專利名稱：一種mdck細(xì)胞制備流感疫苗的培養(yǎng)基及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物制品領(lǐng)域，涉及一種培養(yǎng)基的配置和使用方法，更具體的，涉及一種用于在大規(guī)模高密度生長環(huán)境的培養(yǎng)MDCK細(xì)胞制備流感病毒疫苗的培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
通過動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)以制備最終產(chǎn)品，是生物制品領(lǐng)域最常用的生產(chǎn)方式之一。用于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基，絕大部分需要加入10% -15%的動(dòng)物血清，以提供細(xì)胞生長所需的營養(yǎng)成分及細(xì)胞保持正常形態(tài)的支持蛋白。但是，來源于動(dòng)物的血清的缺點(diǎn)在于:成分難以明確，產(chǎn)品批間差異不易控制，價(jià)格昂貴，并且要求極其嚴(yán)格的檢測程序以確保血清中不含有血清來源動(dòng)物可能攜帶的細(xì)菌、病毒等。MDCK細(xì)胞廣泛用于生物制品領(lǐng)域，尤其是疫苗制備。使用MDCK細(xì)胞制備流感疫苗是近年來流感疫苗生產(chǎn)的一個(gè)新趨勢。生物反應(yīng)器及多種適合的載體，已被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)，其優(yōu)點(diǎn)在于，許多種類的生物反應(yīng)器可以通過灌流培養(yǎng)的方式實(shí)現(xiàn)大規(guī)模，高密度培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞。為達(dá)到良好的培養(yǎng)效果，生物反應(yīng)器的參數(shù)設(shè)置和所選培養(yǎng)基的成分是其中的重要因素。然而，針對使用生物反應(yīng)器大規(guī)模高密度培養(yǎng)MDCK細(xì)胞制備流感疫苗的培養(yǎng)基研究有待深入進(jìn)行。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種適用于大規(guī)模高密度培養(yǎng)MDCK細(xì)胞制備流感疫苗的培養(yǎng)基及其使用方法。使用本發(fā)明所述的培養(yǎng)基，使MDCK細(xì)胞的大規(guī)模高密度培養(yǎng)在低血清濃度條件下進(jìn)行。接種流感病毒后，使用本發(fā)明所述的無血清、低蛋白的培養(yǎng)基用來維持病毒在細(xì)胞液中的增殖。本發(fā)明提供的培養(yǎng)基及其使用方法，使MDCK細(xì)胞高效貼附在微載體上，細(xì)胞生長過程中生長速度快，細(xì)胞形態(tài)好，在灌流培養(yǎng)方式下可以在3-5天內(nèi)達(dá)到極高密度；接種流感病毒后，在維持培養(yǎng)基培養(yǎng)下，可以連續(xù)收獲病毒液7-10天。

本發(fā)明的一種大規(guī)模高密度培養(yǎng)MDCK細(xì)胞制備流感疫苗的培養(yǎng)基，其組成成分及重量份為:成份mg/L
甘氨酸(Glycine)20-55
L-丙氣酸(L-Alanine)2—35
L-精氨酸(L-Arginine)50-150
L-門冬酰胺(L-Asparagine)5-50
L-天門冬氨酸(L-Aspartic acid)1-28
L-半胱氨酸鹽酸鹽(L-Cysteine hydrochloride-ftO)1-30
L-胱氨酸二鹽酸鹽(L-Cystine 2HC1)25-80
L-谷氨酸(L-Glutamic Acid)5-80
L_ 谷氨酰胺(L-Glutamine)200-500
L-組氨酸(L-Histidine)20 - 80
L-徑脯氨酸(L-Hydroxyproline)1-15
L-異亮氨酸(L-1soleucine40-120
L-亮氨酸(L-Leuc ine)40-120
L-賴氨酸鹽酸鹽(L-Lysine hydrochloride)20-130
L-甲硫氨酸(L-Methionine)10-60
L-苯丙氨酸(Phenylalanine)20-80
L-絲氣酸(L-Serine)10-60
L-蘇氨酸(L_Threonine)30-100
L-色氨酸(L-Tryptophan)10-60
L-纈氨酸(L-Valine)20-110
L-脯氨酸(L-Prol ine)10-60
L-酪氨酸鹽鈉鹽二水(L-Tyrosine disodium salt dihydrate30-120
氯化納(Sodium Chloride)4000-9000
無水硫酸鎂(Magnesium Sulfate (anhydrous) )50-150
氯化鉀(Potassium Chloride)200-600
