專利名稱：長效人生長激素綴合物的液體制劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及不含白蛋白的長效人生長激素綴合物的液體制劑，其在長期貯存時可確保所述長效人生長激素綴合物的穩(wěn)定性，其中所述長效人生長激素綴合物包含與免疫球蛋白Fe區(qū)相連接的人生長激素，并且與天然形式相比具有延長的體內穩(wěn)定性。
背景技術：
人生長 激素(下文中稱為“hGH”)是由垂體前葉腺(anterior pituitarygland)分泌的無糖基化的(aglycosylated)肽激素，并且與在多種組織的細胞表面上的特異性受體相互作用，從而刺激分泌其他生長因子，以負責增加身體多個部分的尺寸。自從發(fā)現(xiàn)來自人垂體腺的生長激素是垂體性侏儒癥(pituitary dwarfism)的有效治療劑以來,對hGH的需求出現(xiàn)了爆發(fā)性地增長。然而，可從人垂體腺提取的hGH的供應十分有限。另外，在接受尸體來源之hGH的兒童中發(fā)生了退行性神經病(degenerative neurological disorder)克-雅病(Creutzfeldt-Jacob disease)之后,美國FDA已經禁止使用從尸體垂體腺提取的hGH,這是基于假設引起疾病的傳染性朊病毒(prion)隨尸體來源的hGH而傳播(Roger,L.，Science234 :22，1986)。目前，使用基因重組技術通過E. coli生產的生物合成的人生長激素已經被FDA批準市售。多肽(例如hGH)由于其低穩(wěn)定性而易于退變(degenerate),并且容易被血清蛋白酶降解并且被腎或肝移除。因此，包含多肽作為藥物活性成分的藥物必須頻繁地向患者施用以維持其血清水平和效價。然而，通過頻繁施用(在大多數情況下是以注射的形式)蛋白質藥物來維持活性多肽的高血清水平對患者來說是痛苦的。為了解決這些問題，已嘗試通過提高蛋白質藥物的血清穩(wěn)定性并且長期維持蛋白質藥物的高血清水平來使藥效最大化。因此，需要在患者中具有提高的穩(wěn)定性以及維持在足夠高水平的活性(而不引起免疫應答)的蛋白質藥物的制劑。為了穩(wěn)定蛋白質并防止與蛋白酶相接觸和腎損失，常規(guī)地將高度可溶性聚合物(例如聚乙二醇(PEG))化學添加至蛋白質藥物的表面。非特異性綴合至目標蛋白質的某些或多個位置后，PEG可提高目標蛋白質的溶解度，使蛋白質穩(wěn)定并防止其降解，而不會引起顯著的副作用(Sada 等，J. Fermentation Bioengineering, 1991, 71 :137_139)。PEG 綴合可有助于蛋白質的穩(wěn)定，但是會顯著地降低其活性。較高分子量的PEG具有降低的與蛋白質的反應性，因此降低產量。用于提高生理活性蛋白質的體內穩(wěn)定性的一種替代性策略是通過使用基因重組將目標蛋白質與具有高血清穩(wěn)定性的蛋白質相融合，這是將編碼蛋白質的各基因彼此相連接并且培養(yǎng)用融合基因轉化之動物細胞的方法。例如，已經報道了融合蛋白質，其中已知提高蛋白質穩(wěn)定性的白蛋白或其片段通過基因重組與目標蛋白質相融合(國際專利公開No. W093/15199 和 No. W093/15200,歐洲專利公開 No. EP413, 622)。美國專利No. 5，045，312公開了使用交聯(lián)劑與牛血清白蛋白或鼠免疫球蛋白綴合的hGH具有與未修飾的生長激素相比增強的活性。在該專利中提及的唯一交聯(lián)劑是低分子量化合物(例如，碳二亞胺或戊二醛)。然而，這樣的低分子量交聯(lián)劑由于其非特異性連接而不會確保均一的組成并且可能具有體內毒性。