專(zhuān)利名稱(chēng)：基于第二代聚酰胺-胺樹(shù)狀大分子/金納米顆粒的ct造影劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬納米顆粒的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域，特別是涉及一種基于第二代聚酰胺-胺樹(shù)狀大分子/金納米顆粒的CT造影劑的制備方法。
背景技術(shù)：
CT (計(jì)算機(jī)斷層掃描)技術(shù)因其優(yōu)良的空間和密度分辨率而成為最為廣泛的分子影像學(xué)手段之一，在臨床上受到廣泛的使用。雖然對(duì)骨組織具有良好的成像效果，但對(duì)于各個(gè)臟器等軟組織，CT技術(shù)的應(yīng)用卻頗受限制。在具體使用過(guò)程中，常需造影劑的輔助。目前臨床上使用的造影劑多為基于碘的小分子造影劑。這種造影劑存在體內(nèi)循環(huán)時(shí)間短、具有潛在的腎臟毒性等缺點(diǎn)。因此，開(kāi)發(fā)新型造影劑具有一定的必要性。至今，新型造影劑的 開(kāi)發(fā)更多關(guān)注的是金屬納米顆粒。這是因?yàn)榻饘偌{米顆粒具有高于碘的原子序數(shù)，能顯示更好的X-射線吸收系數(shù)。此外，納米顆粒的尺寸使其能擁有延長(zhǎng)的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間，更利于長(zhǎng)時(shí)間體內(nèi)造影。Ai 等[Ai, K.，et al. , Large-Scale Synthesis of Bi2S3 Nanodots as aContrastAgent for In Vivo X-ray Computed Tomography Imaging. Advanced Materials，2011. 23(42) :p. 4886-4891.]以硫化鉍納米顆粒為造影劑，成功用于對(duì)大鼠的肝臟等器官的CT造影。金納米顆粒因其獨(dú)特的表面等離子體吸收以及光散射特性正受到越來(lái)越廣泛的關(guān)注。近年來(lái)，金納米顆粒因其良好的生物相容性及優(yōu)良的X-射線衰減特性而逐漸成為一種具有前景的CT造影劑。與傳統(tǒng)的基于碘的小分子造影劑相比，金納米顆粒具有顯著的優(yōu)勢(shì)。首先，金具有較高的原子序數(shù)和電荷密度，表現(xiàn)出較高的X-射線衰減系數(shù)，更利于提供高質(zhì)量的CT造影效果。其次，金納米顆粒具有良好的生物相容性。再次，金納米顆粒的表面易于修飾，可賦予其祀向特性及延長(zhǎng)的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間。Wang等[Wang, H. , et al. , Computedtomography imaging of cancer cells using acetylateddendrimer-entrapped gold nanoparticles. Biomaterials, 2011. 32:p. 2979-2988.]以第五代聚酰胺-胺樹(shù)狀大分子為模板，制備了具有良好生物相容性和穩(wěn)定性的金納米顆粒。該產(chǎn)品對(duì)小鼠腫瘤表現(xiàn)出一定的造影效果，具有潛在的CT造影應(yīng)用前景。樹(shù)狀大分子是一類(lèi)合成的、結(jié)構(gòu)可精確控制的有機(jī)大分子。其表面基團(tuán)具有可修飾性，內(nèi)部空腔可用以穩(wěn)定金屬納米顆粒。與高代數(shù)的樹(shù)狀大分子不同，低代數(shù)的樹(shù)狀大分子因其代數(shù)低而具有開(kāi)放式的結(jié)構(gòu)，以及較少的表面基團(tuán)，故用其作為金屬納米顆粒穩(wěn)定劑的研究報(bào)道較少。