特異性結(jié)合金黃色葡萄球菌α毒素的抗體以及使用方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了結(jié)合金黃色葡萄球菌α毒素的抗體和片段的組合物、制造方法以及使用方法。更確切地說(shuō)，本發(fā)明提供了抗體或抗原結(jié)合片段的VH?CDR和VL?CDR區(qū)序列。還披露了預(yù)防、治療或管理與金黃色葡萄球菌感染相關(guān)的病癥的方法。
【專利說(shuō)明】特異性結(jié)合金黃色葡萄球菌α毒素的抗體以及使用方法
[0001]MM
[0002]本技術(shù)涉及抗體部分，并且在某些實(shí)施例中涉及特異性結(jié)合至金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) α 毒素的抗體。
[0003]直量
[0004]金黃色葡萄球菌是一種革蘭氏陽(yáng)性的、兼性需氧、形成簇的球菌細(xì)菌，一般定殖于健康人的鼻子和皮膚。在任何給定時(shí)間，大致20%-30%的人群被金黃色葡萄球菌定殖。金黃色葡萄球菌細(xì)菌(有時(shí)也稱為“staph”、“Staph.aureus”、或“S.aureus”)被認(rèn)為是引起輕微感染(例如，小膿皰、癤)和全身感染的機(jī)會(huì)致病菌。
[0005]通常，粘膜和表皮屏障(皮膚)保護(hù)人體免于金黃色葡萄球菌感染。由于損傷(例如，燒傷、外傷、外科手術(shù)等等)造成的這些天然屏障的破壞顯著增加了感染風(fēng)險(xiǎn)。損害免疫系統(tǒng)的疾病(例如，糖尿病、終末期腎病、癌癥等等)也增加了感染風(fēng)險(xiǎn)。機(jī)會(huì)性金黃色葡萄球菌細(xì)菌感染可以變得嚴(yán)重，引起多種疾病或病癥，其非限制性實(shí)例包括菌血癥、蜂窩織炎、眼瞼感染、食物中毒、關(guān)節(jié)感染、皮膚感染、燙傷樣皮膚綜合征、中毒性休克綜合征、肺炎、骨髓炎、心內(nèi)膜炎、腦膜炎以及膿腫形成。
[0006]金黃色葡萄球菌還可以引起動(dòng)物中的感染和疾病。例如，金黃色葡萄球菌常常與牛乳腺炎相關(guān)。
[0007]金黃色葡萄球菌表達(dá)多種毒力因子，包括莢膜多糖以及蛋白質(zhì)毒素。經(jīng)常與金黃色葡萄球菌感染相關(guān)的、是主要細(xì)胞毒劑的一種毒力因子是α毒素(還稱為α-溶血素或Hla)，是一種由金黃色葡萄球菌的致病`力最強(qiáng)的菌株產(chǎn)生的成孔且溶血的胞外蛋白。該毒素在易感細(xì)胞(例如白細(xì)胞、血小板、紅細(xì)胞、外周血單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、角質(zhì)化細(xì)胞、成纖維細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞)的膜中形成七聚體孔。α毒素孔形成常導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙或溶解。
[0008]披露的簡(jiǎn)要概述
[0009]在某些實(shí)施例中，提供了一種純化或分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，該抗體或片段免疫特異性地結(jié)合至金黃色葡萄球菌α毒素多肽。術(shù)語(yǔ)“α毒素多肽”、“α毒素單體”以及“α毒素寡聚體(例如七聚體)”在此分別稱為“ΑΤ”、“ΑΤ單體”以及“AT寡聚體”。術(shù)語(yǔ)“可變重鏈”稱為“VH”。術(shù)語(yǔ)“可變輕鏈”被稱為“VL”。
[0010]在一些實(shí)施例中，免疫特異性地結(jié)合至金黃色葡萄球菌α毒素多肽的分離抗體或其抗原結(jié)合片段包含:(a) VH CDR1，該VH CDRl包含與SEQ ID NO: 7、10、13或69—致的氨基酸序列或相對(duì)于它們包含1、2、或3個(gè)氨基酸殘基置換；(b)VH⑶R2，該VH⑶R2包含與SEQ ID N0:8、ll、14、17、70或75 —致的氨基酸序列或相對(duì)于它們包含1、2、或3個(gè)氨基酸殘基置換；以及(c)VHCDR3，該 VH CDR3 包含與 SEQ ID N0:9、12、15、18、16、65、66、67、71、72,76或78 —致的氨基酸序列或相對(duì)于它們包含1、2、或3個(gè)氨基酸殘基置換。
[0011]在具體實(shí)施例中，分離抗體或其抗原結(jié)合片段包含VH⑶R1、VH⑶R2和VH⑶R3，該 VH CDRUVH CDR2 和 VH CDR3 在各自的 CDR 中包含與 SEQID N0:7、8 和 9;SEQ ID NO: 10、
11和 12;SEQ ID N0:13、14和15;SEQ IDN0:7、17和 18 ;SEQ ID NO:7、8和 16 ;SEQ ID NO:7、8 和 65;SEQ ID NO:7、8 和 66 ;SEQ ID N07、8 和 67 ;SEQ ID NO:7、8 和 78 ;SEQ ID NO:69、70 和 71;SEQ ID NO: 7、8 和 72 ;SEQ ID NO: 69、75 和 71 ;SEQ ID NO: 69、75 和 76 ;或 SEQ IDNO:69、70和71 —致的氨基酸序列或相對(duì)于它們包含1、2、或3個(gè)氨基酸殘基置換。
[0012]在一些實(shí)施例中，免疫特異性地結(jié)合至金黃色葡萄球菌α毒素多肽的分離抗體或其抗原結(jié)合片段包含:(a) VL⑶R1，該VL⑶Rl包含與SEQ ID NO:1或4 一致的氨基酸序列或相對(duì)于它們包含1、2、或3個(gè)氨基酸殘基置換；(b) VIXDR2，該VL⑶R2包含與SEQ IDN0:2、5、73或77 —致的氨基酸序列或相對(duì)于它們包含1、2、或3個(gè)氨基酸殘基置換；以及
(c)VL CDR3，該VL CDR3包含與SEQ ID NO: 3、6、64、68或74 —致的氨基酸序列或相對(duì)于它們包含1、2、或3個(gè)氨基酸殘基置換。
[0013]在具體實(shí)施例中，分離抗體或其抗原結(jié)合片段包含VL⑶R1、VL⑶R2和VL⑶R3，該 VL CDRUVL CDR2 和 VL CDR3 在各自的 CDR 中包含與 SEQ IDN0:1、2 和 3 ;SEQ ID N0:4、5和 6 ；SEQ ID NO: 1、2 和 64 ；SEQ ID NO: 1、2 和 68 ；SEQ ID NO: 1,73 和 74 ;或 SEQ ID NO: 1、77和74 —致的氨基酸序列或相對(duì)于它們包含1、2、或3個(gè)氨基酸殘基置換。
[0014]在一些實(shí)施例中，免疫特異性地結(jié)合至金黃色葡萄球菌α毒素多肽的分離抗體或其抗原結(jié)合片段包含VH CDRUVH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3，在各自的CDR中包含與以下各項(xiàng)一致的氨基酸序列或相對(duì)于它們包含1、2、或3個(gè)氨基酸殘基置換:(a) VH CDR1，該 VH CDRl 包含 SEQ ID NO: 7、10、13 或 69 的氨基酸序列；(b) VH CDR2，該 VHCDR2 包含 SEQ ID N0:8、ll、14、17、70 或 75 的氨基酸序列；(c)VH CDR3，該 VHCDR3 包含 SEQID N0:9、12、15、18、16、65、66、67、71、72、76 或 78 的氨基酸序列；(d)VL CDR1，該 VL CDRl 包含 SEQ ID NO:1 或4 的氨基酸序列；(e)VL CDR2，該 VL CDR2 包含 SEQ ID NO: 2、5、73、或 77的氨基酸序列；以及(f)VL CDR3，該VL CDR3包含SEQ ID NO: 3、6、64、68或74的氨基酸序列。
[0015]在具體實(shí)施例中，分離抗體或其抗原結(jié)合片段包含VH⑶Rl、VH⑶R2、VH⑶R3、VL CDRUVL CDR2、以及 V L CDR3，該 VH CDRUVH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、以及 VLCDR3 在各自的 CDR 中包含與 SEQID NO: 7、8、9、1、2 和 3 ;SEQ ID NO: 10、11、12、1、2 和 3 ;SEQID N0:13、14、15、4、5 和 6 ;SEQ ID NO:7、17、18、1、2 和 3 ;SEQ ID NO:7、8、16、1、2 和 64 ;SEQID N0:7、8、65、l、2 和 64 ;SEQ ID NO ;7、8、66、1、2和 64 ;SEQ ID NO:7、8、67、1、2 和 68 ;SEQID N0:7、8、67、l、2和 64 ;SEQ ID NO:7、8、78、1、2和 64 ;SEQ ID NO:7、8、65、1、2 和 68 ;SEQIDN0:69、70、71、1、2 和 68 ;SEQ ID NO: 7、8、72、1、73 和 74 ;SEQ ID NO:69、75、71、1、2 和 68 ;SEQ ID N0:69、75、76、l、2和68 ;SEQ ID N0:69、75、76、l、77和74 ;SEQ ID N0:69、70、71、l、77和74 —致的氨基酸序列或相對(duì)于它們包含1、2、或3個(gè)氨基酸殘基置換。
[0016]在一些實(shí)施例中，提供了含有一種分離抗體或其抗原結(jié)合片段的組合物，該分離抗體或其抗原結(jié)合片段(i)包括含有三個(gè)CDR的VH鏈結(jié)構(gòu)域以及含有三個(gè)CDR的VL鏈結(jié)構(gòu)域；并且(ii)免疫特異性地結(jié)合至金黃色葡萄球菌α毒素多肽，其中該VH鏈結(jié)構(gòu)域的三個(gè)CDR包括(a)含有SEQ ID NO: 7、10、13或69的氨基酸序列的VH CDRl ； (b)含有SEQID N0:8、ll、14、17、70 或 75 的氨基酸序列的 VH CDR2;以及(c)含有 SEQ ID N0:9、12、15、18、16、65、66、67、71、72、76或78的氨基酸序列的VH CDR3。在具體實(shí)施例中，VH CDRUVHCDR2 和 VH CDR3 相應(yīng)于 SEQ ID N0:7、8 和 9;SEQ ID NO: 10、11 和 12 ;SEQ ID NO: 13、14 和15 ；SEQ ID NO:7、17 和 18 ；SEQ ID N0:7、8 和 16 ；SEQ ID N0:7、8 和 65 ；SEQ ID N0:7、8 和66 ;SEQ ID N07、8、和 67 ;SEQID NO:7、8 和 78 ;SEQ ID NO:69、70 和 71 ;SEQ ID N0:7、8 和72 ;SEQ IDN0:69、75 和 71 ;SEQ ID NO:69、75 和 76 ;或 SEQ ID N0:69、70 和 71。
[0017]在某些實(shí)施例中還提供了含有一種分離抗體或其抗原結(jié)合片段的組合物，該分離抗體或其抗原結(jié)合片段(i)包括含有三個(gè)CDR的VH鏈結(jié)構(gòu)域以及含有三個(gè)CDR的VL鏈結(jié)構(gòu)域；并且(ii)免疫特異性地結(jié)合至金黃色葡萄球菌α毒素多肽，其中該VL鏈結(jié)構(gòu)域的三個(gè)CDR包括(a)含有SEQ ID NO:1或4的氨基酸序列的VL CDRl ； (b)含有SEQ ID NO: 2、5、73、或77的氨基酸序列的VL CDR2;以及(c)含有SEQ ID NO: 3、6、64、68或74的氨基酸序列的VL CDR3。在具體實(shí)施例中，VL CDRUVL CDR2和VL CDR3相應(yīng)于SEQ ID N0:l、2和3 ；SEQ ID N0:4、5 和 6 ；SEQ ID N0:l、2 和 64 ；SEQ ID N0:l、2 和 68 ；SEQ IDN0:1、73 和 74 ；或 SEQ ID N0:l、77 和 74。
[0018]在一些實(shí)施例中還提供了包含一種分離抗體或其抗原結(jié)合片段的組合物，該分離抗體或其抗原結(jié)合片段(i)免疫特異性地結(jié)合至金黃色葡萄球菌α毒素多肽，(ii)包含重鏈可變域，該重鏈可變域包含與 SEQ ID N0:20、22、24、26、28、41、43、45、47、49、51、53、55、
57、79、59、61、或62的氨基酸序列至少90%的一致性，并且(iii)包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域包含與 SEQ ID N0:19、21、23、25、27、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60 或 63 的氨基酸序列至少90%的一致性。
[0019]在一些實(shí)施例中，分離抗體或其抗原結(jié)合片段包含具有SEQ ID N020、22、24、26、
28、41、43、45、47、49、51、53、55、57、79、59、61、或 62 的重鏈可變域以及具有 SEQ ID NO: 19、
21、23、25、27、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60 或 63 的輕鏈可變域。
[0020]在具體實(shí)施例中，分離抗體或 其抗原結(jié)合片段包含VH和VL，其中該VH和VL各自與 SEQ ID NO: 20 和 19 ；SEQ ID NO: 22 和 21 ；SEQ ID NO: 24 和 23 ；SEQ ID NO: 26 和 25 ；SEQ ID N0:28和27;SEQ ID N0:41 和 42;SEQ IDNO:43 和 44 ;SEQ ID N0:45和46;SEQ IDN0:47和48;SEQ ID N0:47和48;SEQ ID N0:49 和 50;SEQ ID N0:51 和 52;SEQ ID NO: 51和 52;SEQ IDNO:53 和 54 ;SEQ ID N0:55 和 56;SEQ ID N0:57 和 58;SEQ ID NO:59 和 60;SEQ ID N0:61 和 58;SEQ ID N0:62和58;SEQ ID N0:62和63;SEQ IDNO: 79 和 63 的 VH和VL氨基酸序列一致或者與它們各自具有至少90%、95%或98%的一致性。
[0021]在一些實(shí)施例中，一種分離抗體或其抗原結(jié)合片段免疫特異性地結(jié)合至金黃色葡萄球菌α毒素多肽并且具有選自下組的一種或多種特征，該組由以下各項(xiàng)組成:(a)對(duì)于金黃色葡萄球菌α毒素多肽的大約13ηΜ或更小的親和力參數(shù)(Kd) ； (b)以至少50%、60%、70%、80%、90%、或95%抑制金黃色葡萄球菌α毒素多肽的寡聚化；以及(c)以至少50%、60%、70%、80%、90%、或95%減少Α549 (肺上皮)溶解或THP-1 (單核細(xì)胞)以及紅細(xì)胞溶解，其中分離抗體或抗原結(jié)合片段與金黃色葡萄球菌毒素以大約1:1的摩爾比存在。
[0022]在一些實(shí)施例中，紅細(xì)胞是來(lái)自血液的細(xì)胞。在某些實(shí)施例中，來(lái)自血液的細(xì)胞是紅細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，溶解是通過(guò)體外溶血試驗(yàn)確定的。在其他實(shí)施例中，溶解是通過(guò)體外乳酸脫氫酶釋放試驗(yàn)確定的。這些試驗(yàn)進(jìn)一步描述于下文，或者可以由本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員常規(guī)地進(jìn)行。
[0023]在一些實(shí)施例中，分離抗體或其抗原結(jié)合片段包括一種診斷劑。在某些實(shí)施例中，診斷劑包括一種顯像劑。在一些實(shí)施例中，診斷劑包括一種可檢測(cè)標(biāo)記物。在某些實(shí)施例中，該分離抗體或其抗原結(jié)合片段經(jīng)由一種接頭連接至該診斷劑。
[0024]在一些實(shí)施例中，金黃色葡萄球菌α毒素多肽是一種天然毒素多肽。在一些實(shí)施例中，相對(duì)于天然毒素多肽，金黃色葡萄球菌α毒素多肽包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失、添加和/或置換(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個(gè)氨基酸插入、缺失和/或置換)。在一些實(shí)施例中，金黃色葡萄球菌α毒素多肽是一種重組蛋白。在某些實(shí)施例中，金黃色葡萄球菌α毒素多肽包含SEQ ID NO: 39的氨基酸序列或其片段。在某些其他實(shí)施例中，金黃色葡萄球菌α毒素多肽是多肽的減毒形式，如H35L，其中在野生型多肽的位置35處的組氨酸被亮氨酸替換，例如，如通過(guò)SEQ ID NO:40表示的。
[0025]在某些實(shí)施例中，分離抗體或其抗原結(jié)合片段免疫特異性地結(jié)合至金黃色葡萄球菌 α 毒素多肽并且包含 VH CDR3，該 VH CDR3 包含與 SEQ ID NO: 9、12、15、18、16、65、66、67、71、72、76或78 —致的氨基酸序列或相對(duì)于它們包含1、2、或3個(gè)氨基酸殘基置換，其中該抗體或其抗原結(jié)合片段中和該金黃色葡萄球菌α毒素多肽。在一些實(shí)施例中，分離抗體或分離抗體的抗原結(jié)合片段免疫特異性地結(jié)合至金黃色葡萄球菌α毒素多肽并且包含VLCDR3，該VL CDR3包含與SEQ ID NO: 3、6、64、68或74 —致的氨基酸序列或相對(duì)于它們包含1、2、或3個(gè)氨基酸殘基置換，其中該抗體或其抗原結(jié)合片段中和該金黃色葡萄球菌α毒素多肽。
[0026]在某些實(shí)施例中，分離抗體或其抗原結(jié)合片段免疫特異性地結(jié)合至金黃色葡萄球菌 α 毒素多肽并且包含 VH CDR3，該 VH CDR3 包含與 SEQ ID NO: 9、12、15、18、16、65、66、
67、71、72、76或78 —致的氨基酸序列或相對(duì)于它們包含1、2、或3個(gè)氨基酸殘基置換，其中該抗體或其抗原結(jié)合片段抑制該金黃色葡萄球菌α毒素多肽的寡聚化。在一些實(shí)施例中，分離抗體或其抗原結(jié)合片段免疫特異性地結(jié)合至金黃色葡萄球菌α毒素多肽并且包含VLCDR3，該VL CDR3包含與SEQ ID NO: 3、6、64、68或74 —致的氨基酸序列或相對(duì)于它們包含
1、2、或3個(gè)氨基酸殘基置換，其中該抗體或其抗原結(jié)合片段抑制該金黃色葡萄球菌α毒素多肽的寡聚化。在某些實(shí)施例中，寡聚化的抑制是通過(guò)體外結(jié)合和電泳遷移率測(cè)定確定的。
`[0027]在此還提供了試劑盒，這些試劑盒包括(a)含有分離抗體或其抗原結(jié)合片段的組合物，以及(b)用于使用該組合物的說(shuō)明書或者用于獲得使用該組合物的說(shuō)明書的指導(dǎo)。在一些實(shí)施例中，在組合物中的抗體連接至一種固體支撐物。在某些實(shí)施例中，固體支撐物是一種珠粒，并且在一些實(shí)施例中，該珠粒是一種瓊脂糖凝膠珠。在一些實(shí)施例中，使用說(shuō)明書包括金黃色葡萄球菌α毒素多肽的分離、純化、檢測(cè)以及定量中的一項(xiàng)或多項(xiàng)。
[0028]在某些實(shí)施例中，該試劑盒包括一種適用于Western印跡的緩沖液和膜。在一些實(shí)施例中，該試劑盒包含上樣緩沖液和洗脫緩沖液。在某些實(shí)施例中，該試劑盒包含一種適用于酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)的緩沖液。
[0029]在此還提供了用于預(yù)防、治療或管理在受試者中的肺炎的方法，該方法包括:將包含免疫特異性地結(jié)合至金黃色葡萄球菌α毒素多肽的抗體或其抗原結(jié)合片段的組合物以用于預(yù)防、治療或管理肺炎有效的量給予至對(duì)其有需要的受試者。
[0030]在一些實(shí)施例中，該方法預(yù)防肺炎。在某些實(shí)施例中，抗體或其抗原結(jié)合片段免疫特異性地結(jié)合至一種線性或構(gòu)象表位，該線性或構(gòu)象表位包含葡萄球菌α毒素多肽的氨基酸I至293或氨基酸51至293的一個(gè)或多個(gè)殘基或者一部分或片段。在某些實(shí)施例中，抗體或其抗原結(jié)合片段結(jié)合至一種片段，其中該抗體或抗原結(jié)合片段在SEQ ID Ν0:39的Τ261、Τ163、Ν264、Κ266和Κ271處具有接觸殘基。在另外的實(shí)施例中，抗體或其抗原結(jié)合片段結(jié)合至α毒素的一個(gè)片段，其中該抗體或抗原結(jié)合片段在SEQ ID Ν0:39的N177、W179、G180、P181、Y182、D183、D185、S186、W187、N188、P189、V190、Y191 和 R200 處具有另外的接
觸殘基。
[0031]在某些實(shí)施例中，抗體或抗原結(jié)合片段在SEQ ID N0:39的N177、W179、G180、P181、Y182、D183、D185、S186、W187、N188、P189、V190、Y191、R200、T261、T163、N264、K266 和 K271處具有接觸殘基。在其他實(shí)施例中，抗體或其抗原結(jié)合片段結(jié)合至包含SEQ ID N0:39氨基酸261-272的片段。在另外的實(shí)施例中，抗體或其抗原結(jié)合片段結(jié)合至包含SEQ ID NO:39氨基酸248-277的片段。在其他實(shí)施例中，抗體或其抗原結(jié)合片段結(jié)合至包含SEQ ID NO: 39的氨基酸173-201的片段以及包含SEQ ID NO: 39的氨基酸261-272的片段，或者結(jié)合至包含SEQ ID NO: 39的氨基酸173-201的片段以及包含SEQ ID NO: 39的氨基酸248-277的片段。
[0032]在某些實(shí)施例中，抗體或其抗原結(jié)合片段結(jié)合至一種片段，其中該抗體或抗原結(jié)合片段在SEQ ID NO:40的T261、T163、N264、K266和K271處具有接觸殘基。在另外的實(shí)施例中，抗體或其抗原結(jié)合片段結(jié)合至α毒素的一個(gè)片段，其中該抗體或抗原結(jié)合片段在SEQ ID NO: 40 的 Ν177、W179、G180、Ρ181、Υ182、D183、D185、S186、W187、Ν188、Ρ189、V190、Υ191和R200處具有另外的接觸殘基。
[0033]在某些實(shí)施例中，抗體或抗原結(jié)合片段在SEQ ID Ν0:40的N177、W179、G180、P181、Y182、D183、D185、S186、W187、N188、P189、V190、Y191、R200、T261、T163、N264、K266 和K271處具有接觸殘基。在其他實(shí)施例中，抗體或其抗原結(jié)合片段結(jié)合至包含SEQ ID NO:40的氨基酸261-272的片段。在另外的實(shí)施例中，抗體或其抗原結(jié)合片段結(jié)合至包含SEQ IDNO:40的氨基酸248-277的片段。在其他實(shí)施例中，抗體或其抗原結(jié)合片段結(jié)合至包含SEQIDNO:40氨基酸173-201的片段以及包含SEQ ID NO:40氨基酸261-272的片段。
[0034]在其他實(shí)施例中，抗體或其抗原結(jié)合片段結(jié)合至一個(gè)片段，該片段包含葡萄球菌α毒素多肽或葡萄球菌α毒素多 肽變體的(I)氨基酸261-272，(2)氨基酸248-277或(3)氨基酸173-201和261-272，其中氨基酸261-272、氨基酸248-277或氨基酸173-201相應(yīng)于與SEQ ID NO: 39中的相應(yīng)區(qū)域相同的氨基酸序列或者在具有SEQ ID NO: 39中的相應(yīng)區(qū)域的片段之內(nèi)含有置換，其中這些置換不改變抗體或其抗原結(jié)合片段結(jié)合至α毒素多肽的能力。
[0035]在一些實(shí)施例中提供了用于預(yù)防、治療或管理受試者中的皮膚感染病癥的一種方法，該方法包括:將包含根據(jù)本發(fā)明的免疫特異性地結(jié)合至金黃色葡萄球菌α毒素多肽的抗體或其抗原結(jié)合片段的組合物以用于預(yù)防、治療或管理皮膚感染病癥有效的量給予至對(duì)其有需要的受試者。在某些實(shí)施例中，皮膚感染病癥是皮膚壞死。在一些實(shí)施例中，皮膚感染病癥包括皮膚的金黃色葡萄球菌感染。在某些實(shí)施例中，該方法預(yù)防皮膚感染病癥。
[0036]在一些實(shí)施例中提供了用于預(yù)防、治療或管理與金黃色葡萄球菌感染相關(guān)的病癥的一種方法，該方法包括:將包含根據(jù)本發(fā)明的免疫特異性地結(jié)合至金黃色葡萄球菌α毒素多肽的抗體或其抗原結(jié)合片段的組合物以減少該毒素多肽的寡聚化有效的量給予至對(duì)其有需要的受試者。在某些實(shí)施例中，該方法預(yù)防與金黃色葡萄球菌感染相關(guān)的病癥。
[0037]在一些實(shí)施例中，提供了用于預(yù)防、治療、或管理與透析治療、高風(fēng)險(xiǎn)手術(shù)、肺炎、呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎(VAP)、或在從先前的早先治療或手術(shù)的醫(yī)院出院之后的再感染相關(guān)的金黃色葡萄球菌感染的方法，該方法包括將包含免疫特異性地結(jié)合至金黃色葡萄球菌α毒素多肽的抗體或其抗原結(jié)合片段的組合物給予至對(duì)其有需要的受試者。
[0038]在一些實(shí)施例中還提供了用于預(yù)防、治療或管理與金黃色葡萄球菌感染相關(guān)的病癥的一種方法，該方法包括將包含免疫特異性地結(jié)合至金黃色葡萄球菌α毒素多肽的抗體或其抗原結(jié)合片段的組合物以減少細(xì)胞溶解有效的量給予至對(duì)其有需要的受試者。在某些實(shí)施例中，該方法預(yù)防與金黃色葡萄球菌感染相關(guān)的病癥。在一些實(shí)施例中，該細(xì)胞是來(lái)自血液或肺的紅細(xì)胞。
[0039]在一些實(shí)施例中，抗體或其抗原結(jié)合片段免疫特異性地結(jié)合至包含一個(gè)或多個(gè)殘基的線性或構(gòu)象表位。在某些實(shí)施例中，給予至受試者的組合物是根據(jù)在此所述的組合物中的任何一種。
[0040]在某些實(shí)施例中還提供了這樣一種方法，該方法包括:將在此所述的組合物給予至細(xì)胞；并且檢測(cè)與給予組合物至這些細(xì)胞相關(guān)的生物效應(yīng)的存在、不存在或量。在一些實(shí)施例中還提供了一種這樣方法，該方法包括:將在此所述的組合物給予至受試者；并且檢測(cè)受試者中與組合物的給予相關(guān)的生物效應(yīng)的存在、不存在或量。在某些實(shí)施例中還提供了這樣一種方法，該方法包括:將在此所述的組合物給予至受試者；并且監(jiān)測(cè)受試者的病癥。
[0041]在一些實(shí)施例中還提供了通過(guò)將在此所述的有效量的任一種組合物給予至對(duì)其有需要的受試者以便中和毒素多肽而用于中和金黃色葡萄球菌α毒素多肽的方法。
[0042]在某些實(shí)施例中還提供了預(yù)防、治療、或管理在對(duì)其有需要的受試者中的由金黃色葡萄球菌感染介導(dǎo)的病癥的方法，該方法包括將在此所述的有效量的任一種組合物給予至受試者以預(yù)防、治療或管理該病癥。在一些實(shí)施例中還提供了用于治療、預(yù)防或減輕在對(duì)其有需要的受試者中的由金黃色葡萄球菌α毒素多肽介導(dǎo)的失調(diào)癥狀的方法，該方法包括將在此所述的有效量的任一種組合物給予至受試者以治療、預(yù)防或減輕癥狀。
[0043]在某些實(shí)施例 中還提供了用于診斷受試者中的由金黃色葡萄球菌α毒素介導(dǎo)的病癥的方法，該方法包括選擇對(duì)診斷有需要的受試者，并且將診斷有效劑量的在此所述的任何一種組合物給予至受試者。在一些實(shí)施例中，受試者是家畜，并且在某些實(shí)施例中，受試者是人。
[0044]某些實(shí)施例進(jìn)一步描述于以下說(shuō)明書、實(shí)例、權(quán)利要求書以及附圖中。
[0045]附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明
[0046]附圖展示了在此的實(shí)施例并且不是限制性的。為了清晰和容易地說(shuō)明，附圖未按比例作出，并且在一些情況下，不同的方面可能被夸張或放大地顯示以促進(jìn)具體實(shí)施例的理解。
[0047]圖1A和IB圖形展示了紅細(xì)胞溶解被抗α毒素抗體抑制的百分比。實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)和結(jié)果描述于實(shí)例3中。
[0048]圖2Α和2Β圖形展示了人Α549和THP-1細(xì)胞溶解被抗α毒素抗體抑制的百分比。實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)和結(jié)果描述于實(shí)例3中。
[0049]圖3Α和3Β展示了在皮膚壞死模型中用抑制性抗金黃色葡萄球菌α毒素mAb的被動(dòng)免疫的結(jié)果。將5只BALB/c小鼠的組用5mg/kg的抑制性mAb被動(dòng)免疫，并且然后用金黃色葡萄球菌Wood感染并且監(jiān)測(cè)病灶大小持續(xù)6天。圖3A顯示了感染6天后病灶大小的照片。圖3B圖形展示了隨著感染時(shí)程的推移的病灶大小的減小。實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)和結(jié)果描述于實(shí)例4中。
[0050]圖4-7圖形展示了在肺炎模型中用在此所述的不同mAb被動(dòng)免疫的小鼠的存活。圖4展示了在用金黃色葡萄球菌USA300 (3X IO8Cfu)感染之前24小時(shí)用5mg/kg、15mg/kg和45mg/kg純化的12B8.19被動(dòng)免疫的C57BL/6J小鼠的結(jié)果。
[0051]圖5展示了在用金黃色葡萄球菌USA300( 3 X IO8Cfu)感染之前24小時(shí)用5mg/kg、15mg/kg和45mg/kg純化的2A3.1被動(dòng)免疫的C57BL/6J小鼠的結(jié)果。
[0052]圖6展示了在用金黃色葡萄球菌USA300( 3 X IO8Cfu)感染之前24小時(shí)用5mg/kg、15mg/kg和45mg/kg純化的28F6.1被動(dòng)免疫的C57BL/6J小鼠的結(jié)果。
[0053]圖7展示了在用金黃色葡萄球菌USA300( 3 X IO8Cfu)感染之前24小時(shí)用5mg/kg、15mg/kg和45mg/kg純化的10A7.5被動(dòng)免疫的C57BL/6J小鼠的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)和結(jié)果描述于實(shí)例5中。
