專利名稱：癌的治療和/或預(yù)防用藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及針對CAPRIN-I的抗體或其片段作為癌的治療和/或預(yù)防劑等的新的醫(yī)藥用途。
背景技術(shù)：
癌是占所有死亡原因的第一位的疾病，現(xiàn)行的治療是以手術(shù)療法為主、組合使用放療法和化療法的治療。盡管近年來也有新的手術(shù)方法的開發(fā)、新型抗癌藥的發(fā)現(xiàn)，但現(xiàn)狀是除了一部分癌癥，癌的治療成績并沒有多大提高。近年來，隨著分子生物學(xué)、癌免疫學(xué)的進步，與癌特異性反應(yīng)的抗體類、由細胞毒性T細胞識別的癌抗原類、編碼癌抗原的基因類等被鑒定，對以癌抗原類為靶的特異性的癌治療方法的期待正在提 高(非專利文獻I)。在癌治療方法中，為了減輕副作用，期望作為癌抗原被識別的肽、多肽或蛋白質(zhì)在正常細胞中幾乎不存在，而在癌細胞中特異性地存在。1991年，比利時Ludwig研究所的Boon等通過使用了自身癌細胞株和癌反應(yīng)性T細胞的cDNA表達克隆法分離了由⑶8陽性T細胞所識別的人黑素瘤抗原MAGEl (非專利文獻2)。之后，報道了 SEREX (重組表達克隆的抗原血清學(xué)分析，serological identification of antigens by recombinant expressioncloning)法，其采用基因的表達克隆的方法來鑒定由在癌患者的活體內(nèi)與自身的癌反應(yīng)而產(chǎn)生的抗體所識別的腫瘤抗原(非專利文獻3和專利文獻I)，利用該方法，在正常細胞中幾乎沒有表達、在癌中特異性地表達的幾種癌抗原被分離(非專利文獻4 9)。進一步地，實施了使用以其一部分為靶、與癌抗原特異性反應(yīng)的免疫細胞的細胞療法、或含有癌抗原的疫苗等的癌特異性免疫療法的臨床試驗。另一方面，近年來，以癌細胞上的抗原蛋白質(zhì)為靶的、用于治療癌的各種抗體藥物在世界上有所增長。作為癌特異性治療藥得到了一定的藥效而受到人們的矚目，但成為靶的抗原蛋白質(zhì)的大部分在正常細胞中也表達，作為抗體施與的結(jié)果，不僅是癌細胞，表達抗原的正常細胞也受到損傷，該結(jié)果所產(chǎn)生的副作用成為問題。因此，如果能夠鑒定在癌細胞表面特異性地表達的癌抗原、并使用以該癌抗原為靶的抗體作為藥物，則可以期待實現(xiàn)副作用更少的利用了抗體藥物的治療。細胞質(zhì)增殖相關(guān)蛋白I (Cytoplasmic-and proliferation-associateed protein1，CAPRIN-1)是已知在分裂間期的正常細胞發(fā)生活化和/或細胞分裂時表達，并在細胞內(nèi)與RNA形成細胞內(nèi)應(yīng)激顆粒而參與mRNA的運輸、翻譯的控制等的細胞內(nèi)蛋白質(zhì)。另一方面，CAPRIN-I具有各種別名，作為其例子，有GPI錨定膜蛋白I、膜組分表面標志物I蛋白(MllSl)等，有宛如已知本蛋白質(zhì)是細胞膜蛋白質(zhì)那樣的名稱。這些別名本來源自認為CAPRIN-I的基因序列具有GPI結(jié)合區(qū)、并且CAPRIN-I是在大腸癌細胞中表達的膜蛋白質(zhì)(非專利文獻10)的報告，但后來報告了 上述非專利文獻10的報告中的CAPRIN-I的基因序列有誤，現(xiàn)在在GenBank等中登記的CAPRIN-I基因序列中由于I個堿基缺失而發(fā)生移碼，從而80個氨基酸從C末端缺失，其結(jié)果是所產(chǎn)生的人為產(chǎn)物(74個氨基酸)是上述報告中的GPI結(jié)合部分，而且在5’側(cè)也存在基因序列的錯誤，53個氨基酸從N末端缺失(非專利文獻11)。另外，已經(jīng)報告了由現(xiàn)在在GenBank等中登記的CAPRIN-I的基因序列編碼的蛋白質(zhì)不是細胞膜蛋白質(zhì)(非專利文獻11)。并且，基于認為CAPRIN-I是細胞膜蛋白質(zhì)的非專利文獻10的報告，專利文獻2和3以MlISl的名稱記載了 CAPRIN-I作為細胞膜蛋白質(zhì)的一種可作為抗體藥物的靶而用于癌治療(實施例中完全沒有關(guān)于使用了針對本蛋白質(zhì)的抗體的治療的記載)。但是，如非專利文獻11的報告所述，從專利文獻2申請時到現(xiàn)在，CAPRIN-I是不在細胞表面表達的蛋白質(zhì)已經(jīng)成為了一般說法，顯然僅基于CAPRIN-I是細胞膜蛋白質(zhì)這樣的錯誤信息的專利文獻2和3的內(nèi)容不應(yīng)當(dāng)理解為本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)常識?，F(xiàn)有技術(shù)文獻專利文獻 專利文獻I :美國專利第5698396號專利文獻2 :US2008/0075722
專利文獻 3 W02005/100998非專利文獻非專利文獻I :秋吉毅，“癌i化學(xué)療法”、1997年、第24卷、p551_519(癌i化學(xué)療法社、日本)非專利文獻2 =Bruggen P. et al.，Science, 254 :1643-1647(1991)非專利文獻3 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92 :11810-11813(1995)非專利文獻4 : Int. J. Cancer, 72 :965-971(1997)非專利文獻5 =Cancer Res.，58 1034-1041 (1998)非專利文獻6 Int. J. Cancer, 29 :652-658 (1998)非專利文獻7 Int. J. Oncol.，14 :703-708(1999)非專利文獻8 =Cancer Res.，56 :4766-4772 (1996)非專利文獻9 Hum. Mol. Genet6 :33-39,1997非專利文獻10 J. Biol. Chem.，270 :20717-20723,1995非專利文獻11 J. Immunol.，172 :2389-2400,200