但低代數(shù)樹(shù)狀大分子也具有其獨(dú)特的性質(zhì)，如價(jià)格低廉，結(jié)構(gòu)更加精確可控。鑒于此，本專(zhuān)利采用末端氨基的第二代聚酰胺-胺(PAMAM)樹(shù)狀大分子為金納米顆粒的穩(wěn)定劑，研究其對(duì)金納米顆粒的穩(wěn)定作用以及探索所得納米顆粒的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用。金屬納米顆粒的制備方法多種多樣，其中最常采用的是化學(xué)還原法。而本專(zhuān)利中使用的是綠色環(huán)保熱還原法。整個(gè)制備過(guò)程中沒(méi)有任何其它還原劑的添加。整個(gè)制備過(guò)程簡(jiǎn)單易行，具有很強(qiáng)的可操作性。
檢索國(guó)內(nèi)外有關(guān)金納米顆粒用以CT造影方面的文獻(xiàn)和專(zhuān)利結(jié)果發(fā)現(xiàn)在本發(fā)明完成之前，還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)基于第二代聚酰胺-胺樹(shù)狀大分子/金納米顆粒的CT造影劑的制備及其CT造影性能研究方面的報(bào)道。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種樹(shù)狀大分子/金納米顆粒的綠色環(huán)保的制備方法，該方法制備的樹(shù)狀大分子/金納米顆粒具有良好的水溶液分散性和生物相容性。X-射線衰減強(qiáng)度測(cè)試結(jié)果表明，該產(chǎn)品表現(xiàn)出與傳統(tǒng)造影劑碘海醇相近的X-射線衰減系數(shù)；體內(nèi)造影實(shí)驗(yàn)表明，該產(chǎn)品表現(xiàn)出明顯優(yōu)于碘海醇的全身主要器官造影效果，具有潛在的CT造影應(yīng)用前景。
本發(fā)明的一種基于第二代聚酰胺-胺樹(shù)狀大分子/金納米顆粒的CT造影劑的制備方法，包括
(I)以低代數(shù)的末端為氨基的第二代聚酰胺-胺樹(shù)狀大分子作為金納米顆粒的穩(wěn)定劑，配制摩爾濃度為2. 5-3. 5mM的水溶液，預(yù)熱；
(2)在上述溶液中加入氯金酸溶液，其中樹(shù)狀大分子與氯金酸溶液中金的摩爾比為1:3,磁力攪拌；
(3)將反應(yīng)后的溶液室溫冷卻之后，加入樹(shù)狀大分子末端氨基摩爾數(shù)6-12倍的三乙胺，攪拌10-30min ;之后加入樹(shù)狀大分子末端氨基摩爾數(shù)5_10倍的乙酸酐，進(jìn)行乙?；磻?yīng)，攪拌反應(yīng)24h ;隨后透析，得到樹(shù)狀大分子穩(wěn)定的金納米顆粒。
所述步驟(2)中，加入氯金酸之前，樹(shù)狀大分子溶液要先預(yù)熱20_40min，預(yù)熱的溫度為60°C。
所述步驟(2)中的磁力攪拌反應(yīng)過(guò)程持續(xù)3_4h。
所述步驟(3)中的冷卻時(shí)間為O. 5_2h。
該方法中，通過(guò)水熱合成法制備金納米顆粒，所得產(chǎn)品具有良好的穩(wěn)定性和CT造影效果。配制活性元素(金、碘)摩爾濃度為O. lmol/L的樣品，以碘海醇作為對(duì)照，進(jìn)行體內(nèi) CT造影性能評(píng)價(jià)。
使用NMR (核磁共振)、UV-Vis (紫外可見(jiàn)光譜)、TEM (透射電子顯微鏡)、CT機(jī)表征本發(fā)明獲得的樹(shù)狀大分子/金納米顆粒的結(jié)果分別如下
(I) NMR測(cè)試結(jié)果
NMR圖譜表明樹(shù)狀大分子表面基團(tuán)的類(lèi)型以及數(shù)量。參照說(shuō)明書(shū)附圖1。附圖1 中出現(xiàn)在1. 87ppm處的化學(xué)位移峰為乙酰基中甲基的特征峰。由此可證明樹(shù)狀大分子表面的氨基已通過(guò)乙酰化作用被轉(zhuǎn)化為了乙?；?。