[0054]圖8A和8B圖形展示了在用全人型式的mAb2A3.1 (例如，2A3hu)或同種型對(duì)照(R347)被動(dòng)免疫的小鼠中在肺(圖8A)和腎(圖8B)中的細(xì)菌分布。將C57BL/6J小鼠在用USA300感染之前24小時(shí)用2A3hu (15mg/kg)被動(dòng)免疫。還收集樣品以測(cè)量細(xì)胞因子水平并且用于組織病理學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)和結(jié)果描述于實(shí)例5中。
[0055]圖9圖形展示了在用mAb2A3hu被動(dòng)免疫之后炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生的減少。圈起來(lái)的結(jié)果來(lái)自24小時(shí)時(shí)間點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)和結(jié)果描述于實(shí)例6中。
[0056]圖10顯示了用R347對(duì)照處理(參見(jiàn)圖10左側(cè)的頂部和底部照片)或用2A3hu處理(參見(jiàn)圖10右側(cè)的頂部和底部照片)的小鼠中肺部組織學(xué)的代表性照片。實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)和結(jié)果描述于實(shí)例6中。
[0057]圖11圖形展示了在此所述的抗AT (金黃色葡萄球菌α毒素)mAb不抑制天然α毒素(nAT)結(jié)合至存在于 兔紅細(xì)胞血影上的受體。實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)和結(jié)果描述于實(shí)例8中。
[0058]圖12是展示被在此所述的抗體抑制七聚體形成的代表性western印跡。實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)和結(jié)果描述于實(shí)例8中。
[0059]圖13A和13B展示了證實(shí)被在此所述的抗AT mAb抑制寡聚化的代表性western印跡，并且進(jìn)一步展示了該抑制可以被消除(titrated)。實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)和結(jié)果描述于實(shí)例8中。
[0060]圖14-16圖形展示了在細(xì)胞溶解抑制試驗(yàn)中全人抗AT抗體的效力。全人型式的抗AT IgG抗體展現(xiàn)了類似于相應(yīng)的嵌合抗AT IgG抗體的效力。將全人IgG抗體與嵌合IgG抗體在兔RBC (紅細(xì)胞)溶解(圖14)、A549細(xì)胞溶解(圖15)和THP-1細(xì)胞溶解(圖16)中的抑制活性進(jìn)行比較。實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)和結(jié)果描述于實(shí)例9中。
[0061]圖17A和17B圖形展示了在皮膚壞死模型中在用抑制性抗金黃色葡萄球菌α毒素mAb QD20、QD37、LC10、QD33、2A3和對(duì)照R347被動(dòng)免疫之后隨著感染時(shí)程的推移的病灶大小的減少。將5只BALB/c小鼠的組用所示的lmg/kg (圖17A)和0.5mg/kg (圖17B)的抑制性mAb進(jìn)行被動(dòng)免疫，并且然后用金黃色葡萄球菌Wood感染并且監(jiān)測(cè)病灶大小持續(xù)6天。
[0062]圖18圖形展示了在肺炎模型中用mAb QD20、QD37、LC10、QD33、2A3和對(duì)照R347被動(dòng)免疫的小鼠的存活。將小鼠在用金黃色葡萄球菌USA300 (約2X IO8Cfu)感染之前24小時(shí)用5mg/kg純化mAb被動(dòng)免疫。
[0063]圖19圖形描繪了 LC10YTE結(jié)合至α毒素和LukF-PV的ELISA表征。將含有His-標(biāo)簽的α毒素或LukF-PV的細(xì)菌溶解產(chǎn)物包被在96孔的表面上。將LC10YTE或小鼠抗HismAb添加至包被的孔中，并且孵育lh。如由抗His mAb的結(jié)合信號(hào)所示，α毒素和LukF-PV的表達(dá)水平是相似的，同時(shí)LC10YTE僅顯著地結(jié)合至α毒素而不是LukF-PV。
[0064]圖20顯示了 α毒素和LukF-PV蛋白的序列比對(duì)。α毒素與LukF_PV(UniProtKB/TrEMBL登錄號(hào)B1Q018)共享25%的氨基酸序列一致性。氨基酸編號(hào)是基于成熟蛋白質(zhì)。使用Clustal W的方法進(jìn)行比對(duì)。通過(guò)加下劃線突出顯示區(qū)段aa248-277。
[0065]圖21描繪了 α毒素結(jié)構(gòu)的卡通表示。Α) α毒素的可溶性單體的模型化結(jié)構(gòu)的卡通表示。α毒素的模型化單體結(jié)構(gòu)是使用LukF-PV的晶體結(jié)構(gòu)作為模板用Maestro9.1(薛定愕(Schrodinger)公司)來(lái)構(gòu)建的(蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(ProteinData Bank)入口 1PVL)(佩德拉克(Pedelacq), Maveyraud等人1999)。B)來(lái)自六聚體的α毒素原聚體(protomer)的晶體結(jié)構(gòu)的卡通表示(蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)入口 7AHL)(宋(Song),霍鮑(Hobaugh)等人1996)。aal01-110示為藍(lán)色，aa224_231為橙色，并且aa248_277為紅色。
[0066]圖22是LC10YTE Fab-α毒素復(fù)合體的帶狀圖。α毒素分子是由該帶狀圖的頂部部分中的帶指示的。重鏈?zhǔn)怯稍搸顖D的底部部分中的黑色帶指示的，并且輕鏈?zhǔn)怯稍搸顖D的底部部分中的淺色帶指示的。
[0067]圖23是α毒素分子的七聚體和單體狀態(tài)的卡通表示。a.在宿主細(xì)胞的表面上產(chǎn)生孔的蘑菇狀的α毒素分子七聚體組裝物?；疑秃谏珔^(qū)域相應(yīng)于遮蔽在模型中的LC10YTE接觸殘基。在遮蔽位置中存在的接觸殘基是阻止七聚體形成的一致的LC10。b.在孔形成之前(淡灰色)和之后(深灰色)的α毒素分子的重疊結(jié)構(gòu)。
[0068]圖24圖形表示了 LClO在鼠的皮膚壞死模型中的治療功效。將5只Balb/C小鼠的組用15mg/kg LClO或R347被動(dòng)免疫，將Balb/C小鼠用2 X IO8個(gè)金黃色葡萄球菌Wood進(jìn)行鼻內(nèi)感染。感染后(A)I小時(shí)、(B)3小時(shí)或(06小時(shí)，然后將小鼠用5mg/kg、15mg/kg或45mg/kg LClO進(jìn)行治療，并且監(jiān)測(cè)病灶大小持續(xù)6天。5只在細(xì)菌激發(fā)之前24小時(shí)被給予15mg/kg LClO或R347的組被包`括為對(duì)照。
[0069]圖25圖形表示了 LClO在小鼠肺炎模型中的治療功效。將10只C57BL/6小鼠的組用15mg/kg LClO或R347被動(dòng)免疫，24小時(shí)后用2 X IO8個(gè)金黃色葡萄球菌USA300進(jìn)行鼻內(nèi)激發(fā)。將10只C57BL/6小鼠的組用2 X IO8個(gè)金黃色葡萄球菌USA300進(jìn)行鼻內(nèi)感染。感染后(A) I小時(shí)，(B) 3小時(shí)或(C)6小時(shí)，然后將小鼠用5mg/kg、15mg/kg或45mg/kg LClO治療，并且監(jiān)測(cè)存活持續(xù)?天。10只在細(xì)菌激發(fā)之前24小時(shí)被給予15mg/kg LClO或R347的組被包括為對(duì)照。
[0070]圖26圖形表示了 LClO在小鼠肺炎模型中的治療功效。將10只C57BL/6小鼠的組用2 X IO8個(gè)金黃色葡萄球菌USA300進(jìn)行皮內(nèi)感染。感染后一小時(shí)，以(A) 15mg/kg (B) 45mg/kg給予動(dòng)物L(fēng)C-10的單次腹膜內(nèi)注射。動(dòng)物的同期組群在感染后Ih接受皮下萬(wàn)古霉素(VAN)0以一天兩次間隔12小時(shí)(BID ql2)給予另外的VAN治療，持續(xù)總共6次治療。在感染后Ihdf 10只小鼠的對(duì)照組用15mg/kg R347治療。監(jiān)測(cè)存活持續(xù)7天。
[0071]圖27是協(xié)同作用的等效線圖解法分析的圖形顯示，其中N> 1:拮抗作用，N= I:加性效應(yīng)，N < 1:協(xié)同作用。
[0072]詳細(xì)說(shuō)明
[0073]在此提供了結(jié)合至金黃色葡萄球菌α毒素的包括人、人源化和/或嵌合形式的抗體以及其片段、衍生物/偶聯(lián)物和組合物。此類抗體對(duì)于檢測(cè)和/或可視化α毒素可以是有用的，并且因此在試驗(yàn)和診斷方法中可以是有用的。在此所述的抗體還干擾α毒素七聚體形成，由此抑制活性成孔復(fù)合體的形成，并且因此對(duì)于治療和預(yù)防方法可以是有用的。
[0074]金黃色葡萄球菌是普遍存在的病原體，并且有時(shí)是其嚴(yán)重性范圍為從輕微到致命的多種病癥的致病因子。金黃色葡萄球菌產(chǎn)生大量的胞外蛋白和細(xì)胞相關(guān)蛋白，它們中的許多涉及發(fā)病，例如α毒素、β毒素、Y毒素、δ毒素、殺白細(xì)胞素、中毒性休克綜合征毒素(TSST)、腸毒素類、凝固酶、蛋白Α、纖維蛋白原、纖連蛋白結(jié)合蛋白等等。α毒素(例如由hla基因編碼)是金黃色葡萄球菌的毒力因子之一，并且是由大多數(shù)病原性金黃色葡萄球菌菌株產(chǎn)生的。
[0075]金黃色葡萄球菌感染相對(duì)難以治療，并且在抗生素治療之后可能發(fā)生侵襲性疾病和復(fù)發(fā)。另外，在醫(yī)院環(huán)境(例如HA-MRSA或與醫(yī)療保健相關(guān)的)和非醫(yī)院環(huán)境(例如CA-MRSA或與社區(qū)相關(guān)的)中，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌菌株已經(jīng)變得更普遍，進(jìn)一步使得金黃色葡萄球菌感染的治療復(fù)雜化。在許 多情況下，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌菌株還對(duì)一種或多種其他抗生素有抗性，包括氨基糖苷類、四環(huán)素、氯霉素、大環(huán)內(nèi)酯類以及林可酰胺類抗生素。
[0076]α毒素是一種成孔毒素并且在人類以及動(dòng)物中具有溶解細(xì)胞、溶血、皮膚壞死以及致死活性。葡萄球菌α毒素被分泌為具有293個(gè)氨基酸的水溶性單鏈多肽，為大致34千道爾頓(kDa)。不受到理論的限制，人們認(rèn)為存在著α毒素/靶標(biāo)細(xì)胞相互作用的兩種方法；(i) α毒素結(jié)合至在人血小板、單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、白細(xì)胞、肺泡細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、角質(zhì)化細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、兔紅細(xì)胞、以及其他細(xì)胞的細(xì)胞表面上的特異性的高親和力受體(ADAMlO)(參見(jiàn)例如Wilke (威爾克)等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊)107:13473-13478 (2010))，或者(ii) α毒素通過(guò)吸附至脂雙層非特異性地相互作用。在毒素/細(xì)胞相互作用的任一模式中，七個(gè)α毒素單體分子寡聚化以形成l_2nm直徑的七聚體跨膜通道。隨后鉀和核苷酸的流出以及鈉和鈣的流入導(dǎo)致滲透性溶解和/或多重繼發(fā)作用，包括類二十烷酸產(chǎn)生、分泌過(guò)程、收縮功能障礙、細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞因子的釋放。人們認(rèn)為由α毒素引起的細(xì)胞活性的破壞和細(xì)胞溶解促成了與金黃色葡萄球菌感染相關(guān)的病癥和疾病。
[0077]由金黃色葡萄球菌感染引起的一些常見(jiàn)病癥的非限制性實(shí)例包括燒傷、蜂窩織炎、皮膚壞死、眼瞼感染、食物中毒、關(guān)節(jié)感染、肺炎、皮膚感染、手術(shù)傷口感染、燙傷樣皮膚綜合征以及中毒性休克綜合征。另外，它是在異物感染中常見(jiàn)的病原體，例如血管內(nèi)的線(intravascular line)、起搏器、人工心臟瓣膜以及關(guān)節(jié)植入物。由金黃色葡萄球菌感染引起的一些病癥或疾病進(jìn)一步描述于下文。以下描述的一些或所有的病癥和疾病可以涉及作為感染組分或者病癥或疾病狀態(tài)的介質(zhì)的α毒素的直接作用，或者一些或所有的病癥可以涉及α毒素的間接或繼發(fā)作用(例如，原發(fā)性毒力因子導(dǎo)致與病癥相關(guān)的主要癥狀或大多數(shù)癥狀，而α毒素通過(guò)它對(duì)細(xì)胞功能的破壞和細(xì)胞溶解活性起著進(jìn)一步推進(jìn)疾病的作用)。
[0078]燒傷
[0079]燒傷傷口常常最初是無(wú)菌的。然而，中度和重度燒傷通常損害針對(duì)感染的物理和 免疫屏障(例如，皮膚的發(fā)皰、開(kāi)裂或剝離)，導(dǎo)致流體和電解質(zhì)類的丟失，并且引起局部或全身性生理功能障礙。受損皮膚與活細(xì)菌接觸有時(shí)可以導(dǎo)致在損傷部位的混合定殖。感染可以被限制到燒傷表面上的無(wú)活力的碎片(“焦痂”)，或者定殖可以進(jìn)展為全皮膚感染并且侵襲焦痂下的有活力的組織。更嚴(yán)重的感染可以到達(dá)皮膚下，進(jìn)入淋巴系統(tǒng)和/或血液循環(huán)，并且發(fā)展為敗血癥。典型地，在定殖燒傷傷口感染處的病原體中發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌。金黃色葡萄球菌可以破壞肉芽組織并且產(chǎn)生嚴(yán)重的敗血癥。
[0080]皮膚和軟組織感染
[0081]蜂窩織炎
[0082]蜂窩織炎是皮膚的急性感染，常常開(kāi)始于可以在皮膚層下蔓延的表面感染。蜂窩織炎最常見(jiàn)地是由金黃色葡萄球菌結(jié)合化膿性鏈球菌的混合感染引起。蜂窩織炎可以導(dǎo)致全身感染。蜂窩織炎有時(shí)是協(xié)同性細(xì)菌性壞疽的一個(gè)方面。協(xié)同性細(xì)菌性壞疽典型地是由金黃色葡萄球菌和微需氧鏈球菌的混合物引起的。協(xié)同性細(xì)菌性壞疽引起壞死，并且治療被限制為壞死組織的切除。病癥常常是致命的。
[0083]皮膚壞死
[0084]皮膚壞死是皮膚和皮下組織的感染，容易跨越皮下組織內(nèi)的筋膜面(fascialplane)蔓延。該病癥引起皮膚的頂層和/或底層變得壞死，并且可以蔓延至在下面的組織和周圍組織。
[0085]壞死性筋膜炎
[0086]壞死性筋膜炎被稱為“食肉病”或“食肉細(xì)菌綜合征”。壞死性筋膜炎可以由多種微生物感染引起(例如，I型，由混合細(xì)菌感染引起)或由單微生物感染引起(例如，II型，由細(xì)菌的單個(gè)病原菌株引起)。許多類型的細(xì)菌可以引起壞死性筋膜炎，這些細(xì)菌的非限制性實(shí)例包括A群鏈球菌(例如化膿性鏈球菌)、金黃色葡萄球菌、創(chuàng)傷弧菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、以及脆弱擬桿菌。具有抑制 的或受損的免疫系統(tǒng)的個(gè)體更可能遭受皮膚壞死(例如，壞死性筋膜炎)。
[0087]歷史上，A群鏈球菌被診斷為II型皮膚壞死感染的大多數(shù)病例的原因。然而，自2001年以來(lái)，已經(jīng)觀察到耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)作為單微生物壞死性筋膜炎的原因具有增加的頻率。感染局部地(有時(shí)在創(chuàng)傷部位)開(kāi)始，可以是嚴(yán)重的(例如由于手術(shù))、輕微的、或甚至不明顯的?；颊叱３Ｖ髟V劇烈的疼痛，這種疼痛相對(duì)于特定的皮膚外觀可能是過(guò)度的。隨著疾病的進(jìn)展，組織常常在數(shù)小時(shí)內(nèi)變得腫脹。腹瀉和嘔吐也是常見(jiàn)癥狀。
[0088]如果細(xì)菌在組織深處，炎癥的體征在感染早期可能不明顯。如果細(xì)菌不在深處，炎癥的體征例如發(fā)紅和腫脹的或皮膚灼熱非常快速地顯示出來(lái)。皮膚顏色可以進(jìn)展為紫色，并且可以形成水皰，伴隨皮下組織的隨后的壞死(例如，死亡)。具有壞死性筋膜炎的患者典型地會(huì)發(fā)熱并且看起來(lái)病得很重。如果不治療，已經(jīng)記錄了高達(dá)73%的死亡率。在沒(méi)有適合的醫(yī)療救助的情況下，感染進(jìn)展快速并且最終導(dǎo)致死亡。
[0089]肺炎
[0090]金黃色葡萄球菌還已經(jīng)被診斷為葡萄球菌肺炎的原因。葡萄球菌肺炎導(dǎo)致肺部的炎癥和腫脹，進(jìn)而引起液體聚集在肺中。聚集在肺中的液體可以阻止氧氣進(jìn)入血流?；加辛餍行愿忻暗哪切┤司哂邪l(fā)生細(xì)菌性肺炎的風(fēng)險(xiǎn)。在已經(jīng)遭受流行性感冒的那些人中，金黃色葡萄球菌是細(xì)菌性肺炎的最常見(jiàn)的原因。葡萄球菌肺炎的常見(jiàn)癥狀包括咳嗽、呼吸困難以及發(fā)熱。另外的癥狀包括疲勞、黃色或帶血粘液、以及隨著呼吸惡化的胸痛。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)逐漸被診斷為在葡萄球菌肺炎中鑒定的菌株。
[0091]手術(shù)傷口感染
[0092]手術(shù)傷口常常深深地穿入身體。因此如果傷口變得被感染，此類傷口的感染對(duì)患者造成重大風(fēng)險(xiǎn)。金黃色葡萄球菌時(shí)往往是手術(shù)傷口中的感染的致病因子。金黃色葡萄球菌非常善于侵入手術(shù)傷口，縫合傷口可以被引起正常皮膚感染少得多的金黃色葡萄球菌細(xì)胞感染。侵入手術(shù)傷口可以導(dǎo)致嚴(yán)重的金黃色葡萄球菌敗血癥。由金黃色葡萄球菌侵入血流的侵襲可以導(dǎo)致內(nèi)部器官(特別是心臟瓣膜和骨)的種植(seeding)和感染，引起全身性疾病，例如心內(nèi)膜炎和骨髓炎。
[0093]燙傷樣皮膚綜合征
[0094]如果不是致病因子的話，金黃色葡萄球菌可能是“燙傷樣皮膚綜合征”(還被稱為“葡萄球菌性燙傷樣皮膚綜合征”)、“中毒性皮膚壞死”、“局限性大皰性膿皰病”、“里特病(Ritter’s disease)”以及“萊爾病(Lyell’s disease)”的主要致病因子。燙傷樣皮膚綜合征頻繁發(fā)生于大齡兒童中，典型地發(fā)生于由產(chǎn)生表皮松解外毒素(例如，表皮剝脫毒素A和B，有時(shí)被稱為燙傷樣皮膚綜合征毒素)的金黃色葡萄球菌菌株的繁盛(flowering)所導(dǎo)致的爆發(fā)中，這些表皮松解外毒素導(dǎo)致表皮層內(nèi)的分離。外毒素之一是由細(xì)菌染色體編碼的，并且另一種是由質(zhì)粒編碼的。外毒素是切割橋粒芯糖蛋白-1的蛋白酶，橋粒芯糖蛋白-1通常將皮膚的顆粒層和棘層(spinosum layer)保持在一起。
[0095]細(xì)菌可以最初僅感染一個(gè)較小的病灶，然而，毒素破壞細(xì)胞間連接，蔓延表皮層，并且允許感染滲透皮膚外層，產(chǎn) 生象征疾病的脫屑。皮膚外層的脫落通常暴露下面的正常皮膚，但是如果不進(jìn)行適當(dāng)治療，在過(guò)程中的液體丟失可以在幼兒中產(chǎn)生嚴(yán)重的損傷。
[0096]中毒性休克綜合征
[0097]中毒性休克綜合征(TSS)是由產(chǎn)生所謂的“中毒性休克綜合征毒素”的金黃色葡萄球菌菌株弓I起的。該疾病可以由金黃色葡萄球菌在任何部位的感染引起，但是常常錯(cuò)誤地被認(rèn)為僅僅是使用衛(wèi)生棉的女性專有的疾病。該疾病涉及毒血癥和敗血癥，并且可以是致命的。
[0098]中毒性休克綜合征的癥狀取決于基本病因而不同。由于細(xì)菌金黃色葡萄球菌的感染引起的TSS典型地另外表現(xiàn)在其他方面健康的具有高熱的個(gè)體中，伴有低血壓、不適以及意識(shí)錯(cuò)亂，可以快速進(jìn)展至昏呆(Stupor)、昏迷、以及多器官衰竭。常常在疾病的早期病程中見(jiàn)到的特征性皮疹類似于曬斑，并且可以累及身體的任何區(qū)域，包括嘴唇、嘴、眼睛、手掌以及腳底。在最初的感染猛攻(onslaught)中存活的患者中，在10-14天之后皮疹脫屑、或剝落。
[0099]如上所指出的，由于金黃色葡萄球菌的耐多藥菌株的增加，越來(lái)越多數(shù)目的常用于治療金黃色葡萄球菌感染的抗生素不再控制或消除耐甲氧西林以及耐多藥的金黃色葡萄球菌的感染。針對(duì)在此所述的金黃色葡萄球菌α毒素的抗體可以幫助降低感染的嚴(yán)重性，并且還可以輔助從感染宿主清除、防止(預(yù)防性地)或減少病原性金黃色葡萄球菌。
[0100]抗體
[0101]如在此使用的，術(shù)語(yǔ)“一種抗體”、“多種抗體”(還被稱為“免疫球蛋白”)以及“抗原結(jié)合片段”包括單克隆抗體(包括全長(zhǎng)單克隆抗體)、多克隆抗體、從至少兩種不同的表位結(jié)合片段形成的多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)、人抗體、人源化抗體、駱駝科(camelid)抗體、嵌合抗體、單鏈Fv(scFv)、單鏈抗體、單域抗體、域抗體、Fab片段、F(ab’ )2片段、展現(xiàn)所希望的生物活性的抗體片段(例如抗原結(jié)合部分)、二硫鍵連接的Fv (dsFv)、以及抗獨(dú)特型(ant1-1d)抗體(包括例如針對(duì)在此提供的抗體的抗Id抗體)、細(xì)胞內(nèi)抗體、以及任何上述各項(xiàng)的表位結(jié)合片段。具體而言，抗體包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即，含有至少一個(gè)抗原結(jié)合部位的分子。免疫球蛋白分子可以具有任何同種型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA 和 IgY)、亞同種型(例如 IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl 和 IgA2)或同種異型(例如，Gm,如 Glm(f、z、a 或 x)、G2m(n)、G3m(g、b、或 c)，Am, Em,以及 Km(l、2 或3))?？贵w可以衍生自任何哺乳動(dòng)物，包括但不限于人、猴子、豬、馬、兔、狗、貓、小鼠、等等，或者其他動(dòng)物，例如禽類(例如，雞)。
[0102]天然抗體通常是約150，000道爾頓的異四聚體糖蛋白，由兩個(gè)相同的輕(L)鏈和兩個(gè)相同的重(H)鏈組成。每條輕鏈通過(guò)一個(gè)共價(jià)二硫鍵與一條重鏈相連，而二硫鍵的數(shù)目在不同免疫球蛋白同種型的重鏈之間變化。每條重鏈和輕鏈還具有規(guī)律性間隔的鏈間二硫橋。每條重鏈在一端具有一個(gè)可變域(VH)，之后跟隨多個(gè)恒定域(CH)。每條輕鏈在一端具有一個(gè)可變域(VL)并且在另一端具有一個(gè)恒定域(CL)。輕鏈的恒定域與重鏈的第一恒定域?qū)R，并且輕鏈的可變域與重鏈的可變域?qū)R?；谳p鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，輕鏈被分類為λ鏈或K鏈。κ輕鏈的可變域在此還可以表示為VK。
[0103]在此提供的抗體包括全長(zhǎng)或完整抗體、抗體片段、天然序列抗體或氨基酸變體，人的、人源化的、翻譯后修飾的、嵌合的或融合的抗體、免疫偶聯(lián)物、以及其功能性片段?？贵w可以在Fe區(qū)中被修飾，并且某些修飾可以提供所希望的效應(yīng)子功能或血清半衰期。
[0104]具有本發(fā)明的抗α毒素抗體以及片段的一種或多種生物特征(例如效力，α毒素親和力、效應(yīng)子功能、直系同源物結(jié)合親和力、中和、α毒素七聚體形成的抑制、等等)的抗體也是期望的?？功炼舅乜贵w和 片段可以用于診斷和/或治療和/或減輕和/或預(yù)防如上所述的在哺乳動(dòng)物中的與金黃色葡萄球菌相關(guān)的疾病的一種或多種癥狀。
[0105]在此提供了一種含有抗α毒素抗體或片段以及載體的組合物。出于治療金黃色葡萄球菌相關(guān)疾病的目的，可以將組合物給予對(duì)這種治療有需要的患者，其中組合物可以包含一種或多種抗α毒素抗體和/或其片段。還提供了含有如在此呈現(xiàn)的抗α毒素抗體或其片段以及載體的制劑。在一些實(shí)施例中，該制劑是含有藥學(xué)上可接受載體的預(yù)防性的或治療性的制劑。
[0106]在某些實(shí)施例中，這里提供的方法用于治療在哺乳動(dòng)物中的與金黃色葡萄球菌相關(guān)的和/或α毒素相關(guān)的疾病/病癥和/或預(yù)防和/或減輕該疾病或病癥的一種或多種癥狀，該方法包括將治療有效量的抗α毒素抗體或片段給予至哺乳動(dòng)物?？梢匀玑t(yī)師所指導(dǎo)進(jìn)行短期(急性)或慢性的、或間歇性地給予抗體預(yù)防性或治療性組合物。
[0107]在某些實(shí)施例中，制造的物品(例如在無(wú)菌劑型和/或在試劑盒中)包含至少一種抗α毒素抗體或片段。含有抗α毒素抗體或片段的試劑盒可以發(fā)現(xiàn)例如用于金黃色葡萄球菌細(xì)胞殺傷測(cè)定、用于從細(xì)胞純化或免疫沉淀α毒素的用途。例如,為了分離和純化α毒素，試劑盒可以含有連接至珠粒的抗α毒素抗體或片段(例如，瓊脂糖凝膠珠)。試劑盒可以含有用于在ELISA或Western印跡中體外檢測(cè)和定量金黃色葡萄球菌和/或α毒素的抗體。對(duì)于檢測(cè)有用的這樣一種抗體可以提供有一種標(biāo)記物，例如熒光或放射性標(biāo)記。[0108]術(shù)語(yǔ)
[0109]應(yīng)當(dāng)理解的是，在此提供的方法不限于特定的組合物或工藝步驟，因?yàn)檫@些可以變化。應(yīng)當(dāng)指出，如在本說(shuō)明書和所附權(quán)利要求書中所使用的，單數(shù)形式“一種/個(gè)”(“a”，“an”)和“該”包括單數(shù)和復(fù)數(shù)指示物，除非在上下文中另有明確規(guī)定。
[0110]特異性結(jié)合α毒素多肽(例如，α毒素單體)的分離抗體、或其抗原結(jié)合片段在此是指單數(shù)形式的“抗α毒素抗體或片段”以及復(fù)數(shù)形式的“抗α毒素抗體或片段”。α毒素多肽有時(shí)稱為α溶血素。α毒素在寡聚化為七聚體之后在細(xì)胞膜中形成孔,其中寡聚化的多肽有時(shí)統(tǒng)稱為“α毒素孔”或“α毒素七聚體”。
[0111]常常在此通過(guò)公知的三字母符號(hào)或通過(guò)IUPAC-1UB生物化學(xué)命名委員會(huì)推薦的單字母符號(hào)提及氨基酸。同樣，常常通過(guò)普遍接受的單字母密碼提及核苷酸。
[0112]除非另外指明，在抗體的可變域、互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R)以及框架區(qū)(FR)中的氨基酸的編號(hào)遵循如在 Kabat (卡巴特)等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest (具有免疫學(xué)重要性的蛋白質(zhì)的序列)，Public Health Service, 5th Ed.(公共衛(wèi)生署第五次編寫)，National Institutes of Health (國(guó)立衛(wèi)生研究院)，Bethesda (貝塞斯達(dá))，Maryland (馬里蘭州)(1991)中提出的Kabat定義。使用這個(gè)編號(hào)系統(tǒng),相應(yīng)于可變域的FR或CDR的縮短、或插入，實(shí)際的線性氨基酸序列可以含有較少的或另外的氨基酸。例如，重鏈可變域可以包含在H2的殘基52之后的單個(gè)氨基酸插入(根據(jù)Kabat的殘基52a)以及在重鏈FR殘基82之后的插入殘基(例如，根據(jù)Kabat的殘基82a、82b、和82c，等等)。可以通過(guò)在抗體序列與“標(biāo)準(zhǔn)”Kabat編號(hào)序列的同源區(qū)的比對(duì)而對(duì)給定的抗體確定殘基的Kabat編號(hào)。框架殘基的最大比對(duì)常常需要在編號(hào)系統(tǒng)中的有待用于Fv區(qū)的“間隔”殘基插入。另外，由于種間或等位基因差異，在任何給定的Kabat位點(diǎn)編號(hào)處的某些個(gè)別殘基的身份可以從抗體鏈 到抗體鏈而不同。
[0113]抗α毒素抗體以及片段
[0114]在某些實(shí)施例中，抗α毒素抗體或片段是被分離和/或純化和/或無(wú)熱原的。在此使用的術(shù)語(yǔ)“純化”是指已經(jīng)從其天然環(huán)境的組分中鑒定和分離和/或回收的感興趣分子。因此，在一些實(shí)施例中，提供的抗體是一種純化的抗體，其中它已經(jīng)從其天然環(huán)境的一種或多種組分分離。如在此使用的術(shù)語(yǔ)“分離抗體”是指基本上沒(méi)有具有不同抗原特異性的其他抗體分子的抗體(例如，特異性結(jié)合至α毒素的分離抗體是基本上沒(méi)有特異性結(jié)合不同于α毒素的抗原的抗體)。雙或多特異性抗體分子是在基本上沒(méi)有其他抗體分子時(shí)的分離抗體。因此，在一些實(shí)施例中，提供的抗體是分離抗體，其中它們已經(jīng)從具有不同特異性的抗體分離。分離抗體可以是單克隆抗體。然而，特異性結(jié)合至金黃色葡萄球菌α毒素的同種型或變體的表位的分離抗體可以具有與例如來(lái)自其他物種(例如葡萄球菌種類同系物)的其他相關(guān)抗原的交叉反應(yīng)性。如提供的分離抗體可以基本上沒(méi)有一種或多種其他細(xì)胞材料。在一些實(shí)施例中，“分離的”單克隆抗體的組合被提供，并且涉及具有不同特異性并被組合在定義的組合物中的抗體。在此將更詳細(xì)地描述抗α毒素抗體或片段的產(chǎn)生和純化/分離的方法。
[0115]呈現(xiàn)的分離抗體包括在此披露的抗體氨基酸序列，這些抗體氨基酸序列可以由任何適合的多核苷酸編碼。分離抗體有時(shí)是以配制的形式提供的。在一些實(shí)施例中，抗α毒素抗體或片段結(jié)合金黃色葡萄球菌α毒素并且由此部分或基本上改變?chǔ)炼舅氐闹辽僖环N生物活性，例如寡聚化為活性七聚體復(fù)合體。
