本發(fā)明提供了用于從含膠原組織制造生物假體器械的方法。更具體地，描述了增強(qiáng)植入后生物假體組織耐久性的雙交聯(lián)工藝。

背景技術(shù)：
在1968年，AlainCarpentier首先提出使用戊二醛(“Glut”)以在植入前處理動(dòng)物組織，產(chǎn)生了人體中的瓣膜生物假體的首次植入。Carpentier,A.等人，JThoracCardiovascSurg.1969Oct;58(4):467-83。在隨后的幾年中，該工藝被改進(jìn)，并且瓣膜被安裝在支架(stent)內(nèi)，產(chǎn)生生物假體的概念。Carpentier,A.MedInstrum.1977;11(2):98-101。隨著經(jīng)驗(yàn)的增長(zhǎng)，許多限制變得明顯，包括組織鈣化和膠原變性。通過(guò)添加表面活性劑和乙醇至戊二醛工藝獲得鈣緩解。CarpentierA.,NashefA.等人，Circulation70(3Pt2):1165-68；并在美國(guó)專利號(hào)4,885,005中集中描述。根據(jù)首先由CarpentierS.等人，Ann.Thorac.Surg.Dec.66(6Suppl.)3264-6提出的方法，通過(guò)將組織浸入加熱的戊二醛溶液獲得改進(jìn)的戊二醛固定，這優(yōu)選在大約45至55℃的溫度下進(jìn)行10至12天范圍的時(shí)間段，所述文獻(xiàn)在此全文并入。盡管這些技術(shù)已經(jīng)證明在降低組織鈣化和增強(qiáng)組織穩(wěn)定性中是有效的，但需要進(jìn)一步的改進(jìn)，特別是擴(kuò)大瓣膜生物假體在年輕患者中的使用。二胺，包括賴氨酸或Jeffamine，已經(jīng)由其他人提出以交聯(lián)生物假體組織中的游離的醛基。由HuntsmanInternational銷售的Jeffamine，首先由Hendricks等人(美國(guó)專利號(hào)6,166,184和美國(guó)專利號(hào)7,053,051)使用，以避免用戊二醛處理組織，據(jù)說(shuō)戊二醛增強(qiáng)鈣化。這些方法中的缺點(diǎn)是來(lái)自鄰近的膠原分子的氨基和來(lái)自二胺的殘余氨基不被交聯(lián)或進(jìn)一步修飾。結(jié)果，損害了組織穩(wěn)定性。因此，需要具有增強(qiáng)的植入后耐久性的改進(jìn)的生物假體組織。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明教導(dǎo)改進(jìn)的組織處理工藝，其包括以下的新型組合：1)較高濃度或增加的固定時(shí)間的加熱的戊二醛溶液，以持久地交聯(lián)游離的氨基，和2)二胺處理，以持久地交聯(lián)游離的醛基。本發(fā)明的一個(gè)方面為制備生物假體植入組織的方法，包括通過(guò)用在0.1至10wt%濃度的戊二醛并且在升高的溫度下處理固定生物假體植入組織，通過(guò)用二胺交聯(lián)劑處理加帽所述固定的組織，和用大約0.6wt.%的戊二醛處理所述加帽的組織。該固定步驟在大約50℃和pH5.8下進(jìn)行2至25天，和加帽步驟優(yōu)選在還原劑——諸如硼氫化鈉——的存在下進(jìn)行。該二胺交聯(lián)劑可為Jeffamine、JeffamineD、賴氨酸、多官能聚合物或有機(jī)溶劑，并可投入水或緩沖液中。在一個(gè)實(shí)施方式中，二胺交聯(lián)劑為0.01M至1M濃度的Jeffamine，和加帽處理在4℃和50℃之間的溫度、在8和13之間的pH下進(jìn)行1小時(shí)至7天的時(shí)間。