另外，該專利僅揭示了通過化學偶聯(lián)提高生長激素的活性，但是沒有顯示出化學偶聯(lián)對于針對其他多肽藥物之活性的作用，并且沒有理解與蛋白質之穩(wěn)定性(例如，持久性和血清半衰期的提高)的相關性。最近，引入了生理活性多肽與免疫球蛋白Fe區(qū)和非肽聚合物之間形成的綴合物作為長效制劑，其使得蛋白質藥物具有最小限度降低的活性和提高的穩(wěn)定性這二者，如韓國專利 No. 10-0567902 (Physiologically Active Polypeptide Conjugate HavingImproved In Vivo Durability)和韓國專利 No. 10-0725315 (Protein Complex Using AnImmunoglobulin FragmentAnd Method For The Preparation Thereof)中所述。根據這些方法，hGH可用作生理活性多肽從而可制備長效hGH綴合物。對于這些待用作藥物的長效hGH綴合物，必須維持其在體內的藥效，同時抑制其發(fā)生物理化學變化，例如光、熱或添加劑中的雜質弓I起的變性、聚集、吸附或水解。與hGH相比，長效hGH綴合物在尺寸和分子量上更大，因此更加難以使其穩(wěn)定。通常，蛋白質具有非常短的半衰期，并且當暴露于不適當的溫度、水-空氣界面、高壓、物理或機械應力、有機溶劑、微生物污染等后表現(xiàn)出變性，例如單體聚集、聚集沉淀以及吸附在容器表面上。一旦變性，蛋白質失去其固有的物理化學性質和生理活性。由于在大部分情況下蛋白質變性是不可逆的，所以對于已經變性的蛋白質，恢復其固有的性質幾乎是不可能的。被吸收的蛋白質因其變性而易于聚集。聚集的蛋白質當注射到身體中時可充當抗原性物質，因此必須施用足夠穩(wěn)定的蛋白質。已經研究了防止蛋白質變性的多種方法(John Geigert, J. Paren teral Sc1. Tech. ,43, No5,220-224,1989, David Wong, Pharm.Tech. October, 34-48,1997, ffeiffang.，Int. J. Pharm.，185,129-188,1999, Willem Norde,Adv. ColloidInterface Sc1.，25，267-340，1986,Michelle 等，Int.J.Pharm. 120，179-188，1995)。一些蛋白質藥物采用凍干工藝以避免穩(wěn)定性問題。然而，凍干產品不方便溶于注射用溶劑中。另外，凍干法需要大規(guī)模冷凍干燥機，這在蛋白質藥物的生產中提高了投資成本。還提議了用噴霧干燥機使蛋白質粉末化以維持蛋白質的穩(wěn)定性，但是由于低產量而在經濟上無益。此外，暴露于噴霧干燥的高溫對蛋白質本身產生負面的副作用。已經研究了作為克服這些限制的替代方法而出現(xiàn)的穩(wěn)定劑，這是因為當將其添加至蛋白質藥物溶液時，能夠抑制蛋白質藥物的物理化學變化并且確保體內藥效，甚至在長期貯存后也是如此。已經將人血清白蛋白廣泛用作多種蛋白質藥物的穩(wěn)定劑，并且其性能已經得到了證明(Edward Tarelli 等，Biologicals (1998) 26，331-346)。當與人血清白蛋白一起施用時，患者冒著暴露于生物污染物或病原體(例如，支原體、朊病毒、細菌和病毒)的風險，這是因為盡管用于純化白蛋白的工藝包括滅活、篩選或檢查此類生物污染物或病原體，但是這些可能無法被完全被消除或滅活。例如，篩選工藝包括針對某些病毒檢查供體血清，但是該檢查不總是可靠的。尤其是，非常少量的某些病毒(如果存在的話)可能無法檢出。由于不同蛋白質的化學差異，它們可在貯存期間在不同的條件下以不同的速率逐漸失活。也就是說，通過穩(wěn)定劑延長貯存期對于不同的蛋白質而言是不同的。為此，根據所述目標蛋白質的物理化學性質，待使用的穩(wěn)定劑與目標蛋白質在比例、濃度和類型上有所不同，。