無水氯化韓(Calcium Chloride)100-300
一水鱗酸氫二鈉(Sodium Phosphate monobasic)20-150
五水硫酸銅(Cupric sulfate)0.0001-0.01
泛酸 1 (D-Calcium pantothenated)0.5-5
氯化膽堿(Choline chloride)0.5-10
葉酸(Folic Acid)0.5-5
肌醇(1-1nositol)2—15
煙酷胺(Niacinamide)0.5-5
核黃素(Riboflavin)0.1-5
鹽酸硫胺(Thiamine hydrochloride)0.1-5
葡萄糖(D-Glucose (Dextrose))1000-7000
丙酮酸鈉 Sodium Pyruvate)10-100
酹紅(Phenol Red)8—20
鹽酸Π比唆簽(Pyridoxal hydrochloride)0.01-2
維生素 B12 (Vitamin B12)0.05-1.6
維生素 B6 (Vitamin B6)0, 001-0.1
抗壞血酸(Ascorbic Acid)1-5
亞油酸(Linoleic Acid)0.01-1.5上述培養(yǎng)基的組成成分及重量份優(yōu)選為:成份mg/L
甘氨酸(Glycine)29.5
L-丙氨酸(L-Alanine)18.5
L-精氨酸(L-Arginine)90
L-門冬酰胺(L-Asparagine)28.34
L-天門冬氨酸(L-Aspartic acid)8.35
L-半胱氨酸鹽酸鹽(L-Cysteine hydrochloride)16.45
L-胱氨酸二鹽酸鹽(L-Cystine 2HC1)55
L-谷氨酸(L-Glutamic Acid)42.8
L-谷氨醜胺(L-Glutamine)405
L-組氨酸(L-Hi stidine)35
L-輕脯氨酸(L-Hydroxyproline)8
L-異亮氨酸(L-1soleucine50
L-亮氨酸(L-Leucine )60 L-賴氨酸鹽酸鹽(L-Lysine hydrochloride)43.5
L-甲硫氨酸(L-Methionine)19.5
L-苯丙氨酸(Phenylalanine)30
L-絲氨酸(L-Serine)21.15
L-蘇氨酸(L-Threonine)51.3
L-色氨酸(L-Tryptophan)8
L-纈氨酸(L-Valine)23.5
L-脯氨酸(L-Proline)22.8
L-酪氨酸鹽鈉鹽二水(L-Tyrosine disodium salt dihydrate)49.35
氯化鈉(Sodium Chloride)6850
無水硫酸鎂(Magnesium Sulfate (anhydrous) )100
氯化鉀(Potassium Chloride)425
無水氯化釣(Calcium Chloride)180
一水鱗酸氧二鈾(Sodium Phosphate monobasic)146
五水硫酸銅(Cupric sulfate)0.0004
泛酸f丐(D-Calcium pantothenated)1.2
氯化膽堿(Choline chloride)2.3
葉酸(Folic Acid)1.2
肌醇(1-1nositol)8.5
煙酰胺(Niacinamide)0.9
核黃素(Riboflavin)0.6
鹽酸硫胺(Thiamine hydrochloride)1.8
葡萄糖(D-Glucose (Dextrose))3050
丙酮酸鈉 Sodium Pyruvate)40
酚紅(Phenol Red)12.5
鹽酸P比唆簽(Pyridoxal hydrochloride)0.06
維生素 B12 (Vitamin B12)1.1
維生素 B6 (Vitamin B6)0.005
抗壞血酸(Ascorbic Acid)4.2
亞油酸(Linoleic Acid)0.058
生物素(Biotin)0.01上述培養(yǎng)基，在使用前加入3% -5%的胎牛血清或小牛血清，經(jīng)過膜過濾制成在大規(guī)模高密度環(huán)境下使用的培養(yǎng)MDCK細(xì)胞的培養(yǎng)液。
本發(fā)明的一種大規(guī)模高密度培養(yǎng)得到MDCK細(xì)胞接入流感病毒后，維持病毒感染時(shí)期的培養(yǎng)基，其組成成分及重量份為:
成份mg/L甘氨酸(Glycine) 20-55L-丙氣酸(L-Alanine) 2—35L-精氨酸(L-Arginine) 50-150L-門冬酰胺(L-Asparagine) 5-50L-天門冬氨酸(L-Aspartic acid) 1-28L-半胱氨酸鹽酸鹽(L-Cysteine hydrochloride-1tO) 1-30L-胱氨酸二鹽酸鹽(L-Cystine 2HC1) 25-80L-谷氨酸(L-Glutamic Acid) 5-80L-谷氨酷胺(L-Glutamine) 200*500
L-組氨酸(L-Histidine)20-80 L-徑脯氣酸(L-Hydroxyprol ine) 1-15
L-異亮氦酸(L-1soleucine40-120
L-亮氨酸(L-Leuc ine)40-120
