一種b型流感嗜血桿菌多糖結合疫苗的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種B型流感嗜血桿菌多糖結合疫苗的制備方法，制備方法為:A.B型流感嗜血桿菌的多糖提取物，室溫下用超純水或注射用水溶解PRP多糖至20mg/ml，按照PRP與CDAP的質量比為1的條件下加入CDAP，維持1.5min。0.3M?NaOH調節(jié)pH至9.5，維持3min。按照ADH與PRP多糖質量比為4：1的條件，加入固體ADH。0.3M?NaOH調節(jié)pH至9.5，維持1h。2-8℃，0.2M?NaCl透析；B.透析后的PRP-AH與20mg/ml?TT溶液以質量比1：2混合。0.1M?HCL調節(jié)pH至5.0，然后按照EDAC與PRP質量比為10：1的比例加入固體EDAC，室溫下維持pH5.060min，0.3M?NaOH調節(jié)pH至7.5反應30min。
【專利說明】一種B型流感嗜血桿菌多糖結合疫苗的制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種疫苗的制備方法，特別涉及一種B型流感嗜血桿菌多糖結合疫苗的制備方法。
【背景技術】
[0002]B型流感嗜血桿菌(Hib)是流感嗜血桿菌中具極強侵襲力的一種，在流感嗜血桿菌引起的嚴重感染中，幾乎90%是由B型引起的，主要引起腦膜炎、肺炎、心包炎、關節(jié)炎、菌血癥、會厭炎等疾病，該病使15%至35%的存活者患有終身殘疾，典型的病癥有精神發(fā)育遲滯或耳聾。B型流感嗜血桿菌引起的腦膜炎、肺炎是導致嬰幼兒死亡的主要原因。
[0003]多年流行病學研究表明，使用Hib疫苗是控制Hib侵襲性疾病的有效措施。因此研發(fā)效果好、成本低的Hib疫苗是必要的，也是重要的。
[0004]國內已經上市的B型流感嗜血桿菌多糖結合疫苗，系用純化的b型流感嗜血桿菌莢膜多糖與破傷風類毒素共價結合而成。隨著大量的結合疫苗使用以及基礎免疫中百白破的使用，目前以TT作為載體存在一些明顯的劣勢。目前國際市場上存在的Hib結合疫苗主要有三種載體蛋白，TT、DT、CRM197以及OMP。
[0005]現有Hib結合疫苗的生產技術，主要包括菌種的選育培養(yǎng)，莢膜多糖的提取分離純化，載體蛋白的培養(yǎng)、分離純化，莢膜多糖和載體蛋白的結合，以及疫苗的分離純化等步驟，其中關鍵步驟存在工藝復雜，成本高，質量不穩(wěn)定等缺陷。
[0006]本發(fā)明設計了不含動物源、有利于嗜血桿菌生長和PRP分泌的新培養(yǎng)基，此培養(yǎng)基完全不同于此前大家普遍采用的動物源BHI培養(yǎng)基。
[0007]本發(fā)明提出了新的PRP提取途徑的莢膜多糖提取方法，此工藝的優(yōu)點為處理量大，流程簡單，回收率高，而且對內毒素也有部分去除能力。
[0008]本發(fā)明載體蛋白純化工藝解決了蛋白純化回收率低，蛋白純化過程中活性喪失以及蛋白降解等困難，實現了高純度(達90%以上)，短流程。
[0009]本發(fā)明公開使用CDAP活化PRP，并連接CRM197蛋白或TT蛋白的方法。

【發(fā)明內容】

[0010]本發(fā)明提供一種B型流感嗜血桿菌多糖結合疫苗的制備方法，該方法包括:菌種的選育培養(yǎng)，莢膜多糖的提取分離純化，載體蛋白的培養(yǎng)、分離純化，莢膜多糖和載體蛋白的結合，以及疫苗的分離純化的步驟。
[0011]本發(fā)明在于提供以下制備方法:
[0012]1)B型流感嗜血桿菌的培養(yǎng)(購買至ATCC)；
[0013]2) B型流感嗜血桿菌的多糖提取物即PRP的提取；
[0014]3)取PRP用水溶解，不斷攪拌加入適量CDAP，維持l_3min ;加NaOH調節(jié)
[0015]pH 至 8-11，維持 l-5min ;加入 CRM197，加 NaOH 調節(jié) pH 至 8-11，反應；
