrogen and Qiagen)制備和純化毫克量的天然的和生物工程嗅覺受體。
[0066]3)使用圓二色性(⑶)確定純化的嗅覺受體的二級結(jié)構(gòu)。
[0067]4)使用微型熱泳確定天然和生物工程嗅覺受體變體的結(jié)合親和力。
[0068]5)將天然和變體OR基因轉(zhuǎn)染至HEK293細胞，并使用鈣流入測定法測量天然和突變型嗅覺受體的氣味激活。這些測量值將使微型熱泳結(jié)合數(shù)據(jù)與細胞內(nèi)的功能反應(yīng)相關(guān)。
[0069]6)在存在和不存在氣味及存在和不存在洗滌劑的情況下，針對結(jié)晶條件系統(tǒng)地篩選天然和生物工程嗅覺受體。
[0070]研究策略
[0071]使用QTY替換來設(shè)計可溶性7段螺旋束的嗅覺受體m0R103_15。我們研究的一項創(chuàng)新是將水不溶性的嗅覺受體m0R103-15轉(zhuǎn)換成具有約10.5%特定殘基變化(36aa/340aa)的水溶性受體。我們已經(jīng)系統(tǒng)地和選擇性地改變α-螺旋位置b、c、f處的通常面向親水表面的關(guān)鍵殘基，同時保持0-螺旋位置&、(1、64處的疏水性殘基。我們合成生物學(xué)設(shè)計方法是通用的并廣泛應(yīng)用于研究其它嗅覺受體和G蛋白偶聯(lián)受體。這種策略有潛能克服結(jié)晶嗅覺受體以及其它GPCR和其它膜蛋白的瓶頸。盡管我們設(shè)計改變?nèi)芙舛鹊男蛄屑性诼菪喌腷、C、f位置，可以在不會顯著影響肽、多肽或蛋白的功能和結(jié)構(gòu)的情況下，對所述序列的其它部分進行進一步改變。例如可以進行保守突變。
[0072]實驗方法
[0073]I)使用QTY替換來設(shè)計水溶性7段螺旋束的嗅覺受體m0R103_15。我們使用合成生物學(xué)方法以將水不溶性的嗅覺受體轉(zhuǎn)換成具有-10.5%殘基變化(36aa/340aa)的水溶性受體(圖1-3)。我們已經(jīng)系統(tǒng)地和選擇性地改變α -螺旋位置b、C、f處(其通常形成親水表面)的關(guān)鍵殘基，但是保持α -螺旋位置a、d、e、g處的疏水性殘基(圖1)。我們的合成生物學(xué)設(shè)計方法性質(zhì)上是通用的，因此它被廣泛用于研究其它嗅覺受體以及其它G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)。如果轉(zhuǎn)換后的水溶性膜蛋白保留生物學(xué)功能，那么這種簡易的策略可部分地克服嗅覺受體、GPCR和其它膜蛋白的結(jié)構(gòu)研究的瓶頸。
[0074]為了便于研究嗅覺受體的結(jié)構(gòu)方面和它們的結(jié)合特性，我們可使用QTY替換方法來設(shè)計水溶性7段螺旋束嗅覺受體m0R103-15(圖1-3)。已知七種氨基酸具有α螺旋形成趨勢(32):亮氨酸(L) (1.30)、谷氨酰胺(Q) (1.27)、苯丙氨酸(F) (1.07)、酪氨酸(Y)(0.72)、異亮氨酸(I) (0.97)、纈氨酸(V) (0.91)和蘇氨酸(T) (0.82)。我們也知道Q、Y和T側(cè)鏈均能與水形成氫鍵:Q可以形成4H-鍵(2H-供體得自-NH2，2H-受體得自C=O)，及T和Y可以各自形成3H-鍵(_0H、1-H供體得自-H和2受體得自-O)。Q、T、Y殘基比L、F、I或V更易溶于水，其不能與它們的側(cè)鏈形成任何氫鍵。取代將不會有任何正電荷或負電荷變化。此外，對于成對的亮氨酸/谷氨酰胺、苯丙氨酸/酪氨酸、纈氨酸/蘇氨酸和異亮氨酸/蘇氨酸，分子的形狀和尺寸是非常相似的。因此變化增加了 7次跨膜α-螺旋的溶解度同時保持整體螺旋結(jié)構(gòu)。
[0075]在本可溶性嗅覺受體設(shè)計中，我們進行如下取代:亮氨酸_>谷氨酰胺(L_>Q)、異亮氨酸/纈氨酸_>蘇氨酸(IN->T)和苯丙氨酸_>酪氨酸(F->Y)。在研究中，我們可以檢測水溶性嗅覺受體的二級結(jié)構(gòu)以及測量它的氣味結(jié)合能力。如果用QTY替換來測量氣味結(jié)合，那么有可能我們保留了原始結(jié)構(gòu)的重要組分。我們可以將天然嗅覺受體的二級結(jié)構(gòu)和結(jié)合與設(shè)計的水溶性嗅覺受體進行比較。我們也可以制備毫克量的水溶性受體及在有和沒有氣味時設(shè)立晶體篩選。
[0076]
【權(quán)利要求】
