專利名稱：：一種硫化氫釋放劑在制備治療腎臟纖維化疾病藥物中的用途的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及腎臟纖維化疾病治療用藥領域，特別涉及一種硫化氫釋放劑在制備治療腎臟纖維化疾病藥物中的用途。
背景技術：
：慢性腎臟病是世界范疇的公共健康問題，是發(fā)病率僅次于心腦血管疾病、惡性腫瘤和糖尿病的威脅人類健康的疾病。各種原因引起的慢性腎臟病，其最終結果將發(fā)展成終末期腎功能衰竭而需要進行腎臟替代治療，嚴重威脅人類生命健康，并造成社會和家庭的沉重負擔。在美國和澳洲，患病率約為1116%，最近的一份報告指出，中國北京成年人群中慢性腎臟病的發(fā)病率為13.0%，國內各地區(qū)發(fā)病率也呈逐年上升趨勢。慢性腎臟病盡管病因不同(如慢性腎小球腎炎、糖尿病腎病、高血壓腎病等)，但當病情進展到一定階段后病理都將表現為腎臟纖維化，具體表現為腎小球硬化，腎小管萎縮和腎間質纖維化，即所謂的“共同通道”學說。因此，近年來腎臟纖維化成為各種原因引起的慢性腎臟病的研究熱點，也是慢性腎臟病防治的重點和難點問題。目前的觀點認為腎臟纖維化是由炎癥促發(fā)的，多種致纖維化細胞及細胞因子參與的病理過程。其病理特點為腎小管和腎周毛細血管消失，間質炎癥細胞浸潤，肌纖維母細胞和細胞外基質積聚。活化的肌纖維母細胞是最重要的致纖維化細胞，其分子標志為平滑肌肌動蛋白(a-SMA)。致纖維化細胞因子中TOGF和TGF-βI在腎間質成纖維細增殖和分化過程中發(fā)揮著重要作用，是腎臟纖維化的重要治療靶點。PDGF也是促進成纖維細胞增殖最重要的絲裂原之一。開發(fā)抗腎臟纖維化的藥物也成為慢性腎臟病藥物研究的前沿和熱點。隨著對腎臟纖維化發(fā)病機制認識的不斷深入，產生了許多新的潛在治療靶點及藥物如ΒΜΡ-7，治療靶點為TGF-β1，但是這些藥物臨床療效欠佳，而且由于腎臟纖維化的關鍵調控靶點一直不清楚，纖維化的發(fā)病機制提示抗纖維化需要針對多靶點治療。腎素-血管緊張素系統(tǒng)抑制劑(ACEI)是目前臨床最主要使用的抗纖維化藥物，然而這類藥物的使用有嚴格的適應癥。因為ACEI擴張腎小球出球小動脈的能力大于入球小動脈，理論上會降低腎小球濾過率，尤其是當患者已經出現腎功能不全，或存在血容量不足時，ACEI可能會導致腎功能急劇惡化，表現為血清肌酐升高和高鉀血癥，加劇了腎功能惡化，增加了心臟驟停的風險而無法繼續(xù)使用，因此目前臨床上對于這類患者并無特效藥物，透析及腎移植成為了最后的治療策略。ACEI的另一大禁忌癥是孤立腎和雙側腎功能狹窄，單側腎動脈狹窄則需慎用，其原理也是因為在這三種疾病中使用ACEI后會誘發(fā)急性腎功能衰竭。另外，腎動脈缺血性疾病也將導致腎臟纖維化，腎臟固縮，最終發(fā)展成尿毒癥。如何進一步延緩這部分患者的腎功能惡化，從而降低尿毒癥的發(fā)生率至今仍是腎臟纖維化疾病治療的難題。
發(fā)明內容有鑒于此，本發(fā)明提供了一種硫化氫釋放劑在制備治療腎臟纖維化疾病藥物中的用途。該用途通過硫氫化鈉或硫化鈉作用于腎臟成纖維細胞，抑制了腎間質成纖維細胞增殖和分化，抑制了腎間質膠原纖維沉積，同時改善了腎功能，而不引起血肌酐和血鉀水平的進一步升高，具有抗腎臟纖維化作用。為了實現上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術方案本發(fā)明提供了一種硫化氫釋放劑作為腎臟成纖維細胞增殖抑制劑的應用，硫化氫釋放劑為硫氫化鈉或硫化鈉。硫化氫(H2S)在過去300多年一直被認是一種毒性氣體。然而，近年研究發(fā)現哺乳動物細胞代謝過程本身就會產生H2S,H2S合成相關酶如胱硫醚β合成酶(CBS)和胱硫醚Y裂解酶(CSE)在心、腦、肝、腎以及血管系統(tǒng)內廣泛表達，表明H2S在體內發(fā)揮著重要的生理和病理調節(jié)功能。動物實驗研究表明H2S具有抗氧化、抗炎癥、抗高血壓及其他作用。臨床研究也發(fā)現高血壓、動脈粥樣硬化及其終末性腎病患者血漿中H2S水平顯著下降。新近研究發(fā)現慢性腎臟病模型大鼠外周血H2S含量、肝臟及腎臟中H2S合成酶(CBS或CSE)表達均下降，提示慢性腎臟病是一種伴有H2S缺乏的疾病。最近有證據表明H2S在慢性腎臟病中有保護作用。硫化氫釋放劑是指能夠釋放硫化氫的化合物或組合物，常用的為硫化鈉和硫氫化鈉。腎臟成纖維細胞可通過細胞計數和BrdU滲入率驗證其增殖，也可以通過測定細胞增殖相關基因pcna和c-myc的蛋白表達驗證其增值。本發(fā)明還提供了一種硫化氫釋放劑作為腎臟成纖維細胞分化抑制劑的應用，硫化氫釋放劑為硫氫化鈉或硫化鈉。腎臟成纖維細胞分化成肌纖維母細胞的分子標識是a-SM,a-SMA的mRNA轉錄和蛋白表達表明腎臟成纖維細胞分化成肌纖維母細胞。腎臟成纖維細胞分化還表現為腎臟成纖維細胞中膠原相關基因collagen-1與細胞外基質相關基因fibronectin的mRNA轉錄和蛋白表達。本發(fā)明還提供了一種硫化氫釋放劑作為MAPK信號通路的抑制劑，硫化氫釋放劑為硫氫化鈉或硫化鈉。MAPK信號通路是生物體內重要的信號轉導系統(tǒng)之一，在哺乳動物細胞中MAPK亞族主要包括JNK、p38和ERK等，這幾種蛋白通過磷酸化參與細胞的增殖、分化、轉化及凋亡的調節(jié)。優(yōu)選地，硫化氫釋放劑抑制腎臟成纖維細胞內ERK、P38或JNK蛋白磷酸化。本發(fā)明還提供了一種硫化氫釋放劑用于制備治療腎臟纖維化疾病藥物的用途，硫化氫釋放劑為硫氫化鈉或硫化鈉。本發(fā)明還提供了一種藥物制劑，包含硫化氫釋放劑以及藥學上可接受的輔料，硫化氫釋放劑為硫氫化鈉或硫化鈉。優(yōu)選地，藥物制劑的劑型為口服劑或注射劑。作為優(yōu)選，口服劑為丸劑、顆粒劑、片劑、膠囊劑或散劑。本發(fā)明利用硫化氫釋放劑釋放硫化氫作用于病灶，對腎臟纖維化機制進行了研究。但硫化鈉和硫氫化鈉都為強堿，可與腸胃道消化液中的酸發(fā)生反應，迅速釋放硫化氫，口服后能引起硫化氫中毒。因此，硫化鈉和硫氫化鈉需要制成釋藥速率不受胃腸道消化液影響的口服緩釋制劑?？诜忈屩苿┲缚诜笤谝?guī)定釋放介質中緩慢地釋放藥物的制劑，緩釋制劑能降低藥物進入機體的吸收速率，與相應的普通制劑比較，緩釋制劑減少了普通劑型給藥所呈現血藥濃度的峰谷現象，使血藥濃度保持在比較平穩(wěn)持久的有效范圍內，給藥頻率至少減少一半或有所減少，且能顯著增加患者的順應性或療效，提高了藥物的安全性。目前常用膜包衣技術、骨架技術和滲透泵技術制備口服緩釋制劑。