專利名稱：一種含當(dāng)歸具有治療子宮內(nèi)膜異位癥功效的中藥組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于傳統(tǒng)中醫(yī)藥學(xué)、婦產(chǎn)科學(xué)、分子藥理學(xué)相結(jié)合的領(lǐng)域，具體涉及一種含當(dāng)歸的中藥組合物，該中藥組合物對子宮內(nèi)膜異位癥異位內(nèi)膜組織中凋亡抑制因子Bcl-2、Survivin的表達(dá)水平具有抑制作用，對凋亡促進(jìn)因子Bax的表達(dá)水平具有促進(jìn)作用，從而通過該特殊機(jī)制來治療子宮內(nèi)膜異位癥。
背景技術(shù)：
子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis,EMs)是一種激素依賴性的常見良性病變，在育齡婦女中發(fā)病率高達(dá)10% 15%，占普通婦科手術(shù)的30%以上。且有逐漸增加的趨勢，是 臨床上婦女痛經(jīng)、不孕、慢性盆腔疼痛的主要原因，而且藥物治療和術(shù)后復(fù)發(fā)率較高。而本發(fā)明中的當(dāng)歸、芍藥、桂枝、茯苓溫經(jīng)通脈，祛瘀生新，散結(jié)消瘕。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題研究了含當(dāng)歸的中藥組合物對大鼠子宮內(nèi)膜異位癥異位內(nèi)膜組織中凋亡抑制因子Bcl-2，SUrvivin及凋亡促進(jìn)因子Bax的轉(zhuǎn)錄層面的影響，為闡明含當(dāng)歸的中藥組合物治療子宮內(nèi)膜異位癥機(jī)制提供一條新的途徑。本發(fā)明采取的技術(shù)方案一種含當(dāng)歸具有治療子宮內(nèi)膜異位癥的功效的中藥組合物，該組合物原料藥組成按重量比為當(dāng)歸1200份、芍藥1000份、桂枝1000份、茯苓1000份，該組合物對大鼠子宮內(nèi)膜異位癥異位內(nèi)膜組織中凋亡抑制因子Bcl-2、Survivin的表達(dá)水平具有抑制作用，對凋亡促進(jìn)因子Bax的表達(dá)水平具有促進(jìn)作用。方中當(dāng)歸性溫，味甘辛，長于活血，具有化瘀而不傷血之妙，為君藥；芍藥，味苦而微寒，既可活血以散瘀，又能涼血以消瘀久化熱，為臣藥；桂枝辛甘而溫，具有溫通血脈，和營，通陽，行瘀之功效；茯苓，甘而淡平，有淡滲利濕功效，與桂枝共為佐藥，以助消瘕。諸藥合用，共奏溫經(jīng)通脈，祛瘀生新，散結(jié)消瘕之功效。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)含當(dāng)歸中藥組合物能夠通過下調(diào)凋亡抑制因子Survivin，Bcl-2，上調(diào)促凋亡因子Bax來促進(jìn)子宮內(nèi)膜細(xì)胞的凋亡。本發(fā)明采用改進(jìn)方法制作大鼠子宮內(nèi)膜異位癥異位動物模型，ig含當(dāng)歸的中藥組合物后取子宮內(nèi)膜，采用熒光定量PCR檢測內(nèi)膜組織中Survivin，BCl-2及Bax的表達(dá)情況并采用TUNEL實驗檢測大鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞的凋亡情況。本發(fā)明通過TUNEL檢測發(fā)現(xiàn)，不同劑量的含當(dāng)歸的中藥組合物均能夠誘導(dǎo)大鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞的凋亡。進(jìn)一步的熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，含當(dāng)歸的中藥組合物能夠抑制異位子宮內(nèi)膜中高表達(dá)的凋亡抑制因子Survivin的mRNA水平。