專利名稱：Gep抗體及其用途的制作方法
GEP抗體及其用途
與相關申請的交叉參考本申請要求于2010年5月15日提交的，名稱為“GEP AND DRUG TRANSPORTER RE⑶LATI0N，CANCER THERAPY AND PROGNOSIS” 的美國臨時專利申請系列號 61/334，671 的優(yōu)先權，其整體引入本文作為參考。技術領域
本公開內容一般涉及通過與化學療法結合的靶向生長因子(顆粒素-上皮素前體 (GEP)和ATP依賴性結合盒(ABC)藥物外排轉運蛋白(ABCB5或ABCFl )，用于治療顯示出化學抗性的肝部癌癥的方法。本公開內容進一步涉及在肝部癌癥(hepatic cancer)的治療中有用的組合物。
背景肝癌是全世界的第三大癌癥殺手，每年全球具有超過五十萬個體瀕死。在中國，肝癌是癌癥死亡的第二大主因。以肝部分切除術或肝移植形式的手術切除是根治療法的主要依據(jù)。然而，癌癥復發(fā)在根治手術后仍是常見的。此外，肝癌經(jīng)常在晚期時診斷，這排除根治療法。對于大多數(shù)肝癌患者的治療不存在有效的治療選項。化學療法廣泛用于治療不能切除的肝癌，但具有微小功效。存在闡明與臨床表現(xiàn)中的復發(fā)和化學抗性有關的關鍵基因，且開發(fā)使肝癌細胞對化學治療劑致敏的新治療方法的迫切需要。
多藥抗性可以起因于不同機制，例如腫瘤細胞凋亡途徑的腫瘤細胞周期檢查點損害的改變，和腫瘤細胞中減少的藥物蓄積。在這些中，降低的細胞內藥物蓄積是癌癥多藥抗性的充分研究的機制，并且已顯示部分起因于ATP依賴性結合盒(ABC)藥物外排轉運蛋白 ABCBl (也稱為P-糖蛋白或MDR1)的腫瘤細胞表達。在人ABC超家族中，ABCBl和ABCCl (也稱為MRPl)已顯示介導多藥抗性，各自具有不同但重疊的外排底物特異性和組織分布類型。多藥抗性表型很久以前在肝致癌作用中得到報道。該表型通常通過ABC藥物轉運蛋白包括ABCBl和ABCCl的過表達介導。這些基因使得肝癌細胞能夠外排廣泛范圍的化學上不同的化學治療劑。然而，調節(jié)臨床表現(xiàn)中的化學抗性的關鍵基因對于肝癌患者仍有待鑒定。
致瘤干細胞對造血癌癥的貢獻已確定一定時間，并且具有干細胞性質的細胞已在幾種實體瘤中描述。盡管化學治療劑會殺死大多數(shù)腫瘤細胞，但它們被認為留下小群體的腫瘤干細胞，這可能是藥物抗性的重要機制。例如，ABC藥物轉運蛋白已顯示保護癌癥干細胞不受化學治療，例如成膠質細胞瘤中的ABCBl和黑素瘤中的ABCB5。
顆粒素-上皮素前體(Granulin-epithelin precursor, GEP,也稱為顆粒素前體、 前上皮素、顆粒蛋白或PC衍生的生長因子)是具有不同生物學作用的多小平面自分泌生長因子，包括癌癥進展、鼠胎兒發(fā)育和組織修復。GEP的突變影響神經(jīng)元存活且引起額顳癡呆。 GEP已由肝癌的總基因表達譜鑒定為治療靶。GEP已顯示在肝癌組織中是上調的，并且功能實驗已證實GEP控制增殖、侵入和致腫瘤性。因此，GEP是用于靶向療法的重要分子。然而， 單獨在臨床情況中的靶向療法一般而言不足以根除實體瘤。
概述下文呈現(xiàn)多個實施方案的簡化概括，以便提供本文描述的一些方面的基礎理解。這個概述不是所公開主題的廣泛概述。它既不預期鑒定所公開主題的關鍵或至關重要的要素， 也不描繪主題實施方案的范圍。它的唯一目的是以簡化形式呈現(xiàn)所公開主題的一些概念作為以后呈現(xiàn)的更詳細描述的序言。
多個實施方案涉及治療顯示出多藥抗性(在本文中也稱為化學抗性)的肝癌。更具體而言，該實施方案涉及靶向和/或抑制生長因子和藥物轉運蛋白，以促進化學抗性肝癌的治療。靶向的具體生長因子可以是顆粒素-上皮素前體(GEP)、其在肝癌細胞中過表達且調節(jié)增殖、侵入和致腫瘤性。GEP的抑制可以增強通過化學治療劑誘導的細胞凋亡效應，而 GEP的上調顯示相反趨勢。GEP已顯示調節(jié)在化學抗性中起作用的ATP依賴性結合盒(ABC) 藥物外排轉運蛋白家族的藥物轉運蛋白，例如ABCB5和ABCF1。相應地，靶向的藥物轉運蛋白可以是ABCB5或ABCFl。這些方法可以進一步包括應用與靶向生長因子和藥物轉運蛋白組合的化學療法。與化學療法組合的靶向生長因子和藥物轉運蛋白可以提供可以根除侵略性肝癌細胞的治療模式。
根據(jù)一個實施方案，描述了用于處理細胞上的生長因子(例如GEP)和藥物轉運蛋白(例如ABCB5或ABCF1)的方法，以及相關產(chǎn)品。在進一步的實施方案中，描述的是使用生長因子(例如GEP)和藥物轉運蛋白(例如ABCB5或ABCF1)結合分子以及生長因子和藥物轉運蛋白分子的抑制，用于處理癌細胞的方法。本文進一步描述的是其表達模式可以用于區(qū)分不同臨床狀況的標記組例如高或低水平的生長因子(例如GEP)和藥物轉運蛋白(例如 ABCB5或ABCF1)。基于不同臨床狀況，可以測定癌癥復發(fā)的可能性、藥物敏感性和預后。本文還描述的是基于預后分類且治療患者的方法。
根據(jù)本公開內容的一些實施方案,提供了包含GEP抗體和化療藥物(chemodrug) 的在肝癌的治療中有用的組合物。根據(jù)本公開內容的其他實施方案，提供了包含GEP抗體、 藥物轉運蛋白-特異性抗體化療藥物的在肝癌的治療中有用的組合物。
下述詳述和附圖詳細闡述所公開主題的特定舉例說明性方面。然而，這些方面僅指示其中可以采用多個實施方案的原理的少數(shù)不同方法。所公開的主題預期包括所有此類方面及其等價方面。當與附圖結合考慮時，所公開的主題的其他優(yōu)點和不同特征由于多個實施方案的下述詳述將變得顯而易見。