[0116]抗α毒素抗體或片段常常免疫特異性地結(jié)合至對(duì)α毒素蛋白、肽、亞基、片段、部分、寡聚體或其任何組合為特異的一種或多種表位，并且通常不特異性地結(jié)合至其他多肽。術(shù)語(yǔ)“寡聚體”或“α毒素寡聚體”是指形成功能性孔(例如7個(gè)α毒素單體)的α毒素單體(例如,2個(gè)單體、3個(gè)單體、4個(gè)單體、5個(gè)單體、6個(gè)單體或7個(gè)單體)的結(jié)合。表位可以包括含有α毒素蛋白的至少一部分的至少一個(gè)抗體結(jié)合區(qū)。如在此使用的術(shù)語(yǔ)“表位”是指能夠結(jié)合至抗體的蛋白質(zhì)決定簇。表位通常包括諸如氨基酸和/或糖側(cè)鏈的分子的化學(xué)活性表面基團(tuán)，并且通常具有特定的三維結(jié)構(gòu)特征、以及特定的化學(xué)特征(例如電荷、極性、堿性、酸性、疏水性等等)。構(gòu)象和非構(gòu)象表位的區(qū)別在于:在變性溶劑的存在下，與前者(而不是后者)的結(jié)合消失。在一些實(shí)施例中，識(shí)別的表位干擾活性七聚體的形成(例如，抑制α毒素單體寡聚化為活性七聚體復(fù)合體)。
[0117]在某些實(shí)施例中，表位是由涉及α毒素七聚體復(fù)合體形成的α毒素蛋白的至少一部分組成的。指定的表位可以包括α毒素蛋白的連續(xù)氨基酸的至少3個(gè)氨基酸殘基乃至整個(gè)指定部分中的至少一個(gè)氨基酸序列的任何組合。在一些實(shí)施例中，表位是α毒素蛋白的連續(xù)氨基酸中的至少4個(gè)氨基酸殘基、至少5個(gè)氨基酸殘基、至少6個(gè)氨基酸殘基、至少7個(gè)氨基酸殘基、至少8個(gè)氨基酸殘基、至少9個(gè)氨基酸殘基、至少10個(gè)氨基酸殘基、至少11個(gè)氨基酸殘基、至少12個(gè)氨基酸殘基、至少13個(gè)氨基酸殘基、至少14個(gè)氨基酸殘基、或至少15個(gè)氨基酸殘基乃至整個(gè)指定部分。在某些其他實(shí)施例中，表位包含1、2、3、4、5、6、
7、8、9、10、11、12、13、14或15個(gè)連續(xù)或非連續(xù)氨基酸殘基。在另外的實(shí)施例中，包含在表位之內(nèi)的氨基酸殘基涉及α毒素七聚體復(fù)合體形成。在某些實(shí)施例中，接觸殘基包括Τ261、Τ263、Ν264、Κ266和Κ271。在其他實(shí)施例中，接觸殘基包括SEQ ID NO:39的Ν177、W179、G180、P181、Y182、D183 、D185、S186、W187、N188、P189、V190、Y191 和 R200。在另外的實(shí)施例中，接觸殘基包括 SEQ ID NO: 39 的 N177、W179、G180、P181、Y182、D183、D185、S186、W187、N188、P189、V190、Y191、R200、T261、T263、N264、K266 和 K271。在某些實(shí)施例中，與抗體或其抗原結(jié)合片段接觸的α毒素部分包括SEQ ID NO:39的氨基酸261-272。在其他實(shí)施例中，與抗體或其抗原結(jié)合片段接觸的α毒素部分包括SEQ ID NO: 39的氨基酸248-277。在其他實(shí)施例中，與抗體或其抗原結(jié)合片段接觸的α毒素部分包括SEQ ID Ν0:39的氨基酸173-201 以及 261-272。
[0118]因此，在具體實(shí)施例中，分離/純化的抗α毒素抗體和片段免疫特異性地結(jié)合至包含根據(jù)SEQ ID NO:39的氨基酸序列的分子和/或包含根據(jù)SEQ ID Ν0:40的氨基酸序列的分子。在某些實(shí)施例中，抗α毒素抗體和片段還結(jié)合來(lái)自不同物種的α毒素同系物或直系同源物，或者結(jié)合至SEQ ID NO: 39的氨基酸序列的變體，其中在位置35處的組氨酸被亮氨酸替換或被相應(yīng)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的Η35突變的其他氨基酸替換。
[0119]可變區(qū)
[0120]在某些實(shí)施例中，抗α毒素抗體或片段是從親本抗體制備的。在一些實(shí)施例中，抗α毒素抗體或片段包含在親本抗體中。如在此使用的，術(shù)語(yǔ)“親本抗體”是指由用于制備在此定義的變體或衍生物的氨基酸序列編碼的抗體。親本多肽可以包含天然抗體序列(即，天然存在的，包括天然存在的等位基因變體)或天然存在序列的具有事先存在的氨基酸序列修飾(例如其他插入、缺失和/或置換)的抗體序列。親本抗體可以是人源化抗體或人抗體。在具體實(shí)施例中，抗α毒素抗體和片段是親本抗體的變體。如在此使用的，術(shù)語(yǔ)“變體”是指借助在親本抗體序列中添加、缺失和/或置換一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基而在氨基酸序列上不同于“親本”抗α毒素抗體或片段氨基酸序列的抗α毒素抗體或片段。
[0121]抗體的抗原結(jié)合部分包含保留特異性結(jié)合至抗原(例如α毒素)能力的抗體一個(gè)或多個(gè)片段。已經(jīng)顯示抗體的抗原結(jié)合功能可以由全長(zhǎng)抗體的片段完成。包含在術(shù)語(yǔ)抗體“抗原結(jié)合部分”之內(nèi)的結(jié)合片段的實(shí)例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CHl結(jié)構(gòu)域組成的單價(jià)片段；(ii)F(ab’)2片段，包含在鉸鏈區(qū)由二硫橋連接的兩個(gè)Fab片段的二價(jià)片段；
(iii)Fd片段，由VH和CHl結(jié)構(gòu)域組成；(iv)Fv片段，由抗體的單臂的Fv片段VL和VH結(jié)構(gòu)域組成，(V) dAb片段，由VH結(jié)構(gòu)域組成；以及(vi)分離的互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R)。雖然Fv片段的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域VL和VH常常由分離的基因編碼，可以使用重組方法通過(guò)使它們能夠被制造為單一蛋白質(zhì)鏈的合成接頭而將它們結(jié)合，該單一蛋白質(zhì)鏈中的VL和VH區(qū)配對(duì)以形成單價(jià)分子(稱為單鏈Fv (scFv))。此類單鏈抗體還被包含在術(shù)語(yǔ)“抗體”和抗體的“抗原結(jié)合部分”之內(nèi)?？梢允褂靡阎募夹g(shù)獲得這些抗體片段，并且這些片段能以與完整抗體相同的方式篩選其結(jié)合活性?？梢酝ㄟ^(guò)重組DNA技術(shù)或通過(guò)完整免疫球蛋白的酶裂解或化學(xué)裂解而產(chǎn)生抗原結(jié)合部分。
[0122]本發(fā)明的抗α毒素抗體和片段包含至少一個(gè)抗原結(jié)合域。在一些實(shí)施例中，抗α毒素抗體或片段包括含有 SEQ ID Ν0:20、22、24、26、28、41、43、45、47、49、51、53、55、57、79、59、61、或62的氨基酸序列的VH。在某些實(shí)施例中，抗α毒素抗體或片段包括含有SEQ IDNO: 19、21、23、25、27、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60 或 63 的氨基酸序列的 VL0 在又另一個(gè)實(shí)施例中，抗α毒素抗體或片段包括含有SEQ ID Ν0:20、22、24、26、28、41、43、45、47、
49、51、53、55、57、79、59、61、或 62 的氨基酸序列的 VH 以及含有 SEQ ID NO: 19、21、23、25、27、42、44、46、48、50、5 2、54、56、58、60或63的氨基酸序列的VL0參見(jiàn)實(shí)例11，表7表示如在此呈現(xiàn)的VH和VL序列，這些VH和VL序列能以形成抗α毒素抗體或片段的任何組合存在，或者以形成本發(fā)明的mAb的一種組合存在。在一些實(shí)施例中，VH選自SEQ ID NO: 20,
22、24、26、28、41、43、45、47、49、51、53、55、57、79、59、61、或62。在不同的實(shí)施例中，VL 選自EQ ID N0:19、21、23、25、27、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60 或 63。某些 VH 和 VL 核苷酸序列呈現(xiàn)于實(shí)例11、表8中。
[0123]在一些實(shí)施例中，分離抗體或其抗原結(jié)合片段包含VH和VL，其中該VH和VL具有由 SEQ ID NO: 20 和 19 ；SEQ ID NO: 22 和 21 ；SEQ ID NO: 24 和 23 ；SEQ ID NO: 26 和 25 ；SEQ ID N0:28和27;SEQ ID N0:4UP42;SEQ ID N0:43和44;SEQ ID N0:45和46;SEQ IDN0:47和48;SEQ ID N0:47和48;SEQ ID N0:49 和 50;SEQ ID N0:51 和 52;SEQ ID NO: 51和 52;SEQ ID N0:53和54;SEQ ID N0:55和56;SEQ ID N0:57和58;SEQ ID NO: 59 和 60;SEQ ID N0:61 和 58;SEQ ID N0:62和58;SEQ ID N0:62和63;SEQ ID NO: 79 和 63 表示的氨基酸序列。
[0124]實(shí)例11的表1-7提供了用于在此呈現(xiàn)的抗體和片段的某些實(shí)施例的重鏈可變區(qū)(VH)、輕鏈可變區(qū)(VL)、以及互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R)。在某些實(shí)施例中，抗α毒素抗體和片段包括具有與披露于表7中的VH和/或VL序列的至少一者的給定百分比一致性的VH和/或VL0如在此使用的，術(shù)語(yǔ)“序列一致性百分比(％)”(也包括“同源性”)被定義為在比對(duì)序列和(如果需要的話)引入空位(以便獲得最大的百分比序列一致性)并且不將任何保守性置換考慮為序列一致性的部分之后，在候選序列中的氨基酸殘基或核苷酸與在參考序列(例如親本抗體序列)中的氨基酸殘基或核苷酸一致的百分比。除了手動(dòng)外，可以借助于本領(lǐng)域已知的局部同源性算法或借助于使用這些算法的計(jì)算機(jī)程序(威斯康星州，麥迪遜市，科學(xué)驅(qū)動(dòng)路 575 號(hào)(575Science Drive),遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)集團(tuán)(Genetics Computer Group)的威斯康星遺傳學(xué)軟件包(Wisconsin Genetics SoftwarePackage)中的 GAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P, BLAST N以及TFASTA)而產(chǎn)生用于比較的序列的最優(yōu)比對(duì)。
[0125]在一些實(shí)施例中，抗α毒素抗體或片段包含這樣一種VH氨基酸序列，該VH氨基酸序列包含與 SEQ ID Ν0:20、22、24、26、28、41、43、45、47、49、51、53、55、57、79、59、61、或62的氨基酸序列至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%的一致性，或包含與其100%的一致性。在一些實(shí)施例中，抗α毒素抗體或片段包含這樣一種VH氨基酸序列，該VH氨基酸序列與SEQ ID Ν0:20、22、24、26、28、41、43、45、47、49、51、53、55、57、79、59、61、或 62 的氨基酸序列至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% —致，或 100% —致。在某些實(shí)施例中，抗 α 毒素抗體或片段包含 SEQ ID Ν0:20、22、24、26、28、41、43、45、47、49、51、53、55、57、79、59、61、或62的氨基酸序列中的1-10個(gè)保守性置換。在某些實(shí)施例中，包含具有與SEQ IDΝ0:20、22、24、26、28、41、43、45、47、49、51、53、55、57、79、59、61、或 62 的給定百分比一致性的VH氨基酸序列的抗α毒素抗體或片段具有一種或多種選自下組的特征(以下更詳細(xì)描述)，該組由以下各項(xiàng)組成:
[0126](a)對(duì)于α毒素大約13ηΜ或更小的親和常數(shù)(Kd)；
[0127](b)結(jié)合至α毒素單體,但不抑制α毒素結(jié)合至α毒素受體；
[0128](c)以至少50%、60%、70%、80%、90%或95%抑制α毒素寡聚體的形成；
[0129](d)以至少50%、60%、70%、80%、90%或95%降低α毒素的細(xì)胞溶解活性(例如，如通過(guò)細(xì)胞溶解和溶血試驗(yàn)所確定) ;
[0130](e)減少細(xì)胞浸潤(rùn)和促炎細(xì)胞因子釋放(例如，在一種動(dòng)物肺炎模型中)。
[0131]在一些實(shí)施例中，分離抗體或其抗原結(jié)合片段以由解離常數(shù)(Kd)表征的親和力而結(jié)合抗原(例如α毒素)，該解離常數(shù)在大約0.0lnM至大約50ηΜ、0.05ηΜ、0.1ηΜ、0.5ηΜ、1ηΝ、5ηΜ、10ηΜ、20ηΜ、30ηΜ、或 40ηΜ 的范圍內(nèi)。
[0132]在某些實(shí)施例中，抗α毒素抗體或片段包含這樣一種VL氨基酸序列，該VL氨基酸序列與 SEQ ID NO: 19、21、23、25、27、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60 或 63 的氨基酸序列至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%—致，或100%—致。在一些實(shí)施例中，抗α毒素抗體或片段包含這樣一種VL氨基酸序列，該VL氨基酸序列與SEQ ID NO: 19、21、23、25、
27、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60 或 63 的氨基酸序列至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%—致，或100%—致。在不同的實(shí)施例中，抗α毒素抗體或片段包含在SEQID Ν0:19、21、23、25、27、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60 或63 的氨基酸序列中的 1-10個(gè)保守性置換。在某些實(shí)施例中，包含具有與SEQ ID Ν0:19、21、23、25、27、42、44、46、48、50、
52、54、56、58、60或63的給定百分比一致性的VL氨基酸序列的抗α毒素抗體或片段具有一種或多種選自下組的特征(以下更詳細(xì)描述)，該組由以下各項(xiàng)組成:
[0133](a)對(duì)于α毒素大約13ηΜ或更小的親和常數(shù)(Kd)；
[0134](b)結(jié)合至α毒素單體,但不抑制α毒素結(jié)合至α毒素受體；
[0135](c)以至少50%、60%、70%、80%、90%或95%抑制α毒素寡聚體的形成；[0136](d)以至少50%、60%、70%、80%、90%或95%降低α毒素的細(xì)胞溶解活性(例如，如通過(guò)細(xì)胞溶解和溶血試驗(yàn)所確定);
[0137](e)減少細(xì)胞浸潤(rùn)和促炎細(xì)胞因子釋放(例如，在一種動(dòng)物肺炎模型中)。
[0138]在一些實(shí)施例中，分離抗體或其抗原結(jié)合片段以由解離常數(shù)(Kd)表征的親和力而結(jié)合抗原(例如α毒素)，該解離常數(shù)在大約0.0lnM至大約50ηΜ、0.05ηΜ、0.1ηΜ、0.5ηΜ、1ηΝ、5ηΜ、10ηΜ、20ηΜ、30ηΜ、或 40ηΜ 的范圍內(nèi)。
[0139]在具體實(shí)施例中，抗體或抗體片段免疫特異性地結(jié)合至α毒素，并且包含重鏈可變域，該重鏈可變域包括與 SEQ ID Ν0:20、22、24、26、28、41、43、45、47、49、51、53、55、57、
79、59、61、或62的氨基酸序列至少90%的一致性，并且包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域具有與 SEQ ID NO: 19、21、23、25、27、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60 或 63 的氨基酸序列至少90%的一致性，其中抗體具有抑制一種或多種α毒素毒素單體彼此結(jié)合的活性(例如，抑制寡聚化)。
[0140]互補(bǔ)決定區(qū)
[0141]當(dāng)可變域(VH和VL)包含抗原結(jié)合區(qū)時(shí)，變異性不是通過(guò)抗體的可變域均勻分布的。它被集中在輕鏈(VL或VK)和重鏈(VH)可變域兩者中的稱為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的區(qū)段中?？勺冇虻母弑Ｊ匦缘牟糠址Q為框架區(qū)(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變域各自包含由三個(gè)⑶R連接的四個(gè)FR，這四個(gè)FR大體上采用β片層構(gòu)型，這三個(gè)⑶R形成連接β片層結(jié)構(gòu)的環(huán)并且在一些情況下形成β片層結(jié)構(gòu)的部分。在每個(gè)鏈中的⑶R由FR緊密靠近地保持在一起，與來(lái)自另一條鏈的CDR促成了抗體的抗原結(jié)合部位的形成(參見(jiàn)Kabat (卡巴特)等人，上文)。重鏈的三個(gè)⑶R被 指定為VH-⑶Rl、VH⑶R2、和VH-⑶R-3，而輕鏈的三個(gè)⑶R被指定為VL-⑶Rl、VL-⑶R2、和Vl-⑶R3。在此使用Kabat編號(hào)系統(tǒng)。像這樣，VH-⑶Rl大致開(kāi)始于氨基酸31 (即，在第一個(gè)半胱氨酸殘基之后大致9個(gè)殘基處)，包括大致5-7個(gè)氨基酸，并且結(jié)束于下一個(gè)絲氨酸殘基。VH-⑶R2開(kāi)始于在⑶R-Hl末端之后的第十五個(gè)殘基，包括大致16-19個(gè)氨基酸，并且結(jié)束于下一個(gè)甘氨酸殘基。VH-⑶R3開(kāi)始于在VH-⑶R2末端之后的大致第三十個(gè)氨基酸殘基處；包括大致13-15個(gè)氨基酸；并且結(jié)束于序列M-D-V。VL-⑶Rl大致在殘基24處開(kāi)始(即，在半胱氨酸殘基之后);包括大致10-15個(gè)殘基；并且結(jié)束于序列Y-V-S。VL-⑶R2開(kāi)始于在VL-⑶Rl末端之后大致第十六個(gè)殘基處，并且包括大致7個(gè)殘基。VL-⑶R3開(kāi)始于在VH-⑶R2末端之后的大致第三十三個(gè)殘基處；包括大致7_11個(gè)殘基并且結(jié)束于序列T-1-L。注意CDR從抗體到抗體相當(dāng)不同(并且通過(guò)限定將不展現(xiàn)與Kabat共有序列的同源性)。
[0142]本發(fā)明的抗α毒素抗體和片段包含至少一個(gè)抗原結(jié)合域，該抗原結(jié)合域包含至少一個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R1XDR2或⑶R3)。在一些實(shí)施例中，抗α毒素抗體或片段包括含有至少一個(gè)VH⑶R (例如，⑶R-H1、⑶R-H2或⑶R-H3)的VH。在某些實(shí)施例中，抗α毒素抗體或片段包括含有至少一個(gè)VL⑶R (例如，⑶R-L1、⑶R-L2或⑶R-L3)的VL。
[0143]在一些實(shí)施例中，免疫特異性地結(jié)合至金黃色葡萄球菌α毒素多肽的分離抗體或其抗原結(jié)合片段包含:(a) VH CDR1，該VH CDRl包含與SEQ ID NO: 7、10、13或69—致的氨基酸序列或相對(duì)于它們包含1、2、或3個(gè)氨基酸殘基置換；(b) VH⑶R2，該VH⑶R2包含與SEQ ID N0:8、ll、14、17、70或75 —致的氨基酸序列或相對(duì)于它們包含1、2、或3個(gè)氨基酸殘基置換；以及(c)VH CDR3，該 VH CDR3 包含與 SEQ ID N0:9、12、15、18、16、65、66、67、71、72,76或78 —致的氨基酸序列或相對(duì)于它們包含1、2、或3個(gè)氨基酸殘基置換。
[0144]在具體實(shí)施例中，分離抗體或其抗原結(jié)合片段包含VH⑶R1、VH⑶R2和VH⑶R3，該VH CDRUVH CDR2和 VH CDR3在各自的CDR中包含與 SEQ ID N0:7、8和9;SEQ ID NO: 10,
11和 12;SEQ ID N0:13U4 P15 ；SEQ ID NO:7、17和 18 ;SEQ ID N0:7、8和 16 ;SEQ ID NO:7,8 和 65;SEQ ID NO:7、8 和 66 ;SEQ ID N07、8 和 67 ;SEQ ID NO:7、8 和 78 ;SEQ ID NO:69、70 和 71;SEQ ID NO: 7、8 和 72 ;SEQ ID NO: 69、75 和 71 ;SEQ ID NO: 69、75 和 76 ;或 SEQ IDNO:69、70和71 —致的氨基酸序列或相對(duì)于它們包含1、2、或3個(gè)氨基酸殘基置換。
[0145]在一些實(shí)施例中，免疫特異性地結(jié)合至金黃色葡萄球菌α毒素多肽的分離抗體或其抗原結(jié)合片段包含:(a) VL⑶R1，該VL⑶Rl包含與SEQ ID NO:1或4 一致的氨基酸序列或相對(duì)于它們包含1、2、或3個(gè)氨基酸殘基置換；(b) VIXDR2，該VL⑶R2包含與SEQ IDN0:2、5、73或77 —致的氨基酸序列或相對(duì)于它們包含1、2、或3個(gè)氨基酸殘基置換；以及
(c)VL CDR3，該VL CDR3包含與SEQ ID NO: 3、6、64、68或74 —致的氨基酸序列或相對(duì)于它們包含1、2、或3個(gè)氨基酸殘基置換。
[0146]在具體實(shí)施例中，分離抗體或其抗原結(jié)合片段包含VL⑶R1、VL⑶R2和VL⑶R3，該 VL CDRUVL CDR2 和 VL CDR3 在各自的 CDR 中包含與 SEQ ID N0:l、2 和 3;SEQ ID NO: 4,5和 6;SEQ ID N0:1、2和64;SEQ ID NO: 1、2和 68 ;SEQ ID NO: 1、73和 74 ;或SEQ ID NO: 1、77和74 —致的氨基酸序列或相對(duì)于它們包含1、2、或3個(gè)氨基酸殘基置換。
[0147]在一些實(shí)施例中，免疫特異性地結(jié)合至金黃色葡萄球菌α毒素多肽的分離抗體或其抗原結(jié)合片段包含VH CDR1、VH` CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3，在各自的CDR中包含與以下各項(xiàng)一致的氨基酸序列或相對(duì)于它們包含1、2、或3個(gè)氨基酸殘基置換:(a)VH CDR1，該 VH CDRl 包含 SEQ ID NO:7、10、13 或 69 的氨基酸序列；(b)VH CDR2，該VH CDR2 包含 SEQ ID N0:8、ll、14、17、70 或 75 的氨基酸序列；(c)VH CDR3，該 VH CDR3 包含 SEQ ID N0:9、12、15、18、16、65、66、67、71、72、76 或 78 的氨基酸序列；(d)VL CDR1，該 VLCDRl 包含 SEQ ID N0:1 或 4 的氨基酸序列；(e)VL CDR2，該 VL CDR2 包含 SEQ ID NO: 2、5、
73、或77的氨基酸序列；以及(f)VL CDR3，該VL CDR3包含SEQ ID NO: 3、6、64、68或74的氨基酸序列。
[0148]在具體實(shí)施例中，分離抗體或其抗原結(jié)合片段包含VH⑶R1、VH⑶R2、VH⑶R3、VLCDRUVL CDR2、以及 VL CDR3，在各自的 CDR 中包含與 SEQ ID NO: 7、8、9、1、2 和 3 ;SEQ IDN0:10、ll、12、l、2 和 3 ;SEQ ID NO:13、14、15、4、5 和 6 ;SEQ ID NO:7、17、18、1、2 和 3 ;SEQID N0:7、8、16、l、2 和 64 ;SEQ ID NO:7、8、65、1、2 和 64 ;SEQ ID NO ;7、8、66、1、2 和 64 ;SEQID N0:7、8、67、l、2和 68 ;SEQ ID NO:7、8、67、1、2 和 64 ;SEQ ID NO:7、8、78、1、2 和 64 ;SEQID N0:7、8、65、l、2 和 68 ；SEQ ID N0:69、70、71、l、2 和 68 ；SEQ ID NO:7、8、72、1、73 和 74 ；SEQ ID N0:69、75、71、l、2 和 68 ;SEQ ID N0:69、75、76、l、2 和 68 ;SEQ ID N0:69、75、76、l、77和74 ；SEQ ID N0:69、70、71、l、77和74 —致的氨基酸序列或相對(duì)于它們包含1、2、或3個(gè)氨基酸殘基置換。
[0149]在一些實(shí)施例中，提供了一種含有分離抗體或其抗原結(jié)合片段的組合物，該分離抗體或其抗原結(jié)合片段(i)包括含有三個(gè)CDR的VH鏈結(jié)構(gòu)域以及含有三個(gè)CDR的VL鏈結(jié)構(gòu)域；并且(ii)免疫特異性地結(jié)合至金黃色葡萄球菌α毒素多肽，其中該VH鏈結(jié)構(gòu)域的三個(gè)CDR包括(a)含有SEQ ID NO: 7、10、13或69的氨基酸序列的VH CDRl ; (b)含有SEQID N0:8、ll、14、17、70 或 75 的氨基酸序列的 VH CDR2;以及(c)含有 SEQ ID N0:9、12、15、
18、16、65、66、67、71、72、76或78的氨基酸序列的VH CDR3。在具體實(shí)施例中，VH CDRUVHCDR2 和 VH CDR3 相應(yīng)于 SEQ ID N0:7、8 和 9;SEQ ID NO: 10、11 和 12 ;SEQ ID NO: 13、14 和15 ；SEQ ID NO:7、17 和 18 ；SEQ ID NO:7、8 和 16 ；SEQ ID NO:7、8 和 65 ；SEQ ID NO:7、8 和66 ;SEQ ID N07、8、和 67 ;SEQ ID NO: 7、8 和 78 ;SEQ ID NO:69、70 和 71 ;SEQ ID NO:7、8 和72 ；SEQ ID NO:69、75 和 71 ；SEQ ID NO:69、75 和 76 ;或 SEQ ID N0:69、70 和 71。
[0150]在某些實(shí)施例中還提供了含有一種分離抗體或其抗原結(jié)合片段的組合物，該分離抗體或其抗原結(jié)合片段(i)包括含有三個(gè)CDR的VH鏈結(jié)構(gòu)域以及含有三個(gè)CDR的VL鏈結(jié)構(gòu)域；并且(ii)免疫特異性地結(jié)合至金黃色葡萄球菌α毒素多肽，其中該VL鏈結(jié)構(gòu)域的三個(gè)CDR包括(a)含有SEQ ID NO:1或4的氨基酸序列的VL CDRl ； (b)含有SEQ ID NO: 2、5、73、或77的氨基酸序列的VL CDR2;以及(c)含有SEQ ID NO: 3、6、64、68或74的氨基酸序列的VL CDR3。在具體實(shí)施例中，VL CDRUVL CDR2和VL CDR3相應(yīng)于SEQ ID N0:l、2和3 ；SEQ ID N0:4、5 和 6;SEQ ID NO: 1、2 和 64 ;SEQ ID NO: 1、2 和 68 ;SEQ ID N0:l、73 和 74;或 SEQ ID N0:l、77 和 74。
[0151]在某些實(shí)施例中，抗α毒素抗體或片段免疫特異性地結(jié)合金黃色葡萄球菌α毒素，并且包含(a)VH CDR1，該VH CDRl包含與SEQ ID NO:7、10、13或69—致的氨基酸序列或相對(duì)于它們包含1、2、或3個(gè)氨基酸殘基置換；(b) VH CDR2，該VH CDR2包含與SEQ ID N0:8、
11、14、17、70或75 —致的氨基酸序列或相對(duì)于它們包含1、2、或3個(gè)氨基酸殘基置換；以及
(c)VH CDR3，該 VH CDR3 包含與 SEQ ID N0:9、12、15、18、16、65、66、67、71、72、76 或 78—致的氨基酸序列或相對(duì)于它們包含1、2、或3個(gè)氨基酸殘基置換；(d)VL⑶R1，該VL⑶Rl包含 SEQ ID NO:1 或 4 的氨基酸序列；(e)VL CDR2，該 VL CDR2 包含 SEQ ID NO: 2、5、73、或 77的氨基酸序列；以及(f)VL CDR3，該VL CDR3包含SEQ ID NO: 3、6、64、68或74的氨基酸序列，并且具有選自下組的一種或多種特征(以下更詳細(xì)描述)，該組由以下各項(xiàng)組成::
[0152](a)對(duì)于α毒素大約13ηΜ或更小的親和常數(shù)(Kd)；
[0153](b)結(jié)合至α毒素單體,但不抑制α毒素結(jié)合至α毒素受體；
[0154](c)以至少50%、60%、70%、80%、90%或95%抑制α毒素寡聚體的形成；
[0155](d)以至少50%、60%、70%、80%、90%或95%降低α毒素的細(xì)胞溶解活性(例如，如通過(guò)細(xì)胞溶解和溶血試驗(yàn)所確定);
[0156](e)減少細(xì)胞浸潤(rùn)和促炎細(xì)胞因子釋放(例如，在一種動(dòng)物肺炎模型中)。
[0157]在一些實(shí)施例中，分離抗體或其抗原結(jié)合片段以由解離常數(shù)(Kd)表征的親和力而結(jié)合抗原(例如α毒素)，該解離常數(shù)在大約0.0lnM至大約50ηΜ、0.05ηΜ、0.1ηΜ、0.5ηΜ、1ηΝ、5ηΜ、10ηΜ、20ηΜ、30ηΜ、或 40ηΜ 的范圍內(nèi)。
[0158]實(shí)例11、表 1-7提供了本發(fā)明抗體的VH CDRUVH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL⑶R3的序列。表9提供了 VH和VL⑶R的總結(jié)。這些區(qū)域能以各種組合而組合，因?yàn)槊總€(gè)CDR區(qū)可以被獨(dú)立選擇用于給定的抗體。表7展示了可以被選擇用于每個(gè)區(qū)的不同序列。在某些實(shí)施例中，VL CDR3序列能以任何組合存在，從而形成本發(fā)明的抗α毒素抗體或片段。在某些實(shí)施例中，如在表9中所描繪，VH CDRl選自SEQ ID NO: 7、10、13或69，VH CDR2 選自 SEQ ID NO: 8、11、14、17、70 或 75，并且 VH CDR3 選自 SEQ ID NO: 9、12、15、18、
16、65、66、67、71、72、76或78。在一些實(shí)施例中，如在表9中所描繪，VL CDRl選自SEQ IDNO:1 或 4，VL CDR2 選自 SEQ ID NO: 2、5、73、或 77，并且 VL CDR3 選自 SEQ ID N0:3、6、64、
