凹頂藻提取物在制備抗金黃色葡萄球菌的藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種凹頂藻提取物的應(yīng)用，其為將凹頂藻提取物應(yīng)用于制備抗金黃色葡萄球菌的藥物。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)測(cè)試證明，凹頂藻提取物對(duì)金黃色葡萄球菌有較好的抑菌作用，可作為天然抗菌劑替代有毒副作用的合成抗菌劑，且金葡菌對(duì)其不易產(chǎn)生耐藥性，而且作為一種天然提取物，具有來(lái)源廣泛、對(duì)人體毒副作用小的優(yōu)點(diǎn)，將其進(jìn)行開發(fā)利用具有重要的價(jià)值，具有廣闊應(yīng)用前景。
【專利說明】四頂藻提取物在制備抗金黃色葡萄球菌的藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種凹頂藻提取物的應(yīng)用，具體地說是將三列凹頂藻(LaurenciatristichaTseng, Chang, E.Z.et.B.M.Xia)為原料制備具有抑菌作用的凹頂藻提取物并將其用于制備抗金黃色葡萄球菌的藥物。屬于天然物提取【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]三列凹頂藻(Laurenciatristicha),屬紅藻門(Rhodophyta),紅藻綱(Rhodophyceae)，仙菜目(Ceramiales),松節(jié)藻科(Rhodomelaceae),凹頂藻屬(Laurencia)海藻，在我國(guó)南海海域分布廣泛，也是分布于我國(guó)海域的特有紅藻品種之一。
[0003]作為臨床常見致病菌的金黃色葡萄球菌，可引起肺炎、化膿性骨髓炎、敗血癥等多種疾患，且近年來(lái)耐藥數(shù)目不斷增多，如耐甲氧西林金葡菌(MRSA)的出現(xiàn)，使感染的發(fā)生率成倍增加，是臨床治療上十分棘手的問題。目前，除了繼續(xù)致力于篩選對(duì)耐藥菌有效的、具有新抗微生物譜和新作用機(jī)制或新作用靶位的抗生素之外，也開始尋找提高抗生素效能、增強(qiáng)宿主防御機(jī)能和衰減微生物病原性的物質(zhì)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種凹頂藻提取物在制備抗金黃色葡萄球菌的藥物中的應(yīng)用，將凹頂藻提取物作為新的天然抗菌劑替代有毒副作用的合成抗菌劑 ，用于抑制金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)，尤其對(duì)金黃色葡萄球菌耐藥菌有效，解決金黃色葡萄球菌耐藥性逐年增加，致使一些抗生素療效降低、甚至無(wú)效的問題。
[0005]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是，將凹頂藻提取物應(yīng)用于制備抗金黃色葡萄球菌的藥物。所述凹頂藻提取物由下列步驟制備得到:
[0006](I)將三列凹頂藻沖洗、陰干、粉碎，而后用3-6倍質(zhì)量的純度95%乙醇浸泡50-60小時(shí)，浸泡過程中不斷攪拌，之后用20目篩網(wǎng)及紗絹各過濾一次，真空泵抽濾，除去微細(xì)沙土，得棕綠色清亮濾液，收集濾渣；將濾液在40-50°C條件下減壓蒸發(fā)濃縮至膏狀，得凹頂藻浸膏；
[0007](2)將步驟(1)處理后的濾渣以純度95%乙醇反復(fù)浸泡3次，每次3小時(shí)，每次浸泡后均過濾并收集濾液；然后將濾渣再以純度99%甲醇40°C浸泡2次，每次2小時(shí)，每次浸泡后均過濾并收集濾液；將濾渣再以純度99%甲醇55°C浸泡2次，每次2小時(shí)，每次浸泡后均過濾并收集濾液；上述濾液均減壓蒸發(fā)得浸膏；
[0008](3)將上述步驟(2)與步驟(1)的浸膏合并，用約10倍體積的水溶解，用足量的乙酸乙酯萃取水相至無(wú)色為止，分成乙酸乙酯相和水相；
[0009](4)取步驟(3)中乙酸乙酯相減壓蒸發(fā)得凹頂藻提取物，高效液相色譜(HPLC)法測(cè)得其總職含量為63.29 %。所述三列凹頂藻(Laurencia tristicha Tseng, Chang,Ε.Z.et.B.M.Xia),屬紅藻門(Rhodophyta)紅藻綱(Rhodophyceae),仙菜目(Ceramiales),松節(jié)藻科(Rhodomelaceae),凹頂藻屬(Laurencia),采于廣東省湛江市硇洲島附近海域，由中國(guó)科學(xué)院海洋研究所提供并鑒定。
[0010]本發(fā)明的有益效果是:實(shí)驗(yàn)測(cè)試證明，凹頂藻提取物對(duì)金黃色葡萄球菌有較好的抑菌作用，可作為天然抗菌劑替代有毒副作用的合成抗菌劑，且金葡菌對(duì)其不易產(chǎn)生耐藥性，而且作為一種天然提取物，具有來(lái)源廣泛、對(duì)人體毒副作用小的優(yōu)點(diǎn)，將其進(jìn)行開發(fā)利用具有重要的價(jià)值，具有廣闊應(yīng)用前景。
