專利名稱：利用中波紫外線對離體皮膚消毒的方法及其產品的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于一種消毒方法，具體涉及利用中波紫外線對離體皮膚消毒的方法，還涉及用該方法制得的產品。
背景技術：
異體和異種皮膚是臨床上替代自體皮膚治療大面積燒傷的主要敷料，但異種和異體皮膚抗原性強，特別是新鮮皮膚，還帶有大量的菌污染，皮膚移植后的強烈免疫排斥反應往往會導致皮膚過早的壞死。中波紫外線(UltravioletRadiationB, UVB),是到達地球表面的紫外線中引起機體生物學效應的主要光譜，波長280-320nm。 經研究表明311nm的窄譜中波紫外線(NB-UVB)在治療銀屑病具良好單一性，紅斑反應、色素沉著輕微，且療效可靠，可產生最佳治療效果，單純NB-UVB照射治療銀屑病有效率可達73. 3%，而290-300nm波長的UVB可致皮膚灼傷(紅斑效應和角質形成細胞壞死)，而無治療作用。目前，利用中波紫外線對離體皮膚消毒還處理空白，如何在降低離體皮膚免疫原性的同時，帶菌量少，又可保持離體皮膚活性較高。是皮膚移植中亟待解決的問題。

發(fā)明內容
有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供利用中波紫外線對離體皮膚消毒的方法，操作簡單方便，條件易于控制，對離體皮膚活性影響較小，并能有效控制離體皮膚的帶菌量和降低免疫原性。為實現上述發(fā)明目的，技術方案為
利用中波紫外線對離體皮膚消毒的方法，將離體皮膚用電壓為18(T240V，照射劑量為10(T400J/cm2的中波紫外線照射。優(yōu)選的，所述離體皮膚置于溫度為(T25°C，濕度為40-70%的環(huán)境下。更優(yōu)選的，所述離體皮膚置于溫度為25°C，濕度為60%環(huán)境下，用電壓為220V，照射劑量為300J/cm的中波紫外線照射。更優(yōu)選的，波紫外線照射前還包括離體皮膚預處理，具體為將離體皮膚制成厚度為I. Omm的材料。本發(fā)明中離體皮膚可以選用臨床上可接受的皮膚，優(yōu)選的離體皮膚為離體豬皮，具有來源廣泛，成本低的特點。本發(fā)明的目的之二在于提供由中波紫外線對離體皮膚消毒制備的離體皮膚，其免疫原性低，帶菌量少，皮膚活性高。為實現上述發(fā)明目的，技術方案為
所述利用中波紫外線對離體皮膚消毒的方法制備的離體皮膚。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明公開的利用中波紫外線對離體皮膚消毒的方法，操作簡單，條件易于控制，對離體皮膚活性影響較小，并且制得的離體皮膚帶菌量少，免疫原性低，能用于臨床上替代自體皮膚治療大面積燒傷的敷料，具有廣泛的應用前景。
具體實施例方式以下將參照實施例，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。優(yōu)選實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。一、消毒方法
利用中波紫外線對立體豬皮進行消毒的方法，具體步驟如下
A制皮
取新鮮豬皮，然后制成厚度為O. 8-1. Omm的離體豬皮，切塊，備用；
B照射