68或 74。
[0159]VH⑶R3和VL⑶R3結(jié)構(gòu)域在針對(duì)抗原的抗體結(jié)合特異性/親和力中起作用。因此，在一些實(shí)施例中，抗α毒素抗體或片段或其抗原結(jié)合片段包含VH⑶R3，該VH⑶R3包含與SEQ ID Ν0:9、12、15、18、16、65、66、67、71、72、76或78 一致的氨基酸序列或相對(duì)于它們包含1、2、或3個(gè)氨基酸殘基置換。在不同的實(shí)施例中，抗α毒素抗體或片段包含VLCDR3，該VL CDR3包含與SEQ ID NO: 3、6、64、68或74 —致的氨基酸序列或相對(duì)于它們包含1、2、或3個(gè)氨基酸殘基置換?？功炼舅乜贵w和片段的剩余部分(例如-1?1、-1?2、￥!1、￥1-，等等)可以包含在此披露的特定序列或者已知序列，前提是這些抗α毒素抗體和片段免疫特異性地結(jié)合至金黃色葡萄球菌α毒素。
[0160]在一些實(shí)施例中，分離抗體或其抗原結(jié)合片段免疫特異性地結(jié)合α毒素并且包含 VH CDR3，該 VH CDR3 包含與 SEQ ID N0:SEQ ID Ν0:9、12、15、18、16、65、66、67、71、72、76
或78 —致的氨基酸序列或相對(duì)于它們包含1、2、或3個(gè)氨基酸殘基置換，其中該抗體或抗原結(jié)合片段抑制α毒素寡聚化。
[0161]在一些實(shí)施例中，分離抗體或其抗原結(jié)合片段免疫特異性地結(jié)合α毒素并且包含VL CDR3，該VL CDR3包含與SEQ ID NO: 3、6、64、68或74 —致的氨基酸序列或相對(duì)于它們包含1、2、或3個(gè)氨基酸殘基置換，其中該抗體或抗原結(jié)合片段抑制α毒素寡聚化。
[0162]在一些實(shí)施例中，分離抗體或其抗原結(jié)合片段免疫特異性地結(jié)合α毒素并且包含 VH CDR3，該 VH CDR3 包含與 SEQ ID N0:SEQ ID Ν0:9、12、15、18、16、65、66、67、71、72、76或78 —致的氨基酸序列或相對(duì)于它們包含1、2、或3個(gè)氨基酸殘基置換，其中該抗體或抗原結(jié)合片段減少或抑制細(xì)胞因子的釋放。
[0163]在一些實(shí)施例中，分離抗體或其抗原結(jié)合片段免疫特異性地結(jié)合α毒素并且包含VL CDR3，該VL CDR3包含與SEQ ID NO: 3、6、64、68或74 —致的氨基酸序列或相對(duì)于它們包含1、2、或3個(gè)氨基酸殘基置換，其中該抗體或抗原結(jié)合片段減少或抑制細(xì)胞因子的釋放。
[0164]在一些實(shí)施例中，分離抗體或其抗原結(jié)合片段免疫特異性地結(jié)合α毒素并且包含 VH CDR3，該 VH CDR3 包含與 SEQ ID N0:SEQ ID Ν0:9、12、15、18、16、65、66、67、71、72、76或78 —致的氨基酸序列或相對(duì)于它們包含1、2、或3個(gè)氨基酸殘基置換，其中該抗體或抗原結(jié)合片段減輕或消除皮膚壞死。
[0165]在一些實(shí)施例中，分離抗體或其抗原結(jié)合片段免疫特異性地結(jié)合α毒素并且包含VL CDR3，該VL CDR3包含與SEQ ID NO: 3、6、64、68或74 —致的氨基酸序列或相對(duì)于它們包含1、2、或3個(gè)氨基酸殘基置換，其中該抗體或抗原結(jié)合片段減輕或消除皮膚壞死。
[0166]抗α毒素抗體和片段常常包含與在此所述的氨基酸序列基本上相同的一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列?；旧舷嗤陌被嵝蛄邪ê斜Ｊ匦园被嶂脫Q以及氨基酸缺失和/或插入的序列。保守性氨基酸置換是指一個(gè)第一氨基酸被一個(gè)第二氨基酸替換，該第二氨基酸具有與第一氨基酸的化學(xué)和/或物理性質(zhì)相似的化學(xué)和/或物理性質(zhì)(例如，電荷、結(jié)構(gòu)、極性、疏水性/親水性)。保守性置換包括將一個(gè)氨基酸用在以下組中的另一個(gè)氨基酸替換:賴氨酸(K)、精氨酸(R)以及組氨酸(H);天冬氨酸(D)以及谷氨酸(E);天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(Τ)、酪氨酸(Y)、K、R、H、D和E ;丙氨酸(Α)、纈氨酸(V)、亮氨酸(L)、異亮氨酸(I)、脯氨酸(P)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、甲硫氨酸(Μ)、半胱氨酸(C)以及甘氨酸(G)
[0167]框架區(qū)
[0168]重鏈和輕鏈的可變域各自包含四個(gè)框架區(qū)(通常為FR1、FR2、FR3、FR4或可替代地為FW1、Fff2, Fff3, FW4)，是可變域的更高保守性的部分。重鏈的四個(gè)框架區(qū)在此被指定為VH-FWl、VH-FW2、VH-FW3和VH-FW4，并且輕鏈的四個(gè)框架區(qū)在此被指定為VL-FWl、VL-FW2、VL-FW3和VH-FW4。在此使用了 Kabat編號(hào)系統(tǒng)，并且像這樣，VH-FWl開(kāi)始于位置I并且大約在氨基酸30處結(jié)束，VH-FW2大致是從氨基酸36至49，VH-FW3大致是從氨基酸66至94，并且VH-FW4大致為氨基酸103至113。VL-Fffl開(kāi)始于氨基酸I并且在大致氨基酸23處結(jié)束，VL-FW2大致是從氨基酸35至49，VL-FW3大致是從氨基酸57至88，并且VL-FW4大致是從氨基酸98至107。在某些實(shí)施例中，框架區(qū)包含根據(jù)Kabat編號(hào)系統(tǒng)的置換，例如在VL-Fffl中106A處的插入。除了天然存在的置換之外，F(xiàn)R殘基的一種或多種改變(例如，置換)也可以被引入抗α毒素抗體或片段中。在某些實(shí)施例中，這些改變導(dǎo)致針對(duì)抗α毒素的抗體結(jié)合親和力的改進(jìn)或優(yōu)化?？梢员恍揎椀目蚣軈^(qū)殘基的非限制性實(shí)例包括非共價(jià)直接結(jié)合抗原、與CDR的構(gòu)象相互作用/影響CDR構(gòu)象、和/或參與VL-VH界面的那些殘基。
[0169]在某些實(shí)施例中，框架區(qū)可以包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸變化，用于“種系化(germlining)”的目的。例如，將所選擇的抗體重鏈和輕鏈的氨基酸序列與種系重鏈和輕鏈氨基酸序列進(jìn)行比較，并且其中所選擇的VL和/或VH鏈的某些框架殘基不同于種系構(gòu)型(例如，由于用來(lái)制備噬菌體文庫(kù)的免疫球蛋白基因的體細(xì)胞突變)，可能希望的是使所選擇抗體的改變的框架殘基“回復(fù)突變 ”為種系構(gòu)型(即，改變所選擇的抗體的框架氨基酸序列，使得它們與種系框架氨基酸序列相同)?？蚣軞埢倪@種“回復(fù)突變”(或“種系化”)可以通過(guò)用于引入特定突變的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法完成(例如，定點(diǎn)誘變；PCR介導(dǎo)的誘變，等等)。在一些實(shí)施例中，可變的輕鏈和/或重鏈框架殘基被回復(fù)突變。在某些實(shí)施例中，呈現(xiàn)的分離抗體或其抗原結(jié)合片段的可變重鏈被回復(fù)突變。在某些實(shí)施例中，分離抗體或其抗原結(jié)合片段的可變重鏈包含至少一個(gè)、至少兩個(gè)、至少三個(gè)、至少四個(gè)或更多個(gè)回復(fù)突變。
[0170]在某些實(shí)施例中，在此呈現(xiàn)的抗α毒素抗體或片段的VH可以包含F(xiàn)Rl、FR2、FR3和 / 或 FR4，該 FR1、FR2、FR3 和 / 或 FR4 具有與在 SEQ ID NO: 20、22、24、26、28、41、43、45、
47、49、51、53、55、57、79、59、61、或62內(nèi)的相應(yīng)框架區(qū)從大約65%至大約100%的氨基酸序列一致性(即，抗體X的FRl相比于抗體Y的FRl)。在一些實(shí)施例中，抗α毒素抗體或片段包含與 SEQ ID Ν0:20、22、24、26、28、41、43、45、47、49、51、53、55、57、79、59、61、或 62 的相應(yīng) FR 至少 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95% —致或 100% —致的 VH FR 氨基酸序列(FR1、FR2、FR3和/或FR4)。在某些實(shí)施例中，抗α毒素抗體或片段包含與VH SEQ ID NO:20、
22、24、26、28、41、43、45、47、49、51、53、55、57、79、59、61、或 62 的相應(yīng) FR 至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% —致或 100% —致的 VH FR 氨基酸序列(FRl、FR2、FR3 和 /或FR4)。
[0171]在某些實(shí)施例中，抗α毒素抗體或片段可以包含VH FR (FR1、FR2、FR3和/或FR4)，該 VH FR 包含與 VH SEQ ID NO: 20、22、24、26、28、41、43、45、47、49、51、53、55、57、79、59、61、或62的相應(yīng)FR —致的氨基酸序列或相對(duì)于它們的相應(yīng)FR包含1、2或3個(gè)氨基酸置換。具體而言，VH的FR1、FR2、FR3或FR4可以各自具有與VH SEQ ID NO: 20、22、24、26、
28、41、43、45、47、49、51、53、55、57、79、59、61、或 62 的相應(yīng) FR1、FR2、FR3 或 FR4 —致的氨基酸序列或相對(duì)于它們的相應(yīng)FR1、FR2、FR3或FR4包含1、2或3個(gè)氨基酸置換。
[0172]在某些實(shí)施例中，在此提供的抗α毒素抗體或片段的VL可以包含F(xiàn)Rl、FR2、FR3和 / 或 FR4，該 FR1、FR2、FR3 和 / 或 FR4 具有與在 VL SEQ ID NO: 19、21、23、25、27、42、44、
46、48、50、52、54、56、58、60或63之內(nèi)的相應(yīng)框架區(qū)的氨基酸序列一致性(B卩，抗體X的FRl相比于抗體Y的FRl)(例如，從大約65%至大約100%序列一致性)。在一些實(shí)施例中，抗α毒素抗體或片段包含與 VL SEQ ID Ν0:19、21、23、25、27、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60或63的相應(yīng)FR至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、95% —致或100% —致的VL FR氨基酸序列 町、？1?2、？1?3和/或？1?4)。在某些實(shí)施例中，抗α毒素抗體或片段包含與VL SEQ IDΝ0:19、21、23、25、27、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60 或 63 的相應(yīng) FR 至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% —致或 100% —致的 VL FR 氨基酸序列(FRl、FR2、FR3 和 /或 FR4)。
[0173]在某些實(shí)施例中，抗α毒素抗體或片段包含VL FR (FRU FR2、FR3和/或FR4)，該 VL FR 包含與 VL SEQ ID NO: 19、21、23、25、27、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60 或 63的相應(yīng)FR —致的氨基酸序列或相對(duì)于它們的相應(yīng)FR包含1、2或3個(gè)氨基酸置換。具體而言，VL 的 FR1、FR2、FR3 或 FR4 可以各自具有與 VH SEQ ID NO: 19、21、23、25、27、42、44、46、
48、50、52、54、56、58、60或63的相應(yīng)FR1、FR2、FR3或FR4 —致的氨基酸序列或相對(duì)于它們的相應(yīng)FRl、FR2、FR3或FR4包含1、2或3個(gè)氨基酸置換。
[0174]在某些實(shí)施例中，分離抗體或其抗原結(jié)合片段免疫特異性地結(jié)合α毒素并且包含 VH FR (FRl、FR2、FR3 和 / 或 FR4)和 / 或 VL FR (FRl、FR2、FR3 和 / 或 FR4)，該 VH FR包含與 VH SEQ ID Ν0:20、22、24、26、28、41、43、45、47、49、51、53、55、57、79、59、61、或 62 的相應(yīng)FR —致的氨基酸序列或相對(duì)于它們的相應(yīng)FR包含1、2或3個(gè)氨基酸置換，該VL FR包含與 VL SEQ ID Ν0:19、21、23、25、27、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60 或 63 的相應(yīng) FR一致的氨基酸序列或相對(duì)于它們的相應(yīng)FR包含1、2或3個(gè)氨基酸置換，其中該抗體具有一種或多種選自下組的特征(以下更詳細(xì)描述)，該組由以下各項(xiàng)組成:
[0175](a)對(duì)于α毒素大約13ηΜ或更小的親和常數(shù)(Kd)；
[0176](b)結(jié)合至α毒素單體,但不抑制α毒素結(jié)合至α毒素受體；
[0177](c)以至少50%、60%、70%、80%、90%或95%抑制α毒素寡聚體的形成；
[0178](d)以至少50%、60%、70%、80%、90%或95%降低α毒素的細(xì)胞溶解活性(例如，如通過(guò)細(xì)胞溶解和溶血試驗(yàn)所確定);
[0179](e)減少細(xì)胞浸潤(rùn)和促炎細(xì)胞因子釋放(例如，在一種動(dòng)物肺炎模型中)。
[0180]在一些實(shí)施例中，分離抗體或其抗原結(jié)合片段以由解離常數(shù)(Kd )表征的親和力而結(jié)合抗原(例如α毒素)，該解離常數(shù)在大約0.0lnM至大約50ηΜ、0.05ηΜ、0.1ηΜ、0.5ηΜ、1ηΝ、5ηΜ、10ηΜ、20ηΜ、30ηΜ、或 40ηΜ 的范圍內(nèi)。
[0181]編碼抗α毒素抗體和片段的核苷酸序列
[0182]除了以上所述的氨基酸序列之外，另外提供了相應(yīng)于這些氨基酸序列并且編碼在此披露的人的、人源化的和/或嵌合的抗體的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，多核苷酸包含編碼在此所述的抗α毒素抗體或片段或其片段的核苷酸序列。這些包括但不限于編碼以上提及的氨基酸序列的核苷酸序列。核苷酸序列提供于實(shí)例11、表8中。因此，還提供了編碼包括在此所述的抗體的CDR和FR的VH和VL框架區(qū)的多核苷酸序列以及用于它們?cè)诩?xì)胞(例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中有效表達(dá)的表達(dá)載體。使用多核苷酸制造抗α毒素抗體或片段的方法更詳細(xì)地描述于下文。
[0183]還包括在嚴(yán)謹(jǐn)或較低嚴(yán)謹(jǐn)性的雜交條件(例如，如在此定義的)下與編碼抗α毒素抗體或片段的多核苷酸雜交的多核苷酸。如在此使用的術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)謹(jǐn)性”是指雜交實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)條件(例如，溫度和鹽濃度)，指示在兩個(gè)核酸之間的同源性的程度；嚴(yán)謹(jǐn)性越高，兩個(gè)核酸之間的同源性百分比越高。
[0184]嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件包括但不限于:在6Χ氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中、在大約45°C下雜交至過(guò)濾器結(jié)合的DNA，隨后在大約50°C -65°C在0.2X SSC/0.1%SDS中洗滌一次或多次；高度嚴(yán)謹(jǐn)條件例如在6X SSC中、在大約45°C下雜交至過(guò)濾器結(jié)合的DNA，隨后在大約65°C在0.1X SSC/0.2%SDS中洗滌一次或多次；或者任何其他已知的嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件。
[0185]在某些實(shí)施例中，核酸或其片段可以編碼抗α毒素抗體或片段并且在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與包含編碼 SEQ ID Ν0:19、21、23、25、27、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60 或 63 的氨基酸序列的核苷酸序列的核酸雜交。
[0186]在某些實(shí)施例中，多核苷酸序列可以包含編碼抗α毒素抗體或片段的核苷酸序列，該核苷酸序列與編碼 SEQ ID Ν0:19、21、23、25、27、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60 或63的氨基酸序列的核苷酸序列至少大約65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、或100%—致。在一些實(shí)施例中，多核苷酸序列可以包含編碼抗α毒素抗體或片段的核苷酸序列，該核苷酸序列與 SEQ ID Ν0:30、31、32、33、34、35、36、37 或 38 的核苷酸序列至少大約 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%—致。在一些實(shí)施例中，抗α毒素抗體或片段包含這樣一種核苷酸序列，該核苷酸序列包括與編碼SEQ ID Ν0:19、21、23、25、27、42、44、46、48、50、52、54、
56、58、60或63的氨基酸序列的核苷酸序列至少大約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的一致性。`
[0187]在某些實(shí)施例中，多核苷酸序列可以包含編碼抗α毒素抗體或片段的核苷酸序列，該核苷酸序列與編碼 SEQ ID Ν0:20、22、24、26、28、41、43、45、47、49、51、53、55、57、79、
59、61、或62的VH氨基酸序列的VH核苷酸序列至少大約65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%—致。在一些實(shí)施例中，多核苷酸序列可以包含編碼抗α毒素抗體或片段的核苷酸序列，該核苷酸序列與SEQ ID Ν0:30、32、34、36或38的VH核苷酸序列至少大約65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%—致。在一些實(shí)施例中，抗α毒素抗體或片段是由編碼VH的核苷酸序列編碼的，該編碼VH的核苷酸序列包括與編碼SEQ ID NO: 20、22、24、26、28、
41、43、45、47、49、51、53、55、57、79、59、61、或62的氨基酸序列的核苷酸序列至少大約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的一致性。
[0188]在某些實(shí)施例中，多核苷酸序列可以包含編碼抗α毒素抗體或片段的核苷酸序列，該核苷酸序列與編碼 SEQ ID Ν0:19、21、23、25、27、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60 或63的VL氨基酸序列的VL核苷酸序列至少大約65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100% —致。在一些實(shí)施例中，多核苷酸序列可以包含編碼抗α毒素抗體或片段的核苷酸序列，該核苷酸序列與SEQ ID Ν0:29、31、33、35或37的VL核苷酸序列至少大約65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%—致。在一些實(shí)施例中，抗α毒素抗體或片段是由編碼VL的核苷酸序列編碼的，該編碼VL的核苷酸序列包括與編碼EQ ID NO: 19、21、23、25、27、42、44、46、
48、50、52、54、56、58、60 或 63 的氨基酸序列的核苷酸序列至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的一致性。
[0189]在具體實(shí)施例中，多核苷酸序列可以包含編碼與VH氨基酸序列至少大約65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100% —致的抗α毒素抗體或片段的核苷酸序列，以及編碼與VL氨基酸序列至少大約65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100% —致的抗α毒素抗體或片段的核苷酸序列，其中VH和VL序列表示為SEQ ID Ν0:20和19 ;SEQ ID N0:22和21;SEQ ID N0:24和 23;SEQ ID N0:26和 25;SEQ ID N0:28和 27;SEQ ID N0:41 和 42;SEQ IDN0:43 和 44;SEQ ID N0:45和46;SEQ ID N0:47和48;SEQ ID N0:47和48;SEQ ID NO:49和 50;SEQ ID N0:51和52;SEQ ID N0:51和52;SEQ ID N0:53和54;SEQ ID NO: 55 和 56;SEQ ID NO: 57 和 58 ；SEQ ID NO: 59 和 60 ；SEQ ID NO: 61 和 58 ；SEQ ID NO: 62 和 58 ；SEQ IDN0:62 和 63;SEQ ID NO:79 和 63。
[0190]基本上一致的序列可以是多態(tài)性序列，即在一個(gè)種群中的可替代序列或等位基因。等位基因差異可以小到一個(gè)堿基對(duì)?；旧弦恢碌男蛄羞€可以包含誘變序列，包括含有沉默突變的序列。突變可以包含一個(gè)或多個(gè)殘基改變、一個(gè)或多個(gè)殘基的缺失、或一個(gè)或多個(gè)另外的殘基的插入。
[0191]可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法獲得多核苷酸以及確定的多核苷酸的核苷酸序列。例如，如果抗體核苷酸序列是已知的，編碼抗體的多核苷酸可以從化學(xué)合成的寡核苷酸組裝，簡(jiǎn)言之，涉及含有編碼抗體的序列的部分的重疊寡核苷酸的合成、那些寡核苷酸的退火和連接、以及然后通過(guò)PCR進(jìn)行連接的寡核苷酸的擴(kuò)增。
[0192]編碼抗體的多核苷酸還可以從來(lái)自適合來(lái)源的核酸產(chǎn)生。如果包含編碼具體抗體的核酸的克隆是不可獲得的，但是抗體分子的 序列是已知的，則編碼該免疫球蛋白的核酸可以化學(xué)合成或通過(guò)使用合成引物(這些合成引物與序列的3’和5’端可雜交)的PCR擴(kuò)增或者通過(guò)使用寡核苷酸探針(對(duì)于特定的基因序列具有特異性，以便從cDNA文庫(kù)鑒定編碼抗體的cDNA克隆)的克隆(例如來(lái)自編碼抗體的cDNA文庫(kù)的cDNA克隆)而從適合來(lái)源(例如，抗體cDNA文庫(kù)、或產(chǎn)生自表達(dá)抗體的任何組織或細(xì)胞的cDNA文庫(kù)或從它們分離的核酸、有時(shí)為polyA+RNA，這些細(xì)胞例如被選擇為表達(dá)抗體的雜交瘤細(xì)胞)獲得?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的任何方法，進(jìn)而將通過(guò)PCR產(chǎn)生的擴(kuò)增核酸克隆進(jìn)可復(fù)制的克隆載體中。
[0193]一旦確定抗體的核苷酸序列和相應(yīng)的氨基酸序列，可以使用用于操縱核苷酸序列的本領(lǐng)域中的已知方法(例如重組DNA技術(shù)、定點(diǎn)誘變、PCR、等等)來(lái)操縱抗體的核苷酸序列，從而產(chǎn)生具有不同氨基酸序列的抗體，例如產(chǎn)生氨基酸置換、缺失、和/或插入。
[0194]如在此使用的，術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)謹(jǐn)條件”是指用于雜交和洗滌的條件。用于雜交反應(yīng)溫度條件優(yōu)化的方法對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是已知的。水性和非水性方法描述于參考文獻(xiàn)中并且可以使用任何一種。嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件的非限制性實(shí)例是在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中、在大約45°C下的雜交，隨后在0.2X SSC、0.1%SDS中在50°C下洗滌一次或多次。嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件的另一個(gè)實(shí)例是在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中、在大約45°C下的雜交，隨后在0.2XSSC、0.1%SDS中在55°C下洗滌一次或多次。嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件的另外的實(shí)例是在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中、在大約45°C下的雜交，隨后在0.2X SSC、0.1%SDS中在60°C下洗滌一次或多次。經(jīng)常地，嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件是在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中、在大約45°C下的雜交，隨后在0.2X SSC、0.1%SDS中在65°C下洗滌一次或多次。更經(jīng)常地，嚴(yán)謹(jǐn)條件是在0.5M磷酸鈉、7%SDS、在65°C，隨后在0.2XSSC、1%SDS中在65°C下洗滌一次或多次。還可以用某些有機(jī)溶劑(例如甲酰胺)的添加來(lái)改變(即，降低)嚴(yán)謹(jǐn)雜交溫度。有機(jī)溶劑，像甲酰胺，降低了雙鏈多核苷酸的熱穩(wěn)定性，使得雜交可以在較低溫度下進(jìn)行，同時(shí)仍然保持嚴(yán)謹(jǐn)條件并且延長(zhǎng)可能不耐熱的核酸的使用壽命。
[0195]如在此使用的，短語(yǔ)“雜交”或其語(yǔ)法變體，是指在低、中、或高嚴(yán)謹(jǐn)性條件下，或在核酸合成條件下，將第一核酸分子結(jié)合至第二核酸分子。雜交可以包括第一核酸分子結(jié)合至第二核酸分子的情況，其中該第一和第二核酸分子是互補(bǔ)的。如在此使用的，相比于雜交至不具有互補(bǔ)序列的核酸分子，“特異性雜交”是指在引物的核酸合成條件下優(yōu)先雜交至具有與引物互補(bǔ)的序列的核酸分子。例如，特異性雜交包括引物與目標(biāo)核酸序列的雜交，該目標(biāo)核酸序列與該引物互補(bǔ)。
[0196]在一些實(shí)施例中，引物可以包括可能與固相核酸弓I物雜交序列互補(bǔ)或基本上與固相核酸引物序列互補(bǔ)(例如，當(dāng)比對(duì)時(shí)，與引物雜交序列互補(bǔ)物大約75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上一致)的核苷酸序列。引物可以包含與固相核酸引物雜交序列不互補(bǔ)或基本上不互補(bǔ)的核苷酸亞序列(例如，在與固相引物雜交序列互補(bǔ)或基本上互補(bǔ)的引物中的核苷酸亞序列的3’或5’端處)。
[0197]在某些實(shí)施例中引物可以包含修飾，例如肌苷、脫堿基位點(diǎn)、鎖核酸、小溝結(jié)合劑、雙鏈體穩(wěn)定劑(例如，吖啶、亞精胺)、Tm修飾劑或改變引物或探針的結(jié)合特性的任何修飾劑。
[0198]在某些實(shí)施例中，引物可以包含可檢測(cè)的分子或?qū)嶓w(例如，熒光團(tuán)、放射性同位素、比色劑、顆粒、酶等等)。 當(dāng)希望時(shí)，可以使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的任何方法修飾核酸以便包括可檢測(cè)標(biāo)記物。在在此所述的任何過(guò)程中，可以將標(biāo)記物摻入作為合成的一部分、或在使用引物之前將其添加。可以在液相中或在固相上進(jìn)行標(biāo)記物的摻入。在一些實(shí)施例中，可檢測(cè)標(biāo)記物對(duì)于目標(biāo)的檢測(cè)可以是有用的。在一些實(shí)施例中，可檢測(cè)標(biāo)記物對(duì)于目標(biāo)核酸的定量可以是有用的(例如，確定核酸的特定序列或種類的拷貝數(shù))。任何適用于檢測(cè)系統(tǒng)中的相互作用或生物活性的可檢測(cè)標(biāo)記物可以由技術(shù)人員適當(dāng)?shù)剡x擇并使用?？蓹z測(cè)標(biāo)記物的實(shí)例是熒光標(biāo)記物，例如熒光素、羅丹明、以及其他(例如，Anantha (阿南塔)等人，Biochemistry (《生物化學(xué)》)(1998)37:27092714 ;以及 Qu (曲)& Chaires,MethodsEnzymol.(《酶學(xué)方法》)(2000) 321:353369);放射性同位素(例如，1251、1311、35S、31P、32P、33P、14C、3H、7Be、28Mg、57Co、65Zn、67Cu、68Ge、82Sr、83Rb、95Tc、96Tc、103Pd、109Cd、和127Xe);光散射標(biāo)記物(例如,美國(guó)專利號(hào)6，214, 560,標(biāo)記物可商購(gòu)于Genicon科學(xué)公司(Genicon Sciences Corporation),加利福尼亞州(California);化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物和酶底物(例如二氧雜環(huán)丁烷和吖啶酯)，酶標(biāo)記物或蛋白質(zhì)標(biāo)記物(例如，綠色熒光蛋白(GFP )或其顏色變體、螢光素酶、過(guò)氧化物酶);其他發(fā)色標(biāo)記物或染料(例如，菁藍(lán))、以及其他輔因子或生物分子，例如地高辛配基、鏈霉親和素(strepdavidin)、生物素(例如，結(jié)合對(duì)的成員，比如像生物素與親和素))、親和捕獲部分(affinity capture moiety)等等。在一些實(shí)施例中，可以用親和捕獲部分來(lái)標(biāo)記引物。還包含在可檢測(cè)標(biāo)記物中的是對(duì)用于質(zhì)譜(例如，基質(zhì)輔助激光解析電離(MALDI)質(zhì)譜和電噴射(ES)質(zhì)譜)檢測(cè)的質(zhì)量修飾有用的那些標(biāo)記物。