此外，含當(dāng)歸的中藥組合物還能抑制線粒體凋亡途徑相關(guān)的凋亡抑制因子Bcl-2的mRNA水平，同時上調(diào)凋亡促進(jìn)因子Bax的mRNA水平。上述實驗結(jié)果表明含當(dāng)歸的中藥組合物能夠通過線粒體凋亡途徑來誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜細(xì)胞的凋亡從而抑制子宮內(nèi)膜細(xì)胞的增生和轉(zhuǎn)移。本研究中，我們利用TUNEL技術(shù)發(fā)現(xiàn)本含當(dāng)歸的中藥組合物能夠誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜細(xì)胞的凋亡，通過熒光定量PCR進(jìn)一步研究證實本含當(dāng)歸的中藥組合物能抑制在異位子宮內(nèi)膜中高表達(dá)的凋亡抑制因子Survivin的mRNA水平。Survivin是凋亡抑制蛋白家族的成員之一，Survivin具有腫瘤特異性，只表達(dá)于腫瘤和胚胎組織，且與腫瘤細(xì)胞的分化增殖及浸潤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，是一種關(guān)鍵性的凋亡抑制因子。Survivin可能主要通過兩條途徑來抑制細(xì)胞凋亡一是直接抑制凋亡終末效應(yīng)酶Caspase-3和Caspase-7的活性來阻斷各種刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程；二是Survivin與周期蛋白激酶⑶K4，⑶K2相互作用阻斷凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。Survivin主要表達(dá)于腺上皮細(xì)胞。Survivin可以使異位細(xì)胞逃避多種外界環(huán)境刺激誘導(dǎo)的凋亡，使正在發(fā)生增殖的細(xì)胞維持有絲分裂狀態(tài)，含當(dāng)歸中藥組合物可通過阻斷Survivin在內(nèi)異癥發(fā)病環(huán)節(jié)中的作用來治療子宮內(nèi)膜異位癥。此外，含當(dāng)歸中藥組合物能明顯抑制線粒體凋亡相關(guān)的凋亡抑制因子Bcl-2的mRNA水平卻上調(diào)促凋亡因子Bax的水平。Bcl-2抗凋亡可以通過以下幾種途徑一是Bcl_2·能改變線粒體巰基的氧化還原狀態(tài)來控制其膜電位從而調(diào)控細(xì)胞凋亡。在細(xì)胞凋亡中，線粒體的巰基可能組成了胞內(nèi)氧化還原電位的傳感器，Bcl-2可能是通過抑制谷胱甘肽(GSH)的外泄，降低胞內(nèi)的氧化還原電位，來抑制細(xì)胞凋亡的；二是Bcl-2能調(diào)節(jié)粒體膜對一些凋亡蛋白前體的通透性。Bcl-2蛋白可能是線粒體PT孔道的組成成份，它在較高pH的條件下能形成離子通道，而Bax則能在較為廣泛的pH范圍內(nèi)形成孔道。Bax能允許一些離子和小分子如細(xì)胞色素c等穿過線粒體膜，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，從而引起細(xì)胞凋亡，而Bcl-2的作用正好相反，它能封閉Bax形成孔道的活性，使一些小分子不能自由通透，從而保護(hù)細(xì)胞凋亡；三是Bcl-2能將凋亡蛋白前體Apaf-I等定位至線粒體膜上，使其不能發(fā)揮凋亡作用。實驗證明，盡管Bcl-2與胱冬肽酶之間無親和力存在，但當(dāng)二者在細(xì)胞中同時表達(dá)時卻發(fā)現(xiàn)它們之間有相互作用。本含當(dāng)歸的中藥組合物能明顯抑制線粒體凋亡相關(guān)的凋亡抑制因子Bcl-2的mRNA水平進(jìn)而引起細(xì)胞的凋亡。本發(fā)明的有益效果目前西醫(yī)對子宮內(nèi)膜異位癥的治療目前以手術(shù)和激素治療為主，但其5年復(fù)發(fā)率仍在40%以上，有關(guān)其治療的研究尚無突破性進(jìn)展，同時由于直接針對異位病灶的治療難以改善患者的生育能力，故有研究嘗試用一種可降低巨噬細(xì)胞活性和細(xì)胞因子產(chǎn)生的免疫機(jī)制-甲基嘌呤衍生物，給腹腔已植入活化巨噬細(xì)胞的倉鼠進(jìn)行腹腔注射，可消除巨噬細(xì)胞對生育力的影響。中醫(yī)中藥治療子宮內(nèi)膜異位癥，具有價格低廉、不用開刀、無激素治療的各種副作用、服用安全的突出優(yōu)點。