附圖簡述圖I顯示GEP水平調節(jié)的化學抗性。6^Hep3B細胞就GEP水平進行調節(jié)GEP抑制(-) 和GEP過表達(+ )。轉染子就GEP mRNA和蛋白質水平調節(jié)(平均熒光強度，MFI)進行驗證。 (B)在GEP水平和化學抗性之間的正相關。GEP抑制證實增加的細胞凋亡群體并且因此細胞對化學治療劑更敏感。GEP過表達導致降低的細胞凋亡群體且因此細胞對化學治療劑更具抗性。GEP賦予對于化學治療劑包括多柔比星和順鉬的化學抗性。rOGEP調節(jié)的ABCB5 水平。就GEP水平調節(jié)的肝癌細胞檢查ABCB5表達。GEP水平的變化對ABCB5 mRNA水平的調節(jié)賦予中等作用，但對ABCB5蛋白質水平的調節(jié)賦予顯著作用。對于流動覆蓋圖，GEP / ABCB5的蛋白質水平(實線)顯示為在扣除相應同種型對照(虛線)后的平均熒光強度(MFI)。
圖2顯示化學抗性細胞中增加的ABCB5。(A)化學抗性細胞證實對于化學治療劑的抗性中的10 - 16倍增加。選擇肝癌細胞且在不同化學治療劑下擴增。具有“獲得抗性”的這些細胞被稱為化學抗性群體。就對于多柔比星的抗性選擇的細胞被稱為多柔比星抗性細胞。類似地，在順鉬下選擇的細胞被稱為順鉬抗性細胞。藥物IC50值通過MTT測定進行測定。多柔比星抗性細胞證實與其親本細胞相比較，對于多柔比星的抗性中超過16倍的增加(IC50值分別為I. 78和O. 11 Pg/ml)。順鉬抗性細胞證實與其親本細胞相比較，對于順鉬的抗性中超過10倍的增加(IC50值分別為8. 53和O. 84 Pg/ml)。(B)在化學抗性細胞中觀察到ABCB5上調。
圖3顯示ABCB5抑制增強多柔比星攝取和細胞凋亡。CV細胞通過siRNA方法抑制ABCB5表達。所有細胞都顯示對于siABCB5降低的ABCB5 mRNA水平(蛋白質水平抑制的結果顯示于圖4中)。在多柔比星(O. 5 Pg/ml)處理24小時后的多柔比星含量。在多柔比星溫育24小時后(實線，與對照的虛線相比較)，大多數(shù)Hep3B細胞具有多柔比星攝取 (76. 4%)。相比之下，GEP過表達細胞和多柔比星抗性細胞具有減少的具有多柔比星攝取的群體(分別為55. 4%和31. 1%)。與細胞對多柔比星的基線敏感性無關(中圖)，通過siRNA方法抑制ABCB5使其對多柔比星攝取致敏(右圖)。在多柔比星(O. 5 Pg/ml)處理24小時后的細胞凋亡。ABCB5的抑制增強在包括H印3B、GEP過表達轉染子和多柔比星抗性細胞的細胞中的細胞凋亡。與對照比較* P<0. 05，# P<0. 01。
圖4顯示在HCC細胞中肝臟干細胞標記表達的表征。雙陽性亞群GEP+ABCB5+細胞顯示于在左圖處的散點圖的右上象限中，在R2/中門控。在R2中門控的雙陽性亞群進一步區(qū)分⑶133 (在中圖處的散點圖)和EpCAM (在右圖處的散點圖)的陽性。6^!fep3B細胞。大多數(shù)ABCB5+細胞也是GEP+(28. 0%細胞)。這些GEP+ABCB5+雙陽性細胞表達CD133 和EpCAM。通過siRNA方法抑制ABCB5有效降低ABCB5表達，減少共表達GEP的細胞群體， 并且縮小表達肝臟干細胞標記⑶133和EpCAM的細胞群體。GEP過表達轉染子。通過 GEP全長cDNA的轉染增加的GEP表達水平增加ABCB5+GEP+雙陽性群體(與親本細胞中的 28. 0%相比較的64. 6%)，并且大多數(shù)這些細胞對于⑶133和EpCAM是陽性的。通過siRNA抑制ABCB5表達降低GEP+ABCB5亞群，并且減少具有肝臟干細胞標記⑶133和EpCAM的細胞群體。多柔比星抗性細胞。在化學抗性細胞中觀察到增加的ABCB5+GEP+亞群(與親本細胞中的28. 0%相比較的57. 6%)，并且這些雙陽性細胞表達肝臟干細胞標記⑶133和EpCAM。 ABCB5表達的抑制降低GEP+ABCB5+亞群以及表達肝臟干細胞標記⑶133和EpCAM的細胞群體。與對照比較 * P<0. 005，**/X0. 001。
圖5顯示伴隨ABCB5的抑制在肝癌細胞中降低的肝臟干細胞標記表達。通過流式細胞術檢查細胞，并且顯示每種蛋白質的平均熒光強度(MFI)。6^Hep3B細胞。0」GEP過表達轉染子。多柔比星抗性細胞。
圖6顯示伴隨升高的GEP和ABCB5表達的高HCC復發(fā)率。⑷與平行的腫瘤相鄰的肝組織(包含肝炎和肝硬化肝臟)和來自健康個體的正常肝臟相比較，GEP過表達在HCC 中是顯著上調的。0」ABCB5表達在HCC中是升高的。大多數(shù)來自健康個體的正常肝臟和來自HCC患者的腫瘤相鄰肝臟顯示無法檢測的ABCB5。(C)根據(jù)GEP水平的卡普蘭-邁耶 (Kaplan-Meier)無復發(fā)存活曲線圖(時序檢驗，P=Q. 028)。在低GEP組中存在26個患者， 并且在高GEP組中存在36個患者(分別為37. 2個月和8. O個月的中值無復發(fā)存活)。(D) 根據(jù)ABCB5水平的卡普蘭-邁耶無復發(fā)存活曲線圖(時序檢驗，TM). 022)。存在具有無法檢測的ABCB5表達的36個患者和具有ABCB5表達的26個患者(分別為32. 4個月和7. 4個月的中值無復發(fā)存活)。
表I顯示關于對基因表達和臨床病理學參數(shù)的無復發(fā)存活的Cox回歸分析。