膜包衣技術是指通過包衣膜控制藥物擴散到胃腸液的速度，控制和調節(jié)制劑中藥物的釋放速度，片劑、顆粒、小丸甚至藥物粉末均可包衣，膜包衣技術是常用的緩釋制劑制備技術之一，膜包衣是在特定的設備中按特定的工藝將糖料或其它能成膜的材料涂覆在藥物固體制劑的外表面，使其干燥后成為緊密粘附在表面的一層或數層不同厚薄、不同彈性的多功能保護層；骨架技術是指藥物和一種或多種惰性固體骨架材料通過壓制或融合技術等制成片狀、小粒或其他形式的制劑；滲透泵技術是利用滲透壓差為驅動力并結合半透膜控制藥物釋放的技術。本發(fā)明利用包衣技術對硫化鈉或硫氫化鈉進行緩釋處理。作為優(yōu)選，注射劑為粉針劑或注射液。優(yōu)選地，注射劑的注射方式為肌肉注射。本發(fā)明提供了一種硫化氫釋放劑用于制備治療腎臟纖維化疾病藥物的應用，硫化氫釋放劑為硫氫化鈉或硫化鈉。該發(fā)明以血清(FBS)刺激腎間質成纖維細胞，測定細胞增殖和細胞增殖相關基因的蛋白表達，結果顯示Na2S抑制了FBS所致的腎間質成纖維細胞的增殖，抑制了腎間質成纖維細胞的DNA合成和BrdU滲入，并抑制了細胞增殖相關基因的蛋白PCNA和c-myc的表達；本發(fā)明以TGF-βI刺激腎間質成纖維細胞，測定細胞內α-SM,Collagen-1和Fibronectin的mRNA轉錄和a-SMA蛋白表達變化，結果顯示Na2S抑制了a-SMA的mRNA轉錄和蛋白表達，抑制了Collagen-1和Fibronectin的mRNA的轉錄；本發(fā)明通過檢測p38、ERK和JNK的蛋白磷酸化水平變化，結果顯示Na2S抑制了MAPK通路的激活。在細胞實驗的基礎上，本發(fā)明通過在體實驗，研究硫化鈉或硫氫化鈉對腎臟組織、腎功能、膠原纖維面積、相關蛋白表達的影響，結果顯示NaHS治療組的皮質厚度顯著高于UUO模型組，顯著降低了血肌酐、尿素氮水平，但未對血鉀和尿酸水平產生顯著影響，顯著減少了間質膠原纖維沉積，顯著抑制了a-SMA蛋白表達水平。由此可見，本發(fā)明通過硫氫化鈉或硫化鈉作用于腎臟成纖維細胞，抑制了腎間質成纖維細胞增殖和分化，抑制了腎間質膠原纖維沉積，同時改善了腎功能，而不引起血肌酐和血鉀水平的進一步升高，具有抗腎臟纖維化作用。圖1示實施例1提供的MTT法測定腎間質成纖維細胞增殖統(tǒng)計圖；以血清(FBS)模擬EGF、PDGF等生長因子的作用，MTT法測定細胞活力；1為1%FBS組，2為1%FBS+Na2S組，3為3%FBS組，4為3%FBS+Na2S組，5為5%FBS組，6為5%FBS+Na2S組，7為10%FBS組，8為10%FBS+Na2S組；#P<0.01vsl%FBS組，*Ρ〈0·01vsl0%FBS組，n=6；Na2S(100μΜ)抑制了不同濃度FBS所致的腎間質成纖維細胞(NRK-49F)的增殖，抗增殖效應在10%FBS組尤為明顯。圖2示實施例2提供的MTT法測定腎間質成纖維細胞增殖統(tǒng)計圖；1為空白對照組，2為FBS組，3為IμMNa2S+FBS組，4為10μMNa2S+FBS組，5為50μMNa2S+FBS組，6為100μMNa2S+FBS組，7為500μMNa2S+FBS組，其中，FBS采用10%的FBS；#P<0.01vsl%FBS組，*P〈0.01vsl0%FBS組，n=6;不同濃度Na2S抑制了血清所致的腎間質成纖維細胞的增殖；100μMNa2S+FBS組與FBS組之間的腎間質成纖維細胞增殖差異極顯著(P<O.01)；圖3示實施例3提供的BrdU滲入法測定腎間質成纖維細胞的增殖情況的熒光顯微鏡圖；以血清模擬EGF、PDGF等生長因子的作用，BrdU染色檢測細胞增殖，在熒光顯微鏡下觀察BrdU發(fā)紅色光，在說明書附圖的圖片中為白色的點；在熒光顯微鏡下觀察，DAPI染色后的細胞核發(fā)藍色光，在說明書附圖的圖片中為白色的點；其中，圖3(a)示空白對照的BrdU滲入圖片，圖3(b)示空白對照組的DAPI染色的細胞核，圖3(c)示圖3(a)和圖3(b)的疊加圖，圖3(d)示FBS組的BrdU滲入圖片，圖3(e)示FBS組的DAPI染色的細胞核，圖3(f)示圖3(d)和圖3Ce)的疊加圖，圖3(g)示Na2S+FBS組的BrdU滲入圖片，圖3(h)示Na2S+FBS組的DAPI染色的細胞核，圖3(i)示圖3(g)和圖3(h)的疊加圖，圖3(j)示Na2S組的BrdU滲入圖片，圖3(k)示Na2S組的DAPI染色的細胞核，圖3(I)不圖3(j)和圖3(k)的置加圖；圖4示實施例3提供的腎間質成纖維細胞的BrdU滲入率統(tǒng)計圖；_Ρ〈0·01vsl0%FBS組，n=6;100μMNa2S+10%FBS組與10%FBS組之間的BrdU滲入率差異極顯著(P<0.01);H2S供體Na2S(IOOyM)作用24小時后抑制了10%FBS所致的腎間質成纖維細胞(NRK-49F)的DNA合成和Brdu滲入；圖5示實施例4提供的PCNA蛋白和Ciyc蛋白的電泳圖；其中，圖5(a)是PCNA蛋白的電泳圖，圖5(b)是C-myc蛋白的電泳圖，β-actin為內參；圖6示實施例4提供的PCNA蛋白和C-myc蛋白與β-actin的累積光密度比率統(tǒng)計圖;*P〈0.05vsl0%FBS組，n=3;其中，圖6Ca)示PCNA蛋白和β-actin累積光密度比率柱狀圖，ΙΟΟμΜNa2S+10%FBS組與10%FBS組之間的蛋白表達量差異顯著(Ρ<0.05);圖6(b)示Ciyc蛋白和β-actin累積光密度比率柱狀圖，100μMNa2S+10%FBS組與10%FBS組之間的蛋白表達量差異顯著(P<0.05)；Na2S(100μΜ)抑制了10%FBS刺激NRK-49F24小時后PCNA和C-myc的蛋白表達；圖7不實施例5提供的Collagen-1、Fibronectin和a-SMA的cDNA電泳圖；其中，圖7(a)不Collagen-1的cDNA電泳圖，圖7(b)不Fibronectin的cDNA電泳圖，圖7(c)示a-SMA的cDNA電泳圖，β-actin和GAPDH為內參；圖8不實施例5提供的a-SMA>ColIagen-1>Fibronectin的cDNA與內參的累積光密度比率柱狀圖；其中，圖8(a)示a-SMAcDNA與GAPDH累積光密度比率柱狀圖，ΙΟΟμΜNaHS+2ng/mLTGF-βI組與2ng/mLTGF-βI組之間的累積光密度比率差異顯著(P<0.05);圖8(b)示Collagen-1cDNA與GAPDH累積光密度比率柱狀圖，100μMNaHS+2ng/mLTGF-βI組與2ng/