專利名稱：一種具有促進血管生成的王不留行黃酮苷的應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種具有促進血管生成的王不留行黃酮苷應用，屬于中藥應用技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及一種具有促進血管生成活性的王不留行黃酮苷，闡明其在醫(yī)藥，食品、化妝品方面的新用途。
背景技術(shù)：
王不留行為石竹科植物麥藍菜Vaccaria segetalis (Neck. ) Garcke的干燥成熟種子。王不留行中主要含有三萜皂苷、黃酮苷、環(huán)肽、類脂和脂肪酸、單糖等成分[I、李帆，梁敬鈺.王不留行的研究進展[J].海峽藥學，2007，19 (3) :1-5]。實驗發(fā)現(xiàn)王不留行黃酮苷具有促進血管新生的作用，其結(jié)果為下式所示
OH
HO''丫
OHI^V0h
° 0H
OH血管內(nèi)皮細胞(Vascular Endothelial Cell)具有多種生理功能，參與機體的凝血、免疫、物質(zhì)轉(zhuǎn)運和生物活性物質(zhì)釋放等生活活動。研究表明[2、Reinhart K，Bayer
0,Brunkhorst F, et al. Markers ofendothelialdamage in organ dysfunction andsepsis [J], CritCare Med, 2002, 30 (5) :302.]，內(nèi)皮細胞的損傷及功能紊亂與多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)，包括高血壓、冠心病、糖尿病、慢性腎功能衰竭等。引起內(nèi)皮細胞損傷是一個復雜的病理過程，參與的因素很多，如糖尿病、高血脂和高血壓等多種疾病，氧化應激以及炎癥反應等等。心血管介入術(shù)主要是機械刺激血管內(nèi)皮，通過刺，戳，擦，擠傷導致?lián)p傷，當被導管繼續(xù)損傷擴大而伴發(fā)急性血栓，導致血管內(nèi)皮剝脫的嚴重內(nèi)膜損傷[3、方宏，馮義柏.血管內(nèi)皮細胞損傷與常見心血管疾病[J].心血管病學進展，2001，22 (I) :34-36]。冠心病心肌缺血壞死的發(fā)生，與病變血管的閉塞直接相關(guān)[遲路湘.肝素與冠心病血管生成治療認識進展[J].微循環(huán)學雜志，2002，12(1) :41-42.]。血管內(nèi)皮細胞的損傷是多種血管性疾病的主要環(huán)節(jié)，保護血管內(nèi)皮功能是防治血管性疾病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。因此，研究保護血管內(nèi)皮功能的藥物成為治療血管性疾病的重要措施。針對內(nèi)皮細胞損傷的不同環(huán)節(jié)進行的藥物研究也在進行中，包括抑制黏附分子生成和釋放、拮抗黏附分子作用的藥物、作用于L0X-1受體的藥物等等，都受到了研究人員的重視。在血管生成中，促進側(cè)枝循環(huán)的建立是改善心肌缺血的另一重要途徑，臨床研究證實，增加側(cè)枝血流量又可增加血流剪切力，刺激血管生長，可緩解和治療心絞痛等缺血性心臟病。表皮生長因子(EGF)在促進內(nèi)皮細胞增殖中表現(xiàn)為可刺激組織修復細胞增殖，趨化炎性細胞，表皮細胞和成纖維細胞向傷口聚集，加劇創(chuàng)面愈合，此生理效應可預防和治療瘢痕修復。經(jīng)過調(diào)研，未見我國學者對王不留行黃酮苷促進血管生成的相關(guān)文獻報道(自CNKI、維普中國期刊網(wǎng))，因此王不留行黃酮苷在促進血管生成的藥理、藥效等研究領(lǐng)域尚處于空白階段。本研究發(fā)現(xiàn)王不留行黃酮苷具有促進內(nèi)皮細胞生成的作用，為保護內(nèi)皮細胞的相關(guān)疾病提供新的治療方法與應用?；酋Ａ_丹明B (Sulforhodamine B，SRB)比色法，主要用來檢測細胞增殖情況。SRB是一種粉紅色陰離子染料，易溶于水，在酸性條件下可特異性地與細胞內(nèi)組成蛋白質(zhì)的堿性氨基酸結(jié)合；在540nm波長下產(chǎn)生吸收峰，吸光值與細胞量成線性正相關(guān)，故可用作細胞數(shù)的定量檢測。SRB染色后不會像MTT法那樣很容易變色，細胞固定染色后在96孔板中可以放置較長時間，因而受測定時間的影響較小。用Tris-base溶液溶解的SRB也可穩(wěn)定較長時間。因此不同時問點固定的96孔細胞培養(yǎng)板可在同一時間測定，測定的吸光值結(jié)果不會受到明顯影響。吸光值與SRB濃度作圖時，在OD單位1.5-2. 0以下為線性，當超出線形范圍時，最好稀釋后重新讀數(shù)。雖然SRB法比其他檢測方法操作步驟繁瑣，但是由于時間可以自己掌握，不受限制，因此適用于高通量篩選。細胞劃痕法是測定細胞的運動特性的方法之一，其借鑒體外細胞致傷愈合實驗模 型，在體外培養(yǎng)的單層細胞上，劃痕致傷，然后加入藥物觀察其抑制腫瘤細胞遷移的能力?；|(zhì)膠(Matrigel)又名ElHS(Engelbreth-Holm-Swarm)提取物、基底膜基質(zhì),是從小鼠EHS腫瘤中提取的可溶的、無菌的基底膜蛋白。MatrigeI在4°C為液態(tài)，37 °C凝固為固態(tài)，適用于將細胞或其它物質(zhì)混合于其中進行皮下注射。該填塞實驗廣泛地應用于評估血管生長因子實驗，以及腫瘤細胞誘導血管形成的實驗。由于Matrigel中不包含任何組織成分，避免了組織中可能含有的促進和抑制血管新生物質(zhì)對實驗因子的影響。