(2) UV-Vis 測(cè)試結(jié)果
UV-Vis測(cè)試結(jié)果表明本發(fā)明中制備得到的納米顆粒在521nm處出現(xiàn)了明顯的吸收峰。參照說(shuō)明書(shū)附圖2。這是金納米顆粒的表面等離子體共振(SPR)峰，表明本發(fā)明中成功制備得到了金納米顆粒。所得納米顆粒在不同PH (5-8)和溫度(4-50°C)條件下具有良好的穩(wěn)定性。參照說(shuō)明書(shū)附圖3。
(3) TEM測(cè)試結(jié)果
TEM測(cè)試結(jié)果顯示了金納米顆粒的尺寸及尺寸分布。參照說(shuō)明書(shū)附圖4。乙酰化前金納米顆粒的平均尺寸為5. 5nm，；乙?；笃骄叽鐬?. 6nm。乙酰化前后，金納米顆粒的尺寸沒(méi)有明顯的改變。
(4)細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果
細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果表明在200-3000nM范圍內(nèi)，乙酰化后的樹(shù)狀大分子/金納米顆粒顯示良好的細(xì)胞相容性，與乙?；暗漠a(chǎn)品相比有明顯的提高。參照說(shuō)明書(shū)附圖5。
(5)體外X-射線衰減性能測(cè)試結(jié)果
體外X-射線衰減性能測(cè)試結(jié)果表明，樹(shù)狀大分子/金納米顆粒與傳統(tǒng)造影劑碘海醇相比，表現(xiàn)出相近的X-射線衰減系數(shù)。參照說(shuō)明書(shū)附圖6。與細(xì)胞共培養(yǎng)后，對(duì)細(xì)胞的 CT值顯示出一定的增強(qiáng)作用。參照說(shuō)明書(shū)附圖7。
(6)體內(nèi)CT造影測(cè)試結(jié)果
體內(nèi)CT造影測(cè)試結(jié)果表明，樹(shù)狀大分子/金納米顆粒與傳統(tǒng)造影劑碘海醇相比， 表現(xiàn)出增強(qiáng)的肝臟等器官的造影效果，以及延長(zhǎng)的體內(nèi)停留時(shí)間。參見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖8、圖9， 以及圖10。
以第二代聚酰胺-胺樹(shù)狀大分子為穩(wěn)定劑，通過(guò)水熱合成法制備具有CT造影功能的樹(shù)狀大分子/金納米顆粒，本發(fā)明涉及了三個(gè)基本原理
(I)聚酰胺-胺樹(shù)狀大分子末端氨基的弱還原性。其還原性在加熱條件下有所增強(qiáng)。
(2)水熱合成法簡(jiǎn)單、易操作，綠色環(huán)保。
(3)金納米顆粒對(duì)X-射線有良好的衰減能力，及延長(zhǎng)的體內(nèi)停留時(shí)間。
有益效果
(I)本發(fā)明的制備過(guò)程簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)條件溫和，易于操作，具有擴(kuò)大規(guī)模生產(chǎn)的可能
(2)本發(fā)明方法制備的金納米顆粒具有良好的穩(wěn)定性和生物相容性；
(3)制備得到的樹(shù)狀大分子/金納米顆粒具有優(yōu)于傳統(tǒng)造影劑碘海醇的活體CT成像效果，為新型造影劑的開(kāi)發(fā)打下了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。


圖1為本發(fā)明制備樹(shù)狀大分子/金納米顆粒乙?；蟮腘MR譜圖2為本發(fā)明制備的樹(shù)狀大分子/金納米顆粒乙?；昂蟮腢V-Vis譜圖3為本發(fā)明制備的樹(shù)狀大分子/金納米顆粒在不同pH (5-8) (a)和溫度 (4-50°C) (b)條件下的UV-Vis圖譜。
圖4為本發(fā)明制備的樹(shù)狀大分子/金納米顆粒的TEM圖片，以及相應(yīng)的尺寸分布圖。其中，乙酰化前(a，b)、乙?；?c，d);