[0199]引物還可以是指與目標(biāo)核酸的亞序列或另一個(gè)引物雜交的多核苷酸序列，并且促進(jìn)引物、目標(biāo)核酸或兩者的檢測(cè)，例如正如分子信標(biāo)。如在此使用的術(shù)語(yǔ)“分子信標(biāo)”是指可檢測(cè)分子，其中該分子的可檢測(cè)特性僅是在某些特定條件下是可檢測(cè)的，由此使得它能夠作為特異性的和信息性的信號(hào)起作用?？蓹z測(cè)特性的非限制性實(shí)例是光學(xué)特性、電性能、磁性能、化學(xué)特性以及通過(guò)已知大小的開(kāi)口的時(shí)間或速度。
[0200]在一些實(shí)施例中，分子信標(biāo)可以是能夠形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的單鏈寡核苷酸，其中環(huán)序列可以與感興趣的目標(biāo)核酸序列互補(bǔ)，并且側(cè)翼為能形成莖的短互補(bǔ)臂?？梢詫⒐押塑账嵩谝欢擞脽晒鈭F(tuán)標(biāo)記并且在另一端用淬滅劑分子標(biāo)記。在莖環(huán)構(gòu)象中，類似于在熒光共振能量轉(zhuǎn)移、或FRET中所見(jiàn)到的，來(lái)自激發(fā)的熒光團(tuán)的能量通過(guò)遠(yuǎn)程偶極-偶極耦合作用而被轉(zhuǎn)移至淬滅劑，并且作為熱而不是光而被釋放。當(dāng)環(huán)序列雜交至特定目標(biāo)序列時(shí)，分子的兩端分開(kāi)，并且來(lái)自激發(fā)的熒光團(tuán)的能量被發(fā)射為光，產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)。分子信標(biāo)提供了附加的優(yōu)勢(shì)，即，由于未雜交探針的自淬滅性質(zhì)，過(guò)量探針的去除是不必要的。在一些實(shí)施例中，分子信標(biāo)探針可以被設(shè)計(jì)為在通過(guò)調(diào)節(jié)環(huán)-靶標(biāo)雜交和莖形成的相對(duì)強(qiáng)度而區(qū)別或容許環(huán)與靶序列之間的錯(cuò)配。如在此所提及的術(shù)語(yǔ)“錯(cuò)配核苷酸”或“錯(cuò)配”是指在那個(gè)位置或那些位置與靶序列不互補(bǔ)的核苷酸。探針可以具有至少一個(gè)錯(cuò)配，但還可以具有2、3、4、
5、6或7或更多個(gè)錯(cuò)配核苷酸。
[0201]抗α毒素抗體和片段的生物特征
[0202]一種抗體可以具有與在此所述的抗體一致或相似的一種或多種特征，并且經(jīng)常具有使它區(qū)別于結(jié)合至相同抗原α毒素的其他抗體的一種或多種生物特征。如在此使用的，抗體的“生物特征”是指生物化學(xué)的結(jié)合和功能特征的任何一種或多種，可以用來(lái)選擇用于治療、研究、以及診斷用途的抗體。例如，抗α毒素抗體和片段可以在例如表位結(jié)合、靶向、親和性、中和、以及抑制寡聚化或七聚體孔復(fù)合體形成方面相同或不同。
[0203]抗α毒素抗體或片段的生物化學(xué)特征包括但不限于等電點(diǎn)(pi)和解鏈溫度(Tm)。抗α毒素抗體或片段的結(jié)合特征包括但不限于結(jié)合特異性；解離常數(shù)(Kd)、或它的倒數(shù)締合常數(shù)(Ka)、或它的分量 或、?率；它結(jié)合的表位；在α毒素的不同形式和/或制品(例如，重組的、天然的、乙?；?之間區(qū)分的能力以及結(jié)合可溶的和/或固定的抗原的能力。在此呈現(xiàn)的抗體的功能特征包括但不限于α毒素受體結(jié)合的抑制、α毒素寡聚化的抑制、由響應(yīng)于α毒素表達(dá)或活性的級(jí)聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)的基因表達(dá)的抑制、表達(dá)α毒素的細(xì)胞的耗盡、表達(dá)α毒素的細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制、α毒素的定位的抑制，以及在與金黃色葡萄球菌、α毒素或金黃色葡萄球菌和α毒素相關(guān)的一種或多種疾病或病癥中的保護(hù)。在此描述了抗α毒素抗體和片段的特征以及用于修飾和微調(diào)那些特征的方法。用于測(cè)量抗體特征的方法在本領(lǐng)域是已知的，其中一些詳述于下文。
[0204]結(jié)合特征
[0205]如上所述，抗α毒素抗體或片段專有地或相對(duì)于其他多肽優(yōu)先地免疫特異性地結(jié)合蛋白質(zhì)、肽、亞基、片段、部分或其任何組合的至少一個(gè)特定表位或抗原決定簇。如在此使用的術(shù)語(yǔ)“表位”或“抗原決定簇”是指能夠結(jié)合至抗體的蛋白質(zhì)決定簇，其中在此的術(shù)語(yǔ)“結(jié)合”經(jīng)常涉及特異性結(jié)合。這些蛋白質(zhì)決定簇或表位經(jīng)常包括分子(例如氨基酸或糖側(cè)鏈)的化學(xué)活性表面基團(tuán)，這些基團(tuán)常常具有特定的三維結(jié)構(gòu)特征，并且常常具有特定的電荷特征。構(gòu)象和非構(gòu)象表位的區(qū)別在于:在變性溶劑的存在下，與前者(而不是后者)的結(jié)合消失。如在此使用的術(shù)語(yǔ)“非連續(xù)表位”是指在從蛋白質(zhì)的一級(jí)序列中的至少兩個(gè)分開(kāi)的區(qū)域形成的蛋白質(zhì)抗原上的構(gòu)象表位。
[0206]在某些實(shí)施例中，抗α毒素抗體或片段免疫特異性地結(jié)合至金黃色葡萄球菌α毒素以及它的與α毒素寡聚化相關(guān)的抗原性片段。在一些實(shí)施例中，抗α毒素抗體或片段免疫特異性地結(jié)合至α毒素、或SEQ ID NO: 39或40的至少任何三個(gè)連續(xù)氨基酸。在一些實(shí)施例中，表位是α毒素蛋白的連續(xù)氨基酸中的至少4個(gè)氨基酸殘基、至少5個(gè)氨基酸殘基、至少6個(gè)氨基酸殘基、至少7個(gè)氨基酸殘基、至少8個(gè)氨基酸殘基或至少9個(gè)氨基酸殘基乃至整個(gè)指定部分。在某些實(shí)施例中，接觸殘基包含Τ261、Τ263、Ν264、Κ266和Κ271。在其他實(shí)施例中，接觸殘基包括 SEQ ID NO:39 的 N177、W179、G180、P181、Y182、D183、D185、S186、W187、N188、P189、V190、Y191和R200。在另外的實(shí)施例中，接觸殘基包括SEQ ID NO:39 N177、W179、G180、P181、Y182、D183、D185、S186、W187、N188、P189、V190、Y191、R200、T261、T263、N264、K266和K271。在某些實(shí)施例中，與抗體或其抗原結(jié)合片段接觸的α毒素部分包括SEQ ID NO:39的氨基酸261-272。在其他實(shí)施例中，與抗體或其抗原結(jié)合片段接觸的α毒素部分包括SEQ ID NO: 39的氨基酸248-277。在其他實(shí)施例中，與抗體或其抗原結(jié)合片段接觸的α毒素部分包括SEQ ID NO:39的氨基酸173-201以及261-272。
[0207]在不同實(shí)施例中，抗α毒素抗體或它的與α毒素寡聚化相關(guān)的片段免疫特異性地結(jié)合具有與SEQ ID NO: 39或40的氨基酸序列至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%的一致性或100%的一致性的α毒素多肽或其抗原性片段。抗α毒素抗體或片段有時(shí)可以免疫特異性地結(jié)合至具有與SEQ ID NO:39或40的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的一致性或100%的一致性的α毒素多肽或其抗原性片段。
[0208]在某些實(shí)施例中，抗α毒素抗體或片段可以結(jié)合在物種間保守的表位。在一些實(shí)施例中，抗α毒素抗體或片段結(jié)合金黃色葡萄球菌α毒素和來(lái)自其他細(xì)菌種類的α毒素同系物或直系同源物以及它們的抗原性片段。在一些實(shí)施例中，抗α毒素抗體或片段可以結(jié)合至一種或多種α毒素直系同源物和或同`種型。在具體實(shí)施例中，抗α毒素抗體或片段結(jié)合至來(lái)自具有α毒素同系物或直系同源物的一種或多種細(xì)菌種類的α毒素以及它的與α毒素寡聚化相關(guān)的抗原性片段。在某些實(shí)施例中，抗α毒素抗體或片段可以結(jié)合在葡萄球菌屬或其他密切相關(guān)細(xì)菌之內(nèi)的表位，該表位在α毒素同系物和/或同種型和/或構(gòu)象變體和/或亞型上。
[0209]在抗原與抗體之間的相互作用常常與其他非共價(jià)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用相同。通常，四種類型的結(jié)合相互作用存在于抗原和抗體之間。(i)氫鍵，(?)分散力，(iii)在路易斯酸與路易斯堿之間的靜電力，以及(iv)疏水相互作用。疏水相互作用是抗體-抗原相互作用的重要的驅(qū)動(dòng)力，并且是基于經(jīng)由非極性基團(tuán)的水的排斥而不是分子的吸引。然而，某些物理力也促進(jìn)抗原-抗體結(jié)合，例如表位形狀與不同的抗體結(jié)合部位的配合或互補(bǔ)。其他材料和抗原可以與抗體發(fā)生交叉反應(yīng)，由此競(jìng)爭(zhēng)可獲得的游離抗體。
[0210]在抗原與抗體之間的結(jié)合的親和常數(shù)和特異性的測(cè)量常常是確定使用抗α毒素抗體和片段的治療、診斷和研究方法的效力的一個(gè)要素?！敖Y(jié)合親和力”通常是指分子(例如，抗體)的單個(gè)結(jié)合部位與其結(jié)合配偶體(例如，抗原)之間的非共價(jià)相互作用的總和的強(qiáng)度。除非另外指明，如在此使用的“結(jié)合親和力”是指反映在結(jié)合對(duì)成員(例如，抗體和抗原)之間的1:1相互作用的固有結(jié)合親和力。分子X(jué)對(duì)于其配偶體Y的親和力通?？梢杂善胶饨怆x常數(shù)(Kd)表示，計(jì)算為比率koff/kon?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的常見(jiàn)方法測(cè)量親和力，包括在此所述和示例的那些(例如，BiaCore方法)。低親和力抗體通常緩慢地結(jié)合抗原并且傾向易于解離，而高親和力抗體通常較快結(jié)合抗原并且傾向于較長(zhǎng)地保持結(jié)合。多種測(cè)量結(jié)合親和力的方法在本領(lǐng)域是已知的，出于本技術(shù)的目的而可以使用它們中的任何一種。
[0211]抗α毒素抗體或片段有時(shí)具有對(duì)α毒素表位的結(jié)合親和力，該結(jié)合親和力由I X IO-2M或更小、I X IO-3M或更小、I X IO-4M或更小、I X IO-5M或更小、I X IO-6M或更小、I X KT7M或更小、I X KT8M或更小、I X KT9M或更小、I X 11010Μ或更小、I X 110ηΜ或更小、
IX KT12M或更小、I X KT13M或更小、I X 11014Μ或更小或I X 11015Μ或更小的解離常數(shù)(Kd)表征。例如，Kd 可以是從 I X KT15M 至 I X 1102Μ、從 I X KT14M 至 I X 11010Μ、從 I X 1109Μ 至 I X KT5M以及從 I X KT4M 至 I X 1102Μ。
[0212]在某些實(shí)施例中，抗α毒素抗體和片段是高親和力抗體?！案哂H和力抗體”表示以小于1108Μ (例如，ΙΟ?ΜΟ,Μ、等等)的親和力結(jié)合至α毒素表位的抗體。
[0213]在某些實(shí)施例中，抗α毒素抗體或片段被描述為具有特定摩爾濃度的或更佳的結(jié)合親和力。當(dāng)在此使用“或更佳”時(shí)，是指較強(qiáng)的結(jié)合，由較小的數(shù)字Kd值表示。例如，對(duì)于一種抗原具有“0.6ηΜ或更佳”的親和力的抗體，對(duì)于該抗原的抗體的親和力是< 0.6ηΜ，即，0.59ηΜ、0.58ηΜ、0.57ηΜ等等、或任何小于0.6ηΜ的值。
[0214]在一些實(shí)施例中，抗α毒素抗體或片段的親和力是就締合常數(shù)(Ka)而言進(jìn)行描述的，計(jì)算為比率kon/koff。在這種情況下，對(duì)于α毒素表位，本發(fā)明的抗α毒素抗體和片段具有包括I X IO2M-1或更大、I X IO3M-1或更大、I X IOM-1或更大、I X IO5W1或更大、I X IO6M-1或更大、I X IO7IT1 或更大、I X IO8IT1 或更大、I X IO9IT1 或更大、I X IO10ITi 或更大 I X IO11ITi或更大I X IO12IT1或更大、I X IO13IT1或更大、I X IO14IT1或更大或者I X IO15IT1或更大的締合常數(shù)的結(jié)合親和力。例如，Ka可以是從IXlO2M-1至IX IO7M'從IXlO7M-1至IXIOiqM'以及從 I X IO10ITi 至 I X IO15M'
[0215]在某些實(shí)施例中，抗α毒素抗體或片段從α毒素表位解離的速率可能是有意義的。在一些實(shí)施例中，抗α毒素抗體或片段能以小于10、'小于5X10、'小于ΙΟΛ-1、小于5Χ l(T4s'或小于KTiV1的kQff結(jié)合至α毒素。在一些實(shí)施例中，抗α毒素抗體和片段與α毒素表位締合的速率可以比Kd或Ka的值更有意義。在這種情況下，本發(fā)明的抗α毒素抗體和片段以至少IOH'至少5X ΙΟΙ—1 S—1、至少10?4S—1、至少SXlO-fV1、至少IO6IT1S'至少5X IO6M-1S'至少IO7M-1S-1的kon比率結(jié)合至α毒素。
[0216]結(jié)合親和力的確定可以使用在實(shí)例部分(參見(jiàn)實(shí)例I)中進(jìn)一步描述的特定技術(shù)以及本領(lǐng)域已知的方法來(lái)測(cè)量。這種方法的一個(gè)實(shí)例包括通過(guò)用感興趣的抗體的Fab型式以及它的抗原來(lái)進(jìn)行的放射性標(biāo)記抗原結(jié)合測(cè)定(RIA)而測(cè)量解離常數(shù)“Kd”，該放射性標(biāo)記抗原結(jié)合測(cè)定如由以下測(cè)定所描述，該測(cè)定通過(guò)在未標(biāo)記抗原的逐步增高劑量系列(titration series)的存在下平衡Fab與(125I) _標(biāo)記抗原的最小濃度、然后用抗Fab抗體包被的板捕獲結(jié)合的抗體而測(cè)量Fab對(duì)抗原的溶液結(jié)合親和力。為了建立該測(cè)定的條件，將微量滴定板(Dynex)用在50mM碳酸鈉(pH9.6)中的5 μ g/ml捕獲性抗Fab抗體(CappelLabs)過(guò)夜包被，并且隨后在室溫(大致23°C)用PBS中的2% (w/v)牛血清白蛋白封閉兩至五個(gè)小時(shí)。在非吸附性板(Nunc#269620)中，將IOOpM或26pM[125I]-抗原與感興趣Fab的連續(xù)稀釋物進(jìn)行混合。然后將感興趣的Fab孵育過(guò)夜；然而，孵育可以連續(xù)持續(xù)較長(zhǎng)的時(shí)期(例如，65小時(shí))以確保達(dá)到平衡。此后，將混合物轉(zhuǎn)移至捕獲板，以用于在室溫孵育(例如，持續(xù)一小時(shí))。然后將溶液去除并且將板用在PBS中的0.1%吐溫20 (Tween-20)洗滌八次。當(dāng)板已經(jīng)干燥時(shí)，添加150 μ I/孔的閃爍體(MicroScint-20 !Packard),并且將板在Topcount Y計(jì)數(shù)器(Packard)上計(jì)數(shù),持續(xù)十分鐘。選擇給出小于或等于20%的最大結(jié)合的各個(gè)Fab的濃度以供在競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定中使用。
[0217]在另一種情況下，可以通過(guò)使用表面等離子體共振測(cè)定來(lái)測(cè)量Kd值，該測(cè)定可以例如使用 BIAcore?-2000 或 BIAcore?-3000 (BIAcore 公司，皮斯卡塔韋(Piscataway),新澤西州)在25°C用在約10個(gè)反應(yīng)單位(response unit, RU)的固定抗原CM5芯片來(lái)進(jìn)行。簡(jiǎn)言之，在這種方法的一個(gè)實(shí)例中，根據(jù)供應(yīng)商的說(shuō)明書，將羧甲基化的葡聚糖生物傳感器芯片(CM5，BIAcore公司)用N-乙基-N' - (3- 二甲基氨基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)以及N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活化。將抗原用pH4.8的I IOmM醋酸鈉稀釋為5 μ g/微升(約0.2 μ Μ)，之后以5 μ I/分鐘的流速注入從而獲得偶聯(lián)蛋白的大致10個(gè)反應(yīng)單位(RU)。在注入抗原后，注入IM乙醇胺以封閉未反應(yīng)的基團(tuán)。為了動(dòng)力學(xué)測(cè)量，在25°C將Fab的兩倍連續(xù)稀釋物(0.78nM至500nM)以大致25 μ 1/min的流速注入具有0.05%吐溫20 (Tween20)(PBST)的PBS中。通過(guò)同時(shí)擬合締合和解離傳感圖，使用簡(jiǎn)單的一對(duì)一朗繆爾結(jié)合模型(BIAcore評(píng)估軟件，3.2版本)計(jì)算締合速率(km)和解離速率(k。 )。
[0218]如果通過(guò)以上的表面等離子體共振測(cè)定所得締合速率超過(guò)IO6M4s'則締合速率可以通過(guò)使用熒光淬滅技術(shù)來(lái)確定，例如，該熒光淬滅技術(shù)測(cè)量在25°C、在抗原漸增濃度的存在下在PBS (pH7.2)中的20nM抗抗原抗體(Fab形式)的熒光發(fā)射強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)=295nm ;發(fā)射波長(zhǎng)=340nm, 16nm帶通)的增加或降低,如用分光計(jì)(例如配備有流動(dòng)停止的分光光度計(jì)(Aviv儀器公司)或具有攪拌紅色比色皿(stir red cuvette)的8000-系列SLM-Aminco分光光度計(jì)(ThermoSpectronic公司))測(cè)量的。根據(jù)這項(xiàng)技術(shù)的“結(jié)合速率”(“on-rate”)或“締合的速率”(“rate of association”)或“km”也可以使用如上所述的BIAcore?-2000 或 BIAcore?-3000 (BIAcore 公司，皮斯卡塔韋(Piscataway),新澤西州)用以上所述的相同的表面等離子體共振`技術(shù)來(lái)`確定。
[0219]適用于確定所呈現(xiàn)的分離抗體或其抗原結(jié)合片段或其改變/突變的衍生物(以下討論)的結(jié)合特征的方法和試劑在本領(lǐng)域中是已知的和/或是可商購(gòu)的。被設(shè)計(jì)用于此類動(dòng)力學(xué)分析的設(shè)備和軟件是可商購(gòu)的(例如，Biacore? A100,和Biacore? 2000儀器；Biacore International AB,烏普薩拉(Uppsala),瑞典)。
[0220]在一些實(shí)施例中，可以將結(jié)合測(cè)定作為直接結(jié)合測(cè)定或者作為競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定而進(jìn)行。可以使用標(biāo)準(zhǔn)ELISA或標(biāo)準(zhǔn)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定來(lái)檢測(cè)結(jié)合。在直接結(jié)合測(cè)定中，測(cè)試了候選抗體與α毒素抗原的結(jié)合。在另一方面，競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定評(píng)定了候選抗體與已知的抗α毒素抗體或片段或其他結(jié)合α毒素的化合物(例如，受體、抑制劑)競(jìng)爭(zhēng)的能力。通常，任何允許抗體與能被檢測(cè)的α毒素結(jié)合的方法被包含在用于檢測(cè)和測(cè)量抗體的結(jié)合特征的技術(shù)的范圍內(nèi)。還可以采用這些方法來(lái)篩選提供所希望的特征的那些的一組抗體。
[0221]在某些實(shí)施例中，分離抗體或其抗原結(jié)合片段免疫特異性地結(jié)合至α毒素并且具有選自下組的一種或多種特征，該組由以下各項(xiàng)組成:
[0222](a)對(duì)于α毒素大約13ηΜ或更小的親和常數(shù)(Kd)；[0223](b)結(jié)合至α毒素單體,但不抑制α毒素結(jié)合至α毒素受體；
[0224](c)以至少50%、60%、70%、80%、90%或95%抑制α毒素寡聚體的形成；
[0225](d)以至少50%、60%、70%、80%、90%或95%降低α毒素的細(xì)胞溶解活性(例如，如通過(guò)細(xì)胞溶解和溶血試驗(yàn)所確定);
[0226](e)減少細(xì)胞浸潤(rùn)和促炎細(xì)胞因子釋放(例如，在一種動(dòng)物肺炎模型中)。
[0227]在一些實(shí)施例中，分離抗體或其抗原結(jié)合片段以由解離常數(shù)(Kd)表征的親和力而結(jié)合抗原(例如α毒素)，該解離常數(shù)在大約0.0lnM至大約50ηΜ、0.05ηΜ、0.1ηΜ、0.5ηΜ、1ηΝ、5ηΜ、10ηΜ、20ηΜ、30ηΜ、或 40ηΜ 的范圍內(nèi)。
`[0228]功能特征
[0229]在某些實(shí)施例中，抗α毒素抗體或片段改變?chǔ)炼舅睾?或表達(dá)α毒素的細(xì)胞的生物特性。在一些實(shí)施例中，抗α毒素抗體或片段通過(guò)結(jié)合至多肽以及抑制α毒素單體組裝成跨膜孔(例如，α毒素七聚體)而中和α毒素的生物活性?？梢杂帽绢I(lǐng)域已知的、在一些情況下使用可商購(gòu)試劑的方法來(lái)進(jìn)行中和測(cè)定。α毒素的中和常常是用I X KT6M或更小、I X KT7M或更小、I X KT8M或更小、I X KT9M或更小、I X 1(10Μ或更小以及I X KT11M或更小的IC50來(lái)度量的。在某些實(shí)施例中，當(dāng)免疫特異性地結(jié)合至金黃色葡萄球菌α毒素的抗體或抗原結(jié)合片段是在如實(shí)例3-6中所述的濃度時(shí)發(fā)生中和。在某些實(shí)施例中，抗α毒素抗體或片段中和α毒素寡聚化并形成跨膜孔的能`力。術(shù)語(yǔ)“抑制濃度50%”(縮寫為“IC50”)表示用于抑制劑靶向的分子的給定活性(例如，形成跨膜孔七聚體復(fù)合體的α毒素寡聚化)的50%抑制所需要的抑制劑(例如，在此提供的抗α毒素抗體或片段)的濃度。較低的IC50值通常相應(yīng)于更有效的抑制劑。
[0230]在某些實(shí)施例中，抗α毒素抗體或片段抑制α毒素的一種或多種生物活性。如在此使用的術(shù)語(yǔ)“抑制”是指任何統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的生物活性的降低，包括活性的完全阻斷。例如，“抑制”可以指生物活性大約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、或100%的降低。在某些實(shí)施例中，抗α毒素抗體或片段以至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、或100%抑制α毒素的一種或多種生物活性。
[0231]在一些實(shí)施例中，抗α毒素抗體或片段可以耗盡由病原性金黃色葡萄球菌分泌的α毒素。在一些實(shí)施例中，抗α毒素抗體或片段可以實(shí)現(xiàn)由金黃色葡萄球菌分泌的α毒素的至少大約20%、至少大約30%、至少大約40%、至少大約50%、至少大約60%、至少大約70%、至少大約80%、至少大約90%、至少大約95%、或大約100%的耗盡。在具體實(shí)施例中，幾乎所有可檢測(cè)的分泌的α毒素從金黃色葡萄球菌感染的細(xì)胞耗盡。
[0232]在某些實(shí)施例中，抗α毒素抗體或片段可以體外抑制刺激的α毒素活性(例如，受體結(jié)合、寡聚化)和/或表達(dá)或分泌α毒素的細(xì)胞的增殖?？功炼舅乜贵w或片段有時(shí)以至少大約10%、至少大約20%、至少大約30%、至少大約40%、至少大約50%或至少大約75%抑制體外α毒素活性，即金黃色葡萄球菌致病性。用于測(cè)量細(xì)胞增殖、致病性以及α溶血素活性的方法在本領(lǐng)域是已知的。
[0233]在某些實(shí)施例中，抗α毒素抗體或片段可以抑制一種或多種可誘導(dǎo)基因的表達(dá)，這些可誘導(dǎo)基因直接或間接響應(yīng)于由金黃色葡萄球菌感染和/或α毒素表達(dá)和功能所創(chuàng)造的環(huán)境。在具體實(shí)施例中，抗α毒素抗體或片段以至少20%、以至少30%、以至少40%、以至少50%、以至少60%、以至少70%、以至少80%、以至少90%、以至少100%、以至少120%、以至少140%、以至少160%、以至少180%、或以至少200%抑制一種或多種可誘導(dǎo)基因的表達(dá)，這些可誘導(dǎo)基因直接或間接響應(yīng)于由金黃色葡萄球菌和/或α毒素表達(dá)和功能所創(chuàng)造的環(huán)境。
[0234]抗α毒素抗體和片段的產(chǎn)生
[0235]以下描述了用于產(chǎn)生抗體的示例性技術(shù)。用于產(chǎn)生抗體的α毒素抗原可以是例如包含涉及寡聚化的α毒素肽序列的肽片段?？梢允褂冒琒EQ ID Ν0:39的天然金黃色葡萄球菌毒素或包含SEQ ID Ν0:40的突變體α毒素、變體或抗原性片段而產(chǎn)生針對(duì)α毒素的抗體。表達(dá)并分泌α毒素的金黃色葡萄球菌細(xì)胞還可以用來(lái)產(chǎn)生抗體。α毒素的核苷酸和氨基酸序列的實(shí)例是可獲得的，如提供于例如表10中。可以使用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)，以來(lái)自細(xì)菌或真核細(xì)胞的分離形式重組地產(chǎn)生α毒素。α毒素可以被表達(dá)為帶標(biāo)簽(例如，表位標(biāo)簽)的蛋白或其他融合蛋白(例如，GST融合)，以便促進(jìn)在不同測(cè)定中的分離和鑒定。結(jié)合至不同標(biāo)簽和融合序列的抗體或結(jié)合蛋白是可獲得的，如下文詳盡闡述。也可以使用其他形式的產(chǎn)生抗體有用的α毒素。
[0236]不同的標(biāo)簽多肽和它們的對(duì)應(yīng)的抗體在本領(lǐng)域是已知的。實(shí)例包括聚-組氨酸(poly-his)或聚-組氨酸-甘氨酸(poly-his-gly)標(biāo)簽；flu HA標(biāo)簽多肽及其抗體12CA5 ；c-myc標(biāo)簽及其8F9、3C7、6E10、G4、B7和9E10抗體；以及單純皰疹病毒糖蛋白D (gD)標(biāo)簽及其抗體。FLAG-肽被抗FLAG-M2單克隆抗體識(shí)別?？梢酝ㄟ^(guò)免疫親和層析進(jìn)行含F(xiàn)LAG肽的蛋白質(zhì)的純化，該免疫親和層析使用包含 共價(jià)連接至瓊脂糖的抗FLAG M2單克隆抗體的親和基質(zhì)。其他標(biāo)簽多肽包括KT3表位肽；α -微管蛋白表位肽；以及Τ7基因10蛋白肽標(biāo)簽。
[0237]可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的不同程序而產(chǎn)生針對(duì)感興趣抗原的多克隆抗體。例如，可以將α毒素多肽或其免疫原性片段給予至不同的宿主動(dòng)物，包括但不限于兔、小鼠、大鼠、等等，從而誘導(dǎo)含有對(duì)抗原具有特異性的多克隆抗體的血清的產(chǎn)生。取決于宿主物種，可以而使用不同的佐劑來(lái)增加免疫應(yīng)答，并且這些佐劑包括但不限于弗氏佐劑(Freund’s)(完全的和不完全的)、礦物膠(例如，氫氧化鋁)、表面活性物質(zhì)(例如溶血卵磷脂)、普盧蘭尼克多元醇(pluronic polyol)、聚陰離子、肽、油乳劑、鑰孔蟲(chóng)戚血藍(lán)蛋白、二硝基苯酹、以及潛在有用的人用佐劑(例如BCG (卡介苗))以及短小棒狀桿菌。此類佐劑在本領(lǐng)域也是已知的。
[0238]可以通過(guò)相關(guān)抗原和佐劑的多重皮下(SC)或腹膜內(nèi)(ip)注射而在動(dòng)物中產(chǎn)生多克隆抗體?？梢杂杏玫氖菍⑾嚓P(guān)抗原(尤其是在使用合成肽時(shí))結(jié)合至一種在有待免疫的物種中為免疫原性的蛋白質(zhì)。例如，可以使用雙功能劑或衍生劑(反應(yīng)基團(tuán))，例如活化酯(通過(guò)半胱氨酸或賴氨酸殘基的結(jié)合)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2、或RlN = C = NR (其中R和Rl是不同的烷基基團(tuán))，將抗原結(jié)合至鑰孔蟲(chóng)戚血藍(lán)蛋白(KLH)、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白、或大豆胰蛋白酶抑制劑。結(jié)合物還可以作為融合蛋白產(chǎn)生于重組細(xì)胞培養(yǎng)物中。
[0239]典型地，通過(guò)將適當(dāng)濃度的抗原或結(jié)合物與佐劑進(jìn)行組合并且將溶液在多個(gè)部位注射而針對(duì)抗原、免疫原性結(jié)合物、或衍生物使動(dòng)物免疫。還可以如在實(shí)例I中所述進(jìn)行免疫(免疫/雜交瘤產(chǎn)生)。