1.一種包含修飾的α-螺旋結(jié)構(gòu)域的水溶性多肽，其中所述修飾的α-螺旋結(jié)構(gòu)域包含氨基酸序列，其中天然膜蛋白的α -螺旋結(jié)構(gòu)域內(nèi)的一個或多個疏水性氨基酸殘基被一個或多個親水性氨基酸殘基替換。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水溶性多肽，其中所述α-螺旋結(jié)構(gòu)域為7次跨膜α -螺旋結(jié)構(gòu)域。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水溶性多肽，其中所述天然膜蛋白為G-蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水溶性多肽，其中所述天然膜蛋白為整合膜蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水溶性多肽，其中所述親水性殘基選自谷氨酰胺(Q)、蘇氨酸(T)，酪氨酸(Y)及其任意組合。
6.根據(jù)權(quán)利要 求1所述的水溶性多肽，其中所述疏水性殘基亮氨酸(L)、異亮氨酸(I)、纈氨酸(V)和苯丙氨酸(F)中的一個或多個被替換。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水溶性多肽，其中所述天然膜蛋白的所述α-螺旋結(jié)構(gòu)域中的一個或多個苯丙氨酸殘基被酪氨酸替換。
8.根據(jù)權(quán)利要求1和7中任一項所述的水溶性多肽，其中所述蛋白的所述α-螺旋結(jié)構(gòu)域的一個或多個異亮氨酸和/或纈氨酸殘基被蘇氨酸替換。
9.根據(jù)權(quán)利要求1、7和8中任一項所述的水溶性多肽，其中所述天然膜蛋白的所述α-螺旋結(jié)構(gòu)域中的一個或多個亮氨酸殘基被谷氨酰胺替換。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水溶性多肽，其中所述天然膜蛋白為嗅覺受體或趨化因子受體CXCR4。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水溶性多肽，其中所述天然膜蛋白為哺乳動物蛋白。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的水溶性多肽，其中所述天然膜蛋白為m0R103-15或趨化因子受體CXCR4。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的水溶性多肽，其中在α-螺旋位置b、c和f處的疏水性氨基酸殘基被替換。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的水溶性多肽，其中在α-螺旋位置a、d、e和g處的疏水性氨基酸殘基不被替換。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水溶性多肽，其包含下列氨基酸序列MERRNHTGRVSEFVLLGFPA PAPQRALQFF QSLQAYVQTL TENIQTITAIRNHPTLHKPM YYFLANMSFYL ETffYTTVTTPKMQAGYIGSE ENHGQLISFE ACMTQLYFFQ GLGCTECTLL AVMAYDRYVA TCHPLHYPVI VSSRQCVQMAAGSffAGGFGT SMTVKVYQISR LSYCGPNTIN HFFCDVSPLL NLSCTDMSTA ELTDFILAIF ILLGPLSVTGASYMAITGAV MRIPSAAGRH KAFSTCASHL TTVITYYAAS IYTYARPKAL SAFDTNKLVS VLYAVIVPLLNPIIYCLRNQ EVKKALRRTL HLAQGDANT KKSSRDGGSS GTETSQVAPA(SEQ ID NO:2)；
或 MEGISIYTSDNYTEEMGS⑶YDSMKEPCFREENANYNKTFLPTIYSIIYQTGTVGNGLVILVMGYQKKLRSMTDKYRLHLSTADLQFVTTLPYWATDATANWYFGNFLCKAVHVIYTVNLYSSVLILAFISLDRYLAIVHATNSQRPRKLLAEKWYVGVWTPAQLLTTPDYTFANVSEADDRYICDRFYPNDLWVWFQFQmMVGLILPGIVILSCYCIIISKLSHSKGHQKRKALKTTTTLIQAFFACffQPYYTGISIDSYILLEIIKQGCEFENTVHKffISTTEAQAFYHCCTNPTQYAYLGAKFKTSAQHALTSVSRGSSLKILSKGKRGGHSSVSTESESSSSFHS(SEQ ID NO:10)。
16.根據(jù)權(quán)利要求2所述的水溶性多肽，其中所述修飾的7次跨膜α-螺旋結(jié)構(gòu)域包含一個或多個以下氨基酸序列:
a.PQRALQFFQSLQAYVQTLTENIQTITAI R(SEQ ID NO:3)
b.M YYFLANMSFYLETffYTTVTTPKMQAGYI(SEQ ID NO:4)