出人意料地是，當組合使用時，由于穩(wěn)定劑之間的競爭和相互作用，可引起負面影響。此外，由于目標蛋白質的性質或濃度可在貯存期間變化，所以所使用的穩(wěn)定劑可提供與預期不同的作用。因此，需要大量的努力和預防措施以穩(wěn)定溶液中的蛋白質。特別地，通過將生理活性肽hGH與免疫球蛋白Fe區(qū)相連接以提高hGH體內耐久性和穩(wěn)定性而制備的長效hGH綴合物需要特定的組成用于穩(wěn)定蛋白質，這是因為它們在分子量和尺寸上與典型的hGH十分不同。國際專利公開No. W093/19776公開了包含pH6. O 7. O的緩沖劑、氨基酸、甘露醇和任選的防腐劑(例如苯甲醇)的穩(wěn)定的hGH之液體制劑。國際專利公開NO.W094/03198公開了含有hGH、pH6. O的緩沖劑、非離子表面活性劑、防腐劑和任選的中性鹽或甘露醇的穩(wěn)定的液體制劑。美國專利No. 6，448，225公開了含有hGH、pH6. O的緩沖劑、非離子表面活性劑和任選的中性鹽或甘露醇(但不需要甘氨酸)的穩(wěn)定的可藥用液體制劑。韓國專利No. 10-0537260公開了含有PEG(代替非離子表面活性劑和防腐劑)、緩沖劑和等滲劑作為活性成分的穩(wěn)定化hGH之液體制劑，這是由于非離子表面活性劑和防腐劑引起hGH顯著地脫氣基。然而，盡管hGH和免疫球蛋白Fe區(qū)二者都是肽或蛋白質，但是它們具有不同的物理化學性質，并且二者需要同時被穩(wěn)定化。如上所述，不同的蛋白質因其化學差異在貯存期間在不同的條件下以不同的速率逐漸失活。與預期相反的是，使用適合用于在組合中穩(wěn)定肽或蛋白質的穩(wěn)定劑可因它們之間的競爭和相互作用而產生負面影響。因此，對于長效hGH綴合物，其穩(wěn)定制劑的組合物不同于用于單獨穩(wěn)定hGH之制劑的那些。事實上，很難發(fā)現(xiàn)用于穩(wěn)定hGH和免疫球蛋白Fe區(qū)二者的制劑。通過以下產生了本發(fā)明由本發(fā)明的發(fā)明人對長期安全貯存長效hGH-免疫球蛋白Fe綴合物進行的深入和徹底的研究，導致發(fā)現(xiàn)包含pH5. O 6. O的緩沖劑、非離子表面活性劑、糖醇和鹽的穩(wěn)定劑組合物可提供具有長效hGH綴合物的經濟上有益的液體制劑，該制劑在長期貯存 階段可極大地促進提高長效hGH綴合物的穩(wěn)定性而不必擔憂病毒污染。發(fā)明的公開內容技術問題因此，本發(fā)明的一個目的是提供一種提高貯存穩(wěn)定性的包含長效hGH綴合物、PH5. O 6. O的緩沖劑、糖醇、鹽和非離子表面活性劑的長效hGH綴合物之液體制劑。技術方案根據其的一個方面，本發(fā)明提供了包含藥物有效量的長效hGH綴合物、pH5. O
6.O的緩沖劑、糖醇、鹽和非離子表面活性劑的長效hGH綴合物之液體制劑。本文中使用的術語“長效hGH綴合物”意指這樣的綴合物，其中將生理活性肽人生長激素與免疫球蛋白Fe區(qū)相連接并且其生理活性與天然hGH相比持續(xù)時間更長。本文中使用的術語“長效”意指生理活性具有比天然hGH更長的持續(xù)時間?？捎糜诒景l(fā)明的hGH具有野生型的氨基酸序列或具有與野生型類似活性的密切相關類似物的氨基酸序列。本發(fā)明中可使用任何hGH(無論是天然的或重組的)。優(yōu)選使用E. coli作為宿主制備的重組hGH。本領域中可使用通過氨基酸殘基的替換、缺失或插入而衍生自天然hGH的任何突變體，只要其生物活性沒有顯著改變即可。