mLTGF-βI組之間的累積光密度比率差異顯著(P<0.05);圖8(c)示Fibronectin的cDNA與GAPDH累積光密度比率柱狀圖，100μMNaHS+2ng/mLTGF-βI組與2ng/mLTGF-βI組之間的累積光密度比率差異顯著(P<0.05);GAPDH為內參，CON為假手術組；*P〈0.05vsTGF組，n=3;NaHS(100μM)抑制了TGF-βI(2ng/ml)刺激NRK-49F24小時后a-SMA,collagen-1和FibronectinmRNA的表達；圖9示實施例5提供的a-SMAcDNA和蛋白的電泳圖；圖9(a)示a-SMAcDNA的電泳圖；圖9(b)示a-SMA蛋白的電泳圖；其中，β-actin和GAPDH為內參；圖10示實施例5提供的a-SMA蛋白和cDNA與內參的累積光密度比率統(tǒng)計圖；其中，圖10Ca)示a-SMAcDNA與內參的累積光密度比率統(tǒng)計圖；圖10(b)示與內參的累積光密度比率統(tǒng)計圖；#P〈0.Olvs對照組，*P〈0.01vsTGF組，n=3；Na2S(ΙΟΟμΜ)抑制了TGF-βI(2ng/ml)刺激NRK-49F24小時后a-SMAmRNA和蛋白表達；圖11示實施例6提供的p-ERK、p_P38和p-JNK蛋白的電泳圖；其中，圖11(a)示P-ERK的電泳圖，ERK作為p-ERK內參，圖11(b)示p_P38的電泳圖，P38作為p_P38內參，圖11(c)示p-JNK的電泳圖，JNK作為p-JNK內參；圖12示實施例6提供的？4腿作腿4-38/^38和？-見1(/7爾的累積光密度比率柱狀圖；圖12(a)示p-ERK/ERK的累積光密度比率柱狀圖，100μMNaHS+2ng/mLTGF-βI組與2ng/mLTGF-βI組之間的累積光密度比率差異極顯著(P<O.01);圖12(b)示ρ_Ρ38/Ρ38的累積光密度比率柱狀圖，100μMNaHS+2ng/mLTGF-βI組與2ng/mLTGF-βI組之間的累積光密度比率差異極顯著(P<O.01);圖12(C)示Ρ-JNK/JNK的累積光密度比率柱狀圖，100μMNaHS+2ng/mLTGF-βI組與2ng/mLTGF-βI組之間的累積光密度比率差異極顯著(P<O.01)；#P<0.Olvs對照組，*P〈0.OlvsTGF組，n=3；Na2S(ΙΟΟμΜ)預處理30分鐘降低了TGF-βI(5ng/ml)刺激細胞60分鐘后細胞內p-ERK、p_P38及p-JNK的水平；圖13示實施例7提供的SD大鼠單側輸尿管梗阻誘導的腎臟纖維化模型(UUO)及各治療組患側腎臟剖面圖；其中，I為假手術組，2為UUO組，3為依那普利(ACEI)+UUO給藥組，4為PAG(25mg/kg/d)+UUO給藥組，5為AOAA(5mg/kg/d)+UUO給藥組，6為NaHS(O.1μmol/kg/d)+UU0給藥組，7為NaHS(Iμmol/kg/d)+UU0給藥組，8為NaHS(10μmol/kg/d)+UUO給藥組；圖14示實施例7提供的SD大鼠單側輸尿管梗阻誘導的腎臟纖維化模型(UUO)及各治療組患側腎臟皮質厚度統(tǒng)計圖，顯示了不同濃度NaHS(0.l-10ymol/kg/d.1p(腹腔注射))，CBS抑制劑(A0AA5mg/kg/d.1p(腹腔注射))以及CSE抑制劑(PAG25mg/kg/d.1p(腹腔注射))對單側輸尿管梗阻誘導的腎臟纖維化模型(UUO)皮質厚度的影響；***P〈0.OlvsUUO組，n=5;其中，I為假手術組，2為UUO組，3為依那普利(ACEI)+UUO給藥組，4為NaHS(0.1μmol/kg/d)+UU0給藥組，5為NaHS(Iμmol/kg/d)+UU0給藥組，6為NaHS(10μmol/kg/d)+UU0給藥組,7為AOAA(5mg/kg/d)+UU0給藥組,8為PAG(25mg/kg/d)+UU0給藥組；依那普利(ACEI)+UUO給藥組和NaHS(Iμmol/kg/d)+UUO給藥組與UUO組之間的腎臟皮質厚度差異顯著(P<0.05)；圖15示實施例8提供的SD大鼠單側輸尿管梗阻誘導的腎臟纖維化模型(UUO)及各治療組的血肌酐、尿素氮、尿酸和血鉀檢測結果統(tǒng)計圖，顯示了不同濃度NaHS(0.1-10μmol/kg/d.1p(腹腔注射))，CBS抑制劑(A0AA5mg/kg/d.1p(腹腔注射))以及CSE抑制劑(PAG25mg/kg/d.1p(腹腔注射))對大鼠單側輸尿管梗阻誘導腎臟纖維化模型(UUO)血肌酐、尿素氮、尿酸和血鉀的影響；*P〈0.05vsUUO組，n=5;圖15Ca)示血肌酐摩爾濃度柱狀圖，NaHS(Iμmol/kg/d)+UUO給藥組與UUO組之間的血肌酐摩爾濃度差異顯著(P<0.05);圖15(b)示尿素氮摩爾濃度柱狀圖，NaHS(Iμmol/kg/d)+UUO給藥組與UUO組之間的尿素氮摩爾濃度差異顯著(P<0.05);圖15(c)示血鉀摩爾濃度柱狀圖，各組之間血鉀摩爾濃度無統(tǒng)計學差異；圖15(d)示尿酸摩爾濃度柱狀圖，各組之間尿酸摩爾濃度無統(tǒng)計學差異；其中，I為假手術組，2為UUO組，3為依那普利(ACEI)+UUO給藥組，4為NaHS(O.1μmol/kg/d)+UU0給藥組，5為NaHS(Iμmol/kg/d)+UU0給藥組，6為NaHS(10μmol/kg/d)+UUO給藥組,7為AOAA(5mg/kg/d)+UUO給藥組,8為PAG(25mg/kg/d)+UUO給藥組；圖16示實施例9提供的SD大鼠單側輸尿管梗阻誘導的腎臟纖維化模型(UUO)及各治療組腎臟組織切片HE染色光鏡圖；其中，圖16Ca)示假手術組，圖16(b)示UUO組，圖16(c)示依那普利(ACEI)+UUO給藥組，圖16(d)示NaHS(O.1μmol/kg/d)+UUO給藥組，圖16(e)示NaHS(Iμmol/kg/d)+UU0給藥組，圖16(f)示NaHS(10μmol/kg/d)+UU0給藥組，圖16(g)7]\PAG(25mg/kg/d)+UUO給藥組，圖16(h)不AOAA(5mg/kg/d)+UUO給藥組；圖17示實施例9提供的SD大鼠單側輸尿管梗阻誘導的腎臟纖維化模型(UUO)及各治療組腎臟組織切片Masson染色光鏡圖；其中，圖17(a)示假手術組，圖17(b)示UUO組，圖17(c)示依那普利(ACEI)+UUO給藥組，圖17Cd)示NaHS(O.1μmol/kg/d)+UUO給藥組，圖17(e)不NaHS(Iμmol/kg/d)+UUO給藥組，圖17(f)不NaHS(10