L-賴氨酸鹽酸鹽(L-Lysine hydrochloride)20-130 L-甲硫氨酸(L-Methionine) 10-60
L-苯丙氨酸(Phenylalanine)20-80 L-絲氨酸(L-Serine) 10-60
L_ 蘇氨酸(L-Threonine)30-100 L-色氨酸(L-Tryptophan) 10-60
L-纈氨酸(L-Val ine)20-110L-脯氨酸(L-Proline) 10-60
L-酪氨酸鹽鈉鹽二水(L-Tyrosine disodium salt dihydrate30-120
氯化鈉(Sodium Chloride)4000-9000
無水硫酸鎂(Magnesium Sulfate (anhydrous) )50-150
氯化鉀(Potassium Chloride)200-600 無水氯化 1 (Calcium Chloride) 100-300
一水憐酸氧二鈉(Sodium Phosphate monobasic)20-150
五水硫酸銅(Cupric sulfate)0.0001-0.01
泛酸媽(D-Calcium pantothenated)0.5-5
氯化膽堿(Choline chloride)0.5-10
葉酸(Folic Acid)0.5-5
肌醇(1-1nositol)2—15
煙酰胺(Niacinamide)0.5-5
核黃素(Riboflavin)0.1-5
鹽酸硫胺(Thiamine hydrochloride)0.1-5
葡萄糖(D-Glucose (Dextrose))1000-7000
丙酮酸鈉 Sodium Pyruvate)10-100
酚紅(Phenol Red)8—20
鹽酸批唆簽(Pyridoxal hydrochloride)0.01-2
維生素 B12 (Vitamin B12)0.05-1.6
維生素 B6 (Vitamin B6)0.001-0.1
抗壞血酸(Ascorbic Acid)1-5
亞油酸(Linoleic Acid)0.01-1.5
上述培養(yǎng)基的組成成分及重量份優(yōu)選為:
成份mg/L
甘氨酸(Glycine)32.5
L-丙氨酸(L-Alanine)18.5
L-精氨酸(L-Arginine)90
L-門冬酰胺(L-Asparagine)30
L-天門冬氨酸(L-Aspartic acid)8.35
L-半胱氨酸鹽酸鹽(L-Cysteine hydrochloride)12.3
L-胱氨酸二鹽酸鹽(L-Cystine 2HC1)50.5
L-谷氨酸(L-Glutamic Acid)40 L-谷氨酰胺(L-Glutamine)422
L-組氨酸(L-Histidine)35
L-經(jīng)脯氨酸(L-Hydroxypr*ol ine)8
L-異亮氨酸(L-1soleucine50
L-亮氦酸(L-Leucine)60
L-賴氨酸鹽酸鹽(L-Lysine hydrochloride)41.8
L-甲硫氨酸(L-Methionine)19.5
L-苯丙氨酸(Phenylalanine)30
L-絲氨酸(L-Serine)19.35
L-蘇氨酸(L-Threonine)51.3
L-色氨酸(L-Tryptophan)10
L-纈氨酸(L-Valine)23.5
L-脯氨酸(L-Proline)22.8
L-酪氨酸鹽鈉鹽二水(L-Tyrosine disodium salt dihydrate)47.3
氯化鈉(Sodium Chloride)6630
無水硫酸鎂(Magnesium Sulfate (anhydrous) )100
氯化鉀(Potassium Chloride)425
無水氯化媽(Calcium Chloride)180
一水憐酸氫二鈉(Sodium Phosphate monobasic)158
五水硫酸銅(Cupric sulfate)0.0004
泛酸 1 (D-Calcium pantothenated)1.2
氯化膽堿(Choline chloride)2.0
葉酸(Folic Acid)1.2
肌醇(1-1nositol)8.2
煙酰胺(Niacinamide)0.9
核黃素(Riboflavin)0- 6
鹽酸硫胺(Thiamine hydrochloride)1-8
葡萄糖(D-Glucose (Dextrose))2890
丙酮酸鈉 Sodium Pyruvate)42
酷紅(Phenol Red)13
鹽酸批嗔簽(Pyridoxal hydrochloride)0.04
維生素 B12 (Vitamin B12)1.0
維生素 B6 (Vitamin B6)0.005
抗壞血酸(Ascorbic Acid)4.1
亞油酸(Linoleic Acid)0.062
生物素(Biotin)0- 015
上述培養(yǎng)基還包含如下成分及其重量比例:
成份mg/L
七水硫酸亞鐵(Ferric sulfate)0,01-0.5
氯化I (Calcium Chloride)2-20
乙醇胺(Ehanolamine)1~10
亞硒酸鈉(Sodium Selenite)0.0001-0.001
膽固醇(Cholesterol)0.5-3