至于可用于本發(fā)明的免疫球蛋白Fe，其可以是人免疫球蛋白Fe或與其密切相關的類似物或者可來源于動物(例如，牛、山羊、豬、小鼠、兔、倉鼠、大鼠、豚鼠等)。免疫球蛋白Fe區(qū)可衍生自IgG、IgA、IgD、IgE、IgM或者其組合或雜合體。免疫球蛋白Fe區(qū)可以是選自IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的免疫球蛋白的不同結構域的雜合Fe區(qū)，或者可以是具有相同來源之結構域的單鏈免疫球蛋白的二聚體或多聚體。優(yōu)選已知提高配體結合蛋白之血清半衰期的衍生自IgG或IgM(其在人血液中最豐富)的Fe區(qū)，并且最優(yōu)選衍生自IgG的Fe區(qū)?？赏ㄟ^用某些蛋白酶處理天然IgG獲得免疫球蛋白Fe或者使用基因重組技術由經轉化細胞產生免疫球蛋白Fe。優(yōu)選地，所述免疫球蛋白Fe是在E. coli中產生的重組人免疫球蛋白Fe。IgG分為IgGl、IgG2、IgG3和IgG4亞型，并且本發(fā)明可包括其組合或雜合體。優(yōu)選IgG2和IgG4亞型，并且最優(yōu)選很少具有效應器功能(例如，CDC(補體依賴性細胞毒性(Complement Dependent Cytotoxicity)))的IgG4的Fe區(qū)。也就是說，最適合作為本發(fā)明藥物載體的免疫球蛋白Fe區(qū)是人IgG4來源的無糖基化的Fe區(qū)。人來源的Fe區(qū)比非人來源的Fe區(qū)更優(yōu)選，所述非人來源的Fe區(qū)可在人體中充當抗原并且引起不期望的免疫應答，例如產生針對抗原的新抗體?？赏ㄟ^將hGH與由上述方法生產的免疫球蛋白Fe區(qū)相連接來制備用于本發(fā)明的長效hGH綴合物。該連接方法可通過經由非肽基聚合物將hGH與免疫球蛋白Fe相交聯(lián)或者通過產生融合蛋白質(其中使用基因重組將hGH與免疫球蛋白Fe區(qū)相融合)來實現(xiàn)。優(yōu)選hGH與免疫球蛋白Fe區(qū)之間經由非肽基聚合物連接?？捎糜谒鼋宦?lián)的非肽基聚合物可選自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇與丙二醇的共聚物、聚氧乙烯化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯基乙基醚、可生物降解的聚合物(例如，PLA(聚(乳酸))和PLGA(聚(乳酸-羥基乙酸)))、脂質聚合物、甲殼素類(chitins)、透明質酸及其組合。最優(yōu)選聚乙二醇。其在本領域中公知的衍生物和可使用本領域已知方法很容易制備的衍生物也在 本發(fā)明的范圍內。對于制備長效hGH綴合物，可參照韓國專利No. 0725315，其公開內容通過引用整體并于本文。本領域技術人員可參照所述文獻生產本發(fā)明的長效hGH綴合物。本發(fā)明的長效hGH綴合物之液體制劑包含藥物有效量的長效hGH綴合物。通常，hGH的藥物有效量對應于單次使用的小瓶中的約I 3mg。用于本發(fā)明的長效hGH綴合物的濃度范圍為lmg/mL至55mg/mL,優(yōu)選15mg/mL至25mg/mL。本文中使用的術語“穩(wěn)定劑”意指允許長效hGH綴合物穩(wěn)定貯存的物質。術語“穩(wěn)定”意為損失低于活性成分的某一百分比，通常低于10%，優(yōu)選低于5%。當在10±3°C下貯存2年、在25±2°C下貯存6個月或在40±2°C下貯存一至兩周后與最初活性相比長效hGH綴合物的活性保持90%或更高的水平(優(yōu)選約92 95%的水平)，那么認為制劑是穩(wěn)定的。對于蛋白質(例如長效hGH綴合物)，其貯存穩(wěn)定性在抑制潛在地產生其抗原形式以及確保其準確劑量上是非常重要的。盡管通過本發(fā)明的長效hGH綴合物保持在一起，生理活性肽hGH和免疫球蛋白Fe區(qū)的物理化學性質彼此不同并且必須被同時穩(wěn)定化。它們之間的物理化學差異可引起不同的肽或蛋白質在貯存期間在不同條件下以各自的速率逐漸失活。出人意料的是，在組合中使用適于活性肽或蛋白質的穩(wěn)定劑可因它們彼此競爭或相互作用而產生負面影響。