發(fā)明內(nèi)容
所述黃酮苷對內(nèi)皮細胞增殖的影響，將HMEC-I (人臍靜脈內(nèi)皮細胞)經(jīng)培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，加入不同濃度的黃酮苷作用48h，經(jīng)SRB法染色，用酶標儀在波長A540測得OD值。每組設(shè)置4個復孔，每批樣品重復3次。所述黃酮苷對細胞遷移的影響，將HMEC-I經(jīng)培養(yǎng)箱合縱孵育24h，待細胞貼壁后用移液塑料槍頭于每孔中心位置化一條Imm款寬的灼傷帶，并加入含不同黃酮苷濃度的培養(yǎng)基培養(yǎng)。然后在IOOX顯微鏡下與同一視野進行拍照。所述黃酮苷對小鼠模型中血管生成的影響,將0. 5ml Matrigel皮下注射于小鼠腹部右側(cè)，按4mg/(kg*d)的劑量灌胃給予黃酮苷，連續(xù)14d。實驗分為陰性對照組，實驗組。對照組給以等體積0.9%生理鹽水，觀察方法和時間同實驗組。種植14d后，頸椎脫曰處死小鼠，手術(shù)剖開腹部皮膚，取出Matrigel種植體。


圖I王不留行黃酮苷促進HMEC-I增殖。在王不留行黃酮苷濃度為0. 76 u g/ml時，HMEC-I細胞進入對數(shù)增長期。圖2王不留行黃酮苷對HMEC-I遷移的作用A對照組，Oh出王不留行黃酮苷(5 y g/ml), Oh ；C對照組，24h ；D王不留行黃酮苷(5 g/ml)，24h ；E對照，48h ；F王不留行黃酮苷(5u g/ml)，48h。圖3王不留行黃酮苷對Matrigel膠血管生成的作用G對照；H黃酮苷,4mg/(kg d)。
具體實施例方式實施例I :SRB法測黃酮苷對內(nèi)皮細胞增殖的影響取對數(shù)生長期HMEC-I細胞，按每孔8000-10000個細胞接種于96孔板中，放置于37°C、50ml/L CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，加入不同濃度的黃酮苷作用48h，以不加藥組為陰性對照組，每組同時設(shè)4個復孔，每批樣品重復3次試驗。加藥后培養(yǎng)至72h測板，用MK3型酶標儀在波長A540處測定每孔A值。計算增殖率(％ )(見圖I)。實施例2 :細胞劃痕法測黃酮苷對內(nèi)皮細胞遷移的影響用劃線灼傷法研究細胞遷移，將常規(guī)培養(yǎng)的HMEC-消化懸浮，以每孔8X IO4(5X IO4)個細胞加到24孔板中，置37°C、50ml/L CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育24h，待細胞貼壁后用移液塑料槍頭于每孔中心位置劃一條Imm寬的灼傷帶，然后用PBS洗去脫落細胞，并加入含不同藥物濃度的細胞培養(yǎng)基以及對照組。然后在100X顯微鏡下拍照，此刻為Oh細胞遷移圖，接著在24h，48h分別于同一視野處拍(所得圖片用IPWin60C軟件圖象軟件進行處理，測量灼傷帶距離，見下表表I王不留行黃酮苷對HMEC-I遷移距離的作用(U m)
權(quán)利要求
1.一種用于促進血管生成的王不留行黃酮苷。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述王不留行黃酮苷，其特征在于所述王不留行黃酮苷是用于防止和/或治療至少一種選自下述之一的疾病冠心病、心機梗死后等缺血性心臟病，腦梗塞后、血管閉塞性血栓性脈管炎,心血管接入術(shù),傷口愈合中抑制斑痕形成等于血管生成有關(guān)疾病的預防與治療。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述，其特征在于王不留行黃酮苷應用的產(chǎn)品形式包括藥物制劑、營養(yǎng)品、保健品、化妝品。
全文摘要
一種具有促進血管生成的王不留行黃酮苷的應用，屬于中藥應用技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)王不留行黃酮苷具有促進血管生成的活性，可用于冠心病、心機梗死后等缺血性心臟病，腦梗塞后、血管閉塞性血栓性脈管炎，心血管接入術(shù)，傷口愈合中抑制斑痕形成等血管生成有關(guān)的疾病的預防與治療。這種王不留行黃酮苷可應用于藥物制劑、營養(yǎng)品、保健品、化妝品等用途。
文檔編號A61P9/14GK102964405SQ201210512699
公開日2013年3月13日 申請日期2012年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月5日
發(fā)明者邱麗穎, 馮磊, 馬麗萍, 洪奎 申請人:江南大學