表2顯示ATP結合轉運蛋白基因。選擇其在至少一個樣品中的表達水平與其跨越所有樣品的平均表達水平相差至少兩倍的基因用于進一步分析。留下7836個克隆，存在22 個克隆，編碼ATP結合轉運蛋白的19種基因?；蚋鶕?jù)其表達水平與GEP的關聯(lián)系數(shù)值進行排序。
圖7顯示在第一組肝臟樣品中的微陣列證據(jù)。GEP和ABCFl表達水平是關聯(lián)的 0°〈0· 001)。
圖8顯示GEP和ABCFl關聯(lián)的驗證G°〈0. 001)。通過實時定量PCR分析肝臟樣品的獨立樣品組。
圖9顯示腫瘤組織中的ABCFl mRNA水平顯著高于平行非腫瘤肝臟G°〈0. 001)。


圖10顯示根據(jù)ABCFl水平對于無復發(fā)存活的卡普蘭-邁耶曲線圖。顯示出低濃度 ABCFl的細胞顯示出比顯示出高濃度ABCFl的細胞更高的無復發(fā)存活率(時序，/M). 001)。
表3顯示關于對基因表達和臨床病理學參數(shù)包括ABCFl的無復發(fā)存活的Cox回歸分析。
圖11顯示GEP抗體處理和化療藥物對H印3B中的細胞凋亡增強的作用。
圖12顯示應用GEP抗體處理和化療藥物的腫瘤大小的連續(xù)監(jiān)控。與化療藥物組合的GEP抗體處理顯示與單獨的任一處理相比較改善的生長抑制。
詳述多個方面涉及肝癌的治療。常規(guī)治療涉及根治手術例如肝部分切除術和/或化學療法。化學療法具有微小功效，并且患者顯示出弱存活后果。這可以是由于顯示出多藥抗性 (在本文中也稱為化學抗性)的小部分細胞。
多藥抗性可以起因于降低的細胞內藥物蓄積，例如至少部分是由于ATP依賴性結合盒(ABC)藥物外排轉運蛋白的腫瘤細胞表達。在肝臟致癌作用中的多藥抗性表型通常通過ABC藥物轉運蛋白包括ABCBl和ABCCl的過表達介導。這些轉運蛋白使得肝癌細胞能夠外排廣泛范圍的化學上不同的化學治療劑。
多藥抗性還可以通過致癌干細胞得到促進。致瘤干細胞對造血癌癥的貢獻已確定一定時間。盡管化學治療劑殺死大多數(shù)腫瘤細胞，但可以留下小群體的癌癥干細胞。這些剩余的癌癥干細胞可以例如被ABCB5和ABCFl保護不受化學治療。
肝癌的基因表達譜分析研究已顯示肝部癌癥細胞表達GEP。GEP已顯示在肝癌組織中是上調的，并且在功能上，GEP控制增殖、侵入和致腫瘤性。相應地，GEP是用于靶向療法的重要分子。對于動物模型使用抗GEP單克隆抗體用于肝癌的GEP靶向治療的治療方法先前已得到證實。然而，單獨在臨床情況中的靶向療法不足以根除實體瘤。
如實驗章節(jié)中所示，GEP的過表達賦予對于肝癌細胞的化學抗性，而GEP的抑制致使更喜歡的(lover)癌細胞化學敏感。另外，GEP在ATP依賴性結合盒(ABC)藥物外排轉運蛋白(ABCB5或ABCFl)的上游，從而使得GEP可以調節(jié)ABCB5和/或其他藥物外排轉運蛋白例如ABCFl的蛋白質水平。ABCB5或ABCFl的抑制可以致使肝癌細胞化學敏感。與化學療法組合的靶向GEP和藥物外排轉運蛋白可以提供根除侵略性、化學抗性肝癌細胞的治療模式。
此外，GEP+ABCB5+細胞共表達肝臟干細胞標記⑶133和EpCAM，并且干性(sternness)特征解釋對于表達GEP / ABCB5的肝癌在根治性肝部分切除術后的高復發(fā)率。 相應地，GEP通過ABCB5調節(jié)化學抗性，并且GEP+ABCB5+細胞表達肝臟干細胞標記。
GEP和藥物轉運蛋白的抑制是用于肝癌細胞的可行治療模式。當與單獨抑制GEP 相比較時，GEP和ABCB5的抑制已顯示使化學療法的攝取增加至少20%。在其他實施方案中，當與單獨抑制GEP相比較時，GEP和ABCB5的抑制已顯示使化學療法的攝取增加至少 40%。當與用單獨的化學療法的治療相比較時，GEP和ABCB5的抑制已顯示使化學療法的攝取增加至少40%。另外，當與用單獨的化學療法的治療相比較時，抑制GEP以及藥物轉運蛋白ABCB5和ABCFl的治療使化學療法增加至少45%。另外，與化學療法組合的抑制GEP和 ABCB5的治療使肝癌細胞的細胞凋亡率增加至少30%。在另一個實施方案中，與化學療法組合的抑制GEP、ABCB5和ABCFl的治療使肝癌細胞的細胞凋亡率增加至少40%。此外，GEP和 ABCB5的抑制可以使藥物抗性的癌癥干細胞數(shù)目減少至少25%。GEP、ABCB5和ABCFl的抑制可以使藥物抗性的癌癥干細胞數(shù)目減少至少35%。
此外，與化學療法組合的抑制GEP和藥物轉運蛋白的治療使至少50%的患者中的無復發(fā)存活時間增加超過六個月。根據(jù)更優(yōu)選實施方案，與化學療法組合的抑制GEP和藥物轉運蛋白的治療使至少30%的患者中的無復發(fā)存活時間增加超過12個月。根據(jù)更優(yōu)選實施方案，與化學療法組合的抑制GEP和藥物轉運蛋白的治療使至少10%的患者中的無復發(fā)存活時間增加超過24個月。
本公開內容進一步提供了包含GEP抗體和化療藥物的組合物，其在肝癌的治療中有用。在一些實施方案中，本公開內容的組合物進一步包含藥物轉運蛋白特異性抗體。
GEP抗體是本領域眾所周知和本領域可獲得的。可以在本發(fā)明中使用的GEP抗體包括但不限于GEP單克隆抗體A23。
藥物轉運蛋白特異性抗體是本領域眾所周知和本領域可獲得的。本領域技術人員能夠選擇合適的藥物轉運蛋白特異性抗體用于本公開內容。
用于治療肝癌的化療藥物也是本領域眾所周知的。可以在本發(fā)明中使用的化療藥物包括但不限于順鉬、多柔比星和/或氟尿嘧啶。