設計用于同時穩(wěn)定生理活性肽hGH和免疫球蛋白Fe區(qū)二者，使得長效hGH綴合物的活性可長時間維持期望的水平，本發(fā)明的穩(wěn)定劑包含特定的緩沖劑、糖醇、鹽和非離子表面活性劑。緩沖劑的作用在于將溶液的pH維持在預定的范圍內以防止可導致長效hGH失活的急劇PH變化。本發(fā)明中可使用任何緩沖劑，只要是本領域中已知的可藥用PH緩沖劑即可?？捎糜诒景l(fā)明的緩沖劑包括堿性鹽(alkaline salt)(磷酸鈉或磷酸鉀或者其氫鹽或二氫鹽)、檸檬酸鈉/檸檬酸、醋酸鈉/醋酸及其組合。優(yōu)選檸檬酸鹽緩沖劑和磷酸鹽緩沖齊U，更優(yōu)選檸檬酸鹽緩沖劑。可用于本發(fā)明的檸檬酸鹽緩沖劑可包含優(yōu)選5mM至IOOmM量的并且更優(yōu)選IOmM至50mM濃度的檸檬酸鹽。由于溶液內的反應可根據溶液中緩沖劑的pH而改變，所以穩(wěn)定劑的pH非常重要。反應發(fā)生時的PH以及其對溶解度的影響因蛋白質不同而不同。因此，很難以維持高溶解度和準確的三維結構而不產生變性雜質的方式穩(wěn)定蛋白質。常規(guī)hGH制劑通常使用pH6. O
7.O或更高的緩沖劑以降低雜質的產生并且提高蛋白質的溶解度。本發(fā)明的穩(wěn)定劑包含ρΗ5· O 6. O、優(yōu)選ρΗ5· 2 6. O并且更優(yōu)選ρΗ5· 2 5. 5的緩沖劑。在本發(fā)明的一個實施方案中，在貯存3個月后測量的#6和#7雜質(對應hGH的脫氨基雜質)含量在低PH(例如，pH5. 2)下尤其地降低(

圖1)。這些數據表明，因為由hGH和免疫球蛋白Fe區(qū)構成的長效hGH綴合物在性質上與單獨的hGH不同，所以設計用于穩(wěn)定長效hGH綴合物和提高長效hGH綴合物之溶解度二者的液體制劑必須在pH上不同于常規(guī)的hGH之液體制劑。

此外，糖醇的作用在于提高長效hGH綴合物的穩(wěn)定性。在本發(fā)明中，基于所述制劑的總體積，糖醇優(yōu)選以I至10% (w/v)的量并且更優(yōu)選以5% (w/v)的量使用。可用于本發(fā)明的糖醇的實例包括但不限于甘露醇、山梨醇及其組合。如從表4的數據中所理解的，將
O.5% L-Arg-HCl添加至甘露醇對長效hGH綴合物的穩(wěn)定性沒有影響。當hGH綴合物的溶液被注射到身體中時，鹽具有進一步穩(wěn)定溶液中長效hGH綴合物以及作為維持適當滲透壓之等滲劑的作用。通常，鹽是水溶性無機鹽，并且優(yōu)選氯化鈉。在制劑中，鹽可優(yōu)選以5至200mM的量并且更優(yōu)選以150mM的量存在，并且其含量可根據成分的類型和量進行調整，從而使制劑等滲。在本發(fā)明的一個實施方案中，在鹽存在或不存在下，對包含pH5. O 6. O的緩沖齊U、糖醇和非離子表面活性劑之制劑中長效hGH綴合物的穩(wěn)定性進行評價。結果，與不存在NaCl下的相比，在NaCl (尤其是150mMNaCl)存在下在含有5 %的甘露醇的制劑中在25°C下貯存4周時，長效hGH綴合物的穩(wěn)定性維持在顯著更高的水平(表2)。與常規(guī)hGH相比，根據本發(fā)明的長效hGH綴合物可在含有I 10% (w/v)糖醇和5 200mM NaCl的制劑中穩(wěn)定化并且還可在含有PH5. O 6. O的緩沖劑、糖醇、非離子表面活性劑和鹽的制劑中穩(wěn)定化。非離子表面活性劑降低了蛋白質溶液的表面張力，以防止蛋白質在疏水性表面上的吸收或聚集?？捎糜诒景l(fā)明的非離子表面活性劑的實例包括聚山梨醇酯(polysorbate)、泊洛沙姆(poloxamer)及其組合，優(yōu)選聚山梨醇酯。