μmol/kg/d)+UUO給藥組，圖17(g)不PAG(25mg/kg/d)+UUO給藥組，圖17(h)不AOAA(5mg/kg/d)+UUO給藥組；圖18示實施例9提供的SD大鼠單側輸尿管梗阻誘導的腎臟纖維化模型(UUO)及各治療組腎臟組織切片HE和Masson染色結果統(tǒng)計圖，顯示了不同濃度NaHS(0.1-1Oymol/kg/d.1p(腹腔注射))，CBS抑制劑AOAA(5mg/kg/d.1p(腹腔注射))及CSE抑制劑PAG(25mg/kg/d.1p(腹腔注射))對單側輸尿管梗阻誘導的腎臟纖維化模型(UUO)病理形態(tài)HE染色和腎間質膠原面積(Masson染色)的影響；***P〈0.OlvsUUO組，η=10;縱坐標為每個光鏡視野中藍色膠原纖維占整個視野的面積百分比，其中，I為假手術組，2為UUO組，3為依那普利(ACEI)+UUO給藥組，4為NaHS(O.1μmol/kg/d)+UUO給藥組，5為NaHS(Iμmol/kg/d)+UUO給藥組，6為NaHS(10μmol/kg/d)+UUO給藥組，7為AOAA(5mg/kg/d)+UUO給藥組，8為PAG(25mg/kg/d)+UUO給藥組；圖19示實施例10提供的單側輸尿管梗阻模型(UUO)造模后腎臟組織勻漿中CBS和CSE表達的變化；#P〈0.05vsUUO組，n=4;圖19(a)示CBS蛋白電泳圖，圖19(b)示CSE蛋白電泳圖，圖19(c)示CBS與β-actin的累積光密度比率統(tǒng)計分析柱狀圖；圖19(d)示CSE與β-actin的累積光密度比率統(tǒng)計分析柱狀圖；圖20示實施例10提供的單側輸尿管梗阻模型(UUO)造模后腎臟組織勻漿中a-SMA蛋白表達的變化，顯示了不同濃度NaHS(0.1-10μmol/kg.d.1p),CBS抑制劑AOAA(5mg/kg/d.1p)及CSE抑制劑PAG(25mg/kg/d.1p)對單側輸尿管梗阻模型(UUO)腎臟a-SMA表達的影響；*P〈0.05vsUUO組，n=4;其中，I為假手術組，2為UUO組，3為依那普利(ACEI)+UU0給藥組，4為NaHS(0.1μmol/kg/d)+UU0給藥組，5為NaHS(Iμmol/kg/d)+UUO給藥組，6為NaHS(10μmol/kg/d)+UUO給藥組，7為AOAA(5mg/kg/d)+UUO給藥組，8為PAG(25mg/kg/d)+UUO給藥組；與假手術組相比，UUO組的a-SMA蛋白表達量明顯升高(P<0.05);依那普利(ACEI)+UUO給藥組和NaHS(Iμmol/kg/d)+UUO給藥組的蛋白表達量與UUO組相比，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05);其中，圖20(a)示a-SMA蛋白電泳圖，圖中分子量42kd的條帶為目的條帶α-SMA(如箭頭所示)，另外一條條帶是由于抗體質量等因素造成的雜帶，雜帶可以通過優(yōu)化雜交條件去除；圖20(b)示a-SMA蛋白的累積光密度比率統(tǒng)計分析柱狀圖。具體實施例方式本發(fā)明公開了一種硫化氫釋放劑在制備治療腎臟纖維化疾病藥物中的用途，本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內容、精神和范圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發(fā)明技術。本發(fā)明提供了一種硫化氫釋放劑作為腎臟成纖維細胞增殖抑制劑的應用，硫化氫釋放劑為硫氫化鈉或硫化鈉。硫化氫釋放劑是指能夠釋·放硫化氫的化合物或組合物，常用的為硫化鈉和硫氫化鈉。細胞的增殖依賴于生長因子的刺激作用。生長因子是具有刺激細胞生長活性的細胞因子，它是一類通過與特異的、高親和的細胞膜受體結合，調節(jié)細胞生長與其他細胞功能等多效應的多肽類物質，存在于血小板和各種成體與胚胎組織及大多數培養(yǎng)細胞中，對不同種類細胞具有一定的專一性，通常培養(yǎng)細胞的生長需要多種生長因子順序的協(xié)調作用。生長因子多為廣義的肽激素，有胰島素、表皮生長因素(EGF)、成纖細胞生長因素(FGF)、血小板來源增殖因素(TOGF)以及生長激素釋放抑制因子等。離體培養(yǎng)的細胞一般需在其培養(yǎng)液中加入具有刺激細胞生長作用的胎?；蛐∨Ｑ?血清中含有多種生長因子)。本發(fā)明中以血清模擬EGF、PDGF等生長因子的作用。在本發(fā)明提供的一些實施例中，腎臟成纖維細胞通過細胞計數和BrdU滲入率驗證其增殖；在本發(fā)明提供的另外一些實施例中，通過測定細胞增殖相關基因Pcna和c-myc的蛋白表達驗證其增值。本發(fā)明還提供了一種硫化氫釋放劑作為腎臟成纖維細胞分化抑制劑的應用，硫化氫釋放劑為硫氫化鈉或硫化鈉。細胞的分化依賴轉化生長因子(TGF)的作用。TGF是指兩類多肽類生長因子，TGF-α和TGF-β。TGF-α是由巨噬細胞，腦細胞和表皮細胞產生，可誘導上皮發(fā)育；人類TGF-β有TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3三個亞型，它是一多功能蛋白質，可以影響多種細胞的生長，分化、細胞凋亡及免疫調節(jié)等功能。TGF-β可以結合到細胞表面的TGF-β受體結合而激活其受體。TGF-β受體是絲氨酸/蘇氨酸激酶受體。腎臟成纖維細胞分化成肌纖維母細胞的分子標識是a-SMA，在本發(fā)明提供的實施例中，通過測定a-SMA的mRNA轉錄和蛋白表達水平的變化驗證腎臟成纖維細胞的分化；通過腎臟成纖維細胞中膠原相關基因collagen-1與細胞外基質相關基因fibronectin的mRNA轉錄和蛋白表達驗證腎臟成纖維細胞的分化。本發(fā)明還提供了一種硫化氫釋放劑作為MAPK信號通路的抑制劑，硫化氫釋放劑為硫氫化鈉或硫化鈉。MAPK信號通路是生物體內重要的信號轉導系統(tǒng)之一，在哺乳動物細胞中MAPK亞族主要包括JNK、p38和ERK等，這幾種蛋白通過磷酸化參與細胞的增殖、分化、轉化及凋亡的調節(jié)。在本發(fā)明提供的實施例中，硫化氫釋放劑抑制了腎臟成纖維細胞內ERK、P38或JNK蛋白磷酸化。本發(fā)明還提供了一種硫化氫釋放劑用于制備治療腎臟纖維化疾病藥物的用途，硫化氫釋放劑為硫氫化鈉或硫化鈉。本發(fā)明還提供了一種藥物制劑，包含硫化氫釋放劑以及藥學上可接受的輔料，硫化氫釋放劑為硫氫化鈉或硫化鈉。根據給藥途徑，本發(fā)明提供的藥物制劑可以為口服劑，也可以為注射劑。