實驗石開究方案由 Institutional Review Board of the University of Hong Kong / Hospital Authority Hong Kong West Cluster (HKU/HAHKff I RB)批準。在 2002 年 10 月和2005年7月之間，在香港Queen Mary Hospital召募具有用于肝細胞癌(HCC)的根治性肝部分切除術的66個患者，具有對于該研究的知情同意書。相同的外科醫(yī)生團隊在這個時期自始至終執(zhí)行所有操作。預期收集臨床病理學數(shù)據(jù)。所有患者都已診斷有原發(fā)性HCC。 無復發(fā)存活是終點，并且從手術日期到復發(fā)日期計算。復發(fā)的診斷基于在造影劑增強性計算機X線斷層攝影術掃描中的一般成像發(fā)現(xiàn)和血清甲胎蛋白水平的增加。在不確定的情況下，可以執(zhí)行肝動脈造影術和碘化油后計算機X線斷層攝影術掃描，并且需要時，細針抽吸細胞學用于確認。僅62個患者包括在無復發(fā)存活研究中。由于缺省隨訪、醫(yī)院死亡率或并發(fā)的射頻消蝕，四個患者從存活后果分析中排除。直到分析日期，中值隨訪時間是66. 6個月。
細胞培養(yǎng)和測定人肝癌細胞系Hep3B和H印G2購自美國典型培養(yǎng)物中心(Manassas，VA)。培養(yǎng)方法先前已例如通過Ho JC 等人,Hepatology 2008 ；47 :1524-1532 和 Cheung ST 等人，Clin Cancer Res 2004 ；10 =7629-7636得到描述。關于GEP過表達和抑制的穩(wěn)定轉染子也已得到描述。 對于化學抗性群體，將Hep3B細胞鋪平板且以10倍稀釋在多個濃度的多種化學治療劑下選擇30天。使用超過延長選擇期仍具有活細胞的最高劑量且將細胞擴增用于進一步選擇。 隨后將一步選擇的細胞再次鋪平板，并且在擴大劑量的各自藥物下以2倍方式選擇另一個 30天。兩步選擇過程可以選擇對化學治療劑更多抗性的細胞群體。就對于多柔比星的抗性選擇的細胞被稱為多柔比星抗性細胞。類似地，在順鉬下選擇的細胞被稱為順鉬抗性細胞。藥物IC50值通過MTT測定進行測定。對于細胞凋亡測定，將細胞連同或不連同化學治療劑一起溫育24 - 48小時。使用流式細胞術通過錨定蛋白V-FITC (AV-FLI)和碘化丙啶 (PI-FL2)染色測定細胞凋亡?？偧毎蛲鋈后w包括散點圖的早期細胞凋亡細胞(AV的高 MFI但低PI)加上晚期細胞凋亡細胞(AV和PI的高MFI )。關于細胞凋亡測定的條形圖顯示在指定處理時間后細胞凋亡細胞的凈增加(例如=在多柔比星處理下24小時的細胞凋亡群體減去不含多柔比星的對照)。對于多柔比星攝取測定，將細胞連同或不連同多柔比星一起溫育24小時，并且通過流式細胞術分析多柔比星含量(FL2)。先導研究已檢查處理時間點0、1、3、6和24小時，并且后面三個時間點具有相似的數(shù)據(jù)概況。因此，對于多柔比星攝取和細胞凋亡測定，在后續(xù)實驗中檢查處理時間點O、I和24小時。存在時間依賴性效應， 并且因此數(shù)據(jù)圖表呈現(xiàn)與基線數(shù)據(jù)相比較的24小時處理的數(shù)據(jù)。針對(Everest Biotech Ltd, Oxfordshire, UK)、CD133 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach,德國)、EpCAM (BD Biosciences, San Jose，CA)和 GEP (先前由 Ho KC 等人，！fepatology 2008 ；47 :1524-1532 描述)的抗體用于通過流式細胞術(FACSCalibur，BD Biosciences)的免疫熒光染色中。
實時定量RT-PCR實時定量 RT-PCR 如先前由 Cheung ST 等人，Clin Cancer Res 2004 ; 10 :7629-7636 所述執(zhí)行。定量用 ABI Prism 7700 序列檢測系統(tǒng) Applied Biosystems,Foster City, CA)執(zhí)行。用于 GEP 的引物和探針已由 Cheung ST 等人，Clin Cancer Res 2004 ; 10 : 7629-7636 描述。關于ABCB5和對照18s的引物和探針試劑是現(xiàn)成的試劑(Pre-Developed TaqMan Assay Reagents, Applied Biosystems)。已對于RNA量變動用對照18s和對于板間變動用校準物標準化的GEP和ABCB5的相對量呈現(xiàn)為相對倍數(shù)變化。
RNA 干擾由Invitrogen (Carlsbad, CA)設計且合成對于ABCB5特異性的這些秘密的(stealth) 小干擾 RNAs (siRNA) (HSS139171、HSS139172 和 HSS139173)和具有匹配 GC 含量的對照siRNA。根據(jù)制造商的說明書，使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)執(zhí)行轉染。 總共100 nmol/L siRNA雙鏈體用于每次轉染。每組轉染具有三個對照，包括細胞加上 Lipofectamine、細胞加上Lipofectamine和對照siRNA、和僅細胞對照。這三種對照具有相似的數(shù)據(jù)概況，并且因此數(shù)據(jù)圖表呈現(xiàn)對照的平均數(shù)據(jù)。關于ABCB5的三種siRNAs的比較指出HSS139172對mRNA和蛋白質抑制具有更一致的作用，并且因此數(shù)據(jù)圖表呈現(xiàn)siABCB5 HSS 139172的平均數(shù)據(jù)。