將步驟A處理的離體豬皮放置于中波紫外線(UVB)恒溫箱，并保持豬皮與UVB燈管的 距離小于20cm，按照表I設計的正交試驗對豬皮進行處理，得消毒豬皮。取新鮮豬皮，未經UVB處理皮為陰性對照，以25kGYCo~60照射為陽性對照。25kGYCo~60表示用25kGY鈷-60的劑量，在輻射加工過程中，受照物質單位質量所吸收的能量，國際單位定義為戈瑞(Gy)，I戈瑞表示I千克(Kg)物質吸收I焦耳(J)能量，I Gy = I J/ Kg ;輻射加工中常用千戈瑞(KGy)表示吸收劑量。表I.正交實驗法UVB照射豬皮因素與水平表
因素一
I,壓I 溫度(-ο；) MS. (%)照射_重(J/cm)
1__180__O__40__IOO_
2__200__5__BO__200_
3__220__15__60__300_
4丨 240 I 25 I 70 I400
備注V—電壓；T一溫度；S—濕度；Z—照射劑量處理后測定皮膚各指標，分別為UVB對皮膚表皮細胞刺激淋巴細胞增殖抑制率(YZL)；UVB照射對皮膚LC數量下降百分率(LC)5UVB對皮膚帶菌量細菌下降百分率(XJ)和UVB照射后的皮膚活性百分率(HX)。二、淋巴細胞增殖實驗 I)淋巴細胞的分離
將淋巴細胞分離液(購自上海研拓生物科技有限公司)與健康人全血按體積比為1:1先后加入離心管，在溫度為25°c、轉速為3000rpm條件下離心20分鐘；吸取中間層淋巴細胞層，并用淋巴細胞分離液清洗3次，然后進行活細胞計數，并用質量分數為10%CS-RPMI1640調整細胞濃度至IXlO6 cells/ml。2)表皮細胞的分離
將消毒豬皮剪成O. 3cmX 2cm皮條，加入質量分數為O. 25%的胰蛋白酶(胰蛋白酶與消毒豬皮的體積比為5 :1)，置于4°C冰箱中消化15小時，用鑷子輕輕揭下表皮。將表皮剪碎在溫度為37°C條件下，用質量分數為O. 25%胰蛋白酶搖床中熱消化O. 5小時，加入相當于消化液1/10體積的血清終止消化，在轉速為IOOOrpm條件下離心5分鐘，然后進行活細胞細胞計數，并用質量分數為10% CS-RPMI 1640調整細胞濃度至I X IO6 cells/mL。3)制板
在96孔板中每孔加入IXlO5 cells淋巴細胞和I X IO4Cells表皮細胞為實驗組，空白組單獨加入IXio5 cells淋巴細胞，對照組加相同數量的未經UVB處理離體豬皮分離的I X IO4ceIls表皮細胞和I X IO5 cells淋巴細胞，其余用培養(yǎng)液補足，每組做5個復孔。加液完畢，移96孔板在溫度為37°C，體積分數為5%的CO2孵育50小時，然后在轉速為IOOOrpm條件下離心5分鐘，棄液加入質量分數為O. 05%氯丁膠新型交聯劑(MTT) 100 μ L，繼續(xù)培養(yǎng)4小時，培養(yǎng)結束后，棄液加入150 μ L 二甲基亞砜(DMSO)，吹打均勻，待紫色結晶完全溶解，置96孔平底細胞培養(yǎng)板于酶聯反應檢測儀在波長為570nm處測定OD值。根據如下公式計算抑制率抑制率=1-(實驗組OD值-空白組OD值/對照組OD值-空白組OD值)X 100%,結果如表2所示。三、ATP酶染色朗格漢細胞(LC)
按照上述方法分離消毒豬皮的表皮為實驗組，并以未經UVB處理的離體豬皮分離表皮作為對照組。
I) ATP 酶染色
將分離下來的表皮分別放入含30g/L的Tris和29g/L的馬來酸緩沖液中展開(包括實驗組和對照組)，洗滌3次，每次洗滌10分鐘；放入含12. 8g/L的二甲腫酸和40g/L的福爾馬林的固定液中，在溫度為4°C條件下固定20分鐘；將固定好的表皮放入含O. 45g/L ATP二鈉和2. Og/L硝酸鉛的孵育液中，在溫度為37°C條件下孵育40分鐘；孵育后用濃度為O. Imol/L的Tris-馬來酸緩沖液(pH5. 0-8. 5)洗滌3次，每次清洗10分鐘；然后在含llg/L的硫化銨中顯色20分鐘；再用自來水沖洗10分鐘。將真皮面向上展平在載玻片上，用甘油明膠封固后，在光鏡放大100倍下觀察ATP酶染色陽性的樹突狀細胞(朗格漢細胞)的大小和分布，并顯微攝影。2)表皮單位面積LC數量的測定
