專利名稱：紅曲提取物在制備防治乳腺癌的保健食品和藥品的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及以中藥紅曲提取物為原料制成的防治乳腺癌的保健食品和藥品的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，居女性惡性腫瘤的首位。2011年美國CA :A Cancer Journal for Clinicians雜志(2010年影響因子94. 262)公布的最新統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，美國2011年預(yù)計將有230480例女性罹患乳腺癌，占女性新發(fā)惡性腫瘤的30%，排名女性惡性腫瘤發(fā)病率第一位。全世界每年約有135萬婦女被確診患乳腺癌，約有50萬婦女死于該腫瘤。其發(fā)病率在我國占惡性腫瘤的7% 10%，發(fā)病年齡以40 60歲居多。近年來，乳腺癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，發(fā)病年齡也明顯年輕化，嚴重威脅著婦女的健康。乳腺癌的治療手段包括手術(shù)治療、放射治療、化學(xué)治療、內(nèi)分泌治療和分子靶向治療。乳腺癌的化療藥物包括從上世紀70年代的環(huán)磷酰胺、甲氨蝶呤、氟尿嘧啶，到80年代的蒽環(huán)類藥物阿霉素、表阿霉素，再到90年代的紫杉類藥物紫杉醇、多西紫杉醇等，為乳腺癌 的治療提供了許多可供化療的藥物，無論在乳腺癌的術(shù)前新輔助、術(shù)后的輔助治療還是復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者的解救治療中都取得積極的作用，其他藥物如長春瑞濱、吉西他濱、卡培他濱、鉬類、烷化劑、氨甲喋呤等也常用于乳腺癌化療并也取得積極的效果。但這些化療藥物在治療過程中均有骨髓抑制等較為嚴重的不良反應(yīng)，如臨床治療乳腺癌的最常用的藥物阿霉素，其抗癌的主要機制是通過嵌入DNA的相鄰堿基對之間，使DNA鏈裂解，阻礙DNA復(fù)制，并阻斷RNA聚合酶，抑制RNA合成，此外，還具有影響拓撲異構(gòu)酶II，改變細胞膜結(jié)構(gòu)等作用，但在臨床使用后可引起惡心、嘔吐、脫發(fā)、高熱、消瘦、靜脈炎、骨髓抑制、肝毒性以及心臟毒性等不良反應(yīng)。紅曲源于中國，至今已有一千多年的應(yīng)用歷史，是我國傳統(tǒng)的食藥雙效的發(fā)酵產(chǎn)品，古往今來一直被廣泛應(yīng)用于食品著色、釀酒、發(fā)酵食品生產(chǎn)、中藥等各個領(lǐng)域。紅曲最早的藥用記錄為元代的《日用本草》，“破血行藥勢，殺山嵐瘴氣，治打撲傷損”。紅曲味甘，性平，無毒，歸脾、胃、肝、火腸經(jīng)，明代李時珍在《本草綱目》評價它說“此乃人窺造化之巧者也”，“奇藥也”。紅曲為曲霉科真菌紫色紅曲霉Monascus purpureus Went菌絲體及孢子，經(jīng)人工培養(yǎng)使菌絲在粳米內(nèi)部生長，最終整個米粒變?yōu)榧t色所得的制品。近年研究發(fā)現(xiàn)紅曲中含有紅曲色素、紅曲多糖、洛伐他汀、麥角留醇、Y-氨基丁酸、生物黃酮、皂苷、膳食纖維、氨基多糖、輔酶QlO等豐富的生理活性物質(zhì)，這些成分是否有抗癌作用，至今沒有報道，本課題在尋找具有抗乳腺癌作用的研究中，發(fā)現(xiàn)天然紅曲70 %乙醇提取物對人乳腺癌細胞MCF-7的增殖有明顯的作用，可以作為臨床預(yù)防和治療乳腺癌的保健食品和藥品。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明采用天然紅曲,先用8 12倍量的70%乙醇浸泡12 24小時，80°C回流提取，再用8 12倍量70%乙醇再80°C回流提取2次，每次2 4小時，合并3次提取液，回收乙醇，減壓干燥后得到的紅曲提取物。經(jīng)人癌細胞實驗研究，證明對乳腺癌有明顯的抑制作用，可以用來制備防治乳腺癌的保健食品和藥品。本發(fā)明提出，可取這些天然紅曲提取物按常規(guī)的藥品生產(chǎn)規(guī)范制成可供臨床應(yīng)用的產(chǎn)品形式，如片劑，膠囊劑，顆粒劑，沖劑。這些天然紅曲提取物還可做成餅干、飲料等保健食品應(yīng)用，其中這些天然紅曲提取物作為保健食品餅干的添加量為5 30% ;作為飲料的添加量為I 15%。
