專(zhuān)利名稱(chēng)：積雪酸在制備預(yù)防或治療腎臟纖維化的藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及積雪酸在制藥中的應(yīng)用，尤其涉及積雪酸在制備預(yù)防或治療腎臟纖維化的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
積雪草是一種植物藥，積雪苷是從積雪草中提取的物質(zhì)，也稱(chēng)為積雪甙(Asiaticoside)，結(jié)構(gòu)見(jiàn)式II。
式II研究發(fā)現(xiàn)積雪苷在治療皮膚粘膜損傷后，其具有纖維疤痕過(guò)增生作用。該物質(zhì)作為相關(guān)用途的化妝品和藥品均有上市，在這些產(chǎn)品中積雪苷是其主要活性成份。積雪酸是積雪苷脫糖后即形成的苷元，其結(jié)構(gòu)見(jiàn)式I所示 式I

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供積雪酸在制備預(yù)防或治療腎臟纖維化的藥物中的應(yīng)用。
其中，所述的腎臟可為腎間質(zhì)和/或腎小球，優(yōu)選腎間質(zhì)。
探討積雪酸(JXS)對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)大鼠腎間質(zhì)纖維化的保護(hù)作用。方法將大鼠隨機(jī)分為UUO組和UUO+JXS組，另設(shè)假手術(shù)(SHAM)組。用藥組(即UUO+JXS組)于術(shù)前三天灌胃給予積雪酸20mg/kg，對(duì)照組(即SHAM組)和UUO組給予等體積生理鹽水，直至術(shù)后第21天處死動(dòng)物，觀(guān)察左側(cè)腎臟病理學(xué)改變，比較腎間質(zhì)基質(zhì)含量和腎間質(zhì)纖維化程度；以α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)的免疫組化觀(guān)察腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)型情況。
本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于本發(fā)明通過(guò)用積雪酸對(duì)大鼠腎臟纖維化的影響，證實(shí)了積雪酸具有抗腎臟纖維化的作用。因而，積雪酸可作為活性成份用于制備抗腎臟纖維化的藥物。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例11.材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 wistar大鼠(中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，雄性，健康清潔級(jí)，8周齡，體重180～220g，飼養(yǎng)環(huán)境為每籠5只，室溫22±2℃，相對(duì)濕度55±2％。
1.2藥物與試劑 積雪酸由廣西昌州天然產(chǎn)物開(kāi)發(fā)有限公司或上海醫(yī)藥工業(yè)研究院制造，小鼠抗大鼠α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)抗體購(gòu)自SIGMA公司，兔抗小鼠IgG即用型二抗購(gòu)自上?？贵w公司，DBA顯色試劑盒購(gòu)自華美公司。
1.3方法1.3.1動(dòng)物模型制作 手術(shù)時(shí)大鼠以10％水合氯醛0.03ml/kg IP麻醉后右臥位固定，剪毛消毒，左側(cè)腹部切口，分離左側(cè)輸尿管，5-0號(hào)絲線(xiàn)結(jié)扎兩道，上一道結(jié)扎點(diǎn)位于左腎下極水平，在兩道結(jié)扎點(diǎn)間剪斷輸尿管，逐層縫合制作UUO模型。假手術(shù)組僅開(kāi)腹并游離左側(cè)輸尿管，但不結(jié)扎和剪斷。
1.3.2動(dòng)物分組及給藥 大鼠隨機(jī)分為三組，分別為假手術(shù)(SHAM)組、UUO組和UUO+JXS組，在UUO術(shù)前三天開(kāi)始給藥JXS 36mg/kg直至UUO術(shù)后第21天。
1.3.3檢查項(xiàng)目 術(shù)后第21天血標(biāo)本分離出血清檢測(cè)生化常規(guī)，處死動(dòng)物，抽取UUO大鼠左側(cè)殘余尿定量；留取左側(cè)腎臟，腎組織分2部分，一部分作光鏡病理檢查，另一部分經(jīng)皮、髓質(zhì)分離后置于-70℃凍存作α-SMA免疫組化。SHAM大鼠留取左側(cè)腎臟作同樣處理。
1.3.4組織病理檢查 腎組織經(jīng)4％多聚甲醛緩沖液固定，石蠟包埋后3μm切片，進(jìn)行PAS和MASSON染色。光鏡下觀(guān)察PAS染色切片皮質(zhì)腎間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤(rùn)程度和纖維化等病理學(xué)改變，雙盲給予PAS染色下腎間質(zhì)病變計(jì)分，標(biāo)準(zhǔn)為0分(間質(zhì)病變占間質(zhì)總量＜5％)；1分(間質(zhì)病變占間質(zhì)總量5％-15％)；2分(間質(zhì)病變占間質(zhì)總量15％-30％)；3分(間質(zhì)病變占間質(zhì)總量30％-60％)；4分(間質(zhì)病變占間質(zhì)總量＞60％或有局灶性壞死)。每張切片在放大200倍情況下取10個(gè)不重疊的視野，分別對(duì)每個(gè)視野進(jìn)行打分，取平均值作為該標(biāo)本的間質(zhì)病變計(jì)分。對(duì)MASSON染色腎組織切片進(jìn)行半定量分析，具體步驟如下采用北航醫(yī)學(xué)圖像分析管理系統(tǒng)，在同一條件下對(duì)每張標(biāo)本選取15個(gè)不重復(fù)視野(40×)，將呈現(xiàn)為綠色的纖維區(qū)域(去除腎小球和大血管)視為陽(yáng)性目標(biāo)，以陽(yáng)性面積與統(tǒng)計(jì)場(chǎng)總面積的比值作為腎小管間質(zhì)的纖維化指數(shù)。采用北航醫(yī)學(xué)圖像采集和分析系統(tǒng)軟件對(duì)MASSON染色進(jìn)行分析。
1.3.5α-SMA免疫組化 切片常規(guī)脫蠟至無(wú)水，浸入37℃含1.5％H2O2的甲醇30min消除內(nèi)源性過(guò)氧化酶，胰蛋白酶消化暴露抗原位點(diǎn)，一抗(小鼠抗大鼠α-SMA抗體，1∶200)4℃過(guò)夜，繼而以對(duì)應(yīng)即用型二抗(兔抗小鼠IgG，1∶200)37℃放置30min，最后在顯微鏡下用DAB顯色。同時(shí)采用刪除第一抗體的方法作為陰性對(duì)照。在高倍鏡下(400×)對(duì)每張切片隨機(jī)選取15個(gè)不重疊的視野，采用北航醫(yī)學(xué)圖像分析管理系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析，結(jié)果以陽(yáng)性目標(biāo)總面積/統(tǒng)計(jì)場(chǎng)總面積表示。所有數(shù)據(jù)用x±s表示，利用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用單因素方差分析及SNK檢驗(yàn)比較各組差異。
2.結(jié)果2.1實(shí)驗(yàn)大鼠基礎(chǔ)指標(biāo)觀(guān)察 UUO大鼠左側(cè)腎盂及輸尿管擴(kuò)張，內(nèi)為梗阻后的殘余尿。UUO組和UUO+JXS組殘余尿量無(wú)顯著性差異，各組動(dòng)物血清生化指標(biāo)均為正常，組間比較無(wú)顯著性差異，見(jiàn)表1。
表1 UUO模型大鼠基礎(chǔ)指標(biāo)(n＝6)