阿爾法-生育酷憐酸酷(Alpha-tocopherol Phosphate)0.001-0.01
氯化鎂(Magnesium Chloride)10-50`
碳酸氫鈉(NaHC03)50-450
硫辛酸(Lipoic Acid)0.05-0.8
半乳糖(Galactose)500-3000
胰島素(Insulin)5 - 20
胸腺啼卩定(Thymine)0.05-0.5
尿嘧啶(Uracil)0.05- .5
次黃嘌呤(Hypoxanthine)0.1-0.8
鹽酸鳥嘌呤(Guanine.HCL)5-40
硫酸腺卩票呤(Adenine sulfate)5-40
轉(zhuǎn)鐵蛋白(Holo Transferrin)1-20
谷光甘肽(Glutathione)0.6-3.6
胸苷(Thymidine)0.05-0.8
緩沖液 HEPES800-5000
腐胺(Putrescine-2HCL)0.8-6
維生素 B2 (Vitamin B2)0.05-0.5
維生素 A(Vitamin A)0.01-0.1
維生素 D(Vitamin D)O, 01-0.1
維生素 K (Vitamin K)0.001-0.01上述培養(yǎng)基包含的添加成分，其重量份的優(yōu)選比例為:
成份mgA
七水硫酸亞鐵(Ferric sulfate)0.2
氯化 1 (Calcium Chloride)8.5
乙醇胺(Ehanolamine)3
亞硒酸鈉(Sodium Selenite)0.001
膽固醇(Cholesterol)I.2
阿爾法-生育酷憐酸酯(Alpha-tocopherol Phosphate)0.006氯化鎂(Magnesium Chloride)21.5
碳酸氫鈉(NaHC03)200
硫辛酸(Lipoic Acid)0.25
半乳糖(Galactose)1000
胰島素(Insulin)10.5
胸腺嘧啶(Thymine)0.12
尿嘧啶(Uracil)0.12
次黃卩票呤(Hypoxanthine)0.35
鹽酸鳥嘌呤(Guanine.HCL)18
硫酸腺嘌呤(Adenine sulfate)12
轉(zhuǎn)鐵蛋白(Holo Transferrin)6
谷光甘肽(Glutathione)1.65
胸苷(Thymidine)0.33
緩沖液HEPES3000
腐胺(Putrescine_2HCL)1.85
維生素 B2 (Vitamin B2)0.15
維生素 A (Vitamin A)0.06
維生素 D (Vitamin D)0.06
維生素 K (Vitamin K)0.004 所述大規(guī)模高密度培養(yǎng)MDCK細(xì)胞所用的生物反應(yīng)器可使用本領(lǐng)域常用的內(nèi)部結(jié)構(gòu)支持使用載體的各類生物反應(yīng)器，例如德國Eppendorf (艾本德)公司New BrunswickScientific生物反應(yīng)器,德國Satorious公司生物反應(yīng)器,荷蘭Applicon公司生物反應(yīng)器生物反應(yīng)器，杭州安普公司生物反應(yīng)器，上海日泰公司生物反應(yīng)器，廣州旗幟公司生物反應(yīng)器。優(yōu)選使用德國Eppendorf (艾本德)公司New Brunswick Scientific生物反應(yīng)器，德國Satorious公司生物反應(yīng)器，荷蘭Applicon公司生物反應(yīng)器，更優(yōu)選使用德國Eppendorf (艾本德)公司 New Brunswick Scientific 生物反應(yīng)器。所述載體可選自常規(guī)使用的各種材料制的載體，包括化工材料的聚丙烯，PLA,PGA,多孔硅，PLGA，PPF等，和天然材料的葡聚糖，膠原蛋白，瓊脂，谷物蛋白等。優(yōu)選使用葡聚糖材料的微載體，更優(yōu)選使用美國GE公司Cytodexl球形微載體。所述MDCK細(xì)胞培養(yǎng)的條件是本領(lǐng)域中常規(guī)的使用條件，生物反應(yīng)器的參數(shù)設(shè)置參考生物反應(yīng)器廠家的使用說明書設(shè)置。優(yōu)選的培養(yǎng)條件是:37攝氏度，溶氧DO為30-50%，按比例通入壓縮空氣，氧氣，二氧化碳和氮?dú)馑姆N氣體，通氣量為1.0，轉(zhuǎn)速為IlOrpm0接種流感病毒種毒液，使用病毒液維持培養(yǎng)基時(shí)，培養(yǎng)的條件是本領(lǐng)域中常規(guī)的使用條件，生物反應(yīng)器的參數(shù)設(shè)置參考生物反應(yīng)器廠家的使用說明書設(shè)置。優(yōu)選的培養(yǎng)條件是:36攝氏度，溶氧DO為50-70 %，通入壓縮空氣，氧氣，二氧化碳和氮?dú)馑姆N氣體，通氣量為1.2，轉(zhuǎn)速為IlOrpm0本方法所述的培養(yǎng)基及其使用方法，在生物反應(yīng)器中大規(guī)模高密度的培養(yǎng)MDCK細(xì)胞時(shí)使用低濃度血清，在接種流感病毒后，使用無血清、低蛋白的培養(yǎng)基維持病毒增殖，有效的減少動(dòng)物源血清可能帶來的風(fēng)險(xiǎn)，顯著降低雜蛋白對最終產(chǎn)品的干擾，在較短時(shí)間內(nèi)，通過灌流方式培養(yǎng)生產(chǎn)大量的滴度高的病毒液，制備流感病毒疫苗。本方法所述的培養(yǎng)基及其使用方法，適用于制備針對各種流感病毒亞型，各種宿主的流感病毒滅活疫苗。