[0240]可以使用本領(lǐng)域已知的多種多樣的技術(shù)來(lái)制備單克隆抗體，包括使用雜交瘤、重組體、以及噬菌體展示技術(shù)、或其組合。在此所使用的術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”是指從基本上同種或分離的抗體的群體中獲得的一種抗體，例如單獨(dú)的抗體，這些抗體包括除了可能天然存在的突變(可能以少量存在)之外的相同的群體。單克隆抗體類在多特異性的工程化抗體的情況下針對(duì)單個(gè)抗原位點(diǎn)或多個(gè)抗原位點(diǎn)是高度特異性的。而且，與包括針對(duì)不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制劑相反，每種單克隆抗體是針對(duì)該抗原上的相同決定簇的。除了它們的特異性之外，單克隆抗體是有利的，因?yàn)樗鼈兛梢栽诓槐黄渌贵w污染的情況下被合成。修飾詞“單克隆”不應(yīng)當(dāng)被理解為需要通過(guò)任何特定的方法而產(chǎn)生抗體。以下是用于產(chǎn)生單克隆抗體的代表性方法的描述(不是旨在為限制性的)，并且可以用來(lái)產(chǎn)生例如單克隆哺乳動(dòng)物的、嵌合的、人源化的、人的結(jié)構(gòu)域、雙抗體(diabody )、疫苗體(vaccibody)、線性和多特異性抗體。
[0241]用于使用雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生并篩選特異性抗體的方法在本領(lǐng)域是常規(guī)的和已知的。在雜交瘤方法中，小鼠或其他適當(dāng)?shù)乃拗鲃?dòng)物(例如倉(cāng)鼠)如上所述被免疫從而引出淋巴細(xì)胞，這些淋巴細(xì)胞產(chǎn)生或能夠產(chǎn)生將特異性結(jié)合至用于免疫的抗原的抗體?？商娲?，淋巴細(xì)胞可以被體外免疫。在免疫之后，分離淋巴細(xì)胞，并且然后使用適合的融合劑或融合配偶體(例如聚乙二醇)與骨髓瘤細(xì)胞系融合從而形成雜交瘤細(xì)胞。在某些實(shí)施例中，選擇的骨髓瘤細(xì)胞是有效融合、支持由所選擇的抗體產(chǎn)生細(xì)胞的穩(wěn)定高水平抗體產(chǎn)生、并且對(duì)針對(duì)未融合的親代細(xì)胞而選擇的選擇性培養(yǎng)基敏感的那些骨髓瘤細(xì)胞。在一方面，骨髓瘤細(xì)胞系是鼠類骨髓瘤系，例如衍生自從美國(guó)加利福尼亞州圣地亞哥的索爾克研究所細(xì)胞分配中心(Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California, USA)可獲得的M0PC-21和MPC-1l小鼠腫瘤的、以及從美國(guó)馬里蘭州羅克維爾的美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA)可獲得的 SP-2和衍生物如X63-Ag8-653細(xì)胞的那些鼠類骨髓瘤系。人骨髓瘤和小鼠-人異源骨髓瘤細(xì)胞系也已經(jīng)被描述用于人單克隆抗體的產(chǎn)生。
[0242]一旦產(chǎn)生具有所希望的特異性、親和力、和/或活性的抗體的雜交瘤細(xì)胞被鑒定，則可以通過(guò)有限稀釋程序而將這些克隆 進(jìn)行亞克隆并且通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法使其生長(zhǎng)。用于這個(gè)目的的適合的培養(yǎng)基包括例如D-MEM或RPM1-1640培養(yǎng)基。另外，雜交瘤細(xì)胞可以在一種動(dòng)物中體內(nèi)生長(zhǎng)為腹水瘤，例如通過(guò)將細(xì)胞腹膜內(nèi)(1.P.)注射進(jìn)入小鼠。
[0243]將由亞克隆分泌的單克隆抗體通過(guò)常規(guī)抗體純化程序(例如，如親和力層析(例如使用蛋白A或蛋白G-瓊脂糖凝膠)或離子交換層析、親和標(biāo)簽、羥基磷灰石色譜、凝膠電泳、透析、等等)而從培養(yǎng)基、腹水液、或血清適當(dāng)?shù)胤蛛x。在下文更詳細(xì)地描述示例性的純化方法。
[0244]重組DNA技術(shù)
[0245]用于使用重組DNA技術(shù)而產(chǎn)生和篩選特異性抗體的方法在本領(lǐng)域是常規(guī)的和已知的?？梢匀菀椎厥褂贸Ｒ?guī)程序(例如，通過(guò)使用能夠特異結(jié)合至編碼鼠抗體的重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)將編碼單克隆抗體的DNA分離和/或測(cè)序。一旦分離，可以將DNA放在表達(dá)載體中，進(jìn)而將其轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中，例如大腸桿菌細(xì)胞、猴COS細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、或不以另外的方式產(chǎn)生抗體蛋白的骨髓瘤細(xì)胞，從而在重組宿主細(xì)胞中獲得單克隆抗體的合成。如下對(duì)于通過(guò)噬菌體展示和抗體人源化所產(chǎn)生的抗體所述的，可以從除了雜交瘤之外的產(chǎn)生抗α毒素抗體或片段的一種或多種來(lái)源獲得用于重組抗體的DNA或基因材料。
[0246]抗體或其變體的重組表達(dá)常常需要包含編碼抗體的多核苷酸的表達(dá)載體的構(gòu)建。在此提供了可復(fù)制的載體，這些載體包含可操作地連接至啟動(dòng)子的編碼抗體分子、抗體重鏈或輕鏈、抗體的重鏈或輕鏈可變域或其部分、或者重鏈或輕鏈CDR的核苷酸序列。此類載體可以包含編碼抗體分子恒定區(qū)的核苷酸序列，并且可以將抗體可變域克隆到這種載體中，以用于表達(dá)整個(gè)重鏈、整個(gè)輕鏈、或整個(gè)重鏈和輕鏈兩者。
[0247]一旦通過(guò)常規(guī)技術(shù)將表達(dá)載體轉(zhuǎn)移至宿主細(xì)胞，然后通過(guò)常規(guī)技術(shù)培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以產(chǎn)生抗體。因此，在此提供了包含可操作地連接至異源性啟動(dòng)子的編碼在此的所呈現(xiàn)的分離抗體或其抗原結(jié)合片段或其片段、或其重鏈或輕鏈、或其部分、或單鏈抗體的多核苷酸的宿主細(xì)胞。在某些用于表達(dá)雙鏈抗體的實(shí)施例中，可以將編碼重鏈和輕鏈的載體在宿主細(xì)胞中共表達(dá)，以用于表達(dá)整個(gè)免疫球蛋白分子，如下所詳述。
[0248]作為表達(dá)重組抗體的宿主的可獲得的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系在本領(lǐng)域是已知的，并且包括許多從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)獲得的永生化細(xì)胞系，包括但不限于中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、海拉細(xì)胞、幼倉(cāng)鼠腎(BHK)細(xì)胞、猴腎細(xì)胞(COS)、人肝細(xì)胞癌細(xì)胞(例如，HepG2)、人上皮腎293細(xì)胞、以及多種其他細(xì)胞系。不同的宿主細(xì)胞具有針對(duì)蛋白質(zhì)和基因產(chǎn)物的翻譯后加工和修飾的特有的和特異性的機(jī)制?？梢赃x擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞系或宿主系統(tǒng)以確保所表達(dá)的抗體或其部分的正確修飾和加工。為此，可以使用具有用于初級(jí)轉(zhuǎn)錄物的適當(dāng)加工、基因產(chǎn)物的糖基化、以及磷酸化的細(xì)胞機(jī)器(cellular machinery)的真核宿主細(xì)胞。此類哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞包括但不限于CH0、VERY、BHK、Hela、C0S、MDCK、293、3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT20和T47D、NSO (不內(nèi)源性地產(chǎn)生任何功能性免疫球蛋白鏈的鼠骨髓瘤細(xì)胞系)、SP20、CRL7030以及HsS78Bst細(xì)胞。在某些實(shí)施例中，通過(guò)使人淋巴細(xì)胞永生化而產(chǎn)生的人細(xì)胞系可以用來(lái)重組產(chǎn)生單克隆抗體。在一些實(shí)施例中，可以使用人細(xì)胞系PER.C6.(Crucell，荷蘭)以重組方式產(chǎn)生單克隆抗體。
[0249]可以用作表達(dá)重組抗體的宿主的另外的細(xì)胞系包括但不限于昆蟲(chóng)細(xì)胞(例如Sf21/Sf9，粉紋夜蛾Bt1-Tn5bl-4)或酵母細(xì)胞(例如啤酒酵母(S.cerevisiae)，畢赤酵母屬，US7326681 ;等等)、植物細(xì)胞(US20080066200);以及雞細(xì)胞。
[0250]在某些實(shí)施例中，在此呈 現(xiàn)的抗體被表達(dá)在具有抗體穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系中。穩(wěn)定表達(dá)可以用于重組蛋白的長(zhǎng)期、高產(chǎn)量生產(chǎn)。例如，可以產(chǎn)生穩(wěn)定表達(dá)抗體分子的細(xì)胞系?？梢杂眠m當(dāng)?shù)陌磉_(dá)控制元件(例如，啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄終止子、聚腺苷酸化位點(diǎn)，等等)和選擇標(biāo)記基因的工程化載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。在引入外源DNA后，可以允許細(xì)胞在富集培養(yǎng)基中生長(zhǎng)1-2天，并且然后切換至選擇性培養(yǎng)基。在重組質(zhì)粒中的選擇性標(biāo)記賦予對(duì)選擇的抗性，并且允許將質(zhì)粒穩(wěn)定整合進(jìn)其染色體中的細(xì)胞生長(zhǎng)并且形成病灶，進(jìn)而可以將其克隆并且擴(kuò)充成細(xì)胞系。用于以高產(chǎn)量產(chǎn)生穩(wěn)定細(xì)胞系的方法在本領(lǐng)域是已知的，并且試劑通常是可商購(gòu)的。
[0251]在某些實(shí)施例中，在此呈現(xiàn)的抗體被表達(dá)于具有抗體的瞬時(shí)表達(dá)的細(xì)胞系中。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染是這樣一種方法:在該方法中將核酸引入一種細(xì)胞但不整合入那種細(xì)胞的基因組或染色體DNA中。核酸常常被維持為細(xì)胞中的染色體外因子,例如,作為附加體。附加體的核酸的轉(zhuǎn)錄過(guò)程不受影響，并且由附加體的核酸編碼的蛋白質(zhì)被產(chǎn)生。
[0252]可以被穩(wěn)定或瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系被維持在導(dǎo)致單克隆抗體表達(dá)和產(chǎn)生的、本領(lǐng)域已知的細(xì)胞培養(yǎng)基和條件中。在某些實(shí)施例中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基是基于可商購(gòu)的培養(yǎng)基配方，包括例如DMEM或漢姆氏(Ham’s) F12。在一些實(shí)施例中，將細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行改變以支持細(xì)胞生長(zhǎng)和生物蛋白表達(dá)兩者的增長(zhǎng)。如在此使用的術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞培養(yǎng)基”、“培養(yǎng)基”、以及“培養(yǎng)基配方”是指在多細(xì)胞生物或組織以外的人工體外環(huán)境中用于細(xì)胞的維持、生長(zhǎng)、繁殖、或擴(kuò)充的營(yíng)養(yǎng)液?？梢詫⒓?xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化以用于特定的細(xì)胞培養(yǎng)用途，包括例如，被配制為促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)物生長(zhǎng)培養(yǎng)基，或者被配制為促進(jìn)重組蛋白產(chǎn)生的細(xì)胞培養(yǎng)物生產(chǎn)培養(yǎng)基。術(shù)語(yǔ)營(yíng)養(yǎng)素(nutrient)、成分(ingredient)、以及組分(component)在此可互換地使用，是指組成細(xì)胞培養(yǎng)基的組分(constituent)。
[0253]在不同的實(shí)施例中，使用補(bǔ)料分批法維持細(xì)胞系。如在此使用的“補(bǔ)料分批法”是指在首先用基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)之后，用另外的營(yíng)養(yǎng)素供應(yīng)給補(bǔ)料分批細(xì)胞培養(yǎng)物的方法。例如，補(bǔ)料分批法可以包括根據(jù)所確定的補(bǔ)料時(shí)間表在給定時(shí)期內(nèi)添加補(bǔ)充培養(yǎng)基。因而，“補(bǔ)料分批細(xì)胞培養(yǎng)”是這樣一種細(xì)胞培養(yǎng):最初將細(xì)胞(典型地為哺乳動(dòng)物細(xì)胞)和培養(yǎng)基供應(yīng)至培養(yǎng)容器，并且在培養(yǎng)期間，連續(xù)地或以不連續(xù)遞增方式將另外的培養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)素饋送至培養(yǎng)物，伴隨或不伴隨在培養(yǎng)終止之前的定期的細(xì)胞和/或產(chǎn)物的收獲。
[0254]使用的細(xì)胞培養(yǎng)基以及其中包含的營(yíng)養(yǎng)素在本領(lǐng)域是已知的。在一些實(shí)施例中，細(xì)胞培養(yǎng)基包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基以及產(chǎn)生改良的基礎(chǔ)培養(yǎng)基的至少一種水解產(chǎn)物，例如基于大豆的水解產(chǎn)物、基于酵母的水解產(chǎn)物、或這兩種類型的水解產(chǎn)物的組合。另外的營(yíng)養(yǎng)素可以有時(shí)候僅包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基，例如濃縮的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，或者可以僅包含水解產(chǎn)物、或濃縮的水解產(chǎn)物。適合的基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括但不限于達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco's Modified Eagle’s Medium, DMEM)、DME/F12、極限必需培養(yǎng)基(MEM)、伊格爾基礎(chǔ)培養(yǎng)基(BME)、RPMI1640, F_10、F-12、α -極限必需培養(yǎng)基(α-MEM)、格拉斯哥極限必需培養(yǎng)基(G-MEM)、PF CHO (參見(jiàn)，例如，用于無(wú)蛋白質(zhì)的CHO細(xì)胞(SAFC生物科學(xué)公司)的CHO無(wú)蛋白質(zhì)培養(yǎng)基(西格瑪)或EX-CELL?325PF CHO無(wú)血清培養(yǎng)基)、以及伊斯科夫改良達(dá)爾伯克培養(yǎng)基(Iscove’s Modified Dulbecco's Medium)?？梢杂糜谠诖说募夹g(shù)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基的其他實(shí)例包括BME基礎(chǔ)培養(yǎng)基；達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM，粉末)(Gibco-1nvitrogen#31600)o在某些實(shí)施例中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基可以是無(wú)血清的，意味著該培養(yǎng)基包括不含血清(例如，胎牛血清(FBS)、馬 血清、山羊血清、或本領(lǐng)域已知的任何其他動(dòng)物衍生的血清)或沒(méi)有動(dòng)物蛋白的培養(yǎng)基或化學(xué)限定培養(yǎng)基。
[0255]可以改良基礎(chǔ)培養(yǎng)基以便去除某些在標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)的非營(yíng)養(yǎng)組分，例如不同的無(wú)機(jī)和有機(jī)緩沖液、一種或多種表面活性劑、以及氯化鈉。此類組分從基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基的去除允許剩余營(yíng)養(yǎng)組分的增加的濃度，并且可以改進(jìn)總體的細(xì)胞生長(zhǎng)和蛋白質(zhì)表達(dá)。另外，可以根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)條件的要求，將省去的組分添加回到包含改良的基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)基中。在某些實(shí)施例中，細(xì)胞培養(yǎng)基包含改良的基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基以及至少一種以下?tīng)I(yíng)養(yǎng)素:鐵源、重組生長(zhǎng)因子；緩沖液；表面活性劑；滲透性調(diào)節(jié)劑；能源；以及非動(dòng)物水解產(chǎn)物。另外，改良的細(xì)胞培養(yǎng)基可以任選地包含氨基酸、維生素、或氨基酸和維生素兩者的組合。在一些培養(yǎng)基中，改良的基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)一步包含谷氨酰胺，例如L-谷氨酰胺和/或氨甲蝶呤。
[0256]在一些實(shí)施例中，通過(guò)使用本領(lǐng)域已知的補(bǔ)料分批、分批、灌注的生物反應(yīng)器工藝或連續(xù)進(jìn)料生物反應(yīng)器方法而大量地進(jìn)行抗體產(chǎn)生。大規(guī)模生物反應(yīng)器具有至少1000升的容量，有時(shí)大約1，000至100，000升的容量。這些生物反應(yīng)器可以使用葉輪攪拌器來(lái)分布氧和營(yíng)養(yǎng)素。小規(guī)模生物反應(yīng)器通常是指在不大于大致100升的體積容量中的細(xì)胞培養(yǎng)，并且范圍可以是從大約I升至大約100升?？商娲?，一次性生物反應(yīng)器(SUB)可以用于大規(guī)?；蛐∫?guī)模培養(yǎng)。
[0257]溫度、pH、攪拌、通氣以及接種密度可以取決于所使用的宿主細(xì)胞以及有待表達(dá)的重組蛋白而不同。例如，重組蛋白細(xì)胞培養(yǎng)可被維持在30°C與45°C之間的溫度。可以在培養(yǎng)過(guò)程期間監(jiān)測(cè)培養(yǎng)基的PH，以使得pH停留在最佳水平，對(duì)于某些宿主細(xì)胞該最佳水平可以是在6.0至8.0的pH范圍內(nèi)。葉輪驅(qū)使的混合可以用于攪拌的此類培養(yǎng)方法。葉輪的轉(zhuǎn)速可以大致是50至200cm/秒葉尖速度，但可以取決于正被培養(yǎng)的宿主細(xì)胞的類型而使用本領(lǐng)域已知的其他氣升或其他混合/曝氣系統(tǒng)。提供充足的曝氣從而在培養(yǎng)物維持中大致20%至80%的空氣飽和度的溶解氧濃度，這個(gè)溶解氧濃度再次取決于正被培養(yǎng)的所選擇的宿主細(xì)胞。可替代地，生物反應(yīng)器可以直接將空氣或氧氣噴射到培養(yǎng)基中。存在供氧的其他方法，包括使用中空纖維膜曝氣器的無(wú)泡曝氣系統(tǒng)。
[0258]噬菌體展示技術(shù)
[0259]在一些實(shí)施例中，可以使用如本領(lǐng)域已知的技術(shù)將單克隆抗體或抗體片段從所產(chǎn)生的抗體噬菌體文庫(kù)分離。在這樣的方法中，抗α毒素抗體或片段可以通過(guò)重組組合抗體文庫(kù)(有時(shí)為scFv噬菌體展示文庫(kù))的篩選而分離，這些文庫(kù)是使用從衍生自人淋巴細(xì)胞的mRNA制備的人VL和VH cDNA制備的。用于制備和篩選此類文庫(kù)的方法學(xué)在本領(lǐng)域是已知的。
[0260]抗體純化和分離
[0261]一旦抗體分子已經(jīng)通過(guò)重組或雜交瘤表達(dá)而產(chǎn)生，可以通過(guò)本領(lǐng)域任何已知的用于免疫球蛋白分子純化的方法將其純化，例如，通過(guò)色譜法(例如，離子交換，特別是通過(guò)對(duì)于特定抗原蛋白A或蛋白G的親和力的親和色譜，以及尺寸柱色譜(sizing columnchromatography))、離心、差別溶解 度,或者通過(guò)用于蛋白質(zhì)純化的任何其他標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。此夕卜，本技術(shù)的抗體或其片段可以融合至以上所述的或者本領(lǐng)域另外已知的異源多肽序列(在此稱為“標(biāo)簽”)，以便促進(jìn)純化。
[0262]人源化抗體
[0263]在某些實(shí)施例中，本技術(shù)的抗體是人源化抗體，是使用本領(lǐng)域已知的方法產(chǎn)生的。人源化抗體可以是嵌合抗體。嵌合抗體是這樣的抗體:其中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種的或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而這些鏈的另一部分與衍生自另一物種的或?qū)儆诹硪粋€(gè)抗體類別或亞類的抗體、以及這樣的抗體的片段中的相應(yīng)序列相同或同源，只要它們展現(xiàn)出所希望的生物活性即可。在此感興趣的嵌合抗體包括“靈長(zhǎng)類化”(“primatized”)抗體，這種“靈長(zhǎng)類化”抗體包含從非人靈長(zhǎng)類(例如，舊世界猴，如狒狒、恒河猴或食蟹猴)衍生的可變域抗原結(jié)合序列和人恒定區(qū)序列。
[0264]人抗體
[0265]作為對(duì)人源化的替代方案，可以使用本領(lǐng)域已知的方法來(lái)產(chǎn)生人抗體。人抗體避免了一些與具有小鼠或大鼠可變區(qū)和/或恒定區(qū)的抗體相關(guān)的問(wèn)題。這種小鼠或大鼠衍生的蛋白質(zhì)的存在可以導(dǎo)致抗體的快速清除或可以導(dǎo)致患者產(chǎn)生針對(duì)該抗體的免疫應(yīng)答。為了避免小鼠或大鼠衍生的抗體的使用，可以通過(guò)將功能性人抗體基因座引入嚙齒類動(dòng)物、其他哺乳動(dòng)物或動(dòng)物而產(chǎn)生全人抗體，使得該嚙齒類動(dòng)物、其他哺乳動(dòng)物或動(dòng)物產(chǎn)生全人抗體。[0266]例如，現(xiàn)在可能的是生產(chǎn)能在免疫后在不存在內(nèi)源性免疫球蛋白產(chǎn)生的情況下產(chǎn)生全套人抗體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如，小鼠)。例如，已經(jīng)描述了在嵌合和種系突變小鼠中的抗體重鏈連接區(qū)(JH)基因的純合性缺失導(dǎo)致內(nèi)源性抗體產(chǎn)生的完全抑制。將人種系免疫球蛋白基因陣列轉(zhuǎn)移至這種種系突變小鼠中將導(dǎo)致抗原激發(fā)后人抗體的產(chǎn)生。在實(shí)踐中，使用已經(jīng)被工程化為含有高達(dá)但小于IOOOkb大小的種系的小鼠XenoMouse?品系,配置人重鏈基因座和K輕鏈基因座的片段。XenoMouse?品系可從Amgen公司商購(gòu)(弗里蒙特,加利福尼亞州)。
[0267]小鼠XenoMouse?品系的產(chǎn)生以及在那些小鼠中產(chǎn)生的抗體在本領(lǐng)域是已知的。基本上，用感興趣的抗原(例如，α毒素)免疫小鼠XenoMouse?品系,從超免疫小鼠回收淋巴細(xì)胞(如B細(xì)胞)，并且將回收的淋巴細(xì)胞與髓系細(xì)胞系(myeloid-type cell line)融合，從而使用本領(lǐng)域已知的以上所述的技術(shù)制備永生雜交瘤細(xì)胞系。將這些雜交瘤細(xì)胞系進(jìn)行篩選并且選擇以便鑒定產(chǎn)生對(duì)感興趣的抗原具有特異性的抗體的雜交瘤細(xì)胞系。
[0268]在可替代的途徑即微基因座(minilocus)途徑中，通過(guò)包含來(lái)自Ig基因座的碎片(單獨(dú)的基因)模擬外源Ig基因座。因此，一種或多種VH基因、一種或多種DH基因、一種或多種JH基因、mu恒定區(qū)、以及通常一個(gè)第二恒定區(qū)(例如，Y恒定區(qū))形成用于插入動(dòng)物中的構(gòu)建體。
[0269]來(lái)自小鼠的人抗體的產(chǎn)生是本領(lǐng)域已知的，在這些小鼠中通過(guò)微細(xì)胞融合，已經(jīng)導(dǎo)入大片的染色體、或整個(gè)染色體。另外，已經(jīng)產(chǎn)生KM?-小鼠，這些小鼠是Kirin’s Tc小鼠與Medarex’ s微基因座(Humab)小鼠雜交育種的結(jié)果。這些小鼠具有Kirin小鼠的人IgH轉(zhuǎn)染色體(transchromosome)以及Genpharm小鼠的κ鏈轉(zhuǎn)基因。
[0270]還可以通過(guò)體外方法衍生人抗體。適合的實(shí)例包括但不限于噬菌體展示(醫(yī)學(xué)免疫公司(MedImmune,以前為CAT)、莫弗西斯生物公司(Morphosys)、Dyax> Biosite/Medarex、Xoma> Symphogen、亞力兄公司(Alexion,以前為 Proliferon)、Affimed)、核糖體展示(Medlmmune (以前為CAT))、酵母 展示、等等?？梢允褂檬删w展示技術(shù)從來(lái)自未免疫供體的免疫球蛋白可變(V)結(jié)構(gòu)域基因譜系體外產(chǎn)生人抗體和抗體片段。根據(jù)這項(xiàng)技術(shù)，抗體V結(jié)構(gòu)域基因是以框內(nèi)方式克隆到絲狀噬菌體(例如M13或fd)的主要或次要外殼蛋白基因中，并且在噬菌體顆粒的表面上展示為功能性抗體片段。因?yàn)榻z狀顆粒含有噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，基于抗體的功能特性的選擇還導(dǎo)致編碼展現(xiàn)那些特性的抗體的基因的選擇。因而，噬菌體模擬B細(xì)胞的一些特性。能以多種型式進(jìn)行噬菌體展示。若干V基因區(qū)段來(lái)源可以用于噬菌體展示。已經(jīng)從衍生自免疫小鼠的脾臟的V基因的小隨機(jī)組合文庫(kù)分離抗惡唑酮抗體的不同陣列。可以構(gòu)建來(lái)自未免疫人供體的V基因譜，并且可以遵循本領(lǐng)域已知的技術(shù)而基本上分離針對(duì)抗原(包括自身抗原)的不同陣列的抗體。如上所討論，還可以由體外活化的B細(xì)胞產(chǎn)生人抗體。
[0271 ] 在免疫應(yīng)答的成熟過(guò)程中，免疫球蛋白基因經(jīng)歷不同的修飾，包括在V、D和J基因區(qū)段之間的重組、同種型轉(zhuǎn)換、以及可變區(qū)中的超突變。重組和體細(xì)胞超突變是產(chǎn)生抗體多樣性和親和力成熟的基礎(chǔ)，但是它們還可以產(chǎn)生序列文庫(kù)，這些序列文庫(kù)可以使作為治療劑的這種免疫球蛋白的商業(yè)生產(chǎn)有困難或者增加抗體的免疫原性風(fēng)險(xiǎn)。通常，雖然在框架區(qū)中的突變可以增加免疫原性的風(fēng)險(xiǎn)，CDR區(qū)中的突變可能促成改進(jìn)的親和力和功能。這種風(fēng)險(xiǎn)可以通過(guò)將框架突變回復(fù)為種系而降低，同時(shí)確保抗體的活性未受不利影響。多樣化過(guò)程還可以產(chǎn)生一些結(jié)構(gòu)文庫(kù)，或這些結(jié)構(gòu)文庫(kù)可以存在于促成重鏈和輕鏈可變域的種系序列中。不論來(lái)源，可能希望的是將潛在的結(jié)構(gòu)文庫(kù)去除，這些結(jié)構(gòu)文庫(kù)可以導(dǎo)致產(chǎn)物的不穩(wěn)定性、聚集、異質(zhì)性、或者增加的免疫原性。不希望的文庫(kù)的實(shí)例包括不成對(duì)的半胱氨酸(可以導(dǎo)致二硫鍵混亂或可變的巰基加合物形成)、N-連接糖基化位點(diǎn)(導(dǎo)致結(jié)構(gòu)和活性的異質(zhì)性)、以及脫酰胺作用(例如NG、NS)、異構(gòu)化(DG)、氧化(暴露的甲硫氨酸)、以及水解(DP)位點(diǎn)。
[0272]因此，為了降低免疫原性的風(fēng)險(xiǎn)并且改進(jìn)在實(shí)例11、表1-8中披露的抗體的藥學(xué)特性，可能希望的是將框架序列回復(fù)為種系、將CDR回復(fù)為種系、和/或去除結(jié)構(gòu)傾向(structural liability)。因此,在一些實(shí)施例中,在特定的抗體在氨基酸水平上不同于其對(duì)應(yīng)的種系序列的情況下，可以將抗體序列突變回種系序列。通過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)，這種糾正突變可以在一個(gè)、二個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)位置、或任何突變位置的組合處發(fā)生。
[0273]另外的途徑包括VelocImmunel<技術(shù)(再生兀制藥公司(Regeneron
Pharmaceuticals))。Velocimmune?技術(shù)可以用來(lái)產(chǎn)生針對(duì)治療感興趣的祀標(biāo)的全人單
克隆抗體，并且涉及一種轉(zhuǎn)基因小 鼠的產(chǎn)生，該轉(zhuǎn)基因小鼠具有可操作地連接至內(nèi)源性小鼠恒定區(qū)基因座的、包含人重鏈和輕鏈可變區(qū)的基因組，使得小鼠響應(yīng)于抗原性刺激而產(chǎn)生包含人可變區(qū)和小鼠恒定區(qū)的抗體。編碼抗體重鏈和輕鏈的可變區(qū)的DNA被分離并且可操作地連接至編碼人重鏈和輕鏈恒定區(qū)的DNA。然后在能夠表達(dá)全人抗體的細(xì)胞中得以表達(dá)該DNA。參加，例如，美國(guó)專利號(hào)6，596，541。
[0274]抗體片段
[0275]在某些實(shí)施例中，本發(fā)明抗體是抗體片段或包含這些片段的抗體?？贵w片段包括全長(zhǎng)抗體的一部分，通常是其抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)。抗體片段的實(shí)例包括Fab、Fab’、F (ab’)2、Fd和Fv片段。雙抗體；線性抗體，單鏈抗體分子；以及多特異性抗體是從這些抗體片段形成的抗體。