優(yōu)選地，濃度為0.1M，并且處理在37℃和pH11.7下進(jìn)行48小時(shí)。在一個(gè)實(shí)施方式中，硼氫化鈉以0.05%和1%之間的濃度、在4℃和40℃之間的溫度下被用作對(duì)Jeffamine的添加劑，持續(xù)1hr至3天的時(shí)間。優(yōu)選地，濃度為0.25%，并且該處理在37℃下進(jìn)行24小時(shí)。在該方法的一個(gè)實(shí)施方式中，在固定步驟期間，戊二醛濃度為0.6至10wt.%，并且該處理在從37至75℃的溫度、在pH5.4至6.8下進(jìn)行1至90天。優(yōu)選地，戊二醛濃度為5%，并且該處理在52±2.5℃的溫度、在pH5.8下進(jìn)行18天的時(shí)間。可選地，熱處理在非Glut溶液中實(shí)現(xiàn)。還在另一個(gè)實(shí)施方式中，固定的組織在表面活性劑溶液中進(jìn)行處理，由此基本上消除磷脂類。表面活性劑溶液含有甲醛、乙醇和吐溫80。處理的組織可為心臟瓣膜或瓣膜小葉，其來(lái)源于動(dòng)物、安裝在支架內(nèi)并且用作處理的整個(gè)瓣膜。它可為處理的和安裝為整個(gè)瓣膜的天然瓣膜，并且處理的整個(gè)瓣膜被保存在0.1%至0.6wt.%濃度的戊二醛溶液中，優(yōu)選戊二醛保存溶液具有0.6%的濃度?？蛇x地，處理的整個(gè)瓣膜可作為脫水瓣膜保存，其中在甘油溶液中實(shí)現(xiàn)組織脫水。脫水的瓣膜可在環(huán)氧乙烷中進(jìn)行滅菌。本發(fā)明的另一個(gè)方面為由工藝制造的生物假體植入組織，該工藝包括在升高的溫度通過(guò)用0.1至10wt.%戊二醛處理固定生物假體植入組織；通過(guò)用二胺交聯(lián)劑處理加帽所述固定的組織；和用大約0.6wt.%戊二醛處理所述加帽的組織。本發(fā)明的另一方面為制備生物假體植入組織的方法，其包括：a)在pH5-6.8、45℃-75℃之間下，用至少0.2wt.%戊二醛處理生物假體植入組織1至90天；b)通過(guò)用二胺交聯(lián)劑處理加帽所述組織，隨后用NaBH4還原席夫堿基，c)在室溫下用大約0.6wt.%戊二醛處理所述加帽的組織，優(yōu)選至少1個(gè)月；d)在具有甲醛(FET)的醇溶液中用表面活性劑處理組織；和e)在4℃的0.6%戊二醛中保存組織；其中實(shí)施步驟a)、b)、c)和d)，同時(shí)攪拌。附圖簡(jiǎn)述利用處理的組織樣品的大鼠中的皮下植入進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。圖1為顯示在室溫下、在0.6%Glut中組織的處理前和在4℃下、在0.6%Glut中組織的處理后，在不同Glut濃度下的高溫Glut的鈣緩解效果的圖表。結(jié)果顯示，與預(yù)期相反，50℃下的高濃度Glut比低濃度提供更多的鈣緩解，假設(shè)隨后是低濃度glut處理。圖2為比較暴露于不同胺的Glut處理的組織的鈣化的圖表：ALA：丙氨酸；EA：乙醇胺，LYS：賴氨酸，JEFF：Jeffamine。圖3為顯示具有不同處理時(shí)間的乙醇胺和Jeffamine的鈣緩解效果的圖表。圖4為顯示鈣緩解的圖表，所述鈣緩解通過(guò)Jeffamine處理和通過(guò)NaBH4的席夫堿基還原反應(yīng)，并且隨后是不同的保存：甘油、Glut、Glut之后是甘油。圖5為顯示通過(guò)雙交聯(lián)的鈣緩解的圖表：加熱的Glut隨后是賴氨酸。圖6為顯示非常長(zhǎng)期——多達(dá)12個(gè)月——的雙交聯(lián)工藝的效果的圖表，其包括高溫Glut、二胺交聯(lián)和表面活性劑(FET)。圖7為本文描述的示例性雙交聯(lián)工藝的概括。