統(tǒng)計分析所有統(tǒng)計分析都通過用于Windows的SPSS版本16. O (SPSS Inc.，Chicago, IL)執(zhí)行。通過Spearman關聯(lián)評估連續(xù)變量,并且通過斯氏t檢驗在組之間比較。GEP和ABCB5 mRNA水平是連續(xù)變量，并且數(shù)據(jù)在卡普蘭-邁耶和Cox回歸分析中建模為類別變量。約登 (Youden)指數(shù)，即靈敏度+特異性-1，用于測定關于預測3年無復發(fā)存活的最佳截斷點。還考慮且檢查其他截斷值包括平均值和中值。它們都能夠隔離具有相似臨床牽涉的患者。約登指數(shù)用于同時使預測的靈敏度和特異性達到最大。通過單變量和多變量Cox比例風險回歸用正向分步選擇程序檢查GEP、ABCB5和腫瘤期(AJCC腫瘤分期系統(tǒng))與無復發(fā)存活的關聯(lián)。小于O. 05的產(chǎn)值視為統(tǒng)計上顯著的。
結果生長因子GEP通過ABCB5調節(jié)化學抗性為了檢查GEP是否在化學抗性中具有作用，執(zhí)行轉染實驗以在HCC細胞中過表達或抑制GEP (圖I (A))。研究轉染子在多柔比星和順鉬處理下的化學應答。我們觀察到GEP的抑制(_)使HCC細胞對化學療法致敏，具有增強的細胞凋亡，而GEP的過表達(+ )致使HCC 對化學治療劑抗性，具有更少的細胞凋亡細胞(圖I (B))。
隨后篩選許多ABC藥物轉運蛋白，以檢查GEP是否可以通過調節(jié)藥物轉運蛋白水平來調節(jié)化學抗性。GEP過表達增強ABCB5蛋白質表達，而GEP抑制下調ABCB5蛋白質表達(圖I (C))。值得注意的是，GEP水平的變動證實對ABCB5蛋白質水平調節(jié)的顯著作用。 然而，GEP水平差異僅中等影響細胞系中的ABCB5 mRNA水平。值得注意的是，其他常見ABC 藥物轉運蛋白不受GEP調節(jié)影響，包括ABCBl (也稱為P-糖蛋白或MDRl)、ABCCI (也稱為 MRP1)和ABCC2 (也稱為MRP2)(數(shù)據(jù)未顯示)。
化學抗性HCC細胞用于檢查ABCB5的作用。將細胞鋪平板且在不同化學治療劑下選擇。在多柔比星下選擇的細胞被稱為多柔比星抗性群體，并且它們證實與其親本細胞相比較對于多柔比星的抗性增加(圖2(A))。在順鉬下選擇的細胞被稱為順鉬抗性群體，并且類似地它們顯示對于順鉬的抗性增加。多柔比星和順鉬抗性群體都顯示增強的ABCB5表達 (圖 2 (B))。
具有升高的ABCB5的細胞減少多柔比星攝取使不同的細胞群體暴露于多柔比星且檢查藥物攝取(圖3)。在多柔比星處理后，GEP過表達轉染子和多柔比星抗性細胞都證實與親本H印3B細胞相比較更低的多柔比星攝取(與 76. 4%相比較，具有多柔比星的細胞群體分別為55. 4%和31. W。還注意到H印3B細胞顯示與GEP過表達轉染子和多柔比星抗性細胞相比較更低的ABCB5水平。因此，目前數(shù)據(jù)指出ABCB5水平與多柔比星攝取負相關。
ABCB5的抑制使細胞對多柔比星攝取和細胞凋亡致敏較早描述的結果顯示在化學抗性群體中，GEP調節(jié)化學抗性，GEP調節(jié)ABCB5表達水平并且ABCB5證實增強的表達。為了鞏固ABCB5是否在化學抗性中具有關鍵作用，通過siRNA 方法調節(jié)ABCB5表達水平且檢查功能效應。用針對ABCB5的三種siRNAs轉染Hep3B細胞、 GEP過表達轉染子和多柔比星抗性細胞。所有siRNAs都能夠抑制ABCB5 mRNA和蛋白質水平，并且顯示對于ABCB5 mRNA水平具有更一致作用的siRNA (圖3 (A);圖4是對于ABCB5 蛋白質水平)。
在!fep3B細胞中，ABCB5的抑制證實多柔比星攝取中的顯著增加(76. 4%至93. 8%具有多柔比星攝取的群體)(圖3B)和增強的細胞凋亡(細胞凋亡群體中的12. 5%至27. 9% 凈增加)(圖3C)。進一步顯示ABCB5抑制對含更高ABCB5水平的肝癌細胞具有相似功能作用，包括GEP過表達轉染子和多柔比星抗性細胞。GEP過表達轉染子證實ABCB5抑制可以增強多柔比星攝取(55. 4%至78. 0%)和細胞凋亡(I I. 3%至19. 2%)。類似地，多柔比星抗性細胞顯示ABCB5抑制可以增強多柔比星攝取(31. I %至62.0%)和細胞凋亡(7. 7%至14.2%)。 這些數(shù)據(jù)證實ABCB5水平調節(jié)化學應答，和ABCB5水平的抑制可以使肝癌細胞對化學治療劑致敏，具有增加的細胞內藥物含量和增強的細胞凋亡。
