專利名稱：具微納仿生內(nèi)膜結(jié)構(gòu)的靜電紡絲人工血管的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備具微納仿生內(nèi)膜結(jié)構(gòu)的靜電紡絲人工血管的方法。
背景技術(shù)：
目前，在全世界范圍內(nèi)，心血管疾病,腦血管疾病及周圍動(dòng)脈疾病仍是弓I起人類死亡的主要原因。當(dāng)病變血管需要被替換時(shí)，臨床上最常用的是自體血管，如隱靜脈，乳內(nèi)動(dòng)脈等，每年大約需要實(shí)施600000例血管移植手術(shù)，但接近三分之一的病患者因?yàn)檠芾匣?，血管病變、損傷或之前手術(shù)使用等原因而無法使用自體血管，且此方法往往需要二次手術(shù)，對(duì)病人機(jī)體造成較大損傷。在這種情況下，人工血管成為很好的選擇。目前臨床上使用的人工血管如ePTFE (GORE )及Dacron (Invista )替代大口徑血管(6—IOmm)已經(jīng)非常成熟，但對(duì)于口徑小于6mm的血管或者血流速度慢的區(qū)域，例如冠狀動(dòng)脈或膝下動(dòng)脈，人工血管移植的失敗率很高。造成人工血管移植失敗的主要原因是血液-材料界面血栓形成，因此很有必要研發(fā)新型具有較好血液相容性的材料或者提高原有材料的血液相容性來制備小口徑人工血管天然血管一般由三層結(jié)構(gòu)組成:外膜層，中膜層和內(nèi)膜層。原子力顯微鏡觀察結(jié)果表明，大鼠血管的內(nèi)膜層表面分布著沿血管長(zhǎng)軸方向的亞微米尺度溝槽，以及溝槽表面納米級(jí)的包狀突起。靜電紡絲技術(shù)(電紡)是近幾年興起的一種制備納米至微米級(jí)纖維的十分有效的方法，因?yàn)槠湓O(shè)備簡(jiǎn)易，費(fèi)用低廉，制備出的材料具有較高的比表面積，可控纖維的直徑及孔隙率，以及可制備出接近天然細(xì)胞外基質(zhì)尺度范圍的纖維等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于組織工程支架的制備。大多數(shù)情況下，利用靜態(tài)收集器，靜電紡絲制備出的材料是絮狀或網(wǎng)狀的纖維聚集體，但很多人體組織例血管，骨，神經(jīng)管，韌帶等，具有典型的定向排列微結(jié)構(gòu)，因而利用靜電紡絲技術(shù)制備取向纖維微結(jié)構(gòu)組織工程支架成為一個(gè)熱點(diǎn)。很多研究證實(shí)具仿生血管中膜周向分布微結(jié)構(gòu)的組織工程血管支架可以調(diào)節(jié)人工血管的宏觀力學(xué)特性，并能引導(dǎo)組織再生。目前較少有制備沿血管長(zhǎng)軸方向取向微結(jié)構(gòu)的人工血管的報(bào)道。專利CN201010117485.4中只公開了使用靜電紡絲技術(shù)制備無規(guī)則內(nèi)膜結(jié)構(gòu)的人工血管，專利CN200610144252.7中提出了具微納仿內(nèi)膜結(jié)構(gòu)的二維材料，所以具微納仿生內(nèi)膜結(jié)構(gòu)的三維人工血管的制備是急需解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有人工血管制備技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的主要目的在于提供一種具微納仿生內(nèi)膜結(jié)構(gòu)的靜電紡絲人工血管的制備方法，以提高人工血管的血液相容性，避免因血栓形成造成人工血管腔狹窄。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種具微納仿生內(nèi)膜結(jié)構(gòu)的靜電紡絲人工血管的制備方法，該制備方法按如下步驟進(jìn)行:(I)高分子聚合物靜電 紡絲原液的配制:將高分子聚合物配制成紡絲效果良好地溶劑，用合適的無機(jī)溶劑(水)和/或有機(jī)溶劑(如甲酸、乙酸、乙醇、丙酮、二甲基甲酰胺、四氫呋喃或它們的任意混合物等)配制高分子聚合物溶液。(2)將步驟(I)中制備的溶液移入注射器中，然后將注射器固定到垂直支架上，通過針頭與高壓電源相連，以高速旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)鼓作為收集裝置，轉(zhuǎn)鼓外周覆蓋鋁箔，并通過導(dǎo)線連接地線或者負(fù)高壓電源。