具體實施例方式實施例一紅曲70 %乙醇提取物抑制人乳腺癌MCF-7細胞的增殖實驗研究I實驗材料I. I實驗試劑
試劑.廠家
RPMI1640Gibco 公司
靑鏈霉素索萊寶公司
FBSGibco 公司
0.25%胰酶-EDTAGibco 公司
PBS索萊寶公司
MTTSigma 公司
阿霉素Sigma公司
洛伐他汀對照品中國藥品生物制品檢定所I. 2實驗儀器
細胞培養(yǎng)箱美國NUAIRE公司
Boxun超凈I:作臺上海博迅實業(yè)冇限公司醫(yī)療設(shè)備廠
數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱.上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠
5417R啦高速臺式離心機德國eppendorf公司
町調(diào)微量移液器丨川、20、200、1000|iL) 德國eppendorf公司
針頭預(yù)過濾器美國nelgene公司
注射器北京市六一儀器廠0.22(xm濾膜Pall公司
GB 2002鄧電+分析大平梅特勒-托利多公司
METTLERAE 240屯+分析大平梅特勒-托利多公司
Eclipse TS100-F倒置顯微鏡日本Nikon公司
細胞培養(yǎng)皿(瓶、板)Costarcorporation
一次性移液管(離心管)Costarcorporation
-80 °C冰箱美國Thermo公司
Synergy2多功能酶標儀美國BioTek公司
液氮鱗美國Thermo公司
Centrifuge 5810 R離心機德國Eppendorf公司
ES-315高壓滅歯鍋日本 Tomy Kogyo Co.,Ltd
純水、超純水制備系統(tǒng)法國Millipore公司2實驗方法2. I天然紅曲70%乙醇提取物的制備及其指紋圖譜天然紅曲70%乙醇提取物的制備取天然紅曲30g，70%乙醇浸泡12h，8倍量70%乙醇80°C回流提取3次，每次2h，合并提取液，回收乙醇，減壓干燥后得紅曲70%乙醇提取物。紅曲70 %乙醇提取物HPLC圖譜的測定供試液的制備取紅曲70%乙醇提取物10. 07mg,用甲醇溶解定容至5ml,過濾后
備用用。標準液的制備精密稱取洛伐他汀對照品0. 40mg，用甲醇溶解定容至5ml，超聲，以此濃度用甲醇稀釋成并定容至5ml，使終濃度為0. 02mg/ml，過濾后待用。色譜條件流動相甲醇0. 002%磷酸溶液(75 25);流速lml/min ;色譜柱為kromasil C-18 ;柱溫30°C ;檢測波長238nm ;進樣量10u I0紅曲70%乙醇提取物HPLC圖譜的測定結(jié)果見附圖
I ;洛伐他汀對照品HPLC圖譜的測定結(jié)果見附圖2.2. 2MCF-7細胞復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代和凍存2. 2. 1MCF-7 細胞的復(fù)蘇將凍存的一管MCF-7細胞，37°C水浴箱快速融化，融化后，在超凈工作臺用70%乙醇將凍存管的蓋沿擦干凈，加入10% FBS RPMI1640培養(yǎng)基，輕輕吹打混勻，1000rpm/min,離心3min，去上清，10% FBSRPMI1640培養(yǎng)基重懸，混勻，移至25mL培養(yǎng)瓶中，37°C、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。2. 2. 2MCF-7細胞的傳代及培養(yǎng)待細胞長到80 %匯合時，吸棄上清液，用PBS洗2-3遍，加入0. 25 %胰蛋白酶Iml，放入CO2孵箱中，在37°C、5% CO2及濕度條件進行消化，消化lOmin，然后在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，如果細胞呈圓形，則迅速加入2ml新鮮的10% FBS RPMI1640培養(yǎng)基終止消化，用巴氏吸管吹打制成單細胞懸液，1000rpm/min,離心3min,去上清，10% FBS RPMI1640培養(yǎng)基重懸細胞，吹打混勻，稀釋細胞懸液，按I : 3的比例接種至新的25mL培養(yǎng)瓶中，37°C、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。