其中聚山梨醇酯的非離子表面活性劑是聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60和聚山梨醇酯80。優(yōu)選聚山梨醇酯80。根據本發(fā)明的一個實施方案，觀察到了長效hGH綴合物的穩(wěn)定性在聚山梨醇酯80存在下有所提高(表8)。當用聚山梨醇酯20替代聚山梨醇酯80時，直到兩周之后，長效綴合物的穩(wěn)定性相同，但是在貯存4周后，盡管表面活性劑彼此類似，長效綴合物之間的穩(wěn)定性有顯著性差異。在本發(fā)明的液體制劑中，優(yōu)選以O.1 % (w/v)或更少的量、更優(yōu)選以O. 001至O. 05% (w/v)的量并且遠遠更優(yōu)選以0.005% (w/v)的量包含非離子表面活性劑。Norditropin (購自Nordisk的hGH液體制劑)使用3mg/mL泊洛沙姆188作為表面活性劑(表9)。根據本發(fā)明的一個實施方案，觀察到在含有3mg/mL泊洛沙姆188的制劑中的長效hGH綴合物在25°C下貯存兩周后發(fā)生聚集(表8)。這些數據表明，表面活性劑(充當蛋白質藥物的穩(wěn)定劑)的類型和濃度必須是藥物特異性的。在本發(fā)明的一個實施方案中，發(fā)現(xiàn)除pH5. 2的緩沖劑和非離子表面活性劑之外還含有I 10% (w/v)糖·醇和5 200mM NaCl的制劑顯著地提高了長效hGH綴合物的貯存穩(wěn)定性，表明PH5. 2的緩沖劑、非離子表面活性劑、糖醇和鹽的組合顯示了對長效hGH綴合物之穩(wěn)定性的協(xié)同作用。優(yōu)選地，本發(fā)明的穩(wěn)定劑不含白蛋白。因為其產自人血清，所以總是有以下的可能性可用作蛋白質穩(wěn)定劑的人血清白蛋白可受到人來源的病原性病毒的污染。在一些患者中，明膠或牛血清白蛋白可引起疾病或可易于產生變態(tài)反應。沒有異源性蛋白質(例如人或動物來源的血清白蛋白或經純化的凝膠)，本發(fā)明的穩(wěn)定劑沒有引起病毒污染的可能性。除pH5. O 6. O的緩沖劑、鹽、糖醇和非離子表面活性劑之外，本發(fā)明的液體制劑可還包含本領域公知的成分或材料(除非它們降低本發(fā)明的作用)。例如，本發(fā)明的制劑可還包含糖、多元醇或中性氨基酸。還可包含于制劑中以提高長效綴合物之貯存穩(wěn)定性的糖的優(yōu)選實例包括單糖(例如，甘露糖、葡萄糖、巖藻糖和木糖)和多糖(例如，乳糖、蔗糖、棉籽糖(raffinose)和葡聚糖)。還可用于本發(fā)明的多元醇有丙二醇、低分子量聚乙二醇、甘油、低分子量聚丙二醇及其組合?；谥苿┑目傮w積，糖和多元醇各自可以以I至10% (w/v)的量并且優(yōu)選以5% (w/v)的量使用。根據其中一個優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明提供包含20mM檸檬酸鈉緩沖劑(pH5. 2
6.O)、5 200mM NaCl、I 10% (w/v)甘露醇和O. 001 O. 05%聚山梨醇酯80的液體制齊U。在本發(fā)明的一個實施方案中，將包含檸檬酸鈉緩沖劑(PH5. 2),5% (w/v)甘露醇、150mMNaCl和O. 005% (w/v)聚山梨醇酯80的長效hGH綴合物之液體制劑與購自Nordisk的hGH制劑Norditropin相比較。本發(fā)明的長效hGH綴合物之液體制劑表現(xiàn)出與Norditropin —樣高或比其更高的貯存穩(wěn)定性(表10)。在根據另一個實施方案的長期貯存穩(wěn)定性的測試中，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的長效hGH綴合物之液體制劑使長效hGH綴合物的活性在高水平上維持6個月(表11)。由于沒有相伴的病毒污染危險以及簡單且具有極佳的貯存穩(wěn)定性，本發(fā)明的不含白蛋白的長效hGH綴合物之液體制劑(設計用于提供長效hGH綴合物的穩(wěn)定性)與其他穩(wěn)定劑或冷凍干燥劑相比具有經濟效益。此外，由于本發(fā)明的液體制劑包含與天然形式相比具有更高的體內持久性的長效hGH綴合物，與典型的hGH制劑相比本發(fā)明的液體制劑允許蛋白質的活性長時間維持在高水平，因此可用作有效的藥物制劑。