圖1為細(xì)胞培養(yǎng)的生長曲線對比圖。圖2為接種流感病毒后病毒滴度曲線對比圖
具體實(shí)施例方式材料與設(shè)備1，材料I) MEM培養(yǎng)基，DMEM培養(yǎng)基，GIBCO公司2)胎牛血清，GIBCO公司3) Cytodexl球形微載體，GE公司2，主要設(shè)備I)生物反應(yīng)器:德國Eppendorf (艾本德)公司New Brunswick 14升生物反應(yīng)器(工作體積10升)2) 二氧化碳培養(yǎng)箱，日本三洋公司3)高速離心機(jī)，Beckman公司4)超速離心機(jī)，Beckman公司5) 4度和-20度冰箱，日本三洋公司6)分光光度計(jì),德國Eppendorf (艾本德)公司生產(chǎn)過程主要參數(shù)以下實(shí)施例在實(shí)施過程中的主要參數(shù)均設(shè)置為同樣數(shù)值，僅在培養(yǎng)基的使用上有所區(qū)別，具體成分見實(shí)施例1，實(shí)施例2，實(shí)施例3，實(shí)施例4，實(shí)施例5。I，滅菌和預(yù)處理按照設(shè)備使用說明調(diào)試與準(zhǔn)備生物反應(yīng)器，進(jìn)行必要的清洗，滅菌步驟，并進(jìn)行無菌試驗(yàn)，以確認(rèn)生物反應(yīng)器處于良好的生產(chǎn)狀態(tài)。對選用Cytodexl微載體進(jìn)行浸泡和滅菌準(zhǔn)備。按20克/升培養(yǎng)基加入微載體，每臺14升生物反應(yīng)器(工作體積10升)加入200克經(jīng)預(yù)處理的Cytodexl微載體。2,MDCK細(xì)胞培養(yǎng)的條件是本領(lǐng)域中常規(guī)技術(shù)的使用條件，生物反應(yīng)器的參數(shù)設(shè)置參考生物反應(yīng)器廠家的使用說明書設(shè)置。細(xì)胞接種密度為4.5x10s個(gè)細(xì)胞/毫升。在全部實(shí)施例中，MDCK細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)時(shí)的參數(shù)設(shè)置為:溫度37攝氏度，溶氧DO為40 %，按70 %，20 %，5 %，5 %的比例分別通入空氣，氧氣，二氧化碳和氮?dú)馑姆N氣體，通氣量為1.0升/分鐘，轉(zhuǎn)速為llOrpm。3，以灌流方式培養(yǎng)MDCK細(xì)胞5天。用臺盼藍(lán)法檢測細(xì)胞濃度和活性。將生物反應(yīng)器中的培養(yǎng)基更換為病毒液維持培養(yǎng)基，具體成分見實(shí)施例1，實(shí)施例2，實(shí)施例3，實(shí)施例
4。按照MOI為0.05的量接種流感病 毒種毒液。培養(yǎng)的條件是本領(lǐng)域中常規(guī)的使用條件，生物反應(yīng)器的參數(shù)設(shè)置參考生物反應(yīng)器廠家的使用說明書設(shè)置。在全部實(shí)施例中，接入流感病毒種毒液后的參數(shù)設(shè)置為:溫度36攝氏度，溶氧DO為50 %，按50 %，42 %，7 %，I %的比例分別通入空氣，氧氣，二氧化碳和氮?dú)馑姆N氣體，通氣量為1.1升/分鐘，轉(zhuǎn)速為llOrpm。4，以灌流方式維持病毒液10天，將10天內(nèi)收集得到的全部病毒液在零下20度凍融3次，經(jīng)β -丙內(nèi)酯滅活，純化，稀釋，加入佐劑，制成流感疫苗。實(shí)施例1使用的MDCK細(xì)胞大規(guī)模高密度培養(yǎng)的培養(yǎng)基，其組成成分和重量份的比例如下:
權(quán)利要求
1.一種大規(guī)模高密度培養(yǎng)MDCK細(xì)胞制備流感疫苗的培養(yǎng)基，其特征在于:培養(yǎng)基的組成成分及重量份為:成份mg/L甘氨酸(Glycine)20-55L-丙氨酸(L-Alanine)2—35L-精氨酸(L-Arginine)50-150L-門冬醜胺(L-Asparagine)5-50 L-天門冬氨酸(L-Aspartic acid)I_28 L-半胱氨酸鹽酸鹽(L-Cysteine hydrochloride_H20)1-30 L-胱氨酸二鹽酸鹽(L-Cystine 2HC1)25-80 L-谷氨酸(L-Glutamic Acid)5-80L-谷氨酰胺(L-Glutamine)200-500L-組氨酸(L-Histidine)20-80 L-輕脯氨酸(L-Hydroxyproline)1-15 L-異亮氨酸(L-1soleucine40-120L-亮氨酸(L-Leucine)40-120 L-賴氨酸鹽酸鹽(L-Lysine