比較；
CT造影效果比較。圖5為本發(fā)明制備的樹(shù)狀大分子/金納米顆粒的細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果；圖6為本發(fā)明制備的樹(shù)狀大分子/金納米顆粒與碘海醇的體外X-射線衰減系數(shù)圖7為本發(fā)明制備的樹(shù)狀大分子/金納米顆粒的體外細(xì)胞CT造影結(jié)果；圖8為本發(fā)明制備的樹(shù)狀大分子/金納米顆粒(a)與碘海醇(b)對(duì)大鼠肝臟、膀胱
圖9為本發(fā)明制備的樹(shù)狀大分子/金納米顆粒(a)與碘海醇(b)對(duì)大鼠腎臟、脾臟CT造影效果比較。圖10為本發(fā)明制備的樹(shù)狀大分子/金納米顆粒與碘海醇靜脈注射后的體內(nèi)主要器官CT值。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。實(shí)施例1取HAuCl450mg，溶于蒸餾水中，磁力震蕩使之充分溶解均勻，配制成濃度為30mg/ mL的溶液。取第二代聚酰胺-胺樹(shù)狀大分子(G2. NH2) 162. 97mg,溶于16mL蒸餾水中，磁力震蕩使之充分溶解均勻。將該溶液置于60°C水浴中預(yù)熱20min。取HAuCl4溶液2. 06lmL，加入預(yù)熱好的樹(shù)狀大分子溶液中。溫度維持在60°C，磁力攪拌反應(yīng)3. Oh。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)所得溶液進(jìn)行透析，蒸餾水(6次，2L/次)。然后進(jìn)行冷凍干燥處理，得到乙?；暗臉?shù)狀大分子/金納米顆粒，-20°C保存。UV-Vis測(cè)試結(jié)果表明譜圖中出現(xiàn)的吸收峰位于521nm (附圖2)。這表明體系中成功制備了金納米顆粒。TEM測(cè)試結(jié)果表明制備得到的金納米顆粒的尺寸分布為5.5±1.8nm (附圖4)。乙酰化前的樹(shù)狀大分子/金納米顆粒具有良好的單分散性，未出現(xiàn)團(tuán)聚現(xiàn)象。實(shí)施例2取實(shí)施例1中制備的樹(shù)狀大分子/金納米顆粒溶液(G2. NH2, 74. 48mg),室溫冷卻Ih0加入三乙胺308. 7iiL，攪拌0. 5h。之后，加入乙酸酐174. 7 y L，攪拌反應(yīng)24h。反應(yīng)結(jié)束后，用PBS緩沖液(3次，2L/次)和蒸餾水(3次，2L/次)對(duì)反應(yīng)混和液進(jìn)行透析，然后進(jìn)行冷凍干燥處理，得到乙酰化后的樹(shù)狀大分子/金納米顆粒，_20°C保存。1H NMR譜圖結(jié)果顯示乙酰化反應(yīng)后出現(xiàn)了乙酰甲基的峰(1. 87ppm)，表明乙酰化反應(yīng)的成功進(jìn)行(附圖1)。UV-Vis測(cè)試結(jié)果表明譜圖中出現(xiàn)的吸收峰位于521nm (附圖2)。這表明乙?；螅鸺{米顆粒的尺寸沒(méi)有發(fā)生明顯的改變。TEM測(cè)試結(jié)果表明制備得到的金納米顆粒的尺寸分布為5. 6±1. Snm (附圖4)。乙?；蟮臉?shù)狀大分子/金納米顆粒具有良好的單分散性，未出現(xiàn)團(tuán)聚現(xiàn)象。實(shí)施例3取制備得到的乙?；蟮臉?shù)狀大分子/金納米顆粒，配制為0. 2mg/mL的水溶液。之后，以0.1M的鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)其pH值(5. O、6. 0、7. O、8. O)。室溫放置20min后，進(jìn)行紫外測(cè)試。取制備得到的乙?；蟮臉?shù)狀大分子/金納米顆粒，配制為0. 2mg/mL的水溶液。之后，放置于不同溫度條件(4、室溫20、37、50°C)下。穩(wěn)定半小時(shí)后，進(jìn)行紫外測(cè)試。該產(chǎn)品在不同pH (5-8)和溫度(4_50°C)條件下的紫外圖譜沒(méi)有發(fā)生明顯的偏移和改變，表明其具有良好的穩(wěn)定性(附圖3)。