[0016]4)分離純化得B型流感嗜血桿菌多糖結合疫苗原液。[0017]其中，優(yōu)選的步驟3)為:取PRP用水溶解，不斷攪拌加入適量CDAP，維持l_2min ；NaOH調節(jié)pH至9-10，維持2_4min ;加入CRM197,加NaOH調節(jié)pH至9-10，反應；特別優(yōu)選的步驟3)為:PRP用超純水溶解至25mg/ml，不斷攪拌加入CDAP，其中PRP與CDAP的重量比% 1:1.25,維持 1.5min ；0.3M NaOH 調節(jié) pH 至 9.5，維持 3min ;加入 CRM197，加 0.3M NaOH調節(jié)pH至9.5，反應；利用4FF凝膠色譜柱進行純化，收集Vo附近液體，得B型流感嗜血桿菌多糖結合疫苗。
[0018]本發(fā)明也包括，其中步驟3中的CRM197蛋白可用TT蛋白代替，具體工藝如下:
[0019]A.取B型流感嗜血桿菌的多糖提取物即PRP，室溫下用超純水或注射用水溶解PRP多糖至20mg/ml，不斷攪拌的情況下按照PRP與CDAP的質量比為I的條件下加入CDAP，維持1.5min ；0.3M NaOH調節(jié)pH至9.5，維持3min ;按照ADH與PRP多糖質量比為4:1的條件，加入固體 ADH0 0.3M NaOH 調節(jié) pH 至 9.5，維持 1h ；2-8°C，0.2M NaCl 透析；
[0020]B.透析后的PRP-AH與20mg/ml TT溶液以質量比1:2混合；(λ IM HCL調節(jié)pH至.5.0，然后按照EDAC與PRP質量比為10:1的比例加入固體EDAC，室溫下維持pH5.060min,.0.3M NaOH調節(jié)pH至7.5反應30min ;利用4FF凝膠色譜柱進行純化。
[0021]其中，步驟b)中PRP多糖的制備方法如下:
[0022]A,提取PRP粗糖:1)B型流感嗜血桿菌培養(yǎng)液離心去除菌體沉淀，收集上清；2)上清過中空纖維，收獲濾過液；3)中空纖維濾過液用50KDa的膜包超濾濃縮；4)膜包濃縮液進行分級醇沉:a.低濃度醇沉:順序加入以下物質,每100ml加入0.5-0.7g NaCl，加入無水乙醇使得終濃度為20-30%，同時按每100ml加入2M 0.5-1.5ml CaCl2比例加入CaCl2.醇沉過夜后離心，收集上清；高濃度乙醇醇沉:低濃度醇沉的上清中加入乙醇，終濃度為70-90%，醇沉過夜后離心，收集沉淀；c.0.2M NaCl復溶70-90%乙醇醇沉的沉淀；5)復溶液過0.45um的濾膜后上樣，用4FF柱子進行進一步的分離；6)按照KD=0.55的原則收集洗脫液，脫鹽，凍干即得；
[0023]B,提取PRP精糖:1)用乙酸鈉溶解步驟A中得到的PRP多糖，濃度為5mg/ml或10mg/ml ;2)加入等體積的苯酚，混勻數次，低溫過夜；3)離心收集上層水相；4)再次加入等體積的苯酚，之后重復進行步驟2-3，連續(xù)抽提三次，透析，凍干即得PRP多糖。
[0024]優(yōu)選的，PRP多糖的制備方法如下:
[0025]A,提取PRP粗糖:I) B型流感嗜血桿菌培養(yǎng)液8000rpm IOmin去除菌體沉淀，收集上清；2)上清過0.22um的中空纖維，收獲濾過液；3)中空纖維濾過液用50KDa的膜包超濾濃縮；4)膜包濃縮液進行分級醇沉:a.25%低濃度醇沉:順序加入以下物質，每100ml加Λ 0.616g NaCl，加入無水乙醇使得終濃度為25%，同時按每100ml加入lml2M CaCl2比例加入CaCl 2.醇沉過夜后8000rpm離心20min，收集上清；b.80%高濃度乙醇醇沉:低濃度醇沉的上清中加入乙醇，終濃度為80%，醇沉過夜后8000rpm離心20min，收集沉淀；c.0.2M NaCl復溶80%乙醇醇沉的沉淀；5)復溶液過0.45um的濾膜后上樣，用4FF柱子進行進一步的分離；6)按照KD=0.55的原則收集洗脫液，脫鹽，凍干即得；
[0026]B,提取PRP精糖:1)用10%乙酸鈉溶解步驟A中得到的PRP多糖，濃度為5mg/ml或10mg/ml ;2)加入等體積的苯酹,混勻數次,4攝氏度過夜；3) 12000rpm離心20min,收集上層水相；4)再次加 入等體積的苯酚，之后重復進行步驟2-3，連續(xù)抽提三次，透析，凍干即得PRP多糖。[0027]其中步驟a)中用于提取PRP的B型流感嗜血桿菌用如下方式獲得的:
[0028]培養(yǎng)基配方為，每升培養(yǎng)液中含有如下成分:
[0029]
【權利要求】
1.一種B型流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)多糖結合疫苗的制備方法,其特征在于制備方法如下: DB型流感嗜血桿菌的培養(yǎng)； 2)B型流感嗜血桿菌的多糖提取物即PRP的提?。? 3)取PRP用水溶解，不斷攪拌加入適量CDAP，維持l-3min;加NaOH調節(jié)pH至8_11，維持l-5min ;加入CRM197，加NaOH調節(jié)pH至8-11，反應； 4)分離純化得B型流感嗜血桿菌多糖結合疫苗原液。
2.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于:步驟3為取PRP用水溶解，不斷攪拌加入適量CDAP，維持l-2min ;NaOH調節(jié)pH至9_10，維持2_4min ;加入CRM197，加NaOH調節(jié)pH至9-10，反應。
3.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于制備方法如下: DB型流感嗜血桿菌的培養(yǎng)； 2)B型流感嗜血桿菌的多糖提取物即PRP的提取； 3)PRP用超純水溶解至25mg/ml，不斷攪拌加入CDAP，其中PRP與CDAP的重量比為1:1.25,維持 1.5min ；0.3M NaOH 調節(jié) pH 至 9.5，維持 3min ;加入 CRM197，加 0.3M NaOH 調節(jié)pH至9.5，反應； 4)利用4FF凝膠色譜柱進行純化，收集Vo附近液體，得B型流感嗜血桿菌多糖結合疫苗原液。
4.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟3中的CRM197蛋白用TT蛋白代替，具體工藝如下: A.取B型流感嗜血桿菌的多糖提取物即PRP，室溫下用超純水或注射用水溶解PRP多糖至20mg/ml，不斷攪拌的情況下按照PRP與CDAP的質量比為I的條件下加入CDAP，維持1.5min ；0.3M NaOH調節(jié)pH至9.5，維持3min ;按照ADH與PRP多糖質量比為4:1的條件，加入固體 ADH0 0.3M NaOH 調節(jié) pH 至 9.5，維持 Ih ； 2-8 °C，0.2M NaCl 透析； B.透析后的PRP-AH與20mg/mlTT溶液以質量比1:2混合；0.IM HCL調節(jié)pH至5.0，然后按照EDAC與PRP質量比為10:1的比例加入固體EDAC，室溫下維持pH5.060min,0.3MNaOH調節(jié)pH至7.5反應30min ;利用4FF凝膠色譜柱進行純化。
5.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于PRP多糖的制備方法如下: A.提取PRP粗糖:1)B型流感嗜血桿菌培養(yǎng)液離心去除菌體沉淀，收集上清；2)上清過中空纖維，收獲濾過液；3)中空纖維濾過液用50KDa的膜包超濾濃縮；4)膜包濃縮液進行分級醇沉:a.低濃度醇沉:順序加入以下物質,每100ml加入0.5-0.7g NaCl，加入無水乙醇使得終濃度為20-30%，同時按每100ml加入2M 0.5-1.5ml CaCl2比例加入CaCl2.醇沉過夜后離心，收集上清；b.高濃度乙醇醇沉:低濃度醇沉的上清中加入乙醇，終濃度為70-90%，醇沉過夜后離心，收集沉淀；c.0.2M NaCl復溶70-90%乙醇醇沉的沉淀；5)復溶液過0.45um的濾膜后上樣，用4FF柱子進行進一步的分離；6)按照KD=0.55的原則收集洗脫液，脫鹽，凍干即得； B.提取PRP精糖:I)用乙酸鈉溶解步驟A中得到的PRP多糖，濃度為5mg/ml或IOmg/ml ；2)加入等體積的苯酚，混勻數次，低溫過夜；3)離心收集上層水相；4)再次加入等體積的苯酚，之后重復進行步驟2-3，連續(xù)抽提三次，透析，凍干即得PRP多糖。