Triglyceride甘油三酯；Cholesterol膽固醇；Glucose葡萄糖；BUN血清尿素氮；Creatinine肌酐；Resudual Urine殘余尿量。
2.2大鼠左腎組織的病理學(xué)改變2.2.1PAS染色 與SHAM組大鼠相比，UUO后21天腎組織間質(zhì)增寬，有較多的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小管擴(kuò)張，偶見(jiàn)腎小管管腔內(nèi)有中性粒細(xì)胞聚集，并可見(jiàn)腎小管上皮細(xì)胞萎縮、壞死、脫落；UUO+JXS組上述改變明顯減輕，各組腎間質(zhì)病變計(jì)分結(jié)果見(jiàn)表2。
表2 大鼠腎組織病理、免疫組化結(jié)果(n＝6)

與SHAM組相比，ap＜0.05；與UUO組相比，bp＜0.05Damage score損傷份數(shù)；Interstitial fibrosis index間質(zhì)纖維化指數(shù)；α-SMA Positive areaα-SMA陽(yáng)性面積。
2.2.2 MASSON染色 SHAM組切片可見(jiàn)腎小球基底膜有少量綠色著染，小管間幾無(wú)間隙。UUO后21天腎組織間質(zhì)增寬且廣泛著綠色，顯示基質(zhì)成分增多，纖維化程度明顯。UUO+JXS組腎間質(zhì)纖維化指數(shù)明顯減輕，結(jié)果見(jiàn)表2。
2.3左腎α-SMA免疫組化檢測(cè) SHAM組大鼠α-SMA僅表達(dá)于腎臟血管平滑肌和血管外膜層細(xì)胞，在腎小管和間質(zhì)幾乎無(wú)表達(dá)。UUO組腎皮質(zhì)α-SMA染色明顯增加，主要位于內(nèi)髓部，在皮質(zhì)腎小管上皮細(xì)胞及增寬的的腎間質(zhì)區(qū)也出現(xiàn)α-SMA陽(yáng)性表達(dá)，提示腎小管上皮細(xì)胞向肌纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)型，間質(zhì)成纖維細(xì)胞明顯增多。UUO+JXS組皮質(zhì)區(qū)α-SMA的表達(dá)顯著減少，見(jiàn)表2。
結(jié)論與UUO組比較，UUO+JXS組左側(cè)腎臟的病理改變及腎間質(zhì)纖維化程度明顯減輕(p＜0.05)，腎小管上皮細(xì)胞α-SMA的表達(dá)明顯減少(p＜0.05)，而SHAM組對(duì)左側(cè)腎臟病理學(xué)無(wú)明顯影響。積雪酸對(duì)UUO所致的大鼠腎間質(zhì)纖維化具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能部分是通過(guò)減少腎小管上皮細(xì)胞向肌纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)型，從而改善腎間質(zhì)纖維化。
權(quán)利要求
1.積雪酸在制備預(yù)防或治療腎臟纖維化的藥物中的應(yīng)用，其中該積雪酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)如式I所示 式I。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的腎臟為腎間質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了積雪酸在制備預(yù)防或治療腎臟纖維化的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)用積雪酸對(duì)大鼠腎臟纖維化的影響，證實(shí)了積雪酸具有抗腎臟纖維化的作用。因而，積雪酸可作為活性成份用于制備抗腎臟纖維化的藥物。
文檔編號(hào)A61P13/00GK101032494SQ200610024408
公開(kāi)日2007年9月12日 申請(qǐng)日期2006年3月6日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月6日
發(fā)明者趙帥, 秦燕, 劉全海, 徐智儒, 陳靜 申請(qǐng)人:上海醫(yī)藥工業(yè)研究院