在HCC中的GEP和ABCB5升高用臨床樣品進一步檢查在ABCB5之間的相關。GEP轉錄物和蛋白質水平在Cheung ST 等人，Clin Cancer Res 2004 ; 10 :7629-7636的先前研究中報道。此處，召募獨立的患者群。類似于Cheung等人的觀察，與新樣品組中的平行腫瘤相鄰的肝組織(配對樣品T檢驗， /X0. 001)和來自健康個體的正常肝臟(獨立樣品T檢驗t，P<0. 001)相比較(圖6)，GEP表達在HCC中是顯著升高的。這充當獨立研究，以證實一般而言GEP在HCC中是上調的。腫瘤相鄰的肝組織包含肝炎和肝硬化肝臟，并且這些組織中的GEP表達水平類似于得自健康個體的正常肝臟中的那種，指示GEP過表達在HCC中的唯一性。ABCB5在大多數(shù)正常肝臟 (90%，9/10)和腫瘤相鄰的肝組織(89. 7%，58/66)中是無法檢測的。HCC組織證實與平行的腫瘤相鄰的肝組織(配對樣品T檢驗，產(chǎn)=0. 033)和來自健康個體的正常肝臟(獨立樣品T檢驗，TM). 022)相比較，升高的ABCB5表達。
基因表達水平在HCC樣品中進行比較，并且GEP的表達和ABCB5的那種顯著關聯(lián) (HCC n=66, Spearman的P關聯(lián)系數(shù)=0. 390,/M). 001 )。所有肝臟樣品包括腫瘤、腫瘤相鄰的和正常肝組織隨后包括在關聯(lián)分析中。GEP和ABCB5的表達在研究的不同類型的肝臟樣品中是顯著關聯(lián)的(n=142，Spearman的P關聯(lián)系數(shù)=O. 428，TM). 022)。相應地，GEP和 ABCB5表達在臨床肝臟樣品中顯著關聯(lián)，提供關于在細胞模型上GEP和ABCB5緊密相關的觀察的進一步證據(jù)。
GEP和ABCB5與預后不良的相關GEP蛋白質表達已通過Cheung ST等人，Clin Cancer Res 2004 ; 10 :7629-7636顯示與早期肝內復發(fā)是相關的。目前的患者群具有廣泛的隨訪，且因此檢查在基因表達和無復發(fā)存活之間的相關。卡普蘭-邁耶曲線圖用于檢查與基因表達相關的患者后果。用達到最大的約登指數(shù)將患者隔離為GEP低和GEP高組，以測定最佳截斷值(圖6(C)，表I)。在GEP低組中存在26個患者(中值無復發(fā)存活37. 2個月)，并且在GEP高組中存在36個患者(中值無復發(fā)存活8. O個月)。發(fā)現(xiàn)具有高GEP水平的患者具有弱無復發(fā)存活(時序檢驗，/M). 028)。
基于ABCB5表達執(zhí)行預后分析。通過使約登指數(shù)達到最大測定關于ABCB5的最佳截斷值，并且將患者隔離為ABCB5不存在和ABCB5存在的組(圖6 (D)，表I)。在ABCB5不存在的組中存在36個患者(中值無復發(fā)存活32. 4個月)，并且在ABCB5存在的組中存在26 個患者(中值無復發(fā)存活7. 4個月)。具有ABCB5表達的患者顯示具有弱無復發(fā)存活(時序檢驗，TM). 022)。
為了檢查用于無復發(fā)存活的預測力，Cox回歸分析用于比較基因表達數(shù)據(jù)和腫瘤期(表I)。通過單變量Cox回歸分析，高GEP水平[危害比(HR)= 2. 3 ;95%置信區(qū)間(95%CI) =I. 2-4. 6 -,P = O. 016]、ABCB5 表達(HR = 2. 3 ；95%CI I. 2-4. 4 ；P O. 009)和晚期腫瘤期(HR = 2. 7 ；95% Cl = I. 4-5. 2 -,P=Q. 002)與弱無復發(fā)存活顯著相關。通過多變量Cox回歸分析，僅發(fā)現(xiàn) ABCB5 表達(HR = 2. I ；95%CI = I. 1-4. O -,P=Q. 024)和晚期腫瘤期(HR=2. 5 ；95% Cl = I. 3-4. 7 'P =0. 006)是用于無復發(fā)存活的獨立預后因素。這部分的研究顯示ABCB5表達影響具有根治性肝部分切除術的肝癌患者的預后。
GEP / ABCB5的表達和干細胞標記癌癥干細胞已知表達ABC藥物轉運蛋白，以保護其自身不受化學療法。此外，應用通過根治性肝部分切除術去除的腫瘤主體，高肝癌復發(fā)率可以通過癌癥干細胞/腫瘤起始細胞的存在加以解釋。對肝部癌癥細胞的干細胞標記進一步表征。大多數(shù)GEP+ABCB5+細胞共表達在H印3B細胞中的肝部癌癥干細胞標記，包括⑶133和EpCAM (圖4 (A))。在GEP過表達轉染子中增加的GEP表達增加GEP+ABCB5+群體，并且這些細胞共表達干細胞標記(圖 4 (B))。多柔比星抗性細胞還顯示具有⑶133和EpCAM表達的增加的GEP+ABCB5+群體(圖 4 (O)0
為了進一步研究在GEP/ABCB5和干細胞性質之間的相關，隨后通過siRNA方法使細胞抑制ABCB5。所有細胞包括H印3B、GEP過表達轉染子和多柔比星抗性細胞，都證實降低的ABCB5表達。值得注意的是，GEP+ABCB5+細胞群體通過siABCB5降低，并且大多數(shù)這些雙陽性細胞共表達肝部癌癥干細胞標記⑶133和EpCAM。重要的是，ABCB5的抑制不僅降低三陽性細胞群體(圖4)，也降低具有肝臟干細胞標記⑶133和EpCAM表達的總體群體 (圖5)。因此，GEP+ABCB5+群體與肝部癌癥干細胞群體高度相關。數(shù)據(jù)支持GEP+ / ABCB5+ HCC的觀察與根治性手術后增加的癌癥復發(fā)相關。
其它藥物轉運蛋白的GEP調節(jié)因為僅45%的HCC顯示可檢測的ABCB5，所以假設GEP除ABCB5外還可以調節(jié)其他藥物轉運蛋白。再次檢查肝癌基因表達譜，并且如表2中所示，ATP結合轉運蛋白通過其表達水平與GEP的關聯(lián)系數(shù)值進行排序。微陣列數(shù)據(jù)在獨立的樣品組和獨立的研究方法實時獨立 RT-PCR中加以驗證。