圖I不同劑量含當(dāng)歸的中藥組合物灌胃處理后移植異位子宮內(nèi)膜的生長變化A連續(xù)給藥30天后，各組異位子宮內(nèi)膜的比較B不同給藥組子宮內(nèi)膜體積比較統(tǒng)計Ορ〈0· 05)圖2不同給藥組的異位內(nèi)膜組織HE染色圖3不同給藥組異位內(nèi)膜組織TUNEL鑒定(10X40)
圖4熒光定量PCR檢測不同劑量給藥對凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax、Survivin mRNA影響(ρ〈0· 05)
具體實施例方式實施例I.材料I. I動物健康SPF級雌性SD大鼠80只，體重(200±20)g，購買于上海實驗動物中心,合格證號SCXK (滬)2008-0008。I. 2藥品與試劑本發(fā)明的含當(dāng)歸的中藥組合物，含生藥I. 65g/ml,由江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院制劑室提供，散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊，O. 4g/粒，30瓶，批號20110104，江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)；水合氯醛，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，250克/瓶，批號20110401，熒光定量 PCR 試劑盒 2X Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix Kit 夠買于 Fermentas。其他生化試劑均為分析純?！. 3儀器BX41型顯微鏡，日本Olympus公司；電子天平，德國Sartorius公司；2400型PCR擴(kuò)增儀,美國Applied Biosystems公司；凝膠自動成像儀,美國Bio-rad公司。2.實驗方法2. I大鼠子宮內(nèi)膜異位癥動物模型制作取80只大鼠，留取10只為假手術(shù)組，假手術(shù)組大鼠皮膚常規(guī)消毒后，下腹部正中切口長約3 Cm，逐層打開腹腔，然后常規(guī)關(guān)腹。其余70只為造模組，制作EMs動物模型。大鼠皮膚常規(guī)消毒后，下腹部正中切口長約3 Cm，進(jìn)腹后在膀胱背側(cè)找到子宮。游離左側(cè)子宮，近端離左子宮角I cm處結(jié)扎，遠(yuǎn)端離卵巢I cm處結(jié)扎。將切下的子宮組織放在盛有無菌生理鹽水的培養(yǎng)皿中，縱行解剖開子宮段，剪取3mmX 5mm的子宮內(nèi)膜組織(含子宮肌層)I塊。在腹壁切口右側(cè)從腹肌與皮下筋膜層之間打隧道，以正好能置入子宮片為宜，將子宮內(nèi)膜組織塊平整地置入右側(cè)隧道底部，使內(nèi)膜面緊貼腹肌，常規(guī)關(guān)腹。術(shù)后連續(xù)3d注射青霉素40萬u/只，正常喂養(yǎng)。術(shù)后第2d開始注射雌二醇O. Img / (kg*d)，每隔4天I次，共3次，以促進(jìn)異位內(nèi)膜生長。術(shù)后每周觸摸包塊2次，確定造模是否成功。2. 2分組給藥將已造模成功的55只SD大鼠隨機(jī)分成5組，分別為模型對照組、散結(jié)鎮(zhèn)痛組、含當(dāng)歸中藥組合物低、中、高劑量組每組11只次日開始給藥。含當(dāng)歸中藥組合物低、中、高劑量組(4. 