2. 2. 3MCF-7 細胞的凍存待細胞長到80 %匯合時，吸棄上清液，用PBS洗2-3遍，加入0. 25 %胰蛋白酶Iml，放入CO2孵箱中，在37°C、5% CO2及濕度條件進行消化lOmin，然后在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，如果細胞呈圓形，則迅速加入2ml新鮮的10% FBS RPMI1640培養(yǎng)基終止消化，用巴氏吸管吹打制成單細胞懸液，1000rpm/min，離心3min，去上清，加入適量的凍存液(10%FBS RPMI1640 DMSO = 9 I)用吸管吹打制成細胞懸液(I X IO6 I X IO7個/mL)，每凍存管加入ImL凍存液細胞，密封后標記。將凍存管置于程序降溫盒中，_80°C過夜，放入液氮罐中凍存。2. 3MCF-7細胞的細胞計數(shù) 將血球計數(shù)板及蓋玻片擦試干凈，并將蓋玻片蓋在計數(shù)板上；吸取IOiU已消化的細胞懸液沿蓋玻片邊緣緩緩滴入，使懸液充滿蓋玻片和計數(shù)板之間，注意蓋玻片下不要有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中，靜置3min ;鏡下觀察，統(tǒng)計四個大格的細胞數(shù)，將血球計數(shù)板放于顯微鏡的低倍鏡下觀察，并移動計數(shù)板，當看到鏡中出現(xiàn)計數(shù)方格后，數(shù)出四角的四個大鉻(每個大格含有16個中格)中的細胞數(shù)目。計算計數(shù)板四大格細胞總數(shù)，壓線細胞只計左側(cè)和上方的，然后按下式計算(細胞懸液的細胞數(shù))/ml =(四個大格子細胞數(shù)/4)X104。(公式中除以4因為計數(shù)了 4個大格的細胞數(shù)。公式中乘以IO4因為計數(shù)板中每一個人格的體積為1. Omm(長)X I. Omm(寬)XO. Imm(高)=0. Imm3而Iml =IOOOmm3)注意鏡下偶見由兩個以上細胞組成的細胞團，應(yīng)按單個細胞計算，若細胞團占10%以上，說明分散不好，需重新制備細胞懸液。2. 4MTT法測定藥物對MCF-7細胞的細胞毒作用2. 4. I實驗原理MTT法是一種通過測定細胞能量代謝水平用以間接反映細胞增殖情況的檢測方法。其原理是MTT可作為哺乳類動物細胞線粒體中琥珀酸脫氫酶的底物。當有活細胞存在時，線粒體內(nèi)琥珀酸脫氫酶可將淡黃色的MTT還原成紫藍色的晶狀甲瓚(Formazan)，將結(jié)晶的甲瓚溶解釋放，再用酶聯(lián)免疫檢測儀測定吸光度OD值，OD值的高低可間接反映活細胞的數(shù)量及其活性?；罴毎鄤t吸光度大，反之則吸光度小，從而反映出細胞的存活及增殖情況。2. 4. 2紅曲70 %乙醇提取物對MCF-7的增殖影響將處于對數(shù)生長期的MCF-7細胞用胰蛋白酶消化后，以10% FBS RPMI1640培養(yǎng)液制成5 X IO4個/ml的細胞懸液，然后以每孔100 u I接種到96孔板上，在37°C，5% CO2孵箱中培養(yǎng)24h，然后換成無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，之后再更換培養(yǎng)液，實驗組加入不同濃度的紅曲70%乙醇提取物(用水溶解)100 yl，終濃度分別為:l、10、50、100、150iig/ml ;不同濃度的紅￠70%乙醇提取物(用DMSO溶解)100 ill，終濃度分別為:I、10、50、100、150 ii g/ml ;DMS0溶劑組加入用DMSO溶解紅曲70 %乙醇提取物的濃度對應(yīng)體積；對照組入等體積的培養(yǎng)液；空白對照組不加細胞，加入等體積的培養(yǎng)液，每一樣品均設(shè)3個平行孔。繼續(xù)培養(yǎng)24h，48h及72h后，吸棄原培養(yǎng)液，每孔以PBS洗I次，加入100 U I新的無血清培養(yǎng)基和10 u IMTT溶液(濃度為5mg/ml)，輕振培養(yǎng)板。放回培養(yǎng)箱內(nèi)再孵育4h后，吸棄上清液，每孔中加二甲基亞砜100 iil，置于暗處振蕩lOmin，用酶標儀檢測各孔吸光度(OD值)，測定波長=490nm。