根據藥物狀態(tài)，本發(fā)明提供的口服劑可以為丸劑、顆粒劑、片劑、膠囊劑或散劑。直接口服硫化鈉或硫氫化鈉藥物制劑，硫化鈉或硫氫化鈉藥物制劑會與胃腸道中的酸發(fā)生反應迅速釋放硫化氫氣體，對身體造成毒害，因此，本發(fā)明提供的口服劑需利用包衣技術對硫化鈉或硫氫化鈉進行緩釋處理。根據注射劑的狀態(tài)，本發(fā)明提供的注射劑為粉針劑或注射液。硫化氫是有毒氣體，直接進入血液可能會引起中毒，因此，本發(fā)明中注射劑的注射方式為肌肉注射。本發(fā)明提供了一種硫化氫釋放劑用于制備治療腎臟纖維化疾病藥物的應用，硫化氫釋放劑為硫氫化鈉或硫化鈉。在本發(fā)明提供的一些實施例中，以血清(FBS)刺激腎間質成纖維細胞，測定細胞增殖和細胞增殖相關基因的蛋白表達，結果顯示100μM的Na2S抑制了FBS所致的腎間質成纖維細胞的增殖，抑制了腎間質成纖維細胞的DNA合成和BrdU滲入，并抑制了細胞增殖相關基因的蛋白PCNA和c-myc的表達；在本發(fā)明提供的另外一些實施例中，以TGF-βI刺激腎間質成纖維細胞，測定細胞內a-SMAXollagen-1和Fibronectin的mRNA轉錄和a-SMA蛋白表達變化，結果顯示Na2S抑制了a-SMA的mRNA轉錄和蛋白表達，抑制了Collagen-1和Fibronectin的mRNA的轉錄；通過檢測p38、ERK和JNK的蛋白磷酸化水平變化，結果顯示Na2S抑制了MAPK通路的激活。在細胞實驗的基礎上，本發(fā)明提供的一些實施例通過在體實驗，研究硫化鈉或硫氫化鈉對腎臟組織、腎功能、膠原纖維面積、相關蛋白表達的影響，結果顯示O.1μmol/kg/d和Iμmol/kg/dNaHS治療組的皮質厚度顯著高于UUO模型組，Iμmol/kg/dNaHS治療組的皮質厚度優(yōu)于ACEI治療組；與UUO組相比，Iμmol/kg/dNaHS治療組顯著降低了血肌酐水平,0.1μmol/kg/dNaHS治療組顯著降低了尿素氮水平，但各治療組均未對血鉀和尿酸水平產生顯著影響；0.1μmol/kg/d和Iμmol/kg/dNaHS治療組顯著減少了間質膠原纖維沉積，顯著抑制了a-SMA蛋白表達水平。由此可見，本發(fā)明通過硫氫化鈉或硫化鈉作用于腎臟成纖維細胞，抑制了腎間質成纖維細胞增殖和分化，抑制了腎間質膠原纖維沉積，同時改善了腎功能，而不引起血肌酐和血鉀水平的進一步升高，具有抗腎臟纖維化作用。本發(fā)明中硫化氫釋放劑的用途及含有硫化氫釋放劑的藥物中所用試劑均可由市場購得。下面結合實施例，進一步闡述本發(fā)明實施例1MTT法測定腎間質成纖維細胞的增殖將腎間質成纖維細胞株用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基置于37°C，5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔天換液，0.25%胰酶消化，I3傳代，獲得腎間質成纖維細胞(NRK-49F)。取2X103個腎間質成纖維細胞(NRK-49F)接種于96孔板中培養(yǎng)。以血清(FBS)模擬EGF、PDGF等生長因子的作用。根據FBS濃度梯度進行實驗細胞分組1%FBS，3%FBS，5%FBS,10%FBS,1%FBS+Na2S,3%FBS+Na2S,5%FBS+Na2S,10%FBS+Na2S,其中，Na2S的濃度為100μM0Na2S先預處理30分鐘。細胞處理24小時后每個孔加入MTT(5mg/mL)20μL，4小時后棄去培養(yǎng)基，每孔加入150μLDMSO溶解甲臢，酶標儀490nm波長讀取OD值。試驗結果參見圖1。由圖1可知，H2S供體Na2S(100μM)預處理抑制了不同濃度FBS所致的腎間質成纖維細胞(NRK-49F)的增殖，抗增殖效應在10%FBS組尤為明顯。實施例2MTT法測定腎間質成纖維細胞的增殖取實施例1制備的2XIO3個腎間質成纖維細胞(NRK-49F)接種于96孔板中培養(yǎng)。以血清(FBS)模擬EGF、PDGF等生長因子的作用。根據Na2S濃度梯度進行實驗細胞分組空白對照組，FBS組，IμMNa2S+FBS,10μMNa2S+FBS,50μMNa2S+FBS,100μMNa2S+FBS，500yMNa2S+FBS，其中，FBS采用10%的FBS。Na2S先預處理30分鐘。細胞處理24小時后每個孔加入MTT(5mg/mL)20μL，4小時后棄去培養(yǎng)基，每孔加入150μLDMSO溶解甲臜，酶標儀490nm波長讀取OD值。試驗結果參見圖2。由圖2可知，Na2S濃度為10100μM時，10%FBS所致的NRK-49F的抗增殖效應顯著，Na2S濃度為100μM時尤為明顯。實施例3BrdU滲入法測定腎間質成纖維細胞的增殖取實施例1制備的4Χ104個細胞(NRK-49F)接種于24孔板內，用含O.5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜。細胞貼壁后進行實驗分組空白對照組，10%FBS組，Na2S組(100yM),10%FBS+Na2S(100μΜ)組。10%FBS刺激細胞增殖5小時，加入Brdu(ΙΟμΜ)繼續(xù)孵育5小時。細胞處理結束后用4%多聚甲醛固定20分鐘，繼以2ΝHCLDNA37°C變性20分鐘。5%BSA封閉Ih后加入ant1-Brdu—抗(1:100)4°C過夜，AlexaFluor555DonkeyAnt1-MouseIgG二抗(1:500)室溫I小時,使用含DAPI的Vectormountingmedia封片。突光顯微鏡下觀察10個互不重疊的視野，熒光顯微鏡圖片如圖3所示，用Image-J軟件進行細胞計數，計算染色陽性細胞(紅色)與細胞核(藍色)的百分比。使用SPSS17.O軟件進行統(tǒng)計分析，所有數據均采用均值土標準誤(SEM)來表示。各組間差異比較采用One-wayANOVA方差分析，P<0.05為統(tǒng)計學上有顯著性差異，結果見圖4。由圖3可知，與對照組相比，10%FBS所致的腎間質成纖維細胞(NRK-49F)的DNA合成和Brdu(紅色)滲入增加。Na2S(100μM)預處理30分鐘后，NRK-49F細胞的DNA合成和Brdu滲入減少，著紅色的細胞核較FBS組減少，熒光強度減弱。由圖4可知，10%FBS組與10%FBS+Na2S(100μΜ)組的fcdu滲入量差異顯著，表明Na2S處理組的fcdu滲入明顯減少。