【具體實(shí)施方式】
[0011]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的凹頂藻提取物及其制備工藝和抑菌作用進(jìn)一步詳細(xì)說明，各實(shí)施例可進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
[0012]實(shí)施例1:
[0013](I)將采集新鮮的三列凹頂藻經(jīng)海水清洗，除去表面附著的沙礫及雜藻，陰涼處晾干備用。取三列凹頂藻干品，粉碎成粉末，而后用3倍量的95%乙醇浸泡60小時(shí)，且浸泡過程中不斷攪拌，之后用20目篩網(wǎng)及紗絹各過濾一次，真空泵抽濾，除去微細(xì)沙土，得棕綠色清亮濾液，置入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在40°C條件下減壓蒸發(fā)，濃縮得凹頂藻浸膏；
[0014](2)將步驟(1)處理后的濾渣以95%乙醇反復(fù)浸泡3次，每次3小時(shí)，每次浸泡后均過濾并收集濾液；然后將濾渣再以純度99%甲醇40°C浸泡2次，每次2小時(shí)，每次浸泡后均過濾并收集濾液；將濾渣再以純度99%甲醇55°C浸泡2次，每次2小時(shí)，每次浸泡后均過濾并收集濾液；上述濾液均減壓蒸發(fā)得浸膏；
[0015](3)將上述步驟 (2)與步驟(1)的浸膏合并，用約10倍體積的水溶解，用足量的乙酸乙酯萃取水相至無(wú)色為止，分成乙酸乙酯相和水相。
[0016](4)取步驟(3)中乙酸乙酯相減壓蒸發(fā)得凹頂藻提取物。
[0017](5)將步驟(4)中的凹頂藻提取物進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，對(duì)金黃色葡萄球菌有較好抑制作用。
[0018]實(shí)施例2:
[0019](I)將采集新鮮的三列凹頂藻經(jīng)海水清洗，除去表面附著的沙礫及雜藻，陰涼處晾干備用。取三列凹頂藻干品，粉碎成粉末而后用6倍量的95%乙醇浸泡50小時(shí)，且浸泡過程中不斷攪拌，之后用20目篩網(wǎng)及紗絹各過濾一次，真空泵抽濾，除去微細(xì)沙土，得棕綠色清亮濾液，置入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在50°C條件下減壓蒸發(fā)，濃縮得凹頂藻浸膏；
[0020](2)將步驟(1)處理后的濾渣以95%乙醇反復(fù)浸泡3次，每次3小時(shí)，每次浸泡后均過濾并收集濾液；然后將濾渣再以純度99%甲醇40°C浸泡2次，每次2小時(shí)，每次浸泡后均過濾并收集濾液；將濾渣再以純度99%甲醇55°C浸泡2次，每次2小時(shí)，每次浸泡后均過濾并收集濾液；上述濾液均減壓蒸發(fā)得浸膏；
[0021](3)將上述步驟(2)與步驟(1)的浸膏合并，用約10倍體積的水溶解，用足量的乙酸乙酯萃取水相至無(wú)色為止，分成乙酸乙酯相和水相。
[0022](4)取步驟(3)中乙酸乙酯相減壓蒸發(fā)得凹頂藻提取物。
[0023](5)將步驟(4)中的凹頂藻提取物進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，對(duì)金黃色葡萄球菌有較好抑制作用。
[0024]實(shí)施例3:
[0025](I)將采集新鮮的三列凹頂藻經(jīng)海水清洗，除去表面附著的沙礫及雜藻，陰涼處晾干備用。取三列凹頂藻干品，粉碎成粉末，而后用5倍量的95%乙醇浸泡55小時(shí)，且浸泡過程中不斷攪拌，之后用20目篩網(wǎng)及紗絹各過濾一次，真空泵抽濾，除去微細(xì)沙土，得棕綠色清亮濾液，置入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在45°C條件下減壓蒸發(fā)，濃縮得凹頂藻浸膏；
[0026](2)將步驟(1)處理后的濾渣以95%乙醇反復(fù)浸泡3次，每次3小時(shí)，每次浸泡后均過濾并收集濾液；然后將濾渣再以純度99%甲醇40°C浸泡2次，每次2小時(shí)，每次浸泡后均過濾并收集濾液；將濾渣再以純度99%甲醇55°C浸泡2次，每次2小時(shí)，每次浸泡后均過濾并收集濾液；上述濾液均減壓蒸發(fā)得浸膏；
[0027](3)將上述步驟(2)與步驟(1)的浸膏合并，用約10倍體積的水溶解，用足量的乙酸乙酯萃取水相至無(wú)色為止，分成乙酸乙酯相和水相。
[0028](4)取步驟(3)中乙酸乙酯相減壓蒸發(fā)得凹頂藻提取物。
[0029](5)將步驟(4)中的凹頂藻提取物進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，對(duì)金黃色葡萄球菌有較好抑制作用。
[0030]實(shí)施例4