發(fā)明詳述對(duì)于天然瓣膜狹窄，并且當(dāng)天然瓣膜泄漏或回流時(shí)，諸如當(dāng)小葉鈣化時(shí)，可能需要心臟瓣膜替換。天然瓣膜可被切除并用生物或機(jī)械瓣膜假體替換。生物假體瓣膜具有由被植入血流的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)支撐的生物組織小葉。作為實(shí)例，安裝在支撐結(jié)構(gòu)內(nèi)的生物小葉用于CARPENTIER-EDWARDS豬心臟瓣膜和CARPENTIER-EDWARDSPERIMOUNT心包心臟瓣膜，其從加利福尼亞州Irvine的EdwardsLifesciences可得。盡管這些瓣膜已經(jīng)與在人類中的優(yōu)異長(zhǎng)期功能相關(guān)，但它們中的一些已經(jīng)顯示鈣化的證據(jù)，特別是在年輕患者中。本發(fā)明提供了改進(jìn)的生物假體組織處理工藝，通過(guò)使用交聯(lián)游離氨基，使用高溫、高濃度Glut和通過(guò)二胺交聯(lián)游離醛基的結(jié)合，該工藝大大降低了在戊二醛-處理的組織植入后鈣化的可能性。優(yōu)選的實(shí)施方式使用了JEFFAMINE聚醚胺，其為包含連接至聚醚骨架末端的伯氨基的Huntsman產(chǎn)品的擴(kuò)大的族。該聚醚骨架通?；诃h(huán)氧丙烷(PO)、環(huán)氧乙烷(EO)或混合的PO/EO中的任一個(gè)。因此它們被稱為“聚醚胺”。JEFFAMINE聚醚胺族包括基于該核心結(jié)構(gòu)的單胺、二胺和三胺。最近，添加仲、受阻、高轉(zhuǎn)化的、和基于聚四亞甲基乙二醇(PTMEG)的聚醚胺已經(jīng)變得可得?！吧锛袤w組織”包括但不限于，牛心包和豬組織，其普遍用于生物假體心臟瓣膜、血管、皮膚、硬腦膜、心包、小腸粘膜下層(“SIS組織”)、組織心臟瓣膜、韌帶和腱。在一個(gè)實(shí)施方式中，該組織包括在合適的裝置中安裝和處理的預(yù)切的心臟瓣膜小葉?？蛇x地，該組織可為在合適的裝置中處理的組織的塊體片(bulksheet)。本申請(qǐng)中的“植入物”不僅指心臟瓣膜，包括經(jīng)導(dǎo)管的心臟瓣膜，還指脈管假體和移植物、組織移植物、骨移植物和眼眶移植包裹物等等?！吧锛袤w心臟瓣膜”指至少部分由生物假體組織制造的完整組裝的假體瓣膜。一些整體的豬瓣膜用于所謂的“無(wú)支架”生物假體瓣膜，其中有很少的——如果有的話——合成的材料被添加用于支撐或錨定目的?！坝兄Ъ艿摹鄙锛袤w瓣膜通常具有一些種類的用于小葉的合成(例如，聚合物或金屬的)支撐物，其可為整個(gè)豬瓣膜的小葉或單獨(dú)的牛心包小葉。本文考慮的心臟瓣膜包括外科心臟瓣膜、切頂軸(transapical)心臟瓣膜、經(jīng)股心臟瓣膜和其他類型的心臟瓣膜。本發(fā)明的可植入的生物組織可由通過(guò)同種移植物組織的冰凍保存(即，深低溫保藏)的人類組織形成，或由來(lái)自通過(guò)化學(xué)固定保存的動(dòng)物的組織(即，生物假體組織)形成。這些組織包含結(jié)締蛋白(即，膠原和彈性蛋白)，其起到支撐框架的作用。生物組織的化學(xué)固定涉及將它們暴露于一種或多種化學(xué)固定劑(即，鞣劑)，其形成給出的膠原分子內(nèi)的多肽鏈之間的交聯(lián)(即，分子內(nèi)交聯(lián))，或鄰近的膠原分子之間的交聯(lián)(即，分子間交聯(lián))。已經(jīng)用于交聯(lián)膠原組織的化學(xué)固定劑的例子包括：甲醛、戊二醛、雙醛淀粉、六亞甲基二異氰酸酯和某些聚環(huán)氧化合物。關(guān)于生物假體材料的尚未解決的問(wèn)題是結(jié)締組織蛋白、膠原和彈性蛋白可在體內(nèi)的長(zhǎng)期植入后變得鈣化，特別是在年輕患者中。