實(shí)施例4
取制備得到的乙?；?、后的樹(shù)狀大分子/金納米顆粒各3. 2Img和4. 05mg，用無(wú)菌PBS緩沖液配置成60000nM的母液。之后梯度稀釋為2000，5000，10000，20000，30000nM的樣品溶液。
取培養(yǎng)好的KB細(xì)胞種于96孔板中，按照I萬(wàn)細(xì)胞/孔的密度接種，每孔體積 200 μ L0培養(yǎng)過(guò)夜后，加入上述各稀釋梯度的樣品，與細(xì)胞共培養(yǎng)24h。每個(gè)梯度用培養(yǎng)液稀釋10倍，即每孔終濃度分別為200，500，1000, 2000, 3000nM。每個(gè)梯度做5個(gè)平行孔，以 PBS緩沖液作為空白對(duì)照。隨后用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力。每孔加MTT溶液(5mg/mL)20 μ L， 37°C孵化4h。之后除去孔中液體，加入二甲亞砜溶液200 μ L。搖床混勻20min。之后用酶標(biāo)儀檢測(cè)570nm處吸光度值。
MTT測(cè)試結(jié)果顯示，乙?；暗漠a(chǎn)品在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，顯示出一定的細(xì)胞毒性。 同樣以PBS作為空白對(duì)照，乙?；蟮漠a(chǎn)品在此范圍內(nèi)均不顯示出細(xì)胞毒性。表明乙酰化能顯著提高納米顆粒的細(xì)胞相容性(附圖5)。
實(shí)施例5
取制備得到的乙?；蟮臉?shù)狀大分子/金納米顆粒，以蒸餾水為溶劑，配制金濃度為O.1M的母液。之后梯度稀釋出O. 08，0. 06，0. 04，0. 02，0. 01和O. 005M的樣品。同時(shí)， 以臨床用碘海醇為對(duì)照材料，以蒸餾水稀釋出相應(yīng)碘濃度的樣品。之后，對(duì)這兩組材料進(jìn)行 CT成像測(cè)試。
CT成像測(cè)試結(jié)果顯示，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，樹(shù)狀大分子/金納米顆粒表現(xiàn)出與碘海醇相近的X-射線衰減系數(shù)，二者具有相似的體外CT成像性能(附圖6)。
實(shí)施例6
取培養(yǎng)好的KB細(xì)胞種于6孔板中，按照150萬(wàn)細(xì)胞/孔的密度接種，每孔體積2.5mL。培養(yǎng)過(guò)夜后，加入上述實(shí)施例3中各稀釋梯度的樣品，與細(xì)胞共培養(yǎng)3h。每個(gè)梯度稀釋10倍，即每孔終濃度分別為200，500，1000，2000，3000nM。之后PBS洗三次，胰酶消化， 分散于O.1mL PBS緩沖液中，進(jìn)行CT成像測(cè)試。
CT成像測(cè)試結(jié)果顯示，KB細(xì)胞吞噬納米顆粒后，CT值有一定的提高(附圖7)。
實(shí)施例7
取制備得到的乙?；蟮臉?shù)狀大分子/金納米顆粒250mg，分散于無(wú)菌PBS緩沖液中，制備得到金濃度為O.1M的溶液。取大鼠一只(約170g)，按照每千克體重O. 47mmol金的劑量，尾靜脈注射造影劑，進(jìn)行活體CT成像實(shí)驗(yàn)。間隔時(shí)間點(diǎn)CT掃描。對(duì)掃描圖片測(cè)量各主要器官的CT值。以碘海醇為對(duì)照，注射碘的劑量與金一致。