hydrochloride)20-130L-甲硫氨酸(L-Methionine)10-60 L-苯丙氨酸(Phenylalanine)20-80L-絲氨酸(L-Serine)10 - 60L-蘇氨酸(L-Threonine)30-100L-色氨酸(L-Tryptophan)10-60L-織氨酸(L-Valine)20-110L-腩氨酸(L-Proline)10-60 L-酪氨酸鹽鈉鹽二水(L-Tyrosine disodium salt dihydrate30-120 氯化鈉(Sodium Chloride)4000-9000 無水硫酸鎂(Magnesium Sulfate (anhydrous) )50-150 氯化鉀(Potassium Chloride)200-600 無水氯化媽(Calcium Chloride)100-300 一水憐酸氫二鈉(Sodium Phosphatemonobasic) 20-150 五水硫酸銅(Cupric sulfate)0.0001-0.01 泛酸媽(D-Calcium pantothenated)0.5-5 氯化膽堿(Choline chloride)0.5-10葉酸(Folic Acid)0.5-5肌醇(1-1nositol)2—15煙酰胺(Niacinamide)0.5-5核黃素(Riboflavin)0.1-5 鹽酸硫胺(Thiamine hydrochloride)0.1-5 葡萄糖(D-Glucose (Dextrose))1000-7000 丙酮酸鈉 Sodium Pyruvate)10-100釀紅(Phenol Red)8—20 鹽酸P比嘆簽(Pyridoxal hydrochloride)0.01-2 維生素 B12 (Vitamin B12)0.05-1.6 維生素 B6 (Vitamin B6)0.001-0.1抗壞血酸(Ascorbic Acid)1-5亞油酸(Linoleic Acid)0.01-1.5
2.如權(quán)利要求1所述的大規(guī)模高密度培養(yǎng)MDCK細(xì)胞制備流感疫苗的培養(yǎng)基，其特征在于:培養(yǎng)基的組成成分及重量份優(yōu)選為:·成份mg/L 甘氨酸(Glycine)29.5 L-丙氨酸(L-Alanine)18.5 L-精氨酸(L-Arginine)90 L-門冬酰胺(L-Asparagine)28.34 L-天門冬氨酸(L-Aspartic acid)8.35 L-半胱氨酸鹽酸鹽(L-Cysteine hydrochloride)16.45 L-胱氨酸二鹽酸鹽(L-Cystine 2HC1)55 L-谷氨酸(L-Glutamic Acid)42.8 L-谷氣酰胺(L-Glutamine)405 L-組氨酸(L-Histidine)35 L-輕脯氣酸(L-Hydroxyproline)8 L-異亮氨酸(L-1soleucine50 L-亮氨酸(L-Leucine)60 L-賴氨酸鹽酸鹽(L-Lysine hydrochloride)43.5 L-甲硫氨酸(L-Methionine)19.5 L-苯丙氨酸(Phenylalanine)30 L-絲氨酸(L-Serine)21.15 L-蘇氨酸(L-Threonine)51.3 L-色氧酸(L-Tryptophan)8 L-纈氨酸(L-Valine)23.5 L-脯氨酸(L-Proline)22.8 L-酪氨酸鹽鈉鹽二水(L-Tyrosine disodium salt dihydrate)49.35 氯化鈉(Sodium Chloride)6850 無水硫酸鎂(Magnesium Sulfate (anhydrous) )100 氯化鉀(Potassium Chloride)425 無水氯化 1 (Calcium Chloride)180 一水憐酸氧二納(Sodium Phosphate monobasic)146 五水硫酸銅(Cupric sulfate)0.0004 泛酸 1 (D-Calcium pantothenated)1.2 氯化膽堿(Choline chloride)2.3 葉酸(Folic Acid)1.2 肌醇(1-1nositol)8.5 煙酰胺(Niacinamide)0.9 核黃素(Riboflavin)0.6 鹽酸硫胺(Thiamine hydrochloride)1.8 葡萄糖(D-Glucose (Dextrose))3050 丙酮酸納 Sodium Pyruvate)40 酷紅(Phenol Red)12.5 鹽酸卩比卩多簽(Pyridoxal hydrochloride)0.06 維生素 B12 (Vitamin B12)1_ I 維生素 B6 (Vitamin B6)0.005 抗壞血酸(Ascorbic Acid)4.2 亞油酸(Linoleic Acid)0.058 生物素(Biotin)0.01
3.如權(quán)利要求1或2所述的培養(yǎng)基，在使用前加入3%-5%的胎牛血清或小牛血清，經(jīng)過膜過濾制成在大規(guī)模高密度環(huán)境下使用的培養(yǎng)MDCK細(xì)胞的培養(yǎng)液。