[0276]在傳統(tǒng)上，這些片段是使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)、經(jīng)由完整抗體的蛋白水解消化而衍生的。然而，現(xiàn)在可以通過(guò)重組宿主細(xì)胞直接產(chǎn)生這些片段。所有Fab、Fv和scFv抗體片段都可以表達(dá)在大腸桿菌中并且從其分泌，因而允許大量這些片段的容易生產(chǎn)。在一些實(shí)施例中，可以從以上討論的抗體噬菌體文庫(kù)分離抗體片段?？商娲?，還可以將Fab’ -SH片段直接從大腸桿菌回收，并且將其化學(xué)連接以形成F(ab’)2片段。根據(jù)另一個(gè)途徑，可以直接從重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物分離F (ab’)2片段。其他用于產(chǎn)生抗體片段的技術(shù)是已知的。在一些實(shí)施例中，選擇的抗體是單鏈Fv片段(scFv)。在某些實(shí)施方案中，抗體不是Fab片段。Fv和scFv是具有缺乏恒定區(qū)的完整結(jié)合位點(diǎn)的唯一種類；因而，它們適用于在體內(nèi)使用過(guò)程中減少非特異性結(jié)合?？梢詫cFv融合蛋白構(gòu)建為在scFv的氨基端或羧基端產(chǎn)生效應(yīng)蛋白融合。
[0277]在某些實(shí)施例中，本發(fā)明的抗體是域抗體,例如相應(yīng)于人抗體的重鏈可變區(qū)(VH)或輕鏈可變區(qū)(VL)的、包含抗體的小功能性結(jié)合單位的抗體。域抗體的實(shí)例包括但不限于從Domantis可獲得的、對(duì)治療靶標(biāo)有特異性的那些域抗體?？梢允褂糜蚩贵w的可商購(gòu)文庫(kù)來(lái)鑒定抗α毒素抗體域抗體。在某 些實(shí)施例中，抗α毒素抗體和片段包含α毒素功能性結(jié)合單位以及Fe Y受體功能性結(jié)合單位。
[0278]在此的某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體是線性抗體。線性抗體包括一對(duì)串聯(lián)的Fd區(qū)段(VH-CH1-VH-CH1)，該Fd區(qū)段形成一對(duì)抗原結(jié)合區(qū)。線性抗體可以是雙特異性的或單特異性的。
[0279]某些氨基酸序列修飾
[0280]除了以上所述的人、人源化和/或嵌合抗體之外，本技術(shù)還包括包含一種或多種以下項(xiàng)的抗α毒素抗體或片段的另外的修飾以及它們的變體和其片段:在可變輕鏈(VL)結(jié)構(gòu)域和/或可變重鏈(VH)結(jié)構(gòu)域和/或Fe區(qū)中的氨基酸殘基和/或多肽置換、添加和/或缺失，以及翻譯后修飾。包括在這些修飾中的是其中抗體已經(jīng)共價(jià)連接至一個(gè)部分的抗體結(jié)合物。適用于連接至抗體的部分包括但不限于蛋白質(zhì)、肽、藥物、標(biāo)記物、以及細(xì)胞毒素?？梢宰鞒鲠槍?duì)抗體的這些改變從而改變或微調(diào)抗體的特征(例如，生物化學(xué)的、結(jié)合和/或功能性的)，適用于治療和/或診斷金黃色葡萄球菌相關(guān)的和/或α毒素介導(dǎo)的疾病。用于形成結(jié)合物、作出氨基酸和/或多肽改變以及翻譯后修飾的方法在本領(lǐng)域是已知的，其中一些在下文詳述?？梢宰鞒鋈笔?、插入、以及置換的任何組合以獲得最終的構(gòu)建體，其條件是最終的構(gòu)建體具有所希望的特征。
[0281]針對(duì)抗體的氨基酸變化導(dǎo)致產(chǎn)生與在此所述的抗體序列或親本抗體序列小于100%—致的序列。在某些實(shí)施例中，在這種情況下，抗體可以具有與如在此所述的抗α毒素抗體的重鏈或輕鏈可變域或片段的氨基酸序列大約25%至大約95%的序列一致性。因而，在一些實(shí)施例中，修飾的抗體可以具有這樣一種氨基酸序列:該氨基酸序列具有與如在此所述的抗α毒素抗體的重鏈或輕鏈可變域或片段的氨基酸序列至少25%、35%、45%、55%、65%、75%、80%、85%、90%、或95%的氨基酸序列一致性或相似性。在某些實(shí)施例中，改變的抗體具有這樣一種氨基酸序列:該氨基酸序列具有與如在此所述的抗α毒素抗體的重鏈或輕鏈 CDR1、CDR2、或 CDR3 或 片段的氨基酸序列至少 25%、35%、45%、55%、65%、75%、80%、85%、90%、或95%的氨基酸序列一致性或相似性。改變的抗體可以有時(shí)具有這樣一種氨基酸序列:該氨基酸序列具有與如在此所述的抗α毒素抗體的重鏈或輕鏈FR1、FR2、FR3或FR4或片段的氨基酸序列至少25%、35%、45%、55%、65%、75%、80%、85%、90%、或95%的氨基酸序列一致性或相似性。
[0282]在某些實(shí)施例中，通過(guò)弓I入抗體的一個(gè)或多個(gè)可變區(qū)中的一種或多種氨基酸改變(例如，置換、缺失和/或添加)而產(chǎn)生改變的抗體。在不同實(shí)施例中，氨基酸改變被引入框架區(qū)?？蚣軈^(qū)殘基的一種或多種改變可以導(dǎo)致對(duì)于抗原的抗體的結(jié)合親和力的改進(jìn)。當(dāng)這些變化是針對(duì)人源化抗體(不同于CDR區(qū)，框架區(qū)可以來(lái)自不同的物種)做出時(shí)，尤其如此。要修飾的框架區(qū)殘基的實(shí)例包括非共價(jià)直接結(jié)合抗原、與CDR的構(gòu)象相互作用/影響CDR構(gòu)象、和/或參與VL-VH界面的那些殘基。在一些實(shí)施例中，可以改變從大約一個(gè)至大約五個(gè)框架殘基。有時(shí)，甚至在沒(méi)有任何高變區(qū)殘基已被改變時(shí)，這可能足以產(chǎn)生適合于在臨床前試驗(yàn)中使用的抗體突變體。然而，通常改變的抗體將包含另外的一種或多種高變區(qū)改變。在某些實(shí)施例中，可以隨機(jī)改變高變區(qū)殘基，尤其是在針對(duì)來(lái)自第二哺乳動(dòng)物種類的抗原的抗α毒素抗體或片段的起始結(jié)合親和力是使得如此隨機(jī)產(chǎn)生的抗體可以容易地被篩選的情況下。
[0283]一個(gè)有用的用于產(chǎn)生改變的抗體的程序稱為“丙氨酸掃描誘變”。在這種方法中，一個(gè)或多個(gè)高變區(qū)殘基被丙氨酸或聚丙氨酸殘基替換，從而改變氨基酸與α毒素的相互作用。然后，對(duì)于置換顯示功能敏感度的那些高變區(qū)殘基通過(guò)在(或針對(duì))置換位點(diǎn)引入另外的或其他突變而被改善(refined)。因此，盡管用于引入氨基酸序列變異的位點(diǎn)被預(yù)先確定，本身突變的本性不需要預(yù)先確定。如在此所述，針對(duì)以此方式產(chǎn)生的Ala突變體的生物活性來(lái)篩選它們。
[0284]在某些實(shí)施例中，置換變體涉及置換親本抗體(例如，人源化或人抗體)的一個(gè)或多個(gè)高變區(qū)殘基。通常，所得的被選擇用于進(jìn)一步開(kāi)發(fā)的一種或多種變體相對(duì)于它們從其產(chǎn)生的親本抗體而言將具有改進(jìn)的生物特性。用于產(chǎn)生此類置換變體的方便的方式涉及使用噬菌體的親和力成熟。簡(jiǎn)言之，若干高變區(qū)位點(diǎn)(6-7個(gè)位點(diǎn))被突變以在每個(gè)位點(diǎn)產(chǎn)生所有可能的氨基酸置換。因而產(chǎn)生的抗體突變體被展示為來(lái)自絲狀噬菌體顆粒的、作為與包裝在每個(gè)顆粒中的M13的基因III產(chǎn)物融合的單價(jià)形式。然后，如在此披露，針對(duì)噬菌體展示突變體的生物活性(例如，結(jié)合親和力)來(lái)篩選它們。
[0285]在抗體序列中的突變可以包括置換、缺失(包括內(nèi)部缺失)、添加(包括產(chǎn)生融合蛋白的添加)、或在氨基酸序列之內(nèi)和/或鄰近處的氨基酸殘基的保守性置換，但是那導(dǎo)致“沉默”改變，導(dǎo)致這種改變產(chǎn)生功能相當(dāng)?shù)目功炼舅乜贵w或片段?？梢栽谏婕皻埢臉O性、電荷、溶解度、疏水性、親水性、和/或兩親性的相似性的基礎(chǔ)上做出保守性氨基酸置換。例如，非極性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、以及甲硫氨酸；極性中性氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、以及谷氨酰胺；帶正電荷的(堿性)氨基酸包括精氨酸、賴氨酸、以及組氨酸；以及帶負(fù)電荷的(酸性)氨基酸，包括天冬氨酸和谷氨酸。另外，甘氨酸和脯氨酸是能影響鏈取向的殘基。非保守性置換將使得必需將這些類別之一的成員與另一類別中的成員交換。此外，如果希望的話，非典型氨基酸或化學(xué)氨基酸類似物可以作為置換或添加而被引入抗體序列中。非典型氨基酸大體上包括但不限于普通氨基酸的D-異構(gòu)體、α -氨基異丁酸、4-氨基丁酸、Abu、2-氨基丁酸、Y-Abu、 e-Ahx、6-氨基己酸、Aib、2-氨基異丁酸、3-氨基丙酸、鳥(niǎo)氨酸、正亮氨酸、正纈氨酸、羥脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、磺基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、環(huán)己基丙氨酸、β -丙氨酸、氟代氨基酸、設(shè)計(jì)者(designer)氨基酸(例如β_甲基氨基酸、C-α -甲基氨基酸、N-α -甲基氨基酸、以及氨基酸類似物。
[0286]在某些實(shí)施例中，不涉及維持抗α毒素抗體或片段的適當(dāng)構(gòu)象的任何半胱氨酸殘基還可以被(通常用絲氨酸)置換以改進(jìn)分子的氧化穩(wěn)定性并且預(yù)防異常交聯(lián)。相反，可以將半胱氨酸鍵添加至抗體以改進(jìn)它的穩(wěn)定性(特別是在抗體是諸如Fv片段的抗體片段的情況下)。
[0287]在一些實(shí)施例中，可以將抗體修飾為產(chǎn)生融合蛋白，即融合至異源蛋白質(zhì)、多肽或肽的抗體或其片段。在不同實(shí)施例中，融合至抗體部分的蛋白質(zhì)是抗體導(dǎo)向酶-前體藥物療法(ADEPT)的酶組分。能被工程化為與抗體的融合蛋白的其他蛋白質(zhì)或多肽的實(shí)例包括但不限于毒素(例如蓖麻毒素、相思豆毒素、核糖核酸酶、DNA酶1、葡萄球菌腸毒素-A、美洲商陸抗病毒蛋白、白樹(shù)毒素、白喉毒素、假單胞菌外毒素、以及假單胞菌內(nèi)毒素)。可以使用的酶活性毒素和其片段包括白喉A鏈、白喉毒素的非結(jié)合活性片段、外毒素A鏈(來(lái)自銅綠假單胞菌)、蓖麻毒素A鏈、相思豆毒素A鏈、蒴蓮根毒素A鏈、α -帚曲菌素、油桐蛋白、石竹素蛋白、美洲商陸蛋白(PAP1、PAPIIjP PAP-S)、苦瓜抑制劑、麻風(fēng)樹(shù)毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草抑制劑、白樹(shù)毒素、mitogellin、局限曲菌素、酚霉素、伊諾霉素、以及單端孢霉烯
類。
[0288]可以通過(guò)已知的基因改組(gene-shuf fling)、基序改組(mo ti f-shuf f I ing )、夕卜顯子改組、和/或密碼子改組(統(tǒng)稱為“DNA改組”)技術(shù)產(chǎn)生另外的融合蛋白?？梢圆捎肈NA改組以改變抗體或其片段的特征(例如，具有較高親和力以及較低的解離速率的抗體或其片段)?？贵w可以進(jìn)一步是如本領(lǐng)域已知的結(jié)合結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白融合蛋白。
[0289]變體Fe區(qū)
[0290]本發(fā)明還包括本發(fā)明的結(jié)合成員，以及尤其是具有修飾的IgG恒定域的本發(fā)明的抗體。具有多種功能特征(如在血清中的長(zhǎng)半衰期和介導(dǎo)不同的效應(yīng)子功能的能力)的人IgG類別的抗體被使用于本發(fā)明的某些實(shí)施例中(單克隆抗體:原理與應(yīng)用(MonoclonalAntibodies !Principles and Applications),威利-利斯公司(Wiley-Liss, Inc.),第 I 章
(1995))。人IgG類抗體被進(jìn)一步分成以下4個(gè)亞類:IgGl、IgG2、IgG3以及IgG4。迄今為止，已經(jīng)針對(duì)作為IgG類抗體的效應(yīng)子功能的ADCC和CDC進(jìn)行了大量的研究，并且據(jù)報(bào)道，在人IgG類的抗體中，IgGl亞類在人體內(nèi)具有最高的ADCC活性和CDC活性(化學(xué)免疫學(xué)(Chemical Immunology),65, 88 (1997))。
[0291]“抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用”和“ADCC”是指這樣一種細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng):其中非特異性細(xì)胞毒性細(xì)胞(例如，自然殺傷細(xì)胞(NK)細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、以及巨噬細(xì)胞)識(shí)別靶細(xì)胞上的結(jié)合抗體并且隨后導(dǎo)致該靶細(xì)胞溶解。在一個(gè)實(shí)施例中，這樣的細(xì)胞是人細(xì)胞。雖然不希望被限制于任何具體的作用機(jī)制，但這些介導(dǎo)ADCC的細(xì)胞毒性細(xì)胞通常表達(dá)Fe受體(FcR)。用于介導(dǎo)ADCC的初級(jí)細(xì)胞(NK細(xì)胞)表達(dá)Fe y RIII，而單核細(xì)胞表達(dá)Fe Y R1、Fc Y RH,Fe y RI II和/或Fe Y RIV0造血細(xì)胞上的FcR表達(dá)概述在Ravetch(拉文奇)和 Kinet (基內(nèi)特)，Annu.Rev.1mmunol.(免疫學(xué)年度評(píng)論)，9:457-92 (1991)中。為了評(píng)定分子的ADCC活性，可以進(jìn)行例如描述于美國(guó)專利號(hào)5，500, 362或5，821，337中的體外ADCC測(cè)定。用于這類測(cè)定的有用的效應(yīng)細(xì)胞包括外周血單核細(xì)胞(PBMC)和自然殺傷(NK)細(xì)胞?？商娲鼗蛄硗獾兀信d趣的分子的ADCC活性可以在體內(nèi)，例如在如Clynes (克萊因斯)等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.(國(guó)家科學(xué)院院刊(美國(guó)))，95:652_656 (1998)中披露的動(dòng)物模型中進(jìn)行評(píng)定。
[0292]“補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒作用”或“CDC”是指在補(bǔ)體的存在下分子啟動(dòng)補(bǔ)體活化和溶解靶標(biāo)的能力。通過(guò)補(bǔ)體系統(tǒng)的第一成分(Clq)結(jié)合至與同源抗原復(fù)合的分子(例如，抗體)而啟動(dòng)補(bǔ)體活化途徑。為了評(píng)定補(bǔ)體活化，可以進(jìn)行如在Gazzano-Santaro等人,J.1mmunol.Methods (《免疫學(xué)方法雜志》),202:163 (1996)中描述的CDC測(cè)定。
[0293]人IgGl亞類抗體的ADCC活性和⑶C活性的表達(dá)通常涉及抗體的Fe區(qū)結(jié)合至存在于效應(yīng)細(xì)胞(例如殺傷細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞或活化的巨噬細(xì)胞)表面上的針對(duì)抗體的受體(下文稱為“Fe YR”)。不同的補(bǔ)體成分可以被結(jié)合。關(guān)于結(jié)合，已經(jīng)提出在鉸鏈區(qū)中的若干氨基酸殘基以及抗體C區(qū)的第二結(jié)構(gòu)域(下文稱為“C Y 2結(jié)構(gòu)域”)是重要的(Eur.J.1mmunol.(《歐洲免疫學(xué)雜志》)，23，1098 (1993)，Immunology (《免疫學(xué)》)，86，319 (1995)，Chemical Immunology (《化學(xué)免疫學(xué)》)，65，88 (1997))，并且在C Y 2結(jié)構(gòu)域中的糖鏈(Chemical Immunology (《化學(xué)免疫學(xué)》)，65，88 (1997))也是重要的。
[0294]“效應(yīng)細(xì)胞”是表達(dá)一種或多種FcR并且執(zhí)行效應(yīng)子功能的白細(xì)胞。這些細(xì)胞至少表達(dá)FcyR1、FC Y Rn、Fe Y RIII和/或Fe Y RIV，并且執(zhí)行ADCC效應(yīng)子功能。介導(dǎo)ADCC的人白細(xì)胞的實(shí)例包括外周血單核細(xì)胞(PBMC)、自然殺傷(NK)細(xì)胞、單核細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞。
[0295]術(shù)語(yǔ)“Fe受體”或“FcR”用來(lái)描述結(jié)合至抗體Fe區(qū)的受體。在一個(gè)實(shí)施例中，F(xiàn)cR是天然序列人FcR。而且，在某些實(shí)施例中，F(xiàn)cR是結(jié)合IgG抗體的一種FcR( Y受體)，并且包括Fe Y R1、Fe Y RH、Fe Y RII1、和Fe Y RIV亞類的受體，這些受體包括等位基因變體以及這些受體的選擇性剪接形式。Fe Y RII受體包括Fe Y RIIA (一種“活化受體”)和Fe y RIIB(一種“抑制受體”)，兩者具有主要在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域上不同的相似氨基酸序列?；罨荏wFe Y RIIA在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中含有免疫受體酪氨酸活化基序(ITAM)。抑制受體Fe Y RIIB在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中含有免疫受體酪氨酸抑制基序(ITIM)。(參見(jiàn)Dagron，Annu.Rev.1mmunol.(《免疫學(xué)年度評(píng)論》)，15:203-234 (1997))。FcR被綜述于Ravetch (拉文奇)和Kinet (基內(nèi)特)，Annu.Rev.1mmunol.(《免疫學(xué)年度評(píng)論》),9:457-92 (1991) ；Capel (卡博爾)等人，Immunomethods (《免疫方法》),4:25-34 (1994);以及 de Haas (德哈斯)等人,J.Lab.Clin.Med.(《實(shí)驗(yàn)室臨床醫(yī)學(xué)雜志》)，126:330-41 (1995)中。由在此的術(shù)語(yǔ)“FcR”來(lái)涵蓋其他的FcR，包括有待在將來(lái)鑒定的那些FcR。該術(shù)語(yǔ)還包括新生兒受體FcRn，其負(fù)責(zé)將母源IgG轉(zhuǎn)移至胎兒(Guyer (蓋耶)等人，Immunol.(《免疫學(xué)》)，117:587 (1976)以及Kim (金姆)等人，J.1mmunol.(《免疫學(xué)雜志》)，24:249 (1994))。
[0296]在某些實(shí)施例中，抗α毒素抗體或片段包含改變的Fe區(qū)(在此也被稱為“變體Fe區(qū)”)，其中已經(jīng)在Fe區(qū)做出一種或多種改變以便改變抗體的功能特性和/或藥物代謝動(dòng)力學(xué)特性。這樣的改變可以導(dǎo)致Clq結(jié)合以及依賴補(bǔ)體的細(xì)胞毒作用(CDC)、或者對(duì)于IgG的Fe YR結(jié)合的減少或增加。本技術(shù)涵蓋在此所述的具有變體Fe區(qū)的抗體，其中已經(jīng)做出變化以便改變效應(yīng)子功能，從而提供所希望的效應(yīng)。因此，在一些實(shí)施例中，抗α毒素抗體或片段包括變體Fe區(qū)(B卩，如下所討論的已經(jīng)改變的Fe區(qū))。在此的包含變體Fe區(qū)的抗α毒素抗體和片段在這里還被稱為“Fe變體抗體”。如在此使用的，天然的是指未修飾的親本序列，并且包含天然Fe區(qū)的抗體在此被稱為“天然Fe抗體”。在一些實(shí)施例中，如與天然Fe區(qū)相比的，變體Fe區(qū)展現(xiàn)出相 似的誘導(dǎo)效應(yīng)子功能的水平。在某些實(shí)施例中，如與天然Fe相比的，變體Fe區(qū)展現(xiàn)出較高的效應(yīng)子功能的誘導(dǎo)作用。在某些實(shí)施例中，如與天然Fe相比的，變體Fe區(qū)展現(xiàn)出較低的效應(yīng)子功能的誘導(dǎo)作用。在此詳述了變體Fe區(qū)的一些具體實(shí)施例。用于測(cè)量效應(yīng)子功能的方法在本領(lǐng)域是已知的。
[0297]可以通過(guò)Fe區(qū)的變化而改良抗體的效應(yīng)子功能，這些變化包括但不限于氨基酸置換、氨基酸添加、氨基酸缺失以及對(duì)于Fe氨基酸的翻譯后修飾(例如，糖基化)的變化。以下所述的方法可以用來(lái)改變?nèi)缭诖怂龅姆蛛x抗體或抗原結(jié)合片段的效應(yīng)子功能，導(dǎo)致具有某些有利于預(yù)防或治療具體的金黃色葡萄球菌相關(guān)疾病或病癥的特性的抗體或抗原結(jié)合片段。
[0298]在一些實(shí)施例中，制備了相對(duì)于天然Fe抗體的已經(jīng)改變了對(duì)于Fe配體(例如Fe受體，Clq)的結(jié)合特性的Fe變體抗體。結(jié)合特性的實(shí)例包括但不限于結(jié)合特異性、平衡解離常數(shù)(Kd)、解離和締合速率(分別為Iitjff和km)、結(jié)合親和力和/或抗體親合力。在本領(lǐng)域已知的是平衡解離常數(shù)(Kd)被定義為kf/k。#在某些方面，相對(duì)于具有高Kd的抗體，包含具有低Kd的Fe變體區(qū)的抗體可能是更希望的。然而，在一些情況下，與Kd的值相比，koff的值可以更加有意義?？梢源_定的是哪個(gè)動(dòng)力學(xué)參數(shù)對(duì)于給定抗體應(yīng)用是更重要的。
[0299]在一些實(shí)施例中，如與天然Fe抗體相比的，F(xiàn)e變體抗體展現(xiàn)出對(duì)于一種或多種Fe受體的改變的結(jié)合親和力，這些Fe受體包括但不限于FcRn、Fe y RI (⑶64)(包括同種型 Fe Y RIA, Fe Y RIB、和 Fe y RIC) ；Fc y RH (CD32，包括同種型 Fe Y RIIA、Fe Y RIIBjFe Y RIIC)；以及 Fe Y RIII (CD16，包括同種型 Fe y RIIIA 和 Fe y RIIIB)。
[0300]在某些實(shí)施例中，相對(duì)于天然Fe抗體，F(xiàn)e變體抗體具有增強(qiáng)的對(duì)一種或多種Fe配體的結(jié)合。在某些實(shí)施例中，F(xiàn)e變體抗體展現(xiàn)出增加或降低的對(duì)Fe配體的親和力，該親和力比天然Fe抗體所展現(xiàn)的對(duì)于Fe配體的親和力高或低至少2倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少7倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少30倍、或至少40倍、或至少50倍、或至少60倍、或至少70倍、或至少80倍、或至少90倍、或至少100倍、或至少200倍、或是在2倍與10倍之間、或在5倍與50倍之間、或在25倍與100倍之間、或在75倍與200倍之間、或在100倍與200倍之間。在不同的實(shí)施例中，F(xiàn)e變體抗體展現(xiàn)的對(duì)Fe配體的親和力比天然Fe抗體所展現(xiàn)的對(duì)Fe配體的親和力高或低至少90%、至少80%、至少70%、至少60%、至少50%、至少40%、至少30%、至少20%、至少10%、或至少5%。在某些實(shí)施例中，F(xiàn)e變體抗體具有增加的對(duì)Fe配體的親和力。Fe變體抗體有時(shí)可以具有降低的對(duì)Fe配體的親和力。
[0301]在一些實(shí)施例中，F(xiàn)e變體抗體具有增強(qiáng)的對(duì)Fe受體Fe Y RIIIA的結(jié)合。在一些實(shí)施例中，F(xiàn)e變體抗體具有增強(qiáng)的對(duì)Fe受體Fe Y RIIB的結(jié)合。在某些實(shí)施例中，F(xiàn)e變體抗體具有增強(qiáng)的對(duì)Fe受體Fe YRIIIA和Fe Y RIIB兩者的結(jié)合。在某些實(shí)施例中，與天然的Fe抗體相比，具有增強(qiáng)的對(duì)Fe YRIIIA的結(jié)合的Fe變體抗體在結(jié)合Fe y RIIB受體方面不具有伴隨的增加。在某些實(shí)施例中，F(xiàn)e變體抗體具有降低的對(duì)Fe受體Fe YRIIIA的結(jié)合。Fe變體抗體有時(shí)可以具有降低的對(duì)Fe受體Fe Y RIIB的結(jié)合。在不同的實(shí)施例中，展現(xiàn)出改變的對(duì)Fe Y RIIIA和/或Fe Y RIIB的親和力的Fe變體抗體具有增強(qiáng)的對(duì)Fe受體FcRn的結(jié)合。在一些實(shí)施例 中，相對(duì)于天然Fe抗體，展現(xiàn)出改變的對(duì)Fe Y RIIIA和/或Fe Y RIIB的親和力的Fe變體抗體具有改變的對(duì)Clq的結(jié)合。
[0302]在某些實(shí)施例中，F(xiàn)e變體抗體展現(xiàn)的對(duì)Fe Y RIIIA受體的親和力比天然Fe抗體所展現(xiàn)的對(duì)Fe YRIIIA受體的親和力高或低至少2倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少7倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少30倍、或至少40倍、或至少50倍、或至少60倍、或至少70倍、或至少80倍、或至少90倍、或至少100倍、或至少200倍、或在2倍與10倍之間、或在5倍與50倍之間、或在25倍與100倍之間、或在75倍與200倍之間、或在100倍與200倍之間。在不同的實(shí)施例中，F(xiàn)e變體抗體展現(xiàn)的對(duì)Fe Y RIIIA的親和力比天然Fe抗體所展現(xiàn)的對(duì)Fe YRIIIA的親和力高或低至少90%、至少80%、至少70%、至少60%、至少50%、至少40%、至少30%、至少20%、至少10%、或至少5%。
[0303]在某些實(shí)施例中，F(xiàn)e變體抗體展現(xiàn)的對(duì)Fe Y RIIB受體的親和力比天然Fe抗體所展現(xiàn)的對(duì)Fe Y RIIB受體的親和力高或低至少2倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少7倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少30倍、或至少40倍、或至少50倍、或至少60倍、或至少70倍、或至少80倍、或至少90倍、或至少100倍、或至少200倍、或在2倍與10倍之間、或在5倍與50倍之間、或在25倍與100倍之間、或在75倍與200倍之間、或在100倍與200倍之間。在某些實(shí)施例中，F(xiàn)e變體抗體展現(xiàn)的對(duì)Fe Y RIIB的親和力比天然Fe抗體所展現(xiàn)的對(duì)Fe Y RIIB配體的親和力高或低至少90%、至少80%、至少70%、至少60%、至少50%、至少40%、至少30%、至少20%、至少10%、或至少5%。
[0304]在一些實(shí)施例中，相對(duì)于天然Fe抗體，F(xiàn)e變體抗體展現(xiàn)出增加或降低的對(duì)Clq的親和力。在一些實(shí)施例中，F(xiàn)e變體抗體展現(xiàn)的對(duì)Clq受體的親和力比天然Fe抗體所展現(xiàn)的對(duì)Clq受體的親和力高或低至少2倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少7倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少30倍、或至少40倍、或至少50倍、或至少60倍、或至少70倍、或至少80倍、或至少90倍、或至少100倍、或至少200倍、或在2倍與10倍之間、或在5倍與50倍之間、或在25倍與100倍之間、或在75倍與200倍之間、或在100倍與200倍之間。在某些實(shí)施例中，F(xiàn)e變體抗體展現(xiàn)的對(duì)Clq的親和力比天然Fe抗體所展現(xiàn)的對(duì)Clq的親和力高或低至少90%、至少80%、至少70%、至少60%、至少50%、至少40%、至少30%、至少20%、至少10%、或至少5%。在不同的實(shí)施例中，展現(xiàn)出改變的出對(duì)Clq的親和力的Fe變體抗體具有增強(qiáng)的對(duì)Fe受體FcRn的結(jié)合。在又另一個(gè)具體實(shí)施例中，相對(duì)于天然Fe抗體,展現(xiàn)改變的對(duì)Clq的親和力的Fe變體抗體具有改變的對(duì)Fe Y RIIIA和/或Fe Y RIIB的結(jié)合。
[0305]期望的是，通過(guò)用于確定一種或多種Fe Y R介導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞功能的體外功能測(cè)定來(lái)表征Fe變體抗體。在某些實(shí)施例中，F(xiàn)e變體抗體具有相似的結(jié)合特性，并且效應(yīng)細(xì)胞如在基于體外測(cè)定中那樣在體內(nèi)模型(例如在此描述和披露的那些)中起作用。本技術(shù)不排除在基于體外的測(cè)定中未展現(xiàn)出所希望的表型但在體內(nèi)展現(xiàn)出所希望的表型的Fe變體抗體。
[0306]可以通過(guò)增加Fe區(qū)對(duì)FcRn的結(jié)合親和力而增加包含F(xiàn)e區(qū)的蛋白質(zhì)的血清半衰期。如在此使用的術(shù)語(yǔ)“抗體半衰期”表示一種抗體的藥物代謝動(dòng)力學(xué)特性，它是抗體分子在它們的給予之后的平均存活時(shí)間的量度?？贵w半衰期可以表示為從患者(或其他哺乳動(dòng)物)的身體或其特定區(qū)室(例如，如在血清中測(cè)量的，即循環(huán)半衰期)、或在其他組織中消除50%已知量的免疫球蛋白所需要的時(shí)間。從一種免疫球蛋白或免疫球蛋白類別到另一種免疫球蛋白或免疫球蛋白類別，半 衰期可以不同。通常，抗體半衰期的增加導(dǎo)致循環(huán)中所給予抗體的平均停留時(shí)間(MRT)的增加。