開啟高壓電源，電紡制備取向納米纖維組成的薄膜；(3)將步驟(2)中制備取向納米纖維膜沿纖維長(zhǎng)軸方向拉伸(如圖1c所示)，置于高溫烘箱中，保持拉伸狀態(tài)并烘干；(4)具有取向微結(jié)構(gòu)的人工血管的制備；(5)人工血管體外血小板粘附的測(cè)定；在本發(fā)明的上述技術(shù)方案中，所述步驟(I)中的高分子聚合物包括聚氨酯，聚乳酸、聚乙烯醇、滌綸、聚己內(nèi)酯，聚甲基丙烯酸甲酯，聚苯乙烯，聚烯烴，硅橡膠，醫(yī)用聚氯乙烯以及它們之間的共聚物等合成高分子聚合物，膠原，殼聚糖，纖維素，明膠，纖維蛋白原，絲素蛋白等天然高分子聚合物；進(jìn)一步所述步驟(2)中取向電紡纖維膜的制備過程是將該溶液針頭與轉(zhuǎn)鼓上端間的距離是25-30cm,開動(dòng)轉(zhuǎn)鼓,設(shè)定速度為3000-6000rpm用于制備取向電紡纖維膜,然后施加10-30KV高壓，啟動(dòng)30-60分鐘后，獲得具取向纖維結(jié)構(gòu)的膜；進(jìn)一步所述步驟(4)中人工血管的制備，包括:①將具取向微結(jié)構(gòu)的纖維 膜繞不同規(guī)格金屬模具卷成管狀作為人工血管的內(nèi)膜，其中取向纖維膜的絕大部分纖維方向和磨具長(zhǎng)軸方向相同；②將模具連接到可以高速旋轉(zhuǎn)的電機(jī)上，通過導(dǎo)線連接地線或負(fù)高壓電源；③設(shè)定電紡裝置的工作電壓為25_35kv，工作距離25-30cm，高分子聚合物溶液用量3-10ml電紡?fù)N或不同的高分子聚合物溶液制備人工血管外層；④電紡過程結(jié)束后，將帶有人工血管的模具放入高溫烘箱烘干；⑤干燥去除殘余溶劑后，將人工血管從模具上取下后得到具微納仿生內(nèi)膜結(jié)構(gòu)的靜電紡絲人工血管；⑥將人工血管截成長(zhǎng)度1.4cm的片段，用于測(cè)試體外血小板粘附特性，人工血管的內(nèi)膜微結(jié)構(gòu)通過掃描電鏡表征。進(jìn)一步所述步驟(5)中人工血管體外血小板粘附的測(cè)定是通過一個(gè)自制的血小板體外循環(huán)系統(tǒng)來完成，包括:①用PBS溶液灌注，然后將富血小板懸液平均分為三份，分別通過三個(gè)注射器加入血小板體外循環(huán)系統(tǒng)中，將整個(gè)系統(tǒng)置于37°C的水浴下恒溫靜置I小時(shí)；②取下三種不同內(nèi)膜結(jié)構(gòu)的人工血管，置入4°C戊二醛中固定4小時(shí)，隨后用30%, 50%, 70%, 85%, 95%和100%乙醇梯度脫水，臨界干燥儀干燥后用環(huán)境掃描電鏡的低真空模式進(jìn)行觀察。與現(xiàn)有的小口徑人工血管相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:(I)該發(fā)明制備的靜電紡絲人工血管具有仿血管內(nèi)膜取向排列微結(jié)構(gòu)，使得該人工血管的血液相容性達(dá)到臨床抗凝血性能的要求，提供了制備新型人工血管的一個(gè)新途徑。(2)本發(fā)明不采用抗凝劑，只是通過表面微結(jié)構(gòu)效應(yīng)提高人工血管的血液相容性，因此不存在抗凝劑會(huì)帶來的副作用。


圖1為具微納仿生內(nèi)膜結(jié)構(gòu)的靜電紡絲人工血管制備方法流程圖。圖2為具微納仿生內(nèi)膜結(jié)構(gòu)的靜電紡絲人工血管內(nèi)膜掃描電鏡圖(5000X)。圖3為具微納仿生內(nèi)膜結(jié)構(gòu)的靜電紡絲人工血管內(nèi)膜掃描電鏡圖(1000X )。圖4為血小板體外循環(huán)系統(tǒng)示意圖(圖4中箭頭表示血液循環(huán)方向)。圖5為體外血小板粘附實(shí)驗(yàn)后，人工血管的環(huán)境掃描電鏡的低真空模式圖。