實施例4腎間質成纖維細胞內PCNA、C-myc蛋白的檢測取實施例1制備的細胞(NRK-49F)接種于35mm培養(yǎng)皿。待細胞融合至70%時進行實驗分組空白對照組，10%FBS組，Na2S(100μΜ)組，Na2S/NaHS(100μΜ)加10%FBS組。Na2S預處理30分鐘。用RIPA裂解液提取細胞總蛋白，所有操作在冰上進行，其步驟為首先將細胞裂解液(RIPA原液IOmL+蛋白酶抑制劑(羅氏completeultratablets)—片)加入培養(yǎng)皿中，加入量為100μL/皿，用細胞刮刮取細胞，轉入1.5mLEP管，EP管置于普通冰盒上靜置30min;然后進行低溫高速離心,溫度為4°C,轉速為13200rpm,離心15min;最后，將EP管中上清液轉移至一新EP管中，-80°C保存。使用BCA試劑盒進行總蛋白濃度的測定，操作步驟按照產品說明書操作。配制上樣蛋白。通過換算,取適量蛋白原液,加入5X上樣緩沖液，并用ddH20將每個上樣的蛋白樣品配平成Iug/μL，總體積100μL。95°C煮5分鐘，使蛋白變性。煮過后的樣品_20°C保存。制備10%的分離膠，體系如下CidH2O3.3niL1.5molTris-HCL(PH=8.8)2.5mL30%Acr-Bis(聚乙丙烯)4_0niL10%SDSΟΟμ10%APSΟΟμTEMED4-6μ制備4%的濃縮膠，體系如下ddH203.0mL30%Acr-Bis(聚乙丙烯)0.75mL0.5mo!Tris-HCL(PH=(5.8).25mL10%SDS50μ10%APS50μTEMED5-8μ取總量約20ug蛋白上樣進行電泳，恒壓90V，待marker跑開后，改用恒壓120V，直至藍色指示條帶至膠底部。然后進行轉膜，轉膜條件為恒流350mA，90min。取出PVDF膜，用5%milk-TBST封閉I小時。之后進行一抗孵育，用TBST洗滌PVDF膜3次，IOmin/次，分別孵ant1-PCNA抗體(1:1000稀釋)，ant1-C_myc抗體(1:500稀釋)4°C過夜。最后進行二抗孵育，用TBST洗漆PVDF膜3次，IOmin/次，分別孵Ant1-rabbit/Ant1-rabbitIgG,HRP-LinkedAntibody(1:2000稀釋)，室溫孵育I小時。二抗孵育結束后，ECL發(fā)光試劑A液和B液等體積混合，均勻覆蓋在PVDF表面，半分鐘后用凝膠成像儀顯影。NRK-49F增殖相關蛋白PCNA和C-myc的凝膠成像圖參見圖5。采用ImageJ軟件對條帶的光密度進行分析，β-actin作為內參校正各條帶的累積光密度。使用SPSS17.O軟件對PCNA和Cnyc蛋白的光密度進行統(tǒng)計分析，所有數據均采用均值土標準誤(SEM)來表示。各組間差異比較采用One-wayANOVA方差分析。P〈0.05為統(tǒng)計學上有顯著性差異。PCNA和C-myc蛋白光密度的統(tǒng)計分析結果見圖6。由圖5可知，與對照組相比，10%FBS處理24小時后NRK-49F增殖相關蛋白(PCNA和C-myc)表達增加。Na2S(100μΜ)預處理30分鐘降低了NRK-49F增殖相關蛋白PCNA和C-myc的表達；由圖6可知，與對照組相比，Na2S(100μΜ)預處理30分鐘后的NRK-49F增殖相關蛋白PCNA和C-myc的表達量顯著降低了。結果表明Na2S能夠通過降低增殖相關蛋白的表達降低細胞增殖。實施例5腎間質成纖維細胞內ct-sma、collagen-1、fibronectin的mRNA和α-SM蛋白的檢測取實施例1制備的細胞(NRK-49F)接種于35mm培養(yǎng)皿。待細胞融合至70%時進行實驗分組空白對照組，TGF-βI(2ng/mL)組，Na2S/NaHS(100μΜ)組，Na2S/NaHS(ΙΟΟμΜ)加TGF-βI(2ng/mL)組。Na2S/NaHS預處理30分鐘，細胞處理12小時后提取細胞RNA，24小時后提取細胞總蛋白。Trizol法提取細胞總RNA。每個培養(yǎng)皿中加入ImLTrizol試劑(Invitrogen),細胞提取物轉入1.5mLEP管。每管加入氯仿200μL，劇烈震蕩15秒后，4°C12000g離心15分鐘。離心后小心吸取上層透明水相400μL，加入等體積異丙醇，靜置15分鐘后4°C、12000g離心15分鐘。棄去上清后加入lmL75%乙醇，4°C、7500g離心10分鐘，晾干沉淀后加DEPC水10μL/管，測定RNA濃度。使用Fenmentas第一鏈合成試劑盒,按照說明書操作，將IygSRNA逆轉成cDNA,反應體系為模板RNAIμgoligo(dT)primerIuL加入滅菌水補足體系總量至12μL065°C變性5分鐘,加入以下體系5xReactionBuffer4μιRnaseInhibitor(20ιι/μ)IμιIOmMdNTPMix2μΙM-MuLVReverseTranscriptase(20ιι/μΕ)Iμ加入滅菌水補足體系總量至20μL。42°C孵育60分鐘。使用Fenmentas第二鏈合成試劑盒,按照說明書操作,擴增DNA。其中，利用核苷酸序列如SEQIDNO:1所示的上游引物和核苷酸序列如SEQIDNO:2所示的下游引物對α-sma進行擴增；利用核苷酸序列如SEQIDNO:3所示的上游引物和核苷酸序列如SEQIDNO4所示的下游引物對collagenl進行擴增；利用核苷酸序列如SEQIDNO5所示的上游引物和核苷酸序列如SEQIDNO6所示的下游引物對fibronectin進行擴增，利用核苷酸序列如SEQIDNO:7所示的上游引物和核苷酸序列如SEQIDNO:8所示的下游引物對GAPDH進行擴增。PCR反應體系為cDNA1.OfiL10XPCRBuffer2.5μIOmMdNTPMix0.5μ25mMMgci2\.5μΙ20μΜprimer(Forward)0.7μ20μΜprimer(Reverse)0.7μTagDNA多聚酶0.25μ加入滅菌水17.85μL補足體系總量至25μL。PCR反應條件為94°C5分鐘，94°C30秒，54°C45秒，72°C30秒，72°C10分鐘，35個循環(huán)。配制2%瓊脂糖膠，PCR擴增產物在水平電泳儀上電泳后，使用凝膠成像儀成像，a-sma、collagen-1和fibronectinPCR擴增產物的電泳圖見圖7、圖9(a)。將a-SMA蛋白進行WesternBlot分析，方法同前。所用抗體為a-SMA(1:500)。a-SMA蛋白的凝膠成像圖見圖9(b)。采用ImageJ軟件對條帶的光密度進行分析，GAPDH、β-actin作為內參校正各條帶的累積光密度。