c.CMTQLYFFQGLGCTECTLLAVMAYDRYVA TC (SEQ ID NO:5)
d.RQCVQMAAGSffAGGFGTSMTVKVYQ(SEQ ID NO:6)
e.LTDFILAIFILLGPLSVTGASYMAITGAV(SEQ ID NO:7)
f.HKAFSTCASHLTTVITYYAAS IYTY(SEQ ID NO:8)
g.TNKLVSVLYAVIVPLLNPIIYCLRN(SEQ ID NO:9)。
17.根據(jù)權(quán)利要求1至16中任一項所述的水溶性多肽，其中所述多肽保留了所述天然膜蛋白的生物活性。
18.根據(jù)權(quán)利要求1至16中任一項所述的水溶性多肽，其中潛在氣味結(jié)合位點內(nèi)的一個或多個氨基酸不被替換。
19.一種制備水溶性多肽的方法，包括用一個或多個親水性氨基酸殘基替換天然膜蛋白的α-螺旋結(jié)構(gòu)域內(nèi)的一個或多個疏水性氨基酸殘基。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述α-螺旋結(jié)構(gòu)域為7次跨膜α-螺旋結(jié)構(gòu)域。
21.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述天然膜蛋白為G-蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)。
22.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述親水性殘基選自谷氨酰胺(Q)、蘇氨酸(Τ)、酪氨酸(Y)及其任意組合。
23.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述疏水性殘基亮氨酸(L)、異亮氨酸(I)、纈氨酸(V)和苯丙氨酸(F)被替換。
24.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述天然膜蛋白的所述7次跨膜α-螺旋結(jié)構(gòu)域中的一個或多個苯丙氨酸殘基被酪氨酸替換。
25.根據(jù)權(quán)利要求19和24中任一項所述的方法，其中所述天然膜蛋白的所述α-螺旋結(jié)構(gòu)域中的一個或多個異亮氨酸和/或纈氨酸殘基被蘇氨酸替換。
26.根據(jù)權(quán)利要求19、24和25中任一項所述的方法，其中所述天然膜蛋白的所述α-螺旋結(jié)構(gòu)域中的一個或多個亮氨酸殘基被谷氨酰胺替換。
27.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述天然蛋白為嗅覺受體。
28.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述天然蛋白為哺乳動物蛋白。
29.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述天然蛋白為m0R103-15或趨化因子受體CXCR4。
30.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述多肽包含以下氨基酸序列MERRNHTGRVSEFVLLGFPA PAPQRALQFF QSLQAYVQTL TENIQTITAI RNHPTLHKPM YYFLA匪SFYL ETffYTTVTTP KMQAGYIGSE ENHGQLISFE ACMTQLYFFQGLGCTECTLL AVMAYDRYVA TCHPLHYPVI VSSRQCVQMA AGSffAGGFGT SMTVKVYQISR LSYCGPNTINHFFCDVSPLL NLSCTDMSTA ELTDFILAIF ILLGPLSVTG ASYMAITGAV MRIPSAAGRH KAFSTCASHLTTVITYYAAS IYTYARPKAL SAFDTNKLVS VLYAVIVPLL NPIIYCLRNQ EVKKALRRTL HLAQGDANTKKSSRDGGSS GTETSQVAPA(SEQ ID NO:2)； 或MEGISIYTSDNYTEEMGSGDYDSMKEPCFREENANYNKTFLPTIYSIIYQTGTVGNGLVILVMGYQKKLRSMTDKYRLHLSTADLQFVTTLPYWATDATANWYFGNFLCKAVHVIYTVNLYSSVLILAFISLDRYLAIVHATNSQRPRKLLAEKVVYVGVWTPAQLLTTPDYTFANVSEADDRYICDRFYPNDLWVVVFQFQmMVGLILPGIVILSCYCIIISKLSHSKGHQKRKALKTTTTLIQAFFACWQPYYTGISIDSYILLEIIKQGCEFENTVHKWISTTEAQAFYHCCTNPTQYAYLGAKFKTSAQHALTSVSRGSSLKILSKGKRGGHSSVSTESESSSSFHS(SEQ ID NO:10)。