在光鏡放大100倍下，隨機選10視野，用目鏡網格測微器計算每mm2面積內ATP酶染色陽性樹突狀細胞(朗格漢細胞)數量，UVB照射對皮膚LC數量下降百分率=(對照組LC數量-實驗組LC數量)/對照組LC數量X 100%,結果如表2所示。四、帶菌量檢測 I)消毒豬皮處理
將消毒豬皮加入滅菌生理鹽水，其中消毒豬皮的重量與生理鹽水的體積比為I :2，然后將消毒豬皮培養(yǎng)皿用眼科剪將皮片剪成糊狀。2)菌培養(yǎng)
以金黃色葡萄球菌和白色念珠菌為陽性對照，以生理鹽水為陰性對照，具體方法參照國家藥典委員會主編.中華人民共和國藥典三部.2005年版，附錄73-84。在滅菌營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基倒成培養(yǎng)平板上接種100 μ L消毒豬皮勻漿液，每個樣本3個重復。然后在溫度為30°C條件下培養(yǎng)48小時，用凝膠成像系統進行菌落計數。用以下公式計算消毒豬皮的帶菌量，cfu/g=菌落個數/(皮片重gXlOOyL/加入生理鹽水的量yL)。UVB對皮膚帶菌量細菌下降百分率=(陽性對照組cfu/g-實驗組cfu/g) /陽性對照組cfu/gX 100%,結果如表2所示。表2、UVB照射豬皮條件正交實驗法試驗的結果
~ If \τ |5 Y \yzl (%) \lc (%) \xj (%) ψχ (%)
~T80"~40 Too" I 0. 281 ~0. 1472099~O. 182168~ O. 9022 | 80 |5 |50|200 \2 |θ. 538|θ· 30253 |θ· 565851 |θ. 91權利要求
1.利用中波紫外線對離體皮膚消毒的方法，其特征在于將離體皮膚用電壓為180 240V，照射劑量為10(T400J/cm2的中波紫外線照射。
2.根據權利要求I所述利用中波紫外線對離體皮膚消毒的方法，其特征在于所述離體皮膚置于溫度為(T25°C，濕度為40-70%的環(huán)境下。
3.根據權利要求2所述利用中波紫外線對離體皮膚消毒的方法，其特征在于所述離體皮膚置于溫度為25°C，濕度為60%環(huán)境下，用電壓為220V，照射劑量為300J/cm的中波紫外線照射。
4.根據權利1-3任一項所述利用中波紫外線對離體皮膚消毒的方法，其特征在于中波紫外線照射前還包括離體皮膚預處理，具體為將離體皮膚制成厚度為O. 8-1. Omm的材料。
5.根據權利要求4所述利用中波紫外線對離體皮膚消毒的方法，其特征在于所述離體皮膚為離體豬皮。
6.權利要求1-5任一項所述利用中波紫外線對離體皮膚消毒的方法制備的離體皮膚。
全文摘要
本發(fā)明公開了利用中波紫外線對離體皮膚消毒的方法，具體為，將離體皮膚用電壓為180~240V，照射劑量為100~400J/cm的中波紫外線照射，其方法簡單，條件可控，消毒后的皮膚活性高，帶菌量少，并且抗原性強，制備的消毒皮膚能夠用于替代自體皮膚治療大面積燒傷的敷料。
文檔編號A61L2/10GK102716505SQ201210217819
公開日2012年10月10日 申請日期2012年6月28日 優(yōu)先權日2012年6月28日
發(fā)明者劉宇, 商海濤, 曾本華, 王勇, 郭科男, 魏泓 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學