[0307]半衰期的增加允許給至患者的藥物的量的減少以及給藥頻率的減少。半衰期的增加也可以是有益的，例如對(duì)于金黃色葡萄球菌相關(guān)的疾病或病癥的預(yù)防、以及還有對(duì)于在患者一出院就經(jīng)常發(fā)生的感染復(fù)發(fā)的預(yù)防。為了增加抗體的血清半衰期，如在本領(lǐng)域已知的，可以將補(bǔ)救受體結(jié)合表位結(jié)合到抗體(尤其是抗體片段)中。如在此使用的，術(shù)語(yǔ)“補(bǔ)救受體結(jié)合表位”是指導(dǎo)致IgG分子的體內(nèi)血清半衰期的增加的、IgG分子(例如，IgGl、IgG2、IgG3、或IgG4)的Fe區(qū)的表位。具有增加的半衰期的抗體還可以通過(guò)修飾被鑒定為涉及Fe與FcRn受體之間的相互作用的氨基酸殘基而產(chǎn)生。另外，抗α毒素抗體或片段的半衰期可以通過(guò)用本領(lǐng)域所廣泛使用的技術(shù)結(jié)合至PEG或白蛋白而增加。在一些實(shí)施例中，包含抗α毒素抗體的Fe變體區(qū)的抗體與包含天然Fe區(qū)的抗體相比具有增加大約5%、大約10%、大約15%、大約20%、大約25%、大約30%、大約35%、大約40%、大約45%、大約50%、大約60%、大約65%、大約70%、大約80%、大約85%、大約90%、大約95%、大約100%、大約125%、大約150%或更多的半衰期。在一些實(shí)施例中，包含F(xiàn)e變體區(qū)的抗體與包含天然Fe區(qū)的抗體相比具有增加大約2倍、大約3倍、大約4倍、大約5倍、大約10倍、大約20倍、大約50倍或更多、或在2倍與10倍之間、或在5倍與25倍之間、或在15倍與50倍之間的半衰期。
[0308]在一些實(shí)施例中，在此呈現(xiàn)的技術(shù)提供了 Fe變體，其中Fe區(qū)包含在一個(gè)或多個(gè)
【權(quán)利要求】
1.一種純化的/分離抗體或一種抗體的片段，其中該抗體或該片段免疫特異性地結(jié)合至金黃色葡萄球菌α毒素多肽，并且包括: (a)VH CDR1，該VH CDRl包含與SEQ ID NO: 7、10、13或69—致的氨基酸序列或相對(duì)于它們包含1、2、或3個(gè)氨基酸殘基置換； (b)VHCDR2，該 VH CDR2 包含與 SEQ ID N0:8、ll、14、17、70 或 75—致的氨基酸序列或相對(duì)于它們包含1、2、或3個(gè)氨基酸殘基置換，以及
(c)VHCDR3，該 VH CDR3 包含與 SEQ ID NO:9、12、15、18、16、65、66、67、71、72、76 或 78一致的氨基酸序列或相對(duì)于它們包含1、2、或3個(gè)氨基酸殘基置換。
2.如權(quán)利要求1所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該VH⑶R1、VH⑶R2和VH⑶R3由SEQ ID NO:7、8 和 9 ；SEQ ID NO: 10、11 和 12 ；SEQ ID NO: 13、14 和 15 ；SEQ ID NO: 7、17 和18 ；SEQ ID NO:7、8 和 16 ;SEQ ID NO:7、8 和 65 ;SEQ ID NO:7、8 和 66 ;SEQ ID N07、8、和67;SEQ ID NO:7、8和 78 ;SEQ ID NO:69、70和 71 ;SEQ ID NO:7、8和 72 ;SEQ ID NO:69、75和 71 ；SEQ ID NO:69、75 和 76 ;或 SEQ ID N0:69、70 和 71 表示。
3.一種分離抗體或其抗原結(jié)合片段，其中該分離抗體或其抗原結(jié)合片段免疫特異性地結(jié)合至金黃色葡萄球菌α毒素多肽，并且包括:
(a)VH CDR1，該 V H CDRl 包含 SEQ ID NO: 7、10、13 或 69 的氨基酸序列； (b)VHCDR2，該 VH CDR2 包含 SEQ ID N0:8、ll、14、17、70 或 75 的氨基酸序列;
(c)VHCDR3，該 VH CDR3 包含 SEQ ID NO:9、12、15、18、16、65、66、67、71、72、76 或 78 的氨基酸序列； (d)VLCDRl，該VL CDRl包含SEQ ID NO:1或4的氨基酸序列； (e)VLCDR2，該VL CDR2包含SEQ ID NO: 2、5、73或77的氨基酸序列;以及 (f)VL CDR3，該 VL CDR3 包含 SEQ ID NO:3、6、64、68 或 74 的氨基酸序列。
4.如權(quán)利要求3所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該VH⑶Rl、VH⑶R2、VH⑶R3、VLCDRUVL CDR2 和 VL CDR3 相應(yīng)于 SEQ ID NO: 7、8、9、1、2 和 3 ;SEQ ID NO: 10、11、12、1、2 和3 ；SEQ ID NO:13、14、15、4、5 和 6 ;SEQ ID NO:7、17、18、1、2 和 3 ;SEQ ID NO:7、8、16、1、2和 64;SEQ ID ΝΟ:7、8、65、1、2 和 64 ;SEQ ID NO ;7、8、66、1、2 和 64 ;SEQ ID ΝΟ:7、8、67、1、2和 68;SEQ ID NO:7、8、67、1、2 和 64 ;SEQ ID NO:7、8、78、1、2 和 64 ;SEQ ID NO:7、8、65、1、2和 68;SEQ ID N0:69、70、71、l、2和 68 ;SEQ ID NO:7、8、72、1、73 和 74 ;SEQ ID NO:69、75、71、1、2和 68 ;SEQ ID ΝΟ:69、75、76、1、2和 68 ;SEQ ID NO:69、75、76、1、77和 74 ;SEQ IDN0:69、70、71、l、77和74的氨基酸序列。
5.如權(quán)利要求1所述的分離抗體或其抗原結(jié)合片段，其中該分離抗體或其抗原結(jié)合片段(i)包括含有三個(gè)CDR的VH鏈結(jié)構(gòu)域以及含有三個(gè)CDR的VL鏈結(jié)構(gòu)域；并且(ii)免疫特異性地結(jié)合至金黃色葡萄球菌α毒素多肽，其中該VH鏈結(jié)構(gòu)域的三個(gè)⑶R包含: (a)VH CDR1，該 VH CDRl 包含 SEQ ID NO:7、10、13 或 69 的氨基酸序列； (b)VHCDR2，該 VH CDR2 包含 SEQ ID NO: 8、11、14、17、70 或 75 的氨基酸序列；以及
(c)VHCDR3，該 VH CDR3 包含 SEQ ID NO:9、12、15、18、16、65、66、67、71、72、76 或 78 的氨基酸序列。
6.如權(quán)利要求5所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該VH⑶R1、VH⑶R2和VH⑶R3相應(yīng)于 SEQ ID NO:7、8 和 9 ；SEQ ID NO: 10、11 和 12 ；SEQ ID NO: 13、14 和 15 ；SEQ ID NO:7、·17 和 18;SEQ ID NO: 7、8 和 16 ;SEQ ID NO: 7、8 和 65 ;SEQ ID NO: 7、8 和 66 ;SEQ ID N07、8、和 67;SEQ ID N0:7、8 和 78 ;SEQ ID NO: 69、70 和 71 ;SEQ ID NO: 7、8 和 72 ;SEQ ID NO: 69、·75 和 71 ；SEQ ID N0:69、75 和 76 ;或 SEQ ID N0:69、70 和 71 的氨基酸序列。
7.如權(quán)利要求1所述的分離抗體或其抗原結(jié)合片段，其中該分離抗體或其抗原結(jié)合片段(i)包括含有三個(gè)CDR的VH鏈結(jié)構(gòu)域以及含有三個(gè)CDR的VL鏈結(jié)構(gòu)域；并且(ii)免疫特異性地結(jié)合至金黃色葡萄球菌α毒素多肽，其中該VL鏈結(jié)構(gòu)域的三個(gè)⑶R包含: (a)VL CDRl，該VL CDRl包含SEQ ID NO:1或4的氨基酸序列； (b)VLCDR2，該VL CDR2包含SEQ ID NO: 2、5、73或77的氨基酸序列；以及 (c)VLCDR3，該 VL CDR3 包含 SEQ ID NO:3、6、64、68 或 74 的氨基酸序列。
8.如權(quán)利要求7所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該VL⑶R1、VL⑶R2和VL⑶R3相應(yīng)于 SEQ ID N0:l、2 和 3;SEQ ID N0:4、5 和 6;SEQ ID NO: 1、2 和 64 ;SEQ ID N0:l、2 和 68;SEQ ID N0:1、73和74;或SEQ ID NO: 1、77 和 74 的氨基酸序列。
9.一種分離抗體或其抗原結(jié)合片段，該分離抗體或其抗原結(jié)合片段(i)免疫特異性地結(jié)合至金黃色葡萄球菌α毒素多肽，(ii)包含重鏈可變域，該重鏈可變域具有與SEQ IDN0:20、22、24、26、28、41、43、45、47、49、51、53、55、57、79、59、61、或 62 的氨基酸序列至少90%的一致性，并且(iii)·包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域具有與SEQ ID NO:19、21、23、25、27、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60 或 63 的氨基酸序列至少 90% 的一致性。
10.如權(quán)利要求9所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該VH和VL相應(yīng)于SEQID NO: 20和 19;SEQ ID NO;22 和 21;SEQ ID NO:24和23;SEQ ID NO:26和25;SEQ ID NO: 28 和 27;SEQ ID N0:41 和 42;SEQ ID NO:43 和 44;SEQ ID NO:45 和 46;SEQ ID NO:47 和 48;SEQ IDNO:47和48;SEQ ID N0:49 和 50;SEQ ID NO:51 和 52;SEQ ID NO:51 和 52;SEQ ID NO: 53和 54;SEQ ID NO:55和56;SEQ ID NO:57和58;SEQ ID N0:59和60;SEQ ID NO:61 和 58;SEQ ID NO:62 和 58 ；SEQ ID NO:62 和 63 ；SEQ ID NO:79 和 63 的氨基酸序列。
11.該分離抗體或其抗原結(jié)合片段，其中該該分離抗體或其抗原結(jié)合片段包含具有SEQID N020、22、24、26、28、41、43、45、47、49、51、53、55、57、79、59、61、或 62 的重鏈可變域以及具有 SEQ ID NO: 19、21、23、25、27、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60 或 63 的輕鏈可變域。
12.如權(quán)利要求11所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該VH和VL相應(yīng)于SEQID NO: 20和 19;SEQ ID NO:22和21;SEQ ID NO:24和23;SEQ ID NO:26和25;SEQ ID NO: 28 和 27;SEQ ID N0:41 和 42;SEQ ID NO:43 和 44;SEQ ID NO:45 和 46;SEQ ID NO:47和 48;SEQ IDNO:47和48;SEQ ID N0:49 和 50;SEQ ID NO:51 和 52;SEQ ID NO:51 和 52;SEQ ID NO: 53和 54;SEQ ID NO:55和56;SEQ ID NO:57和58;SEQ ID N0:59和60;SEQ ID NO:61 和 58;SEQ ID NO:62 和 58 ；SEQ ID NO:62 和 63 ；SEQ ID NO:79 和 63 的氨基酸序列。
13.如權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該分離抗體或其抗原結(jié)合片段免疫特異性地結(jié)合至金黃色葡萄球菌α毒素多肽，并且具有一種或多種選自下組的特征，該組由以下各項(xiàng)組成: (a)對(duì)于α毒素大約13ηΜ或更小的親和常數(shù)(Kd)； (b)結(jié)合至α毒素單體,但不抑制α毒素結(jié)合至α毒素受體； (c)以至少50%、60%、70%、80%、90%、或95%抑制α毒素寡聚體的形成； (d)以至少50%、60%、70%、80%、90%、或95%降低α毒素的細(xì)胞溶解活性(例如，如通過(guò)細(xì)胞溶解和溶血試驗(yàn)所確定)；以及 (e)減少細(xì)胞浸潤(rùn)和促炎細(xì)胞因子釋放(例如，在一種動(dòng)物肺炎模型中)。
14.如權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該分離抗體或其抗原結(jié)合片段包括一種另外的藥劑。
15.如權(quán)利要求14所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該另外的藥劑是一種抗生素。
16.如權(quán)利要求14所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該分離抗體或其抗原結(jié)合片段經(jīng)由一種接頭連接至治療劑。
17.如權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該分離抗體或其抗原結(jié)合片段進(jìn)一步包括一種診斷劑。
18.如權(quán)利要求17所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該診斷劑包括一種顯像劑。
19.如權(quán)利要求17所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該診斷劑包括一種可檢測(cè)標(biāo)記物。
20.如權(quán)利要求17所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該分離抗體或其抗原結(jié)合片段經(jīng)由一種接頭連接至該診斷劑。
21.如權(quán)利要求1至20 中任一項(xiàng)所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該金黃色葡萄球菌毒素多肽是一種天然的毒素多肽。
22.如權(quán)利要求1至20中任一項(xiàng)所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該金黃色葡萄球菌α毒素多肽包括SEQ ID ΝΟ:39或SEQ ID Ν0:40的氨基酸序列。
23.如權(quán)利要求Α13所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該細(xì)胞來(lái)自血液或肺。
24.如權(quán)利要求23所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其中來(lái)自血液的該細(xì)胞是一種紅細(xì)胞。
25.如權(quán)利要求13、23或24中任一項(xiàng)所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該細(xì)胞溶解是通過(guò)溶血體外試驗(yàn)或乳酸脫氫酶體外試驗(yàn)確定的。
26.如權(quán)利要求1至25中任一項(xiàng)所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該分離抗體或其抗原結(jié)合片段免疫特異性地結(jié)合至金黃色葡萄球菌α毒素多肽并且包含VH⑶R3，該VHCDR3 包含與 SEQ ID ΝΟ:9、12、15、18、16、65、66、67、71、72、76 或 78 一致的氨基酸序列或相對(duì)它們包含1、2、或3個(gè)氨基酸殘基置換，其中該抗體或抗原結(jié)合片段中和該金黃色葡萄球菌α毒素多肽。
27.如權(quán)利要求1至26中任一項(xiàng)所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該分離抗體或其抗原結(jié)合片段免疫特異性地結(jié)合至金黃色葡萄球菌α毒素多肽并且包含VL⑶R3，該VLCDR3包含與SEQ ID NO: 3、6、64、68或74 —致的氨基酸序列或相對(duì)于它們包含1、2、或3個(gè)氨基酸殘基置換，其中該抗體或抗原結(jié)合片段中和該金黃色葡萄球菌α毒素多肽。
28.如權(quán)利要求1至27中任一項(xiàng)所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該分離抗體或其抗原結(jié)合片段免疫特異性地結(jié)合至金黃色葡萄球菌α毒素多肽并且包含VH CDR3，該VHCDR3 包含與 SEQ ID NO:9、12、15、18、16、65、66、67、71、72、76 或 78 一致的氨基酸序列或相對(duì)于它們包含1、2、或3個(gè)氨基酸殘基置換，其中該抗體或抗原結(jié)合片段抑制該金黃色葡萄球菌α毒素多肽的寡聚化。
29.如權(quán)利要求1至28中任一項(xiàng)所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該分離抗體或其抗原結(jié)合片段免疫特異性地結(jié)合至金黃色葡萄球菌α毒素多肽并且包含VL⑶R3，該VLCDR3包含與SEQ ID NO: 3、6、64、68或74 —致的氨基酸序列或相對(duì)于它們包含1、2、或3個(gè)氨基酸殘基置換，其中該抗體或抗原結(jié)合片段抑制該金黃色葡萄球菌α毒素多肽的寡聚化。
30.如權(quán)利要求13、28或29中任一項(xiàng)所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該寡聚化的抑制是通過(guò)體外結(jié)合和/或電泳遷移率測(cè)定確定的。
31.一種組合物，包含如權(quán)利要求1至30中任一項(xiàng)所述的抗體或抗原結(jié)合片段。
32.一種試劑盒，包含 (a)如權(quán)利要求1至30中任一項(xiàng)所述的抗體或抗原結(jié)合片段或如權(quán)利要求31所述的組合物； (b)用于使用該組合物的說(shuō)明書或者用于獲得使用該組合物的說(shuō)明書的指導(dǎo)。
33.如權(quán)利要求32所述的試劑盒，其中在該組合物中的抗體連接至一種固體支撐物。
34.如權(quán)利要求33所述的試劑盒，其中該固體支撐物是一種珠粒。
35.如權(quán)利要求34所述的試劑盒，其中該珠粒是一種瓊脂糖凝膠珠。
36.如權(quán)利要求32至35中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中用于使用的這些說(shuō)明書包括金黃色葡萄球菌α毒素多肽的分離、純化、檢測(cè)、和定量中的一項(xiàng)或多項(xiàng)。
37.如權(quán)利要求32至36中任一項(xiàng)所述的試劑盒，包含一種緩沖液、一種固體支撐物或者一種緩沖液與一種固體支撐物。
38.如權(quán)利要求37所述.的試劑盒，其中該固體支撐物是珠粒、過(guò)濾器、膜和多孔板(multiwall plate)中的一種或多種。
39.如權(quán)利要求37所述的試劑盒,包括一種適用于Western印跡的緩沖液和膜。
40.如權(quán)利要求37所述的試劑盒，包含一種上樣緩沖液和一種洗脫緩沖液。
41.如權(quán)利要求37所述的試劑盒，包含一種適用于酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)的緩沖液。
42.一種用于預(yù)防、治療或管理在受試者中的肺炎的方法，該方法包括: 將一種如權(quán)利要求1至30中任一項(xiàng)所述的抗體或抗原結(jié)合片段或如權(quán)利要求31所述的組合物以用于預(yù)防、治療或管理肺炎有效的量給予至對(duì)其有需要的受試者。
43.如權(quán)利要求42所述的方法，是一種用于預(yù)防肺炎的方法。
44.如權(quán)利要求42或43所述的方法，其中該抗體或其抗原結(jié)合片段免疫特異性地結(jié)合至在SEQ ID NO:39之內(nèi)的構(gòu)象表位。
45.一種用于預(yù)防、治療或管理在受試者中的皮膚感染病癥的方法，該方法包括:將免疫特異性地結(jié)合至金黃色葡萄球菌α毒素多肽的一種抗體或其抗原結(jié)合片段以用于預(yù)防、治療或管理該皮膚感染病癥有效的量給予至對(duì)其有需要的受試者。
46.如權(quán)利要求45所述的方法，其中該皮膚感染病癥是皮膚壞死。
47.如權(quán)利要求45或46所述的方法，其中該皮膚感染病癥包括皮膚的金黃色葡萄球菌感染。
48.如權(quán)利要求45至47中任一項(xiàng)所述的方法，是一種用于預(yù)防皮膚感染病癥的方法。
49.一種用于預(yù)防、治療或管理與金黃色葡萄球菌感染相關(guān)的病癥的方法，該方法包括將免疫特異性地結(jié)合至金黃色葡萄球菌α毒素多肽的一種抗體或其抗原結(jié)合片段以減少該毒素多肽的寡聚化有效的量給予至對(duì)其有需要的受試者。
50.如權(quán)利要求49所述的方法，是一種用于預(yù)防與金黃色葡萄球菌感染相關(guān)的病癥的方法。
51.一種用于預(yù)防、治療或管理與金黃色葡萄球菌感染相關(guān)的病癥的方法，該方法包括將免疫特異性地結(jié)合至金黃色葡萄球菌α毒素多肽的一種抗體或其抗原結(jié)合片段以減少紅細(xì)胞溶解有效的量給予至對(duì)其有需要的受試者。
52.如權(quán)利要求51所述的方法，是一種用于預(yù)防與金黃色葡萄球菌感染相關(guān)的病癥的方法。
53.如權(quán)利要求51或52所述的方法，其中該紅細(xì)胞是一種來(lái)自血液或肺的細(xì)胞。
54.如權(quán)利要求45至53中任一項(xiàng)所述的方法，其中該抗體或其抗原結(jié)合片段具有一種或多種選自下組的特征，該組由以下各項(xiàng)組成: (a)對(duì)于α毒素大約13ηΜ或更小的親和常數(shù)(Kd)； (b)結(jié)合至α毒素單體,但不抑制α毒素結(jié)合至α毒素受體； (c)以至少50%、60%、70%、80%、90%、或95%抑制α毒素寡聚體的形成； (d)以至少50%、60%、70%、80%、90%、或95%降低α毒素的細(xì)胞溶解活性(例如，如通過(guò)細(xì)胞溶解和溶血試驗(yàn)所確定)；以及 (e)減少細(xì)胞浸潤(rùn)和促炎細(xì)胞因子釋放(例如，在一種動(dòng)物肺炎模型中)。
55.如權(quán)利要求54所述的方法，其中該抗體或其抗原結(jié)合片段免疫特異性地結(jié)合至在SEQ ID NO:39之內(nèi)的構(gòu)象表位。
56.如權(quán)利要求 42至55中任一項(xiàng)所述的方法，其中給予至受試者的抗體或抗原結(jié)合片段或組合物是根據(jù)如權(quán)利要求1至30中任一項(xiàng)或如權(quán)利要求31所述的組合物。
57.—種方法,包括: 將如權(quán)利要求1至30中任一項(xiàng)所述的抗體或抗原結(jié)合片段或如權(quán)利要求31所述的組合物給予至細(xì)胞；并且 檢測(cè)與給予該組合物至這些細(xì)胞相關(guān)的生物效應(yīng)的存在、不存在或量。
58.一種方法，包括: 將如權(quán)利要求1至30中任一項(xiàng)所述的抗體或抗原結(jié)合片段或如權(quán)利要求31所述的組合物給予至受試者；并且 檢測(cè)在受試者中與該組合物的給予相關(guān)的生物效應(yīng)的存在、不存在或量。
59.一種方法，包括: 將如權(quán)利要求1至30中任一項(xiàng)所述的抗體或抗原結(jié)合片段或如權(quán)利要求31所述的組合物給予至受試者；并且 監(jiān)測(cè)受試者的病癥。
60.一種用于中和金黃色葡萄球菌α毒素多肽的方法,該方法通過(guò)將一種有效量的如權(quán)利要求1至30中任一項(xiàng)所述的抗體或抗原結(jié)合片段或如權(quán)利要求31所述的組合物給予至對(duì)其有需要的受試者以中和該毒素多肽。
61.一種預(yù)防、治療、或管理對(duì)其有需要的受試者中的由金黃色葡萄球菌α毒素介導(dǎo)的病癥的方法，該方法包括將有效量的如權(quán)利要求1至30中任一項(xiàng)所述的抗體或抗原結(jié)合片段或如權(quán)利要求31所述的組合物給予至受試者從而預(yù)防、治療或管理該病癥。
62.一種治療、預(yù)防、或減輕對(duì)其有需要的受試者中的由金黃色葡萄球菌α毒素介導(dǎo)的失調(diào)的癥狀的方法，該方法包括將有效量的如權(quán)利要求1至30中任一項(xiàng)所述的抗體或抗原結(jié)合片段或如權(quán)利要求31所述的組合物給予至受試者從而治療、預(yù)防或減輕這些癥狀。
63.—種用于診斷在受試者中的由金黃色葡萄球菌α毒素介導(dǎo)的病癥的方法,該方法包括選擇對(duì)診斷有需要的受試者，并且將診斷有效劑量的如權(quán)利要求1至30中任一項(xiàng)所述的抗體或抗原結(jié)合片段或如權(quán)利要求31所述的組合物給予至受試者。
64.如權(quán)利要求42至63中任一項(xiàng)所述的方法,其中該受試者是一種家畜。
65.如權(quán)利要求42至63中任一項(xiàng)所述的方法，其中該受試者是人。
66.一種用如權(quán)利要求1至30中任一項(xiàng)所述的抗體或抗原結(jié)合片段或如權(quán)利要求31所述的組合物以至少50%、60%、70%、80%、90%或95%抑制金黃色葡萄球菌α毒素寡聚體形成的方法。
67.如權(quán)利要求66所述的方法，其中金黃色葡萄球菌α毒素寡聚體形成的抑制抑制了活性成孔復(fù)合體的形成。
68.一種用如權(quán)利要求1至30中任一項(xiàng)所述的抗體或抗原結(jié)合片段或如權(quán)利要求31所述的組合物以至少50%、60%、70%、80%、90%、或95%降低金黃色葡萄球菌α毒素的細(xì)胞溶解活性的方法，其中該細(xì)胞溶解活性是通過(guò)細(xì)胞溶解和/或溶血試驗(yàn)確定的。
69.一種免疫特異性地結(jié)合至具有SEQ ID ΝΟ:39的金黃色葡萄球菌α毒素的一個(gè)片段的分離抗體或其抗原結(jié)合片段。
70.如權(quán)利要求69所述的分離抗體或抗原結(jié)合片段，其中該抗體或其抗原結(jié)合片段結(jié)合至包含SEQ ID NO:39的氨基酸261-272的一個(gè)片段。
71.如權(quán)利要求69或70所述的`分離抗體或抗原結(jié)合片段，其中該抗體或其抗原結(jié)合片段與 SEQ ID 勵(lì):39的殘基了261、了263、吧64、1(266 和1(271接觸。
72.如權(quán)利要求69或70所述的分離抗體或其抗原結(jié)合片段，其中該抗體或其抗原結(jié)合片段結(jié)合至包含SEQ ID NO:39的氨基酸173-201的一個(gè)片段。
73.如權(quán)利要求69或72所述的分離抗體或其抗原結(jié)合片段，其中該抗體或其抗原結(jié)合片段與 SEQ ID NO: 39 的殘基 Ν177、W179、G180、Ρ181、Υ182、D183、D185、S186、W187、Ν188、Ρ189、V190、Υ191 和 R200 接觸。
74.如權(quán)利要求69至73中任一項(xiàng)所述的分離抗體或其抗原結(jié)合片段，其中該抗體或其抗原結(jié)合片段與 SEQ ID NO: 39 的殘基 Τ261、Τ263、Ν264、Κ266、Κ271、Ν177、W179、G180、P181、Y182、D183、D185、S186、W187、N188、P189、V190、Y191 和 R200 接觸。
75.一種免疫特異性地結(jié)合至金黃色葡萄球菌α毒素片段的分離抗體或其抗原結(jié)合片段，其中該抗體或其抗原結(jié)合片段結(jié)合至包含SEQ ID NO: 39的氨基酸248-277的一個(gè)片段。
76.一種免疫特異性地結(jié)合至金黃色葡萄球菌α毒素的分離抗體或其抗原結(jié)合片段，其中該抗體或其抗原結(jié)合片段防止α毒素七聚體的形成，并且其中所述抗體或抗原結(jié)合片段與SEQ ID ΝΟ:39中的一種或多種選自下組的殘基接觸，該組由以下各項(xiàng)組成:Τ261、T263、N264、K266、K271、N177、W179、G180、P181、Y182、D183、D185、S186、W187、N188、P189、V190、Y191和 R200。
77.如權(quán)利要求42所述的方法，是一種用于治療肺炎的方法。
78.如權(quán)利要求45至47中任一項(xiàng)所述的方法，是一種用于治療皮膚感染病癥的方法。
79.如權(quán)利要求49所述的方法，是一種用于治療與金黃色葡萄球菌感染相關(guān)的病癥的方法。
80.如權(quán)利要求15所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該抗生素是萬(wàn)古霉素。
81.—種抑制α毒素寡聚體形成的方法,該方法包括使一種α毒素單體與免疫特異性地結(jié)合至金黃色葡萄球菌α毒素的一種分離抗體或其抗原結(jié)合片段接觸，其中該抗體或抗原結(jié)合片段與SEQ ID NO: 39中的一種或多種選自下組的殘基接觸，該組由以下各項(xiàng)組成:Τ261、Τ263、Ν264、Κ266、Κ271、Ν177、W179、G180、Ρ181、Υ182、D183、D185、S186、W187、Ν188、Ρ189、V190、Υ191 和 R200。
82.如權(quán)利要求81所述的方法，其中該抗體或其抗原結(jié)合片段與Τ261、Τ263、Ν264、Κ266和Κ271接觸。
83.如權(quán)利要求82所述的方法，其中該抗體或其抗原結(jié)合片段進(jìn)一步與Ν177、W179、G180、P181、Y182、D183、D185、S186、W187、N188、P189、V190、Υ191 和 R200 接觸。
84.具有Fe變體區(qū)的分離抗體或其抗原結(jié)合片段，其中該分離抗體包含SEQID NOiXX以及 SEQ ID Ν0 :ΥΥο
【文檔編號(hào)】A61K39/085GK103443285SQ201280007986
【公開(kāi)日】2013年12月11日 申請(qǐng)日期:2012年2月7日 優(yōu)先權(quán)日:2011年2月8日
【發(fā)明者】B·塞爾曼, C·特卡奇克, L·華, P·喬杜里, R·瓦爾肯, M·達(dá)姆思克洛德, 彭莉, V·奧加尼西安, J·J·西拉德 申請(qǐng)人:米迪繆尼有限公司