鈣化產(chǎn)生不期望的生物假體的變硬或退化，其可導(dǎo)致瓣膜失效。自從發(fā)現(xiàn)它的抗免疫和抗變性作用后，戊二醛(或“Glut”)已經(jīng)成為最廣泛使用的固定劑。Carpentier,A.等人，JThoracCardiovascSurg.1969Oct;58(4):467-83。然而，戊二醛處理不防止組織在膠原、彈性蛋白、基質(zhì)和脂類上的潛在鈣結(jié)合位點(diǎn)的鈣化，這可導(dǎo)致體內(nèi)鈣化。該鈣化傾向可通過(guò)應(yīng)用各種化學(xué)處理降低，如在以下中所描述的：美國(guó)專利號(hào)4,729,139(Nashef)；美國(guó)專利號(hào)4,885,005(Nashef等人)；美國(guó)專利號(hào)4,648,881(Carpentier等人)；美國(guó)專利號(hào)5,002,566(Carpentier)；歐洲專利號(hào)103947(Pollock等人)，美國(guó)專利號(hào)5,476,516(Seifter等人)，美國(guó)專利號(hào)5,215,541(Nashef等人)和美國(guó)專利號(hào)5,862,806(Cheung)。美國(guó)專利號(hào)6,471,723(Ashworth等人)和美國(guó)專利號(hào)4,786,287(Nashef等人)描述了通過(guò)添加多種胺至戊二醛固定的組織中的醛基的鈣化緩解。美國(guó)專利號(hào)5,476,516(Seifter等人)教導(dǎo)了添加多元醇(例如，甘油)和醇至生物假體組織作為鈣化緩解處理。美國(guó)專利號(hào)6,509,145(Torrianni)和美國(guó)專利號(hào)7,078,163(Torrianni)解決生物假體組織的氧化用于鈣化緩解。美國(guó)專利號(hào)6,630,001(Duran等人)和美國(guó)專利號(hào)6,277,55(Duran等人)討論了使用由Zerbini首先提議的甘油保存和組織的凍干法。美國(guó)專利號(hào)6,352,708(Duran等人)包括新鮮的、“非固定的”組織的甘油保存，和用甘油和肝磷脂的處理。在美國(guó)專利號(hào)6,561,970(Carpentier等人)中并且與美國(guó)專利號(hào)5,931,969(Carpentier等人)中的相對(duì)組織/流體移動(dòng)結(jié)合描述了通過(guò)在戊二醛中組織的升高溫度固定進(jìn)行鈣緩解的方法。包括調(diào)節(jié)戊二醛固定溶液的pH的技術(shù)在美國(guó)專利號(hào)6,878,168(Carpentier等人)中公開。本文描述的是處理生物假體植入組織以降低體內(nèi)鈣化的方法，包括：用高溫和高濃度戊二醛固定生物假體植入組織，和隨后用二胺交聯(lián)溶液處理固定的組織，以緩解鈣化。利用戊二醛、吐溫(聚氧乙烯20失水山梨醇單油酸酯)、乙醇和任選地利用甲醛的組織處理，可提供有用的組織固定。然而，這些化合物也將產(chǎn)生能夠與鈣相互作用或吸引鈣的新的結(jié)合位點(diǎn)。用戊二醛處理的組織包含游離的醛基，其引起增加的毒性和更高的鈣化。因此，本文描述的是在植入身體前，加帽這些新形成的結(jié)合位點(diǎn)的方法。術(shù)語(yǔ)“加帽”指阻斷、移除或改變將對(duì)生物假體性質(zhì)具有不利影響的官能團(tuán)。