4.一種大規(guī)模高密度培養(yǎng)得到MDCK細(xì)胞接入流感病毒后，維持病毒感染時(shí)期的培養(yǎng)基，其特征在于:培養(yǎng)基的組成成分及重量份為:成份mg/L甘氨酸(Glycine)20-55L-丙氨酸(L-Alanine)2—35L-精氨酸(L-Arginine)50-150 L-門冬酰胺(L-Asparagine)5-50 L-天門冬氨酸(L-Aspartic acid)1-28 L-半胱氨酸鹽酸鹽(L-Cysteine hydrochloride-ftO)1-30 L-胱氨酸二鹽酸鹽(L-Cystine 2HC1)25-80 L-谷氨酸(L-Glutamic Acid)5-80 L-谷氨酰胺(L-Glutamine)200-500L-組氨酸(L-Histidine)20-80 L-經(jīng)脯氨酸(L-Hydroxyproline)1-15 L-異亮氨酸(L_Isoleucine40-120L-亮氨酸(L-Leucine)40-120 L-賴氨酸鹽酸鹽(L-Lysine hydrochloride)20-130 L-甲硫氨酸(L-Methionine )10-60 L-苯丙氨酸(Phenylalanine)20-80L-絲氨酸(L-Serine)10-60L-蘇氨酸(L-Threonine)30-100 L-色氨酸(L-Tryptophan)10 - 60L-纈氨酸(L-Val ine)20-110L-脯氨酸(L-PiOline)10-60 L-酪氨酸鹽納鹽二水(L-Tyrosine disodium salt dihydrate30-120 氯化鈉(Sodium Chloride)4000-9000 無水硫酸鎂(Magnesium Sulfate (anhydrous) )50-150 氯化鉀(Potassium Chloride)200-600 無水氯化耗(Calcium Chloride)100-300 一水磷酸氫二鈉(Sodium Phosphate monobasic)20-150 五水硫酸銅(Cupric sulfate)0.0001-0.01 泛酸I (D-Calcium pantothenated)0.5-5 氯化膽堿(Choline chloride)0.5-10葉酸(Folic Acid)0.5-5肌醇(1-1nositol)2—15煙酰胺(Niacinamide)0.5-5核黃素(Riboflavin)0.1-5 鹽酸硫胺(Thiamine hydrochloride)0.1-5 葡萄糖(D-Glucose (Dextrose))1000-7000 丙酮酸鈾 Sodium Pyruvate)10-100酹紅(Phenol Red)8--20 鹽酸fl比P多簽(Pyridoxal hydrochloride)0.01-2 維生素 B12 (Vitamin B12)0.05-1.6 維生素 B6 (Vitamin B6)0.001-0.1 抗壞血酸(Ascorbic Acid)1-5 亞油酸(Linoleic Acid)0.01-1.5
5.如權(quán)利要求4所述的培養(yǎng)基，其特征在于:培養(yǎng)基的組成成分及重量份優(yōu)選為:成份mg/L甘氨酸(Glycine)32.5L-丙氨酸(L-Alanine)18.5L-精氣酸(L-Arginine)90L-門冬酰胺(L-Asparagine)30L-天門冬氣酸(L-Aspartic acid)8.35L-半胱氨酸鹽酸鹽(L-Cysteine hydrochloride)12.3L-胱氨酸二鹽酸鹽(L-Cystine 2HC1)50.5L-谷氨酸(L-Glutamic Acid)40L-谷氨酰胺(L-Glutamine)422L-組氨酸(L-Histidine)35L-經(jīng)脯氨酸(L-HydroxyprOline)8L-異亮氨酸(L-1soleucine50L-亮氨酸(L-Leucine)60L-賴氨酸鹽酸鹽(L-Lysine hydrochloride)41.8L-甲硫氨酸(L-Methionine)19.5L-苯丙氨酸(Phenylalanine)30L-絲氨酸(L-Serine)19.35L-蘇氨酸(L-Threonine)51.3L-色氨酸(L-Tryptophan)10L-纈氨酸(L-Valine)23.5L-脯氨酸(L-Proline)22.8L-酪氨酸鹽鈉鹽二水(L-Tyrosine disodium salt dihydrate)47.3氯化鈉(Sodium Chloride)6630 無水硫酸鎂(Magnesium Sulfate (anhydrous) )100氯化鉀(Potassium Chloride)425無水氯化 1 (Calcium Chloride)180一水磷酸氫二鈉(Sodium Phosphate monobasic)158五水硫酸銅(Cupric sulfate)0.0004泛酸韓(D-Calcium pantothenated)I.2氯化膽減(Choline chloride)2.0葉酸(Folic Acid)I.2肌醇(1-1nositol)8.2煙釀胺(Niacinamide)0.9核黃素(Riboflavin)0.6鹽酸硫胺(Thiamine hydrochloride)1.8葡萄糖 CD-Glucose (Dextrose))2890丙酮酸鈉 Sodium Pyruvate)42酌紅(Phenol Red)13鹽酸fl比夠簽(Pyridoxal hydrochloride)0.04維生素 B12 (Vitamin B12)1.0維生素 B6 (Vitamin B6)0.005抗壞血酸(Ascorbic Acid)4.1亞油酸(Linoleic Acid)0.062生物素(Biotin)0.015