6.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于PRP多糖的制備方法如下: A.提取PRP粗糖:I)B型流感嗜血桿菌培養(yǎng)液8000rpm IOmin去除菌體沉淀，收集上清；2)上清過0.22um的中空纖維，收獲濾過液；3)中空纖維濾過液用50KDa的膜包超濾濃縮；4)膜包濃縮液進行分級醇沉:a.25%低濃度醇沉:順序加入以下物質，每100ml加入0.616g NaCl，加入無水乙醇使得終濃度為25%，同時按每100ml加入lml2M CaCl2比例加入CaCl 2.醇沉過夜后8000rpm離心20min，收集上清；b.80%高濃度乙醇醇沉:低濃度醇沉的上清中加入乙醇，終濃度為80%，醇沉過夜后8000rpm離心20min，收集沉淀；c.0.2M NaCl復溶80%乙醇醇沉的沉淀；5)復溶液過0.45um的濾膜后上樣，用4FF柱子進行進一步的分離；6)按照KD=0.55的原則收集洗脫液，脫鹽，凍干即得； B.提取PRP精糖:1)用10%乙酸鈉溶解步驟A中得到的PRP多糖，濃度為5mg/ml或10mg/ml ;2)加入等體積的苯酹,混勻數次,4攝氏度過夜；3) 12000rpm離心20min,收集上層水相；4)再次加入等體積的苯酚，之后重復進行步驟2-3，連續(xù)抽提三次，透析，凍干即得PRP多糖。
7.如權利要求1所述的制備方法， 其特征在于用于提取PRP的B型流感嗜血桿菌用如下方式獲得的: 培養(yǎng)基配方為，每升培養(yǎng)液中含有如下成分:
8.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于用于提取PRP的B型流感嗜血桿菌用如下方式獲得的: 培養(yǎng)基配方為，每升培養(yǎng)液中含有如下成分:
9.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于CRM197的生產過程如下:.O采用天然棒狀白喉桿菌(Corynebacterium diphtheriae)進行發(fā)酵培養(yǎng)；2)發(fā)酵液通過連續(xù)流或者杯式離心機離心后，過中空纖維進行進澄清處理； 3)經過澄清之后的發(fā)酵液用IOkDa超濾膜進行超濾濃縮； 4)超濾濃縮液采用20-50%飽和硫酸銨進行第一次鹽析，離心去除沉淀后用60-85%飽和硫酸銨對上清液進行第二次鹽析，然后復溶； 5)復溶液經離子交換捕獲CRM197蛋白，過程為，復溶液經10-50MPB緩沖液超濾換液至 Cond 10.0-2.0, pH 調節(jié)至 7.0-8.0 上樣，色譜填料選自:ToyopearI DEAE-650S、DEAE.Fratogel EMD、Q.Sepharose.FF、CaptoQ Seharose.FF ;洗脫液為:IOmM-1OOM PB+0.5M KC ；25%B 一步洗脫； 6)捕獲后的蛋白經疏水分離進行進一步純化，分離純化過程為:疏水填料為Butyl-650S Toyopearl、Phenyl Sepharose highsub,平衡緩沖液為 10 ~50mM PB,pH 7.0,.1.5M硫酸銨；洗脫緩沖液為10~IOOmM PB, pH7.0~7.6 ;洗脫緩沖液為10~50mM PB，pH 7.0,洗脫方式為一步洗脫，先用預洗緩沖液洗脫雜蛋白以后，再用洗脫緩沖液洗脫目的蛋白，其中預洗緩沖液為50mM PB, PH 7.0, 1.05M硫酸銨； 7)濃縮至所需濃度保存。
10.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于:步驟4中所得的疫苗原液經含NaCl的水溶液稀釋，同時加入PB緩沖液、tween-80以及磷酸鋁佐劑，至PRP終濃度為20ug/ml，NaCl終濃度為0.9%，磷酸鋁終濃度為2.5mg/ml, PB終濃度為10mM，tween-80終濃度為.0.01%時，分裝得到B型流感嗜血桿菌多糖蛋白結合疫苗。
【文檔編號】A61P31/04GK103623404SQ201210311027
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2012年8月28日 優(yōu)先權日:2012年8月28日
【發(fā)明者】李軍強, 孫倩, 趙秋敏, 李亞冰, 劉賀軍, 金永杰 申請人:天士力制藥集團股份有限公司