不同于現(xiàn)有技術(shù)組織工藝，其中單獨(dú)的目標(biāo)僅為利用低濃度的戊二醛固定組織，或利用阻斷劑加帽組織胺，本方法結(jié)合了兩種工藝，即，利用二胺交聯(lián)游離的醛基和利用高濃度二醛交聯(lián)游離的氨基，而同時(shí)優(yōu)選在還原條件下加帽游離的醛基。在優(yōu)選實(shí)施方式中，戊二醛固定步驟在利用二胺加帽二醛基之前進(jìn)行，優(yōu)選在50℃下利用加熱的Glut進(jìn)行3至25天。Glut固定后是在還原條件(例如，硼氫化鈉)下用Jeffamine二胺處理，以便加帽固定的組織中的醛基，和進(jìn)一步交聯(lián)組織中的蛋白質(zhì)，由此增強(qiáng)它的體內(nèi)穩(wěn)定性。本固定/加帽/交聯(lián)工藝優(yōu)選包括組織的化學(xué)還原，當(dāng)在聚合二胺存在下應(yīng)用時(shí)，該工藝將永久將交聯(lián)劑連接至目標(biāo)醛基。例如，添加Jeffamine諸如JeffamineD至組織將同時(shí)加帽和交聯(lián)醛基，同時(shí)還原劑(例如，硼氫化鈉)將還原由醛基與胺基的反應(yīng)產(chǎn)生的任何席夫堿基。因此醛基最終被橋連基團(tuán)或聚合胺部分取代，其可有益于組織水合、柔性和細(xì)胞相互作用。其他二胺加帽/交聯(lián)劑可代替Jeffamine——諸如賴氨酸或聚合分子——使用。除了硼氫化鈉，在水性溶液中可用的還原劑為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知并且包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，其包括硼氫化鉀、氰基硼氫化物和其他。戊二醛處理戊二醛處理包括3個(gè)步驟：首先，在0.6%Glut中，在pH7.4、在室溫下固定組織至少1個(gè)月，同時(shí)攪拌(Glut固定I10，圖7)；隨后在加熱的Glut中，在45-75℃下進(jìn)一步固定1至90天，同時(shí)攪拌(熱處理12，圖7)；隨后在0.6%中，在室溫下進(jìn)一步固定至少1個(gè)月(Glut固定II14，圖7)。Jeffamine交聯(lián)和通過(guò)硼氫化鈉還原戊二醛-固定的組織在PBS緩沖液中清洗，以去除任何過(guò)量的附著至組織的戊二醛。該組織隨后首先暴露于蒸餾水(DW)中的濃度為0.1±0.01M的Jeffamine二胺的加帽/交聯(lián)溶液，在37℃下攪拌24小時(shí)，并且其次在Jeffamine和0.25%硼氫化鈉溶液中，在37℃攪拌又24小時(shí)(加帽16，圖7)。將該組織從溶液中移出并且在幾分鐘內(nèi)在室溫下，在0.9%NaCl溶液中進(jìn)行清洗。表面活性劑處理將該組織隨后在包含甲醛、乙醇和吐溫80的表面活性劑溶液中在32℃下處理9小時(shí)(表面活性劑18，圖7)。在0.9%NaCl溶液中清洗三次后，根據(jù)以下工藝，在Glut或甘油中進(jìn)行保存。保存1-在4℃下0.6%Glut中保存。由Glut溶液實(shí)現(xiàn)滅菌(保存在Glut20中，圖7)2-保存在甘油中(任選的)。在組織已經(jīng)通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)最終生物負(fù)載還原步驟進(jìn)行加工，并隨后通過(guò)0.6%Glut步驟至少1個(gè)月之后，它可經(jīng)歷75wt%甘油和25wt.%乙醇的溶液中的甘油處理。將該組織在室溫下浸泡在該溶液中一小時(shí)。在該時(shí)間期間，存在于心包組織中的大部分水分子被甘油取代。將該組織從溶液移出并且放置在干凈的罩中，以使得任何過(guò)量的溶液蒸發(fā)或從組織中滴完(干燥保存22，圖7)。滅菌滅菌由環(huán)氧乙烷(EO)實(shí)現(xiàn)。