存活率計算公式為存活率(％) = [(實驗組OD值-空白對照組OD值)/(對照組OD值-空白對照組OD值)]X 100 %。本實驗重復(fù)3次。2. 4. 3紅曲70 %乙醇提取物水溶液及對應(yīng)洛伐他汀對MCF-7細胞的增殖影響將處于對數(shù)生長期的MCF-7細胞用胰蛋白酶消化后，以10% FBS RPMI1640培養(yǎng)液制成5 X IO4個/ml的細胞懸液，然后以每孔100 u I接種到96孔板上，在37°C，5% CO2孵箱中培養(yǎng)24h，然后換成無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，之后再更換培養(yǎng)液，實驗組加入不同濃度的紅曲70%乙醇提取物100 iil，終濃度分別為l、10、50、100、150ii g/ml，每一樣品均設(shè)4個平行孔，空白對照組加入等體積的培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)24h，48h及72h后，吸棄原培養(yǎng)液，每孔以PBS洗I次，加入100 u I新的無血清培養(yǎng)基和10 u IMTT溶液(濃度為5mg/ml)，輕振培養(yǎng)板。放回培養(yǎng)箱內(nèi)再孵育4h后，吸棄上清液，每孔中加二甲基亞砜100 yl，置于暗處振蕩lOmin，用酶標儀檢測各孔吸光度(OD值)，測定波長=490nm。存活率計算公式為存活率(%)=[(實驗組OD值-空白對照組OD值)/(對照組OD值-空白對照組OD值)]X100%。洛伐他汀對照品的加入量為紅曲70%乙醇提取物中的洛伐他汀含量的相同劑量，用無水乙 醇溶解(無水乙醇最人體積為0. 0078%，本實驗已經(jīng)證明此體積含量對MCF-7的增殖無影響)，即終深度為0. 001、0. 01、0. 05、0. 1、0. 15 ii g/ml，每一樣品均設(shè)4個平行孔，空白對照組加入等體積的培養(yǎng)液，按以上同樣操作進行。本實驗重復(fù)3次。2. 4. 4篩選阿霉素抑制人乳腺癌MCF-7細胞的最大無效量將處于對數(shù)生長期的MCF-7細胞用胰蛋白酶消化后，以10% FBS RPMI1640培養(yǎng)液制成5X IO4個/rnl的細胞懸液，然后以每孔100 U I按種到96孔板上，在37°C，5% CO2孵箱中培養(yǎng)24h，然后換成無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，之后再更換培養(yǎng)液，實驗組加入不同濃度的阿霉素100 iil，終濃度分別為0. 0001,0. OOU 0. 01,0. l、lymol/L ;對照組入等體積的培養(yǎng)液；空白對照組不加細胞，加入等體積的培養(yǎng)液，每一樣品均設(shè)6個平行孔。繼續(xù)培養(yǎng)24h，48h及72h后，吸棄原培養(yǎng)液，每孔以PBS洗I次，加入100 U I新的無血清培養(yǎng)基和10 U I MTT溶液(濃度為5mg/ml)，輕振培養(yǎng)板。放回培養(yǎng)箱內(nèi)再孵育4h后，吸棄上清液，每孔中加二甲基亞砜100 iil，置于暗處振蕩lOmin，用酶標儀檢測各孔吸光度(OD值)，測定波長=490nm。存活率計算公式為存活率(％) = [(實驗組OD值-空白對照組OD值)/(對照組OD值-空白對照組OD值)]X 100 %。本實驗重復(fù)3次。2. 4統(tǒng)計學(xué)分析數(shù)據(jù)以表示，采用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)據(jù)分析采用單因素方
差檢驗。3實驗結(jié)果3. I細胞形態(tài)學(xué)觀察藥物對MCF-7細胞的抑制作用3. I. I紅曲70 %乙醇提取物水溶液及對應(yīng)洛伐他汀對MCF-7細胞的抑制作用倒置顯微鏡下觀察經(jīng)過不同處理組中的MCF-7細胞形態(tài)變化。對照組細胞生長狀況良好，透明度大，折光性強，細胞形態(tài)呈多邊形且連成片，經(jīng)不同濃度功能紅曲70%乙醇提取物處理后的MCF-7，生長狀況差，折光性弱，貼壁細胞皺縮，變圓，隨著功能紅曲乙醇提取物濃度的增加，皺縮，變圓的程度增加，有些甚至脫落，漂浮。而洛伐他汀組(0.001