活體CT成像實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，所得納米顆粒在30_45min左右顯示最好的肝臟及脾臟造影效果。腎臟中有較少停留，膀胱中緩慢增加。相比之下，碘海醇對(duì)肝臟、脾臟幾乎沒(méi)有造影效果。相反，在腎臟中有較多停留。這可能會(huì)引起潛在的腎臟毒性。在5min左右， 膀胱中即有大量富集，即將被泌尿系統(tǒng)排出體外(附圖8，9)。這與測(cè)量到的各個(gè)器官的CT 值相吻合(附圖10)?？傊景l(fā)明制備的產(chǎn)品在體內(nèi)循環(huán)時(shí)間長(zhǎng)，未被泌尿系統(tǒng)迅速排出體外，表現(xiàn)出優(yōu)于傳統(tǒng)造影劑碘海醇的對(duì)肝臟等主要器官的CT造影效果。
權(quán)利要求
1.一種基于第二代聚酰胺-胺樹(shù)狀大分子/金納米顆粒的CT造影劑的制備方法，包括 (1)以低代數(shù)的末端為氨基的第二代聚酰胺-胺樹(shù)狀大分子作為金納米顆粒的穩(wěn)定齊U，配制摩爾濃度為2. 5-3. 5mM的水溶液，預(yù)熱； (2)在上述溶液中加入氯金酸溶液，其中樹(shù)狀大分子與氯金酸溶液中金的摩爾比為1:3,磁力攪拌； (3)將反應(yīng)后的溶液室溫冷卻之后，加入樹(shù)狀大分子末端氨基摩爾數(shù)6-12倍的三乙胺，攪拌10-30min ;之后加入樹(shù)狀大分子末端氨基摩爾數(shù)5_10倍的乙酸酐，進(jìn)行乙酰化反應(yīng)，攪拌反應(yīng)24h ;隨后透析，得到樹(shù)狀大分子穩(wěn)定的金納米顆粒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于第二代聚酰胺-胺樹(shù)狀大分子/金納米顆粒的CT造影劑的制備方法，其特征在于所述步驟(2)中，加入氯金酸之前，樹(shù)狀大分子溶液要先預(yù)熱20-40min，預(yù)熱的溫度為60°C。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于第二代聚酰胺-胺樹(shù)狀大分子/金納米顆粒的CT造影劑的制備方法，其特征在于所述步驟(2)中的磁力攪拌反應(yīng)過(guò)程持續(xù)3-4h。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于第二代聚酰胺-胺樹(shù)狀大分子/金納米顆粒的CT造影劑的制備方法，其特征在于所述步驟(3)中的冷卻時(shí)間為O. 5-2h。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于第二代聚酰胺-胺樹(shù)狀大分子/金納米顆粒的CT造影劑的制備方法，包括稱(chēng)取末端為氨基的第二代聚酰胺-胺樹(shù)狀大分子溶于水溶液中，在水浴條件下加入氯金酸溶液，磁力攪拌反應(yīng)3h；室溫冷卻后進(jìn)行乙酰化處理；將反應(yīng)后的溶液進(jìn)行透析，冷凍干燥處理得到終產(chǎn)品；對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行體內(nèi)、體外CT造影性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。本發(fā)明中涉及的產(chǎn)品制備過(guò)程簡(jiǎn)單環(huán)保，所得產(chǎn)品具有良好穩(wěn)定性和細(xì)胞相容性，同時(shí)顯示良好的體內(nèi)CT造影效果。
文檔編號(hào)A61K49/04GK102989014SQ20121045484
公開(kāi)日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2012年11月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月13日
發(fā)明者史向陽(yáng), 劉輝, 張貴祥, 許艷紅 申請(qǐng)人:東華大學(xué), 上海市第一人民醫(yī)院