6.如權(quán)利要求4或5所述的培養(yǎng)基，其特征在于:其中還包含如下成分及其重量比例:成份mgA 七水硫酸亞鐵(Ferric sulfate)0.01-0.5 氯化耗(Calcium Chloride)2-20乙醇胺(Ehanolamine)1-10 亞硒酸鈉(Sodium Selenite)0.0001-0.001膽固醇(Cholesterol)0.5-3 阿爾法-生育釀鱗酸酷(Alpha-tocopherol Phosphate)0.001-0.01 氯化鎂(Magnesium Chloride) 10-50碳酸氫鈉(NaHC03)50-450硫辛酸(Lipoic Acid)0.05-0.8半乳糖(Galactose)500-3000胰島素(Insulin)5-20胸腺喃旋(Thymine)0.05-0.5尿啼P定(Uracil)0.05-0.5 次黃嘌呤(Hypoxanthine)0.1-0.8鹽酸鳥嘌呤(Guanine.HCL)5-40硫酸腺卩票時(shí)(Adenine sulfate) 5-40轉(zhuǎn)鐵蛋白(Holo Transferrin)1-20 谷光甘狀(Glutathione)0.6-3.6 胸苷(Thymidine) 0.05-0.8 緩沖液 HEPES 800-5000腐胺(Putrescine-2HCL)0.8-6維生素 B2 (Vitamin B2) 0.05-0.5 維生素 A (Vitamin A)0.01-0.I 維生素 D(Vitamin D)0.01-0.1 維生素 K (Vitamin K) 0.001-0.01
7.如權(quán)利要求6所述的培養(yǎng)基，其特征在于:其中所述的成分及其重量的優(yōu)選比例為:成份mg/L 七水硫酸亞鐵(Ferric sulfate)0.2 氯化韓(Calcium Chloride)8.5 乙醇胺(Ehanolamine)3 亞硒酸鈉(Sodium Selenite)0.001 膽固醇(Cholesterol)1.2 阿爾法生育釀磷酸酷(Alpha-tocopherol Phosphate)0.006 氯化鎂(Magnesium Chloride)21.5 碳酸氫鈉(NaHC03)200 硫辛酸(Lipoic Acid)0.25 半乳糖(Galactose)1000 胰島素(Insulin)10.5 胸腺嘧卩定(Thymine)0.12 尿嘧啶(Uracil)0.12 次黃嘌呤(Hypoxanthine)0.35 鹽酸鳥嘌呤(Guanine.HCL)18 硫酸腺B票呤(Adenine sulfate)12 轉(zhuǎn)鐵蛋白(Holo Transferrin)6 谷光甘肽(Glutathione)1.65 胸苷(Thymidine)0.33 緩沖液HEPES3000 腐胺(Putrescine-2HCL)1.85 維生素 B2 (Vitamin B2)0.15 維生素 A (Vitamin A)0.06 維生素 D (Vitamin D)0.06 維生素 K (Vitamin K)0.004
8.—種大規(guī)模高密度培養(yǎng)MDCK細(xì)胞制備流感疫苗的培養(yǎng)方法，其特征在于:使用權(quán)利要求1-3所述的培養(yǎng)基，在生物反應(yīng)器中以灌流培養(yǎng)的方式大規(guī)模高密度的培養(yǎng)MDCK細(xì)胞；使用權(quán)利要求4-7所述的培養(yǎng)基，接種流感病毒種毒液，以灌流培養(yǎng)的方式維持流感病毒的增殖，直到收獲病毒液。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于:使用本方法所述的培養(yǎng)基和低濃度的血清，在生物反應(yīng)器中大規(guī)模高密度的培養(yǎng)MDCK細(xì)胞；在接種流感病毒后，使用本方法所述的無血清、低蛋白的培養(yǎng)基維持病毒增殖。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征還在于:適用于制備針對各種流感病毒亞型，各種宿主的流感病毒滅活疫苗。
全文摘要
本發(fā)明提供一種適用于大規(guī)模高密度培養(yǎng)MDCK細(xì)胞制備流感疫苗的培養(yǎng)基。
文檔編號A61K39/145GK103074293SQ20121059509
公開日2013年5月1日 申請日期2012年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月28日
發(fā)明者賈馨丹 申請人:杭州國牧生物科技有限公司