具體實(shí)施例方式為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合具體實(shí)施例，并參照附圖，對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明。實(shí)驗(yàn)材料SD大鼠(400±20g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物處置符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn))，聚醚型聚氨酯(PU，Sigma-Aldrich),四氫呋喃(THF，分析純，北京化工廠)，N，N- 二甲基甲酰胺(DMF,分析純,北京益利精細(xì)化工廠),氯化鈉(北京化工廠，分析純)去離子水(Mill1-Q, Millipore0.22 y m超純水),磷酸氫二鈉(北京化工廠，分析純)，磷酸二氫鈉(北京化工廠，分析純)，水合氯醛(北京化工廠，分析純)，檸檬酸三鈉(北京化工廠，分析純)，戊二醛(北京化工廠，分析純)，硅片(Grinm半導(dǎo)體材料公司，中國)，⑶62P單抗、FITC標(biāo)記羊抗鼠多抗(Abcom公司)，大鼠組織型纖溶酶原激活劑(t_PA) ELISA檢測(cè)試劑盒(北京奇松生物科技有限公司)，大鼠血管性血友病因子(vWF)ELISA檢測(cè)試劑盒(北京奇松生物科技有限公司)，鋁箔(市售)，醫(yī)用注射器(5ml )，針頭(7 12號(hào))。儀器直流高壓電源(DW-P303-1AC，(T+30KV，天津東文高壓電廠)，微量注射泵(TC1-1I型，北京思路高高科技發(fā)展有限公司)，微電子天平(德國Dataphysics公司DCATll動(dòng)態(tài)接觸角儀)，離心機(jī)(湖南長(zhǎng)沙湘儀有限公司H-1650)，恒溫水浴槽，場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(日本電子JEOL JSM-6700)，環(huán)境掃描電子顯微鏡(FEI Corp.Quanta 200FEG)，熒光顯微鏡(TC-XDS-500C倒置熒光顯微鏡)，酶標(biāo)儀(Multiskan FC酶標(biāo)儀)，1.2mm金屬磨具。實(shí)施例1:具微納仿生內(nèi)膜結(jié)構(gòu)的聚氨酯人工血管的制備1.聚氨酯溶液的配制 將聚氨酯顆粒溶入體積比為7:3的四氫呋喃與N，N- 二甲基甲酰胺混合溶液中，攪拌約3h使之形成一澄清、穩(wěn)定、均一的溶液。2.取向電紡纖維膜的制備將該溶液移入5ml注射器中，然后將注射器固定到垂直支架上，通過針頭與高壓電源相連，針頭與轉(zhuǎn)鼓上端間的距離是25cm,開動(dòng)轉(zhuǎn)鼓，設(shè)定速度為3000rpm,然后施加10-30KV高壓，啟動(dòng)30分鐘后，即可獲得具取向纖維結(jié)構(gòu)的膜。3.取向電紡纖維膜的拉伸為了獲得更好的取向度， 將取向纖維膜沿纖維長(zhǎng)軸方向拉伸120%，保持拉伸狀態(tài)放置于60°C烘箱半小時(shí)。4.具有取向微結(jié)構(gòu)的人工血管的制備將具取向微結(jié)構(gòu)的纖維膜繞金屬磨具卷成管狀(具取向微結(jié)構(gòu)的膜保持其纖維方向與磨具長(zhǎng)軸方向一致)作為人工血管的內(nèi)膜，然后將模具連接到可以高速旋轉(zhuǎn)的電機(jī)上，以接地的模具為收集裝置，保持工作電壓25-35kv，工作距離25cm，電紡制備人工血管外層，每根人工血管使用聚氨酯溶液3ml。電紡過程結(jié)束后，將獲得的人工血管取下即可得到本發(fā)明的具微納仿生內(nèi)膜結(jié)構(gòu)的聚氨酯人工血管。通過掃描電鏡表征人工血管內(nèi)膜微結(jié)構(gòu)。從掃描電鏡表征結(jié)果可見，組成人工血管內(nèi)膜的取向電紡纖維的直徑為298±60iim，纖維間距為390± 170nm，與人工血管長(zhǎng)軸夾角在10°以內(nèi)的纖維數(shù)量占總纖維數(shù)量的91.7%。5.體外血小板粘附測(cè)定血小板體外粘附的測(cè)定是通過一個(gè)自制的血小板體外循環(huán)系統(tǒng)來完成，如圖3所示。該系統(tǒng)主要包括:蠕動(dòng)泵，三通管，醫(yī)用硅膠管，注射器，待測(cè)人工血管，其中蠕動(dòng)泵用來提供循環(huán)動(dòng)力，流速采用50ml/min，接近大鼠腹主動(dòng)脈的正常流速。整個(gè)系統(tǒng)的管路按照細(xì)胞培養(yǎng)的水平清洗、處理。