脫水的組織在由具有Tyvek蓋的剛性托盤(PETG)組成的雙重?zé)o菌阻隔包裝(barrierpackaging)中進(jìn)行包裝。該包裝應(yīng)在潔凈室中進(jìn)行密封，并可在100%環(huán)氧乙烷中進(jìn)行滅菌。在固定的和交聯(lián)的組織——諸如在乙醇/甘油溶液中——被脫水的實(shí)施方式中，甘油可包括抗氧化劑并且可包含水溶性蠟。隨后允許該組織干燥并且隨后經(jīng)過(guò)最終滅菌(例如，環(huán)氧乙烷、γ輻照或電子束輻照)。鈣化緩解劑優(yōu)選包含選自以下的加帽/交聯(lián)劑：聚合二胺，諸如JeffamineD、ED和EDR，二氨基酸，諸如賴氨酸，包含至少兩個(gè)氨基的親水多官能聚合物，包含至少兩個(gè)氨基的疏水多官能聚合物。還原劑可為硼氫化鈉、硼氫化鉀、氰基硼氫化物和類似物?；瘜W(xué)抗氧化劑期望選自水溶性抗氧化劑諸如抗壞血酸、脂溶性抗氧化劑諸如生育酚、碳水化合物諸如果糖、蔗糖或甘露醇、受阻酚諸如丁基羥基甲苯(BHT)、受阻胺光穩(wěn)定劑(HALS)諸如對(duì)苯胺二胺、三甲基二氫喹啉或烷基化聯(lián)苯胺、亞磷酸鹽/亞膦酸鹽諸如三苯膦，和硫酯諸如硫代肉桂酸鹽。二胺期望被投入以下溶液之一或以下溶液的組合中：水性溶液，諸如水性緩沖液、水、短鏈醇、甘油或增塑劑，有機(jī)溶劑，和有機(jī)緩沖液。二胺交聯(lián)劑通常如下使用：a)濃度在0.02M至1M，優(yōu)選0.1M；b)持續(xù)1小時(shí)至4天的時(shí)間，優(yōu)選48小時(shí)；c)在4℃和50℃之間的溫度下，優(yōu)選37℃；和d)pH在8和13之間，優(yōu)選11.7。還原劑諸如硼氫化鈉通常如下使用：a)濃度在0.05%和1%之間，優(yōu)選0.25%；b)持續(xù)1hr至3天的時(shí)間，優(yōu)選24hr；c)在4℃和40℃之間的溫度下，優(yōu)選37℃。在高溫固定步驟期間，戊二醛濃度通常為0.1至6wt.%，優(yōu)選0.6wt.%；并在從20至70℃，優(yōu)選52℃+/-2.5℃的溫度下處理1至25天，優(yōu)選18天；pH在5.4至6.8之間，優(yōu)選5.8。高溫步驟前或后的其他固定步驟通常為在室溫下，pH7.4的0.6%Glut。在另一個(gè)實(shí)施方式中，在類似的條件下加熱的Glut可被加熱的緩沖液取代。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，固定的組織在表面活性劑溶液中進(jìn)行處理，以消除磷脂類。例如，表面活性劑溶液可包含甲醛、乙醇和吐溫80。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，假體組織為心臟瓣膜或小葉，其來(lái)源于動(dòng)物、安裝在支架內(nèi)并用作處理的整個(gè)瓣膜。在另一個(gè)實(shí)施方式中，該組織為用于形成心臟瓣膜小葉的牛心包組織，其用于生產(chǎn)生物假體心臟瓣膜。在另一個(gè)實(shí)施方式中，加工的組織為處理和安裝作為整個(gè)瓣膜的天然瓣膜。處理的整個(gè)瓣膜可保存在濃度從0.1%至2%，優(yōu)選0.6wt.%的戊二醛溶液中。在一個(gè)實(shí)施方式中，處理的整個(gè)瓣膜作為脫水瓣膜保存；優(yōu)選組織脫水在甘油溶液中實(shí)現(xiàn)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，脫水瓣膜在環(huán)氧乙烷中滅菌。