31.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述修飾的7次跨膜α-螺旋結(jié)構(gòu)域包含一個或多個以下氨基酸序列:
a.PQRALQFFQSLQAYVQTLTENIQTITAI R(SEQ ID NO:3)
b.M YYFLANMSFYLETffYTTVTTPKMQAGYI(SEQ ID NO:4)
c.CMTQLYFFQGLGCTECTLLAVMAYDRYVA TC (SEQ ID NO:5)
d.RQCVQMAAGSffAGGFGTSMTVKVYQ(SEQ ID NO:6)
e.LTDFILAIFILLGPLSVTGASYMAITGAV(SEQ ID NO:7)
f.HKAFSTCASHLTTVITYYAAS IYTY(SEQ ID NO:8)
g.TNKLVSVLYAVIVPLLNPIIYCLRN(SEQ ID NO:9)SEQ IDNO:2。
32.根據(jù)權(quán)利要求19至31中任一項所述的方法，其中所述水溶性多肽保留了所述天然膜蛋白的生物活性。
33.根據(jù)權(quán)利要求19至31中任一項所述的方法，還包括確定所述多肽的二級結(jié)構(gòu)。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中使用圓二色性確定所述二級結(jié)構(gòu)。
35.根據(jù)權(quán)利要求19至31中任一項所述的方法，還包括測量配體結(jié)合。
36.根據(jù)權(quán)利要求19至31中任一項所述的方法，其中所述多肽通過使用無細胞系統(tǒng)來制備。
37.根據(jù)權(quán)利要求19至31中任一項所述的方法，其中所述蛋白為嗅覺受體，且還包括測量結(jié)合于所述嗅覺受體的氣味。
38.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中將所述水溶性多肽的配體結(jié)合親和力與所述天然膜蛋白的配體結(jié)合親和力進行比較。
39.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中使用微量熱泳測量配體結(jié)合。
40.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中使用鈣流入測定法測量配體結(jié)合。
41.一種根據(jù)權(quán)利要求19至31中任一項所述的方法制備的多肽。
42.一種用根據(jù)權(quán)利要求1至18和41中任一項所述的多肽轉(zhuǎn)染的細胞。
43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中所述細胞為哺乳動物細胞。
44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的細胞，其中所述細胞為HEK293細胞。
45.一種治療哺乳動物患有由天然膜蛋白的活性介導(dǎo)的病癥或疾病的方法，其包括向所述哺乳動物施用有效量的包含修飾性α-螺旋結(jié)構(gòu)域的水溶性多肽，其中所述修飾性α -螺旋結(jié)構(gòu)域包含氨基酸序列，其中所述天然膜蛋白的α -螺旋結(jié)構(gòu)域內(nèi)的一個或多個疏水性氨基酸殘基被一個或多個親水性氨基酸殘基替換。
46.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中所述α-螺旋結(jié)構(gòu)域為7次跨膜α-螺旋結(jié)構(gòu)域。
47.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中所述天然膜蛋白為G-蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)。
48.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中所述天然膜蛋白為整合膜蛋白。
49.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中所述親水性殘基選自谷氨酰胺(Q)、蘇氨酸(T)、酪氨酸(Y)及其任意組合。
50.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中所述疏水性殘基亮氨酸(L)、異亮氨酸(I)、纈氨酸(V)和苯丙氨酸(F)中的一個或多個被替換。