本發(fā)明的有益效果根據本發(fā)明的包含pH5. O 6. O的緩沖劑、糖醇、鹽和非離子表面活性劑的hGH綴合物之液體制劑不含人血清白蛋白和其他潛在受病毒污染的危險因素，并且可提供為由hGH多肽和免疫球蛋白Fe區(qū)構成的與天然相比具有更大分子量和體內持久性的長效hGH綴合物定制的極佳的忙存穩(wěn)定性。附圖簡述通過以下結合附圖的細節(jié)描述將更清楚地理解本發(fā)明的上述和其他目的、特征以及其他優(yōu)勢，其中圖1是如實施例4所述在長效hGH綴合物在多種pH值的緩沖劑中在4°C下貯存三個月期間通過IE-HPLC分析所述綴合物穩(wěn)定性之后所獲得的代表性IE-HPLC色譜圖；和圖2是如實施例7所述在長效hGH綴合物在pH5. 2的緩沖劑中在4°C下貯存六個月期間采用IE-HPLC分析所述綴合物穩(wěn)定性之后所獲得的圖。
具體實施例方式通過以下用于舉例 說明的實施例可獲得對本發(fā)明更好的理解，但是這些實施例不被解釋為限制本發(fā)明。[實施例1]長效hGH綴合物的制備將ALD-PEG-ALD (IDB) (3. 4kDa聚乙二醇，并且在每個末端具有醛基)與hGH (Mw 22kDa)相綴合，之后與人IgG4來源的無糖基化Fe區(qū)(Mw 50 kDa)的N端相連接，然后純化以提供hGH-PEG-Fc綴合物。

[實施例2]在鹽存在 或不存在下測定長效hGH綴合物的穩(wěn)定性為了評價在鹽存在或不存在下在包含緩沖劑、糖醇和非離子表面活性劑的制劑中的長效hGH綴合物的穩(wěn)定性，將長效hGH綴合物在下表I的制劑中在25°C下貯存4周，之后使用離子交換色譜法(ion exchange chromatography, IEC)和尺寸排阻色譜法(sizeexclusion chromatography, SEC)分析其穩(wěn)定性。在所述制劑中，將朽1檬酸鹽緩沖劑用作緩沖劑，甘露醇用作糖醇，以及聚山梨醇酯80用作非離子表面活性劑。在表2中，IE-HPLC (% )和SE-HPLC(% )表示為(面積％ /初始面積％ )，表明長效hGH綴合物與初始純度相比的殘余純度(residual purity)。表I[表 I]
權利要求
1.長效人生長激素綴合物的液體制劑，其包含藥物有效量的所述長效人生長激素綴合物和不含白蛋白的穩(wěn)定劑，在所述長效人生長激素綴合物中，人生長激素與免疫球蛋白Fe區(qū)相連接，所述穩(wěn)定劑包含PH5. O 6. O的緩沖劑、糖醇、非離子表面活性劑和鹽。
2.根據權利要求1所述的長效人生長激素綴合物之液體制劑，其中所述糖醇選自甘露醇、山梨醇及其組合。
3.根據權利要求1所述的長效人生長激素綴合物之液體制劑，其中所述糖醇以基于所述制劑的總體積的1%至10% (w/v)的量使用。
4.根據權利要求1所述的長效人生長激素綴合物之液體制劑，其中所述緩沖劑是檸檬酸鹽或磷酸鹽緩沖劑。
5.根據權利要求1所述的長效人生長激素綴合物之液體制劑，其中所述緩沖劑的pH范圍是5. 2至6. O。
6.根據權利要求1所述的長效人生長激素綴合物之液體制劑，其中所述緩沖劑的PH范圍是5. 2至5. 5。
7.根據權利要求1所述的長效人生長激素綴合物之液體制劑，其中所述鹽是氯化鈉。
8.根據權利要求1所述的長效人生長激素綴合物之液體制劑，其中所述鹽以5mM至200mM的濃度使用。