①用PBS溶液灌注，然后將富血小板懸液平均分為三份，分別通過三個(gè)注射器加入血小板體外循環(huán)系統(tǒng)中，將整個(gè)系統(tǒng)置于37°C的水浴下恒溫靜置I小時(shí)；②取下三種不同內(nèi)膜結(jié)構(gòu)的人工血 管，置入4°C戊二醛中固定4小時(shí)，隨后用30%, 50%, 70%, 85%, 95%和100%乙醇梯度脫水，臨界干燥儀干燥后用環(huán)境掃描電鏡的低真空模式進(jìn)行觀察；③人工血管內(nèi)膜表面粘附的血小板數(shù)量很少，且絕多數(shù)血小板呈現(xiàn)出未激活的圓球形形態(tài)，如圖4所示實(shí)施例2:具微納仿生內(nèi)膜結(jié)構(gòu)的聚己內(nèi)酯人工血管的制備1.聚己內(nèi)酯溶液的配制將聚己內(nèi)酯顆粒溶入體積比為5:5的二氯甲烷與N，N-二甲基甲酰胺混合溶液中，攪拌約3h使之形成一澄清、穩(wěn)定、均一的溶液。2.取向電紡纖維膜的制備將該溶液移入5ml注射器中，然后將注射器固定到垂直支架上，通過針頭與高壓電源相連，針頭與轉(zhuǎn)鼓上端間的距離是27cm,開動(dòng)轉(zhuǎn)鼓，設(shè)定速度為4000rpm,然后施加10-30KV高壓，啟動(dòng)30分鐘后，即可獲得具取向纖維結(jié)構(gòu)的膜。3.取向電紡纖維膜的拉伸為了獲得更好的取向度，將取向纖維膜沿纖維長(zhǎng)軸方向拉伸150%，保持拉伸狀態(tài)放置于60°C烘箱半小時(shí)。4.具有取向微結(jié)構(gòu)的人工血管的制備將具取向微結(jié)構(gòu)的纖維膜繞金屬磨具卷成管狀(具取向微結(jié)構(gòu)的膜保持其纖維方向與磨具長(zhǎng)軸方向一致)作為人工血管的內(nèi)膜，然后將模具連接到可以高速旋轉(zhuǎn)的電機(jī)上，以接地的模具為收集裝置，保持工作電壓25-35kv，工作距離27cm，電紡制備人工血管外層，每根人工血管使用聚己內(nèi)酯溶液2.5ml。電紡過程結(jié)束后，將獲得的人工血管取下即可得到本發(fā)明的具微納仿生內(nèi)膜結(jié)構(gòu)的聚己內(nèi)酯人工血管。通過掃描電鏡表征人工血管內(nèi)膜微結(jié)構(gòu)。5.體外血小板粘附測(cè)定血小板體外粘附的測(cè)定是通過一個(gè)自制的血小板體外循環(huán)系統(tǒng)來完成，環(huán)境掃描電鏡的低真空模式的觀察結(jié)果顯示人工血管內(nèi)膜表面粘附的血小板數(shù)量很少，且絕多數(shù)血小板呈現(xiàn)出未激活的圓球形形態(tài)除非特殊定義，本發(fā)明描述所用的術(shù)語是在有關(guān)技術(shù)領(lǐng)域中公知的術(shù)語。標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)符號(hào)及縮寫符號(hào)可以與其全名互換使用。

除非特殊指明，本發(fā)明所用到但未明確闡述或簡(jiǎn)單闡述的技術(shù)和方法是指本技術(shù)領(lǐng)域通常使用的技術(shù)和方法，可按照本領(lǐng)域公知的技術(shù)和方法進(jìn)行。試劑盒的使用是根據(jù)制造商或供應(yīng)商提供的說明書進(jìn)行。
權(quán)利要求
1.一種具微納仿生內(nèi)膜結(jié)構(gòu)的靜電紡絲人工血管的制備方法，其特征在于該制備方法按如下步驟進(jìn)行: (1)高分子聚合物靜電紡絲原液的配制:將高分子聚合物配制成紡絲效果良好地溶劑，用無機(jī)溶劑和/或有機(jī)溶劑配制高分子聚合物溶液。
(2)將步驟(I)中制備的溶液移入注射器中，然后將注射器固定到垂直支架上，通過針頭與高壓電源相連，以高速旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)鼓作為收集裝置，轉(zhuǎn)鼓外周覆蓋鋁箔，并通過導(dǎo)線連接地線或者負(fù)高壓電源。