51.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中所述天然膜蛋白的所述α-螺旋結(jié)構(gòu)域中的一個或多個苯丙氨酸殘基被酪氨酸替換。
52.根據(jù)權(quán)利要求45和50中任一項所述的方法，其中所述蛋白的所述α-螺旋結(jié)構(gòu)域中的一個或多個異亮氨酸和/或纈氨酸殘基被蘇氨酸替換。
53.根據(jù)權(quán)利要求45和50中任一項所述的方法，其中所述天然膜蛋白的所述α-螺旋結(jié)構(gòu)域中的一個或多個亮氨酸殘基被谷氨酰胺替換。
54.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中所述天然膜蛋白在病癥或疾病中被異常激活、上調(diào)或過度表達。
55.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中所述疾病為癌癥。
56.根據(jù)權(quán)利 要求55所述的方法，其中所述癌癥為小細胞肺癌。
57.根據(jù)權(quán)利要求55所述的方法，其中所述癌癥為黑素瘤。
58.根據(jù)權(quán)利要求55所述的方法，其中所述癌癥為乳腺癌。
59.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中所述疾病為帕金森病。
60.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中所述疾病為心血管疾病。
61.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中所述疾病為高血壓。
62.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中所述疾病為哮喘。
63.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中所述天然膜蛋白選自嘌呤受體(Ρ2ΥρΡ2Υ2、P2Y4、P2Y6)、M1和M3毒蕈堿乙酰膽堿受體、針對凝血酶[蛋白酶激活受體(PAR)-l，PAR-2]的受體、血栓素(TXA2)、鞘氨醇1-磷酸(SlP2, S1P3、SlP4和SlP5)、溶血磷脂酸(LPA1, LPA2'LPA3)、血管緊張素II (AT1)、5_羥色胺(5-HT2。和5_HT4)、生長抑素(sst5)、內(nèi)皮素(ETa和ETb)、膽囊收縮素(CCK1)、Vla加壓素受體、D5多巴胺受體、fMLP甲酰肽受體、GAL2甘丙肽受體、EP3前列腺素受體A1腺苷受體、a i腎上腺素能受體、BB2蛙皮素受體、B2緩激肽受體、鈣敏感受體、趨化因子受體、KSHV-ORF74趨化因子受體、NK1速激肽受體、促甲狀腺激素(TSH)受體、蛋白酶激活受體、神經(jīng)肽受體、腺苷A2B受體、P2Y嘌呤受體、代謝谷氨酸受體、GRK5、GPCR-30、和 CXCR4。
64.根據(jù)權(quán)利要求45至63中任一項所述的方法，其中所述水溶性多肽保留了天然膜蛋白的結(jié)合所述配體的活性。
65.根據(jù)權(quán)利要求45至64中任一項所述的方法，其中所述水溶性多肽保留了結(jié)合所述配體的能力，所述配體通常結(jié)合于所述天然膜蛋白。
66.根據(jù)權(quán)利要求45至65中任一項所述的方法，其中潛在配體結(jié)合位點內(nèi)的一個或多個氨基酸不被替換。
67.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中所述哺乳動物為人。
68.根據(jù)權(quán)利要求45-67中任一項所述的方法,其中所述疏水性氨基酸存在于所述α-螺旋結(jié)構(gòu)域的親水表面。
69.根據(jù)權(quán)利要求45-67中任一項所述的方法，其中所述疏水性氨基酸存在于螺旋圖上的b、c或f位置處。
70.根據(jù)權(quán)利要求19-29中任一項所述的方法，其中存在于α-螺旋結(jié)構(gòu)域的所述親水表面的約10%至約100%的疏水性氨基酸被替換。
71.根據(jù)權(quán)利要求70所述的方法，其中所述α-螺旋結(jié)構(gòu)域的至少約15%、或約25%、或約50或約70%的疏水氨基酸殘基被替換。
72.根據(jù)權(quán)利要求70或71所述的方法，其中所述修飾的螺旋結(jié)構(gòu)域的螺旋含量為所述天然蛋白的螺旋結(jié)構(gòu)域的至少約30%或約50%或約75%或約95%。
73.一種制備跨膜蛋白的天然配體結(jié)合的修飾性多肽的方法，其包括將至少一些所述疏水性氨基酸殘基替換或突變?yōu)橛H水性氨基酸殘基的步驟，其中所述修飾性多肽保留了至少一些所述跨膜蛋白的配體結(jié)合性質(zhì)。