0.I U g/ml)的細胞基本上跟對照組細胞差不多，只有0. 15 u g/ml細胞有一些細胞皺縮，變圓。3. I. 2阿霉素對MCF-7細胞的抑制作用倒置顯微鏡下觀察經(jīng)過不同處理組中的MCF-7細胞形態(tài)變化(圖3. 2A_F)。對照組細胞生長狀況良好，透明度大，折光性強，細胞形態(tài)呈多邊形且連成片，經(jīng)不同濃度阿霉素處理后的MCF-7，濃度為0. 01 I ii mol/L生長狀況差，折光性弱，貼壁細胞皺縮，變圓，隨著阿霉素濃度的增加，皺縮，變圓的程度增加，有些甚至脫落，漂浮。
3. 2藥物對MCF-7增殖率的影響3. 2. I紅曲70 %乙醇提取物對MCF-7增殖率的影響紅曲70%乙醇提取物對MCF-7增殖率的影響見表3. I、圖3. 3、圖3. 4和圖3. 5，紅曲70%乙醇提取物(用水溶解)處理MCF-7細胞24h、48h、72h后，在I y g/ml 150 yg/ml之間，細胞存活率跟濃度呈反比，隨著濃度的增大，細胞存活率降低，與對照組相比，具有顯著性差異(P < 0. 05，P < 0. 01);紅曲70%乙醇提取物(用DMSO溶解)處理MCF-7細胞24h、48h、72h后，在I ii g/ml 150 y g/ml之間，細胞活力跟濃度呈反比，隨著濃度的增大，細胞存活率降低，與對照組相比，具有顯著性差異(P < 0. 05, P < 0. 01) ；DMS0溶劑組隨著DMSO的體積增大，細胞存活力降低，當DMSO達到UL時，與對照組相比，具有顯著性差異(P
<0. 05，P < 0. 01)。表3. IMTT法檢測紅曲70 %乙醇提取物對MCF-7細胞增殖的影響(OD) (A，3c±5,n=3)
權(quán)利要求
1.紅曲提取物在制備預(yù)防乳腺癌保健食品和藥品的應(yīng)用，其中紅曲提取物的制備方法為取天然紅曲，先用8 12倍量的70%乙醇浸泡12 24小時，80°C回流提取，再用8 12倍量70%乙醇再80°C回流提取2次，每次2 4小時，合并3次提取液，回收乙醇，減壓干燥后即得。
2.如權(quán)利要求I所述的紅曲提取物在制備預(yù)防乳腺癌保健食品和藥品的應(yīng)用，其中紅曲提取物最佳的制備方法為取天然紅曲，70%乙醇浸泡12h，8倍量70%乙醇80°C回流提取3次，每次2h，合并提取液，回收乙醇，減壓干燥后即得。
3.如權(quán)利要求I所述的紅曲提取物在制備預(yù)防乳腺癌保健食品方面的應(yīng)用，產(chǎn)品形式為片劑，膠囊劑，顆粒劑，沖劑。
4.如權(quán)利要求I所述的紅曲提取物在制備預(yù)防乳腺癌保健食品方面的應(yīng)用，其中保健 食品是指餅干、飲料。
5.如權(quán)利要求4所述的紅曲提取物在制備預(yù)防乳腺癌保健食品方面的應(yīng)用，紅曲提取物在餅干的添加量為5 30%。
6.如權(quán)利要求6所述的紅曲菌絲體提取物在制備預(yù)防乳腺癌保健食品方面的應(yīng)用，紅曲提取物在飲料的添加量為I 15%。
全文摘要
本發(fā)明采用天然紅曲，先用8～12倍量的70％乙醇浸泡12～24小時，80℃回流提取，再用8～12倍量70％乙醇再80℃回流提取2次，每次2～4小時，合并3次提取液，回收乙醇，減壓干燥后得到的紅曲提取物。經(jīng)人癌細胞實驗研究，證明對乳腺癌有明顯的抑制作用，可以用來制備防治乳腺癌的保健食品和藥品。本發(fā)明提出可取這些天然紅曲提取物按常規(guī)的藥品生產(chǎn)規(guī)范制成可供臨床應(yīng)用的產(chǎn)品形式，如片劑，膠囊劑，顆粒劑，沖劑。這些天然紅曲提取物還可做成餅干、飲料等保健食品應(yīng)用，其中這些天然紅曲提取物作為保健食品餅干的添加量為5～30％；作為飲料的添加量為1～15％。
文檔編號A61P15/14GK102743417SQ20121016639
公開日2012年10月24日 申請日期2012年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月17日
發(fā)明者馮榮潔, 吳鐵, 崔燎 申請人:廣東醫(yī)學(xué)院, 湛江廣醫(yī)醫(yī)藥科技開發(fā)有限公司