在用于制備生物假體植入組織的一個(gè)實(shí)施方式中，戊二醛固定步驟在大約50℃和pH5.8下進(jìn)行至少7天，和利用二胺交聯(lián)劑的加帽在還原劑——優(yōu)選硼氫化鈉——的存在下進(jìn)行。為了更好地理解本發(fā)明的鈣化性質(zhì)，在圖中呈現(xiàn)基于多樣本的皮下測(cè)試的圖表。圖1顯示了在不同Glut濃度下高溫Glut的鈣緩解效果。牛心包組織首先在室溫下用0.6%Glut進(jìn)行處理。隨后對(duì)照組在攪拌下，在50℃用0.6%Glut處理6天。其他兩個(gè)組在攪拌下，在50℃下用2.4%和5%Glut處理6天。組織被植入大鼠3周。結(jié)果顯示5%Glut組中的鈣緩解優(yōu)于2.4%和0.6%Glut組(97.40對(duì)87.00對(duì)72.70μg/mg)，有25%的減少。圖2顯示了在植入大鼠6周后用不同的胺處理的心包樣品的組織鈣化。對(duì)照樣本僅用戊二醛進(jìn)行固定。測(cè)試樣本用戊二醛進(jìn)行固定，并且隨后用丙氨酸(ALA)、乙醇胺(EA)、賴氨酸(LYS)或Jeffamine(JEFF)進(jìn)行加帽。結(jié)果顯示交聯(lián)劑Jeffamine(55.6ug/mg)優(yōu)于賴氨酸(90.2ug/mg)；賴氨酸也可被用作交聯(lián)劑，并且兩者都優(yōu)于單胺化合物乙醇胺(135.5ug/ml)和丙氨酸(146.5ug/mg)。圖3顯示了與用0.5M乙醇胺處理相同時(shí)間、隨后皮下植入大鼠6周的戊二醛-固定的組織相比，用0.3MJeffamine處理24小時(shí)或48小時(shí)的戊二醛-固定的組織的鈣化緩解。結(jié)果顯示Jeffamine優(yōu)于乙醇胺。圖4顯示了用Jeffamine和硼氫化物處理、隨后用戊二醛后處理的戊二醛-固定的組織的鈣化抗性。在植入大鼠3個(gè)月后，觀察到在Jeffamine和NaBH4處理的組織中99.6%的鈣減少(144.5對(duì)0.6μg/mg)。分析了不同的保存條件：Glut或75%甘油/25%乙醇。圖5顯示了在熱Glut處理前，由賴氨酸處理16小時(shí)的Glut組織的高鈣緩解。在植入大鼠5周后，與不含賴氨酸的對(duì)照組相比，具有賴氨酸的組顯示了99.2%的鈣減少。圖6顯示了包括加熱的Glut、賴氨酸和表面活性劑的處理的鈣緩解效果。首先組織在攪拌下，在pH5.8、50℃下暴露于濃縮的(5%)戊二醛溶液6天，隨后在室溫下暴露于0.6%Glut至少3天。在用蒸餾水(DW)中的0.5M賴氨酸，在37℃下加帽/交聯(lián)24小時(shí)后，用0.6%Glut在pH7.4下處理24hr。在賴氨酸處理前或后，在32℃下進(jìn)行9hr的表面活性劑處理(FET)。在4℃下在0.6%Glut中進(jìn)行保存。圖7為顯示該發(fā)明性工藝的實(shí)施方式的流程圖。該組織在pH5.8、50℃下被暴露于0.6%戊二醛溶液18天(12)，隨后在室溫下暴露于0.6%Glut至少2天(11)。在用蒸餾水(DW)中的0.1±0.01MJeffamine在37℃下加帽/交聯(lián)24小時(shí)后，在37℃下，在具有硼氫化鈉的還原條件下進(jìn)一步暴露于Jeffamine24小時(shí)(16)。該步驟(16)之后為在pH7.4下用0.6%Glut處理至少2-3天(17)和隨后在32℃下用表面活性劑(FET)處理9hr(18)。在4℃下0.6%Glut中進(jìn)行保存(20)，或任選地在75%甘油/25%乙醇的溶液中進(jìn)行保存(22)。實(shí)施例實(shí)施例1：鈣化緩解-大鼠模型。為了評(píng)估根據(jù)本文描述的方法處理的(“SFX-處理的”)心包組織的鈣化緩解性質(zhì)，進(jìn)行動(dòng)物可行性研究。