13，8. 26，16. 52g · kg—1)，散結(jié)鎮(zhèn)痛組(O. 44g · kg—1)，給藥量為 IOmL · kg—1，假手術(shù)組及模型組大鼠均ig給予同體積蒸餾水，連續(xù)給藥30天后，將各組大鼠處死，快速摘取異位子宮內(nèi)膜進(jìn)行下一步檢測。2.3HE 染色將取出大鼠異位內(nèi)膜包塊立即置于10%甲醛溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋，4μπι厚度連續(xù)切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察在位、異位內(nèi)膜及正常大鼠子宮內(nèi)膜的組織形態(tài)學(xué)特點及差異。2. 4TUNEL 凋亡檢測石蠟切片二甲苯中脫蠟5-10分鐘。換用新鮮的二甲苯，再脫蠟5-10分鐘。無水乙醇5分鐘。90%乙醇2分鐘。70%乙醇2分鐘，蒸餾水2分鐘。滴加20g/ml不含DNase的蛋白酶K，在20-37°C作用15-30分鐘。用PBS或HBSS洗滌2次。在樣品上加50μ1 TUNEL檢測液，37°C避光孵育60分鐘。PBS或HBSS洗滌3次。用抗熒光淬滅封片液封片后熒光顯微鏡下觀察。2. 5熒光定量PCR分析準(zhǔn)確稱取IOOmg子宮內(nèi)膜異位組織用Trizol法提取總RNA，大約I μ g總RNA被用于 cDNA第一鏈的合成，逆轉(zhuǎn)錄用 Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas)。PCR反應(yīng)在ABI7500熒光定量PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)按照2X Maxima SYBR Green/ROX qPCRMasterMix kit進(jìn)行，反應(yīng)程序如下95。C預(yù)變性2min, 95。C變性30s, 60。C變性Imin共計40循環(huán)。數(shù)據(jù)采用AACt相對定量法分析。引物序列如表I所示。表I引物序列
權(quán)利要求
1.一種含當(dāng)歸具有治療子宮內(nèi)膜異位癥的功效的中藥組合物，該組合物原料藥組成按重量比為當(dāng)歸1200份、芍藥1000份、桂枝1000份、茯苓1000份，其特征為該組合物對大鼠子宮內(nèi)膜異位癥異位內(nèi)膜組織中凋亡抑制因子Bcl-2、Survivin的表達(dá)水平具有抑制作用，對凋亡促進(jìn)因子Bax的表達(dá)水平具有促進(jìn)作用。
全文摘要
本發(fā)明屬于傳統(tǒng)中醫(yī)藥學(xué)、婦產(chǎn)科學(xué)、分子藥理學(xué)相結(jié)合的領(lǐng)域，具體涉及一種含當(dāng)歸的中藥組合物，該中藥組合物對子宮內(nèi)膜異位癥異位內(nèi)膜組織中凋亡抑制因子Bcl-2、Survivin的表達(dá)水平具有抑制作用，對凋亡促進(jìn)因子Bax的表達(dá)水平具有促進(jìn)作用。該組合物原料藥組成按重量比為當(dāng)歸1200份、芍藥1000份、桂枝1000份、茯苓1000份。方中當(dāng)歸性溫,味甘辛，長于活血，具有化瘀而不傷血之妙，為君藥；芍藥，味苦而微寒，既可活血以散瘀,又能涼血以消瘀久化熱，為臣藥；桂枝辛甘而溫，具有溫通血脈，和營，通陽，行瘀之功效；茯苓，甘而淡平，有淡滲利濕功效，與桂枝共為佐藥，以助消瘕。諸藥合用，共奏溫經(jīng)通脈，祛瘀生新，散結(jié)消瘕之功效。
文檔編號A61P15/00GK102885902SQ20121039242
公開日2013年1月23日 申請日期2012年10月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月16日
發(fā)明者王志剛, 胡春萍, 曹鵬, 蔡雪婷, 楊杰 申請人:江蘇省中醫(yī)藥研究院