使用SPSS17.O軟件對a-smaPCR擴增產物、collagen-1PCR擴增產物、bronectinPCR擴增產物和a-SMA蛋白的光密度進行統(tǒng)計分析，所有數據均采用均值土標準誤(SEM)來表示。各組間差異比較采用One-wayANOVA方差分析。P〈0.05為統(tǒng)計學上有顯著性差異。統(tǒng)計分析結果見圖8、圖10。由圖7可知，TGF-βI(2ng/mL)孵育12小時后，細胞內a-sma、collagen-Ι和fibronectinmRNA水平升高，提示腎臟成纖維細胞轉化為肌纖維母細胞；NaHS(100μΜ)抑制了a-sma、collagen-1和fibronectin的mRNA表達，并具有統(tǒng)計學意義(圖8)。由圖9可知，TGF-βΙ(2ng/mL)孵育12小時后，細胞內a-SMA的mRNA和蛋白表達升高；Na2S(ΙΟΟμΜ)預處理降低了α-SMAmRNA和蛋白的表達，表明Na2S(ΙΟΟμΜ)抑制了TGF-βΙ(2ng/ml)刺激NRK-49F24小時后a-SMAmRNA和蛋白表達，并具有統(tǒng)計學意義(圖10)。實施例6腎間質成纖維細胞內p-ERK、p-P38和p-JNK蛋白的檢測取實施例1制得的細胞(NRK-49F)接種于35mm培養(yǎng)皿。待細胞融合至70%時進行實驗分組空白對照組，TGF-βI(2ng/mL)組，Na2S/NaHS(ΙΟΟμΜ)組，Na2S/NaHS(ΙΟΟμΜ)jjpTGF-βI(2ng/mL)組。Na2S/NaHS預處理30分鐘。處理I小時后，每皿加入IOOyLlXloadingbuffer，刮取細胞后，95°C煮5分鐘，使蛋白變性，_20°C保存。然后進行WesternBlot檢測，操作同前，所用抗體為p-ERK/total-ERK(1:500)、p-P38/total_P38(1:500)和p-JNK/total-JNK(1:500)。凝膠成像圖見圖11。采用ImageJ軟件對條帶的光密度進行分析，ERK、P38和JNK作為內參校正各條帶的累積光密度。使用SPSS17.O軟件對其光密度進行統(tǒng)計分析，所有數據均采用均值土標準誤(SEM)來表示。各組間差異比較采用One-wayANOVA方差分析。P〈0.05為統(tǒng)計學上有顯著性差異。統(tǒng)計分析結果見圖12。由圖11、圖12可知，TGF-βI(2ng/mL)孵育I小時后，細胞內p_P38、p-JNK和P-ERK蛋白表達升高，Na2S(10(^10預處理降低了？4腿、？-38和？-見1(蛋白的磷酸化，結果表明H2S可以通過抑制MAPK通路抑制腎臟成纖維細胞分化為肌纖維母細胞。實施例7腎臟標本的制備及皮質厚度的測定動物材料為SD大鼠,雄性,體重180±15.6g,由蘇州大學實驗動物中心提供,飼養(yǎng)于室溫環(huán)境下，明暗周期12h，自由進食，飲水不限，普通大鼠飼料喂養(yǎng)，實驗前適應環(huán)境3天。用4%水合氯醛溶液(lmL/100g)腹腔注射麻醉后，將大鼠仰臥固定于手術臺上，腹部備皮，常規(guī)消毒鋪巾，沿左側腹直肌外緣垂直切開皮膚、肌肉和筋膜，暴露腹腔，翻出腸管，于左側髂動脈處找到并鈍性分離左側輸尿管，取4-0號手術縫線于輸尿管中上段結扎兩道，并從中間剪斷，腸管復位后逐層縫合，獲得單側輸尿管梗阻模型(UU0)。假手術組僅分離，但不結扎和剪斷左側輸尿管。隨機分成8組，分別為假手術組、模型(UUO)組(生理鹽水)、UUO+依那普利(ACEI)組、UUO+NaHS給藥組(O.1μmol/kg/d)、UUO+NaHS給藥組(Iμmol/kg/d)、UUO+NaHS給藥組(10μmol/kg/d)、UU0+A0AA(H2S合成酶CBS抑制劑)給藥組(5mg/kg/d)、UU0+PAG(H2S合成酶CSE抑制劑)給藥組(25mg/kg/d)。給藥于造模前3天開始，每日一次直至術后14天。NaHS,AOAA和PAG給予腹腔注射給藥，依那普利給予灌胃。術后14天，4%水合氯醛麻醉動物，打開腹腔暴露下腔靜脈，靜脈取血4mL，得到靜脈血標本。剪斷下腔靜脈，用生理鹽水經心臟灌注至腎臟色澤轉白，取出左側腎臟，剝除腎包膜，去除腎積水后，得到腎臟標本。取腎臟標本，稱重，測量腎臟長徑。腎臟再縱切為二，記錄經腎門中段腎皮質厚度。如圖13所示，與假手術組相比，UUO組腎臟體積增大，皮質變??；依那普利組和NaHS給藥組(Iμmol/kg/d)與UUO組相比，腎臟體積縮小，皮質厚度增加。如圖14所示，依那普利組和NaHS給藥組(Iμmol/kg/d)與UUO組相比，皮質厚度增加差別有統(tǒng)計學意義(p〈0.05)。而NaHS給藥組(0.1μmol/kg/d)、NaHS給藥組(ομmol/g/d)以及H2S合成酶抑制劑組與UUO組相比腎臟體積和皮質厚度差別不明顯。實施例8腎功能和電解質的測定取實施例7制備的腎臟靜脈血標本4mL，送檢蘇州大學附屬第二醫(yī)院檢驗科生化室測定腎功能(尿素氮、肌酐和尿酸)和電解質(鉀、鈉、鈣、磷)。由圖15可知，與假手術組相比，UUO組血肌酐和尿素氮升高，提示模型組腎功能受損。與UUO組相比，NaHS給藥組(Iμmol/kg/d)血肌酐和尿素氮水平下降，差別有統(tǒng)計學意義(P〈0.05)，H2S合成酶抑制劑組血肌酐和尿素氮有升高趨勢。各治療組均沒有對血鉀和尿酸水平產生顯著影響。各組別血鉀水平雖無無統(tǒng)計學差別，NaHS(Iμmol/kg/d)給藥組血鉀有下降趨勢，但提示此劑量下NaHS不會造成血鉀升高。實施例9腎臟組織的病理染色取實施例7制備的腎臟標本，用石蠟包埋，切成4μm切片進行HE染色和Masson染色。HE染色過程4μm切片二甲苯脫蠟30分鐘X3次，無水酒精各3分鐘X2次，95%酒精3分鐘，85%酒精3分鐘，75%酒精3分鐘，自來水洗5分鐘，蘇木素染10分鐘，自來水洗2分鐘，1%鹽酸酒精分化10-30秒，自來水洗返藍15分鐘，90%酒精I分鐘，伊紅30秒，95%酒精各I秒，無水酒精2分鐘X3次，二甲苯5分鐘X2次，中性樹膠封片。HE染色評分每例標本光鏡下觀察，200倍視野下觀察左上、右上、左下、右下和中間5個視野。根據腎小管空泡變性、小管擴張、小管萎縮、紅細胞和蛋白管型、間質水腫和間質纖維化和間質炎癥細胞浸潤等8項指標觀察腎臟病理變化和對腎小管間質損傷進行評分。Masson染色過程4μπι切片二甲苯脫蠟30分鐘X3次。無水酒精各3分鐘X2次，95%酒精3分鐘，85%酒精3分鐘，75%酒精3分鐘，水洗5分鐘。