在0.9%NaCl中清洗樣本以消除過(guò)量的Glut后，18個(gè)樣本/處理(n=4/大鼠)在12天大的大鼠的背部皮下植入6周(圖3)。這些研究證明在緩解組織中鈣化發(fā)生方面，Jeffamine交聯(lián)/硼氫化鈉處理優(yōu)于乙醇胺/硼氫化鈉，乙醇胺/硼氫化鈉優(yōu)于對(duì)照組(僅Glut)(0.1對(duì)51.61對(duì)103.1μg/mg)。在大鼠中的所有研究中，SFX-處理的組織論證了當(dāng)與對(duì)照組織相比時(shí)鈣化數(shù)據(jù)中降低的可變性。放棄來(lái)自兔子肌肉內(nèi)植入的數(shù)據(jù)，因?yàn)樗鼈兣c太多變化相關(guān)。實(shí)施例2：利用Jeffamine和硼氫化鈉，戊二醛-固定的組織的醛交聯(lián)。緊接在熱處理步驟后將生物假體組織從0.625%戊二醛中移出，并保存在0.6%Glut(pH7.4)中2天。在DW中制備一升交聯(lián)溶液，其包含333mMJeffamine(聚(丙二醇)二(2-氨基丙基醚)，平均M230(Aldrichréf.406651)和0.25%硼氫化鈉。加帽溶液被放置在有軌搖床上，隨后組織(小葉、心包)以3個(gè)小葉每100ml的比率被放置在溶液中。容器不被完全密封，因?yàn)榕c水的化學(xué)反應(yīng)釋放的氫氣能引起容器爆炸。有軌搖床在37℃下，在60-80rpm之間操作24小時(shí)。該組織被移出并保存在0.6%Glut溶液中2-3天，并在32℃下，在FET溶液(甲醛、乙醇、吐溫-80)中處理9小時(shí)，隨后保存在0.6%Glut溶液，直到植入。實(shí)施例3：在高溫下利用高濃度二醛的氨基交聯(lián)如圖6所示，組織首先在50℃下處理6天，隨后在37℃下，在0.5M賴氨酸中處理24小時(shí)，同時(shí)攪拌。FET處理在賴氨酸處理前或后應(yīng)用。賴氨酸處理的效果積累至熱處理，并且FET進(jìn)一步改進(jìn)了結(jié)果。當(dāng)FET在賴氨酸處理后時(shí)，F(xiàn)ET的位置可優(yōu)先起作用。實(shí)施例4：保存已經(jīng)開發(fā)了兩種保存工藝：1-低濃度戊二醛保存：這對(duì)于利用根據(jù)本文描述的方法處理的組織制備的瓣膜是優(yōu)選的保存工藝。假設(shè)考慮某些條件，則glut中的保存不增強(qiáng)鈣緩解。這些條件為在0.6%Glut中保存至少2個(gè)月和在植入前徹底清洗。2-無(wú)戊二醛保存：甘油避免戊二醛作為保存溶液的可選方案是在甘油/乙醇混合物中使生物假體組織脫水，用環(huán)氧乙烷滅菌，和包裝最終產(chǎn)品“干燥物”。該工藝據(jù)說(shuō)繞過(guò)了戊二醛作為殺菌劑和保存溶液的潛在的毒性和鈣化影響。已經(jīng)提出一些方法以使用甘油、醇和其組合作為glut加工后方法，以便所得組織是“干燥”狀態(tài)。甘油中心臟瓣膜組織的保存由Parker等人描述(Thorax197833：638)，但不包括任何鈣化緩解技術(shù)并且沒有描述任何優(yōu)點(diǎn)。同樣，美國(guó)專利號(hào)6,534,004(Chen等人)描述了多羥基醇諸如甘油中生物假體組織的保存。然而，這些方法中的任一個(gè)都沒有解決緩解組織的潛在氧化。推薦的工藝在Edwards美國(guó)專利公布號(hào)2009-0164005中進(jìn)行描述。盡管本發(fā)明已經(jīng)根據(jù)示例性實(shí)施方式進(jìn)行了描述，但將應(yīng)理解這些實(shí)施例是說(shuō)明性的，并不表示是限制性的。因此，可在所附權(quán)利要求內(nèi)進(jìn)行更改，而不脫離本發(fā)明的真實(shí)范圍。