一個此類ATP結合轉運蛋白是ABCF1。GEP和ABCFl表達水平是顯著關聯(lián)的 (7X0. 001)(圖6-7)。與相鄰的非腫瘤肝臟相比較，ABCFl表達在腫瘤中是上調的G°〈0. 001) (圖9)。增加的ABCFl表達與弱無復發(fā)存活相關(時序檢驗，TM). 001)(圖9，表3)。
與化療藥物組合的GEP抗體肝癌H印3B細胞接受不同的細胞測定處理。對照未接受處理。A23接受用100 μδ/πι1 GEP抗體Α23的處理。Cis接受4 μδ/πι1化學治療順鉬的處理。Cis+A23接受GEP抗體A23 (100 Pg/ml)加上順鉬(4 Pg/ml)的組合處理。將細胞收獲，用膜聯(lián)蛋白V (AV)和碘化丙啶(PI)染色，隨后流式分析。總細胞凋亡群體包括早期細胞凋亡細胞(AV的高平均熒光強度但低PI)加上晚期細胞凋亡細胞(AV和PI的高平均熒光強度)。與單獨的化療藥物相比較，與化療藥物組合的GEP抗體處理增強癌細胞凋亡(圖11)。
在動物模型中，將H印3B細胞皮下注射到裸鼠內，并且允許腫瘤生長至O. 3cm3。腫瘤用GEP抗體A23(0. I mg，每周兩次)、或順鉬(O. I mg，每周一次)、或A2加上順鉬的組合、 或單獨的鹽水的腹膜內注射處理一個月。裸鼠體重20-25克。連續(xù)監(jiān)控腫瘤大小。根據(jù)公式AB2/2計算腫瘤大小，其中A和B分別為最大和最小尺度。與單獨的任一處理相比較，與化療藥物組合的GEP抗體處理顯示改善的生長抑制(圖12)。
討論GEP和ABCB5的生物學功能GEP是涉及人前列腺、膀胱、卵巢和乳腺癌的腫瘤發(fā)生的生長因子。GEP已牽涉鼠胎兒發(fā)育和傷口應答。此外，GEP促進神經(jīng)元細胞存活，且GEP的突變引起額顳癡呆。因此，GEP 是涉及許多生理學情況的重要生長因子。GEP調節(jié)肝癌的增殖、侵入和腫瘤發(fā)生。通過抗體方法中和GEP抑制腫瘤生長。
在目前的研究中，我們觀察到GEP的過表達賦予肝癌細胞化學抗性，而GEP的抑制致使細胞化學敏感。此外，GEP調節(jié)ABCB5蛋白質水平，并且ABCB5水平的抑制致使肝癌細胞化學敏感。此外，GEP+ABCB5+細胞共表達肝臟干細胞標記⑶133和EpCAM，并且干性特征解釋對于表達GEP/ABCB5的肝癌在根治性肝部分切除術后的高復發(fā)率。這是證實GEP通過 ABCB5調節(jié)化學抗性，并且GEP+ABCB5+細胞表達肝臟干細胞標記的首個研究。
藥物抗性增加的證據(jù)已揭示GEP在多個癌癥類型中介導對于許多臨床藥物的抗性中的作用。 GEP的過表達已顯示致使乳腺癌細胞對于它莫西芬和曲妥珠單抗有抵抗力，多發(fā)性骨髓瘤細胞對于地塞米松不敏感、和卵巢細胞對于順鉬有抵抗力。然而，由此GEP賦予藥物抗性的確切信號仍未得到闡述，且GEP是否調節(jié)藥物轉運蛋白由文獻是未知的。在這個研究中，發(fā)現(xiàn)GEP在調節(jié)ABCB5蛋白質水平中具有顯著作用(圖1(C))。因此，GEP在穩(wěn)定ABCB5蛋白質或影響ABCB5翻譯率中具有正面效應。此外，通過siRNA方法抑制ABCB5導致減少的GEP 蛋白質水平(圖4)，但對GEP轉錄物水平不具有顯著作用(數(shù)據(jù)未顯示)。該觀察進一步支持 GEP蛋白質和ABCB5蛋白質能夠彼此穩(wěn)定。
癌癥干細胞和藥物抗性已知與ABCB5-亞群相比較，ABCB5+黑素瘤細胞能夠自我更新和分化且具有更大的致瘤能力。已知ABCB5在黑素細胞的⑶133+祖細胞中表達且介導對于多柔比星的抗性。此外，已知ABCB5+亞群具有T細胞調節(jié)功能，這可能允許亞群逃避宿主抗腫瘤免疫。然而，調節(jié)ABCB5蛋白質水平的信號傳導分子是先前未知的。這個研究證實GEP調節(jié)ABCB5蛋白質水平，并且增強的GEP增加ABCB5蛋白質水平，而GEP的抑制降低ABCB5蛋白質水平。重要的是，GEP或ABCB5任一的抑制使癌細胞對化學治療劑致敏。
相應地，化學抗性和弱存活后果由GEP+ABCB5+肝癌細胞亞集指示。與化學療法組合的靶向特異性生長因子/藥物轉運蛋白可以提供根除侵略性肝癌細胞的治療模式。
其他藥物轉運蛋白的GEP調節(jié)為了解釋GEP如何調節(jié)化學抗性的發(fā)信號機制，已檢查文獻中報道的許多常見的ATP 依賴性結合盒(ABC)藥物外排轉運蛋白。GEP顯示調節(jié)藥物轉運蛋白ABCB5的表達，并且 ABCB5的阻斷使肝癌細胞對化學治療劑致敏，并且減弱肝部癌癥干細胞標記CD133和EpCAM 的表達。此外，GEP和ABCB5表達水平在臨床樣品中顯著關聯(lián)，并且與肝部分切除術后的肝細胞癌復發(fā)相關。GEP控制生長，通過藥物轉運蛋白ABCB5和肝部癌癥干細胞標記表達調節(jié)化學抗性，部分解釋在腫瘤切除后的快速復發(fā)和與肝癌中的化學抗性相關的特征。
目前研究報道系統(tǒng)檢查與化學抗性有關的GEP相關基因的基因組方法。值得注意的是，GEP表達在所有肝癌組織中都是可檢測的，而僅45%顯示可檢測的ABCB5轉錄物。因此，GEP僅在肝癌亞集中通過ABCB5調節(jié)化學抗性。因此，GEP除ABCB5外還可以調節(jié)其他藥物轉運蛋白。