開啟高壓電源，電紡制備取向納米纖維組成的薄膜； (3)將步驟(2)中制備取向納米纖維膜沿纖維長(zhǎng)軸方向拉伸，置于高溫烘箱中，保持拉伸狀態(tài)并烘干； (4)具有取向微結(jié)構(gòu)的人工血管的制備:①將具取向微結(jié)構(gòu)的纖維膜繞不同規(guī)格金屬模具卷成管狀作為人工血管的內(nèi)膜，其中取向纖維膜的絕大部分纖維方向和磨具長(zhǎng)軸方向相同；②將模具連接到可以高速旋轉(zhuǎn)的電機(jī)上，通過導(dǎo)線連接地線或負(fù)高壓電源；③設(shè)定電紡裝置的工作電壓為25-35kv，工作距離25-30cm，高分子聚合物溶液用量3-10ml電紡?fù)N或不同的高分子聚合物溶液制備人工血管外層；④電紡過程結(jié)束后，將帶有人工血管的模具放入高溫烘箱烘干干燥去除殘余溶劑后，將人工血管從模具上取下后得到具微納仿生內(nèi)膜結(jié)構(gòu)的靜電紡絲人工血管將人工血管截成長(zhǎng)度1.4cm的片段，用于測(cè)試體外血小板粘附特性，人工血管的內(nèi)膜微結(jié)構(gòu)通過掃描電鏡表征。
(5)人工血管體外血小板粘附的測(cè)定:其通過一個(gè)自制的血小板體外循環(huán)系統(tǒng)來完成，包括:①用PBS溶液灌注，然后將富血小板懸液平均分為三份，分別通過三個(gè)注射器加入血小板體外循環(huán)系統(tǒng)中，將整個(gè)系統(tǒng)置于37°C的水浴下恒溫靜置I小時(shí)；②取下三種不同內(nèi)膜結(jié)構(gòu)的人工血管，置入4°C戊二醛中固定4小時(shí)，隨后用30 %，50 %，70 %，85 %，95 %和100%乙醇梯度脫水，臨界干燥儀干燥后用環(huán)境掃描電鏡的低真空模式進(jìn)行觀察。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述 的具微納仿生內(nèi)膜結(jié)構(gòu)的靜電紡絲人工血管的制備方法，其特征在于步驟(I)中的高分子聚合物包括聚氨酯，聚乳酸、聚乙烯醇、滌綸、聚己內(nèi)酯，聚甲基丙烯酸甲酯，聚苯乙烯，聚烯烴，硅橡膠，醫(yī)用聚氯乙烯以及它們之間的共聚物等合成高分子聚合物，膠原，殼聚糖，纖維素，明膠，纖維蛋白原，絲素蛋白等天然高分子聚合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具微納仿生內(nèi)膜結(jié)構(gòu)的靜電紡絲人工血管的制備方法，其特征在于步驟(2)中取向電紡纖維膜的制備過程是將該溶液針頭與轉(zhuǎn)鼓上端間的距離是25-30cm,開動(dòng)轉(zhuǎn)鼓,設(shè)定速度為3000-6000rpm用于制備取向電紡纖維膜,然后施加10-30KV高壓，啟動(dòng)30-60分鐘后，獲得具取向纖維結(jié)構(gòu)的膜。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具微納仿生內(nèi)膜結(jié)構(gòu)的靜電紡絲人工血管的制備方法，其特征在于無機(jī)溶劑為水。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具微納仿生內(nèi)膜結(jié)構(gòu)的靜電紡絲人工血管的制備方法，其特征在于有機(jī)溶劑為甲酸、乙酸、乙醇、丙酮、二甲基甲酰胺、四氫呋喃或它們的任意混合物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用靜電紡絲技術(shù)制備的具微納仿生內(nèi)膜結(jié)構(gòu)的人工血管的制備方法，其主要步驟包括高分子聚合物溶液的配制；取向電紡纖維膜的制備；拉伸；人工血管的制備；掃描電鏡表征；血液相容性的測(cè)定。該方法制備的人工血管具有仿血管內(nèi)膜取向排列微結(jié)構(gòu)，使得該人工血管的血液相容性達(dá)到臨床抗凝血性能的要求，提供了制備新型人工血管的一個(gè)新途徑，同時(shí)由于不采用抗凝劑，只是通過表面微結(jié)構(gòu)效應(yīng)提高人工血管的血液相容性，因此減少了抗凝劑會(huì)帶來的副作用，在醫(yī)學(xué)臨床血管移植領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61F2/06GK103211663SQ201210287469
公開日2013年7月24日 申請(qǐng)日期2012年8月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月13日
發(fā)明者王深明, 劉瑞明, 趙勇, 胡作軍, 秦原森 申請(qǐng)人:王深明, 劉瑞明, 趙勇, 胡作軍, 秦原森