[0031]凹頂藻提取物抑菌作用的藥理試驗(yàn)
[0032]1.材料:三列凹頂藻采于廣東省湛江市硇洲島附近海域，由中國(guó)科學(xué)院海洋研究所提供并鑒定；青霉素藥敏紙片3xl05IU/mL、氯霉素藥敏紙片3 X 105IU/mL，購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；水解酪蛋白(Mueller-Hint0n，MH)瓊脂購(gòu)自浙江省軍區(qū)后勤部衛(wèi)生防疫檢驗(yàn)所；營(yíng)養(yǎng)瓊脂購(gòu)自濟(jì)寧市化工研究所。
[0033]2.實(shí)驗(yàn)方法
[0034]2.1試驗(yàn)樣品:凹頂藻提取物。
[0035]2.2凹頂藻提取物藥敏紙片的制備
[0036]制備直徑5.5mm的濾紙片，吸水量約10uL，經(jīng)15磅高壓滅菌后，置于干燥箱內(nèi)充分烘干備用；以二氯甲烷為溶劑，將凹頂藻提取物溶解稀釋，0.22um微孔濾膜過濾除菌；加樣器逐片加樣，放置一天以上至溶劑完全蒸發(fā)。冷凍干燥后，密封，_20°C保存?zhèn)溆?。同時(shí)設(shè)空白對(duì)照。
[0037]2.3紙片擴(kuò)散法抑菌實(shí)驗(yàn)
[0038]將菌種畫線接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18h后,于4°C冰箱中保存，每隔一周傳代一次。在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上挑取典型菌落于試管的無(wú)菌生理鹽水中，調(diào)整濁度與0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)的比濁管相同，相當(dāng)于該菌懸液中菌量為5xl07~5X IO8CFU/mL。用無(wú)菌棉拭子蘸取菌液在管內(nèi)壁將多余菌液旋轉(zhuǎn)擠去后在MH瓊脂表面均勻涂布接種3次，每次旋轉(zhuǎn)60度，最后沿平板內(nèi)緣涂抹I周。MH瓊脂平板在室溫干燥3min后，加上抗菌藥片:實(shí)驗(yàn)組；對(duì)照組。無(wú)菌鑷子將含藥紙片無(wú)菌操作貼在MH瓊脂表面，各紙片中心相距大于24mm，紙片距平板內(nèi)緣應(yīng)大于15mm，置35°C孵育18h后用透明尺測(cè)量抑菌環(huán)直徑(包括紙片)并記錄。金黃色葡萄球菌以青霉素和氯霉素作為陽(yáng)性對(duì)照。
[0039]3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0040]由表1可知，制備的凹頂藻提取物紙片(8mg/片)對(duì)金葡菌的抑菌環(huán)直徑為17mm，凹頂藻提取物原液對(duì)金葡菌的抑菌環(huán)直徑為22mm，青霉素作用的抑菌環(huán)直徑大小為23mm，氯霉素抑菌環(huán)直徑為19_，可見凹頂藻提取物原液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用優(yōu)于氯霉
素，與青霉素接近。[0041]表1不同劑型凹頂藻提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌環(huán)直徑(mm)
[0042]
【權(quán)利要求】
1.將凹頂藻提取物應(yīng)用于制備抗金黃色葡萄球菌的藥物。
2.權(quán)利要求1所述的凹頂藻提取物，其特征在于:其由下列步驟制備得到: (1)將三列凹頂藻沖洗、陰干、粉碎，而后用3-6倍質(zhì)量的純度95%乙醇浸泡50-60小時(shí)，浸泡過程中不斷攪拌，之后用20目篩網(wǎng)及紗絹各過濾一次，真空泵抽濾，除去微細(xì)沙土，得棕綠色清亮濾液，收集濾渣；將濾液在40-50°C條件下減壓蒸發(fā)濃縮至膏狀，得凹頂藻浸膏； (2)將步驟(1)處理后的濾渣以純度95%乙醇反復(fù)浸泡3次，每次3小時(shí)，每次浸泡后均過濾并收集濾液；然后將濾渣再以純度99%甲醇40°C浸泡2次，每次2小時(shí)，每次浸泡后均過濾并收集濾液；將濾渣再以純度99%甲醇55°C浸泡2次，每次2小時(shí)，每次浸泡后均過濾并收集濾液；上述濾液均減壓蒸發(fā)得浸膏； (3)將上述步驟(2)與步驟(1)的浸膏合并，用約10倍體積的水溶解，用足量的乙酸乙酯萃取水相至無(wú)色為止，分成乙酸乙酯相和水相； (4)取步驟(3)中乙酸乙酯·相減壓蒸發(fā)得凹頂藻提取物。
【文檔編號(hào)】A61P31/04GK103845368SQ201210517050
【公開日】2014年6月11日 申請(qǐng)日期:2012年12月6日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月6日
【發(fā)明者】戈娜, 梁惠, 劉穎, 董春景 申請(qǐng)人:青島大學(xué)