再次檢查肝癌基因表達，并且ATP藥物轉運蛋白家族成員與GEP表達模式結合進行排序(表2)。使用獨立研究平臺實時定量RT-PCR，在臨床樣品的獨立群中進一步驗證在微陣列雜交數(shù)據(jù)集中顯示與GEP表達具有高關聯(lián)的ABC基因。與相鄰的非腫瘤肝臟相比較，藥物轉運蛋白ABCFl的表達水平在腫瘤中是顯著上調的(P < O. 001)，并且增加的表達與弱無疾病存活相關(時序檢驗，P = 0.001)?？傊?，化學抗性和弱存活結果通過GEP+ABC+ 肝癌細胞亞集指示。與化學療法組合的靶向特異性生長因子/藥物轉運蛋白(例如ABCB5 或ABCFl)可以提供根除侵略性肝癌細胞的治療模式。
與化療藥物組合的GEP抗體用GEP抗體A23和化療藥物的組合處理肝癌顯示出比單獨的GEP抗體A23或化療藥物任一更大的細胞凋亡效應。相應地，與化學療法組合的靶向特異性生長因子可以提供根除侵略性肝癌細胞的更有效治療模式。
就對于給定特征的任何數(shù)字或數(shù)目范圍而言，來自一個范圍的數(shù)字或參數(shù)可以與對于相同特征的來自不同范圍的另一個數(shù)字或參數(shù)組合，以生成數(shù)目范圍。
除了在操作實施例中之外，或當另有說明時，在說明書和權利要求中提及成分數(shù)量、反應條件等使用的所有數(shù)目、值和/或表達應理解為在所有情況下由術語“約”修飾。
如申請中公開且描述的實施方案預期是舉例說明和解釋性的，而不是限制性的。 所公開實施方案例如采用的(或待采用的)過程和儀器以及使用的(或待使用的)組合物和處理的修飾和變動是可能的；所有此類修飾和變動都預期在本申請的范圍內。
權利要求
1.一種用于處理肝部癌癥細胞的方法，其包括 給肝部癌癥細胞施用包含顆粒素-上皮素前體(GEP)抗體和化療藥物的處理； 抑制顆粒素-上皮素前體(GEP)； 通過抑制GEP調節(jié)GEP下游的藥物轉運蛋白的表達；和 使所述肝部癌癥細胞對于所述化療藥物致敏。
2.權利要求I的方法，其中所述藥物轉運蛋白是ATP依賴性結合盒(ABC)藥物外排轉運蛋白。
3.前述權利要求中任一項的方法，其中所述藥物轉運蛋白是ABCB5。
4.前述權利要求中任一項的方法，其中所述藥物轉運蛋白是ABCF1。
5.前述權利要求中任一項的方法，其中所述施用所述處理進一步包含給所述肝部癌癥細胞施用包含所述GEP抗體、藥物轉運蛋白特異性抗體和所述化療藥物的處理。
6.前述權利要求中任一項的方法，其中使所述肝部癌癥細胞對所述化療藥物致敏進一步包含使所述化療藥物對所述肝部癌癥細胞的細胞凋亡增強至少20%。
7.前述權利要求中任一項的方法，其中使所述肝部癌癥細胞對所述化療藥物致敏進一步包含使所述化療藥物對所述肝部癌癥細胞的細胞凋亡增強至少30%。
8.一種用于將治療劑遞送給肝部癌癥細胞的方法，其包括 使肝部癌癥細胞與以有效量的綴合至化學治療劑的選擇性結合顆粒素-上皮素前體(GEP)的分子接觸，以將所述化學治療劑遞送給所述肝部癌癥細胞的細胞內區(qū)室。
9.權利要求8的方法，其進一步包括 抑制GEP ;和 下調所述GEP下游的藥物轉運蛋白的表達。
10.權利要求8- 9中任一項的方法，其進一步包括使所述肝部癌癥細胞對所述化學治療劑致敏，并且使所述肝部癌癥細胞的細胞凋亡率增加至少20%。
11.權利要求8- 10中任一項的方法，其進一步包括與施用單獨的所述化學治療劑相比較，使所述化學治療的攝取增加至少40%。
12.權利要求8- 11中任一項的方法，其中所述藥物轉運蛋白是ABCB5。
13.權利要求8- 12中任一項的方法，其中所述藥物轉運蛋白是ABCF1。
14.權利要求8- 14中任一項的方法，其進一步包括使所述癌細胞的細胞凋亡率增加至少30%。
15.一種用于治療肝部癌癥的組合物，其包含 與GEP選擇性結合的顆粒素-上皮素前體(GEP)抗體； 包含化療藥物的治療劑， 其中所述GEP抗體與所述治療劑共配制。
16.權利要求15的組合物，其中所述GEP抗體與GEP選擇性結合，并且從而促進藥物轉運蛋白蛋白質的下調。
17.權利要求15- 16中任一項的組合物，其中所述藥物轉運蛋白是ABCB5。
18.權利要求15- 17中任一項的組合物，其中所述藥物轉運蛋白是ABCF1。
19.權利要求15- 18中任一項的組合物，其中與單獨的化療藥物相比較，所述組合物促進癌細胞中增大20%的細胞凋亡率。
20.權利要求15- 19中任一項的組合物，其中與單獨的化療藥物相比較，所述組合物促進癌細胞中增大40%的細胞凋亡率。
21.權利要求15- 20中任一項的組合物，其進一步包含藥物轉運蛋白特異性抗體。
22.GEP抗體和化療藥物在制備用于治療肝部癌癥的藥物中的用途.
23.GEP抗體、藥物轉運蛋白特異性抗體和化療藥物在制備用于治療肝部癌癥的藥物中的用途. .23.一種用于在肝部癌癥治療中使用的組合物，其包含 與GEP選擇性結合的顆粒素-上皮素前體(GEP)抗體； 包含所述化療藥物的治療劑， 其中所述GEP抗體與所述治療劑共配制.
24.權利要求23的組合物，其進一步包含藥物轉運蛋白特異性抗體。
全文摘要
公開了用于治療肝部癌癥的組合物，其包含顆粒素-上皮素前體(GEP)抗體。該組合物進一步包含化療藥物和藥物轉運蛋白特異性抗體。也公開了GEP抗體在制備用于治療肝部癌癥的藥物中的用途。
文檔編號A61K39/395GK102985111SQ201180034576
公開日2013年3月20日 申請日期2011年5月13日 優(yōu)先權日2010年5月14日
發(fā)明者張兆恬, 范上達 申請人:香港大學