3%重鉻酸鉀溶液氧化過夜，水洗10分鐘，Weigert鐵蘇木素溶液5分鐘，水洗3分鐘，1%鹽酸酒精分化30秒，水洗5分鐘，麗春紅酸性品紅液5分鐘，水洗2分鐘，O.2%乙酸溶液洗2次，1%磷目酸液分化5分鐘，2%苯胺蘭液5分鐘，O.2%乙酸溶液洗3次，無水酒精脫水3次，VancIeart透明劑透明，Vanmount封片。Masson染色半定量分析200倍視野下隨機選取互不重疊的視野10個，使用Image-ProPlus6.O軟件計算每個視野中藍色膠原纖維占整個視野的面積百分比。腎組織HE和Masson染色結果分別見圖16、圖17，統(tǒng)計分析結果見圖18。結果顯示，UUO組腎小管萎縮，伴腎小管腔擴張，腎間質擴大，腎間質炎癥細胞增多，藍色膠原纖維沉積明顯。與UUO組相比，依那普利組、NaHS給藥組(O.1μmol/kg/d)和NaHS給藥組(Iμmol/kg/d)腎小管萎縮程度相對較輕，藍色膠原面積減少，差別有統(tǒng)計學意義(P〈0.05)，尤以NaHS給藥組(Iμmol/kg/d)組藍色膠原面積最少。H2S合成酶抑制劑組與UUO相比腎間質膠原纖維面積無明顯減少。實施例10CBS、CSE和a-SMA蛋白的檢測取實施例7制得的腎臟標本用RIPA裂解液提取大鼠腎臟總蛋白，所有操作在冰上進行，操作步驟為切取腎臟標本，稱重(約2030mg)后置入1.5mLEP管；按照lmg/10yL的比例加入相應體積的組織裂解液(RIPA原液IOmL+蛋白酶抑制劑(羅氏completeultratablets)一片)，組織勻漿器勻漿；勻漿結束后置于普通冰盒上靜置30min;將勻漿置于冷凍離心機中低溫高速離心，溫度為4°C，轉速為13200rpm，離心15min;離心結束后，將EP管中上清液轉移至EP管中，-80°C保存。使用BCA試劑盒按照產品說明書操作，測定總蛋白濃度。通過換算，取適量蛋白原液，加入5X上樣緩沖液,并用ddH20將每個上樣的蛋白樣品配平成4ug/μL，總體積100μL。95°C煮5分鐘，使蛋白變性。煮過后的樣品_20°C保存。然后取蛋白樣品進行WesternBlot印跡試驗,方法同前,所用抗體為ant1-CBS抗體(I1000稀釋)，ant1-CSE抗體(I250稀釋)和ant1-SMA抗體(I1000稀釋)。采用ImageJ軟件對條帶的光密度進行分析，β-actin作為內參校正各條帶的累積光密度。使用SPSS17.O軟件進行統(tǒng)計分析，所有數據均采用均值土標準誤(SEM)來表示。各組間差異比較采用One-wayANOVA方差分析。P〈0.05認為統(tǒng)計學上有顯著性差異。由圖19可知，與假手術組相比，UUO組CBS蛋白表達明顯下降(P〈0.05)，而CSE表達兩組無統(tǒng)計學差異。這一結果提示腎臟纖維化模型中，內源性H2S水平可能也是下降的，支持外源性補充或適度提高H2S水平、或通過調節(jié)內源性H2S生成對腎臟纖維化具有切實的療效。由圖20可知，與假手術組相比，UUO組a-SMA蛋白表達明顯升高(P〈0.05)，進一步驗證造模成功。與UUO組相比，依那普利組、和NaHS(Iμmol/kg/d)給藥組a-SMA表達下降(P〈0.05)，其余組別a-SMA表達與UUO組相比無差異，表明NaHSlμmol/kg/d腹腔注射能夠改善腎臟纖維化。圖20(a)中分子量42kd的條帶為目的條帶a-SMA(如箭頭所示),另外一條條帶是由于抗體質量等因素造成的雜帶，雜帶可以通過優(yōu)化雜交條件去除。實施例11硫化氫釋放劑藥物片劑的制備取市售的硫化鈉與常規(guī)輔料，按照常規(guī)方法制備獲得硫化氫釋放劑藥物片劑。實施例12硫化氫釋放劑藥物丸劑的制備取市售的硫氫化鈉與常規(guī)輔料，按照常規(guī)方法制備獲得硫化氫釋放劑藥物丸劑。實施例13硫化氫釋放劑藥物顆粒劑的制備取市售的硫化鈉與常規(guī)輔料，按照常規(guī)方法制備獲得硫化氫釋放劑藥物顆粒劑。實施例14硫化氫釋放劑藥物膠囊劑的制備取市售的硫化鈉與常規(guī)輔料，按照常規(guī)方法制備獲得硫化氫釋放劑藥物膠囊劑。實施例15硫化氫釋放劑藥物散劑的制備取市售的硫氫化鈉與常規(guī)輔料，按照常規(guī)方法制備獲得硫化氫釋放劑藥物散劑。實施例16硫化氫釋放劑藥物粉針劑的制備取市售的硫氫化鈉與常規(guī)輔料，按照常規(guī)方法制備獲得硫化氫釋放劑藥物粉針齊U，制得的硫化氫釋放劑藥物粉針劑的注射方式為肌肉注射。實施例17硫化氫釋放劑藥物注射液的制備取市售的硫化鈉與常規(guī)輔料，按照常規(guī)方法制備獲得硫化氫釋放劑藥物注射液，制得的硫化氫釋放劑藥物注射液的注射方式為肌肉注射。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。權利要求1.一種硫化氫釋放劑作為腎臟成纖維細胞增殖抑制劑的應用，所述硫化氫釋放劑為硫氫化鈉或硫化鈉。2.一種硫化氫釋放劑作為腎臟成纖維細胞分化抑制劑的應用，所述硫化氫釋放劑為硫氫化鈉或硫化鈉。3.一種硫化氫釋放劑作為MAPK通路的抑制劑，所述硫化氫釋放劑為硫氫化鈉或硫化鈉。4.根據權利要求3所述的抑制劑，其特征在于，所述硫化氫釋放劑抑制腎臟成纖維細胞內ERK、P38或JNK蛋白磷酸化。5.一種硫化氫釋放劑用于制備治療腎臟纖維化疾病藥物的用途，所述硫化氫釋放劑為硫氫化鈉或硫化鈉。6.一種藥物制劑，其特征在于，包含硫化氫釋放劑以及藥學上可接受的輔料，所述硫化氫釋放劑為硫氫化鈉或硫化鈉。7.根據權利要求6所述的藥物制劑，其特征在于，所述藥物制劑的劑型為口服劑或注射劑。8.根據權利要求7所述的藥物制劑，其特征在于，所述口服劑為丸劑、顆粒劑、片劑、膠囊劑或散劑。9.根據權利要求7所述的藥物制劑，其特征在于，所述注射劑為粉針劑或注射液。10.根據權利要求7所述的藥物制劑，其特征在于，所述注射劑的注射方式為肌肉注射。全文摘要本發(fā)明涉及腎臟纖維化疾病治療用藥領域，特別涉及一種硫化氫釋放劑在制備治療腎臟纖維化疾病藥物中的用途。該用途是一種硫化氫釋放劑用于制備治療腎臟纖維化疾病藥物的應用，硫化氫釋放劑為硫氫化鈉或硫化鈉。本發(fā)明提供的用途通過硫氫化鈉或硫化鈉作用于腎臟成纖維細胞，抑制了腎間質成纖維細胞增殖和分化，抑制了腎間質膠原纖維沉積，同時改善了腎功能，而不引起血肌酐和血鉀水平的進一步升高，具有抗腎臟纖維化作用。文檔編號A61K33/04GK103040861SQ201210524309公開日2013年4月17日申請日期2012年12月7日優(yōu)先權日2012年12月7日發(fā)明者胡麗芳,宋鍇,劉春風申請人:蘇州大學