9.根據權利要求1所述的長效人生長激素綴合物之液體制劑，其中所述非離子表面活性劑是聚山梨醇酯80。
10.根據權利要求1所述的長效人生長激素綴合物之液體制劑，其中所述非離子表面活性劑以基于所述制劑的總體積的O. 001%至O. 05% (w/v)的量使用。
11.根據權利要求1所述的長效人生長激素綴合物之液體制劑，其中所述穩(wěn)定劑還包含一種或更多種選自糖、多元醇和氨基酸的成分。
12.根據權利要求1所述的長效人生長激素綴合物之液體制劑，其中所述長效人生長激素綴合物包含經由聚乙二醇連接的人生長激素和免疫球蛋白Fe區(qū)，并且所述穩(wěn)定劑包含pH5. 2至6. O的檸檬酸鹽緩沖劑、I 10 % (w/v)甘露醇、O. 001 0.05%聚山梨醇酯80和 5 200mM NaCl。
13.根據權利要求1所述的長效人生長激素綴合物之液體制劑，其中所述人生長激素具有與天然人生長激素相同的氨基酸序列。
14.根據權利要求1所述的長效人生長激素綴合物之液體制劑，其中所述免疫球蛋白Fe 區(qū)衍生自 IgG、IgA、IgD、IgE 或 IgM。
15.根據權利要求14所述的長效人生長激素綴合物之液體制劑，其中所述免疫球蛋白Fe區(qū)是免疫球蛋白之不同結構域的雜合Fe區(qū)，所述免疫球蛋白選自IgG、IgA、IgD、IgE和IgM。
16.根據權利要求14所述的長效人生長激素綴合物之液體制劑，其中所述免疫球蛋白Fe區(qū)是具有相同來源之結構域的單鏈免疫球蛋白的二聚體或多聚體。
17.根據權利要求14所述的長效人生長激素綴合物之液體制劑，其中所述免疫球蛋白Fe區(qū)是IgG4Fc區(qū)。
18.根據權利要求17所述的長效人生長激素綴合物之液體制劑，其中所述免疫球蛋白Fe區(qū)是無糖基化的人IgG4Fc區(qū)。
19.根據權利要求1所述的長效人生長激素綴合物之液體制劑，其中所述長效人生長激素綴合物包含經由非肽基聚合物連接的人生長激素和免疫球蛋白Fe區(qū)。
20.根據權利要求19所述的長效人生長激素綴合物之液體制劑，其中所述非肽基聚合物選自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇與丙二醇的共聚物、聚氧乙烯化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯基乙基醚、聚乳酸(PLA)、PLGA(聚乳酸-羥基乙酸)、脂質聚合物、甲殼素類、透明質酸、及其組合。
21.用于生產如權利要求1至20中任一項所述的長效人生長激素綴合物之液體制劑的方法，其包括 a)制備長效人生長激素綴合物；和 b)將所述長效人生長激素綴合物與穩(wěn)定劑組合，所述穩(wěn)定劑包含pH5.O 6. O的緩沖齊U、糖醇、非離子表面活性劑和鹽。
全文摘要
本發(fā)明公開了不含白蛋白的長效人生長激素(hGH)綴合物之液體制劑，其可確保所述長效hGH綴合物在長期貯存時的穩(wěn)定性，其中所述長效人生長激素綴合物包含與免疫球蛋白Fc區(qū)相連接的人生長激素并且與天然形式相比具有延長的體內穩(wěn)定性。包含pH5.0～6.0的緩沖劑、糖醇、鹽和非離子表面活性劑的hGH綴合物之液體制劑不含人血清白蛋白和其他潛在受病毒污染的危險因子，并且可提供為由hGH多肽和免疫球蛋白Fc區(qū)構成之長效hGH綴合物定制的極佳的貯存穩(wěn)定性，所述綴合物與所述天然形式相比具有更高的分子量和體內持久性。
文檔編號A61K9/08GK103068366SQ201180039263
公開日2013年4月24日 申請日期2011年7月14日 優(yōu)先權日2010年7月14日
發(fā)明者洪性熙, 李炳善, 任大成, 李才敏, 裴城敏, 權世昌 申請人:韓美科學株式會社