74.一種用于治療由跨膜蛋白的配體結(jié)合介導(dǎo)的疾病或病癥的方法，其包括施用修飾性多肽的步驟，其中所述多肽對應(yīng)于所述蛋白的突變氨基酸序列，其中修飾所述序列的跨膜區(qū)域使得至少一些所述疏水性氨基酸殘基被親水性氨基酸殘基替換。
75.根據(jù)權(quán)利要求73或74所述的方法，其中所述跨膜區(qū)域為α-螺旋。
76.根據(jù)權(quán)利要求73或74所述的方法，其中對應(yīng)于所述螺旋輪的至少一個b、c或f位置處的疏水性氨基酸殘基被親水性氨基酸殘基替換。
77.根據(jù)權(quán)利要求76所述的方法，其中所述親水性殘基選自谷氨酰胺(Q)、蘇氨酸(T)、酪氨酸(Y)及它們的任意組 合。
78.根據(jù)權(quán)利要求75或76所述的方法，其中所述疏水性殘基選自亮氨酸(L)、異亮氨酸(I)、纈氨酸(V)和苯丙氨酸(F)。
79.根據(jù)權(quán)利要求73-78中任一項所述的方法，其中所述修飾性多肽保留了所述跨膜蛋白的配體結(jié)合親和力。
80.根據(jù)權(quán)利要求79所述的方法，其中所述多肽的配體結(jié)合親和力基本上類似于或優(yōu)于所述跨膜蛋白的配體結(jié)合親和力。
81.根據(jù)權(quán)利要求79所述的方法，其中所述多肽的配體結(jié)合親和力為所述跨膜蛋白的配體結(jié)合親和力的約10%、或約20%或約30%或約40%或約50%或約60%或約70%或約80%或約90%。
82.根據(jù)權(quán)利要求73-81中任一項所述的方法，其中所述修飾性多肽為水溶的。
83.根據(jù)權(quán)利要求73-82中任一項所述的方法，其中所述跨膜蛋白為G-蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)。
84.根據(jù)權(quán)利要求73-82中任一項所述的方法，其中所述跨膜蛋白選自嘌呤受體(P2Yp P2Y2、P2Y4、P2Y6)、M1和M3毒蕈堿乙酰膽堿受體、針對凝血酶[蛋白酶激活受體(PAR)-1, PAR-2]的受體、血栓素(TXA2)、鞘氨醇1-磷酸(SlP2, S1P3、SlP4和SlP5)、溶血磷脂酸(LPArLPAyLPA3)、血管緊張素 II (AT1)、5_ 羥色胺(5_HT2。和 5_HT4)、生長抑素(sst5)、內(nèi)皮素伍1\和ETb)、膽囊收縮素(CCig、Vla加壓素受體、D5多巴胺受體、fMLP甲酰肽受體、GAL2甘丙肽受體、EP3前列腺素受體、A1腺苷受體、a j腎上腺素能受體、BB2娃皮素受體、B2緩激肽受體、鈣敏感受體、趨化因子受體、KSHV-0RF74趨化因子受體、NK1速激肽受體、促甲狀腺激素(TSH)受體、蛋白酶激活受體、神經(jīng)肽受體、腺苷A2B受體、P2Y嘌呤受體、代謝谷氨酸受體、GRK5、GPCR-30 和 CXCR4。
85.根據(jù)權(quán)利要求84所述的方法，其中所述修飾性多肽結(jié)合于相應(yīng)的天然配體。
86.根據(jù)權(quán)利要求84或85所述的方法，其中所述修飾性多肽為CXCR4QTY。
87.根據(jù)權(quán)利要求73-86中任一項所述的方法，其中所述修飾性多肽的水溶性比所述跨膜蛋白的水溶性大至少約10%或約20%或約30%或約40%或約50%或約60%或約70%或約80%或約90%或約100%或約125%或約150%或約175%或約200%或約225%或約250%或約300%。
88.根據(jù)權(quán)利要求45-54或63-87中任一項所述的方法，其中所述疾病或病癥選自關(guān)節(jié)炎、淋巴瘤、非小細胞肺癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、多發(fā)性硬化、中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育疾病、癡呆、帕金森病、阿爾茨海默病、腫瘤、纖維瘤、星形細胞瘤、骨髓瘤、膠質(zhì)母細胞瘤、炎性疾病、器官移植排斥或血管生成。
89.一種由根據(jù)權(quán)利要求83-87中任一項所述的方法制備的修飾性多肽。
90.一種藥物組合物，其包含有效量的根據(jù)權(quán)利要求1至9、11或88中任一項所述的水溶性多肽和藥學(xué)上可接 受的稀釋劑或載體。
【文檔編號】A61K38/16GK103458915SQ201280009690
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2012年2月23日 優(yōu)先權(quán)日:2011年2月23日
【發(fā)明者】S·張, A·瑞馳, K·科林, L·T·泰格勒 申請人:麻省理工學(xué)院