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的課題本發(fā)明的目的是鑒定在癌細胞的表面特異性地表達的癌抗原蛋白質(zhì)，提供以該癌抗原蛋白質(zhì)作為靶的抗體的、作為癌的治療和/或預(yù)防劑的用途。用于解決課題的方法本發(fā)明人等進行了努力研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過使用了源于狗的睪丸組織的cDNA文庫和患乳癌的狗的血清的SEREX法，獲取編碼與在源于荷癌生物體的血清中存在的抗體結(jié)合的蛋白質(zhì)的cDNA，以獲取的基因和該基因的人、牛、馬、小鼠、雞同源性基因為基礎(chǔ)，制作了具有序列編號2 30中偶數(shù)的序列編號所示的氨基酸序列的CAPRIN-I和針對這些CAPRIN-I的抗體。并且發(fā)現(xiàn)CAPRIN-I在乳癌、腦瘤、白血病、淋巴瘤、肺癌、宮頸癌、膀胱癌、食道癌、大腸癌、胃癌和腎癌細胞中特異性地表達，而且發(fā)現(xiàn)CAPRIN-I蛋白質(zhì)的一部分在這些癌細胞的細胞表面特異性地表達。發(fā)現(xiàn)針對這些CAPRIN-I的在各癌細胞的細胞表面表達的部分的抗體損傷表達CAPRIN-I的癌細胞，從而完成了本發(fā)明。因此，本發(fā)明具有以下特征。本發(fā)明提供用于癌的治療和/或預(yù)防的藥物組合物，其特征在于，含有與由序列編號2 30中偶數(shù)的序列編號表示的CAPRIN-I的部分多肽具有免疫反應(yīng)性的抗體或其片段作為有效成分，所述CAPRIN-I的部分多肽具有序列編號37所示的氨基酸序列(在序列編號37所示的氨基酸序列中，優(yōu)選序列編號69或序列編號70所示的氨基酸序列的區(qū)域)、或與該氨基酸序列具有80%以上的序列同一性的氨基酸序列。在該實施方式中，上述癌是乳癌、腦瘤、白血病、淋巴瘤、肺癌、宮頸癌、膀胱癌、食道癌、大腸癌、胃癌或腎癌。在另外的實施方式中，上述抗體為單克隆抗體或多克隆抗體。在另外的實施方式中，上述抗體為人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、或雙 特異性抗體。在另外的實施方式中，上述抗體是與多肽或其片段具有免疫反應(yīng)性的抗體，所述多肽具有序列編號37所示的氨基酸序列(在序列編號37所示的氨基酸序列中，優(yōu)選序列編號69或70所示的氨基酸序列的區(qū)域)、或與該氨基酸序列具有80%以上、優(yōu)選85%以上、更優(yōu)選90%以上、進一步優(yōu)選95%以上的序列同一性的氨基酸序列。在另外的實施方式中，提供上述抗體或以含有該抗體作為有效成分為特征的用于癌的治療和/或預(yù)防的藥物組合物，其中，上述抗體是以下(a) (f)中的任一抗體，且與CAPRIN-I蛋白質(zhì)具有免疫反應(yīng)性。(a)包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的抗體，所述重鏈可變區(qū)包含序列編號40、41和42，所述輕鏈可變區(qū)包含序列編號44、45和46。(b)包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的抗體，所述重鏈可變區(qū)包含序列編號48、49和50，所述輕鏈可變區(qū)包含序列編號52、53和54。(c)包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的抗體，所述重鏈可變區(qū)包含序列編號56、57和58,所述輕鏈可變區(qū)包含序列編號60、61和62。(d)包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的抗體，所述重鏈可變區(qū)包含序列編號73、74和75，所述輕鏈可變區(qū)包含序列編號77、78和79。(e)包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的抗體，所述重鏈可變區(qū)包含序列編號81、82和83，所述輕鏈可變區(qū)包含序列編號85、86和87。(f)包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的抗體，所述重鏈可變區(qū)包含序列編號89、90和91，所述輕鏈可變區(qū)包含序列編號93、94和95。本說明書包含作為本申請的優(yōu)先權(quán)基礎(chǔ)的日本專利申請2010-023451號的說明書和/或附圖
中記載的內(nèi)容。發(fā)明的效果本發(fā)明中使用的針對CAPRIN-I的抗體損傷癌細胞。因此，針對CAPRIN-I的抗體在癌的治療和/或預(yù)防中是有用的。附圖的簡單說明圖I是顯示編碼CAPRIN-I蛋白質(zhì)的基因的在正常組織和腫瘤細胞株中的表達圖譜的圖。參照編號I顯示編碼CAPRIN-I蛋白質(zhì)的基因的表達圖譜，參照編號2顯示GAPDH基因的表達圖譜。圖2是顯示由與癌細胞的細胞表面反應(yīng)的針對CAPRIN-I的單克隆抗體(#1、#2和#3)產(chǎn)生的、對表達CAPRIN-I的乳癌細胞株MDA-MB-157的細胞毒性的圖。參照編號3顯示添加#1的針對CAPRIN-I的單克隆抗體時的活性，參照編號4顯示添加#2的針對CAPRIN-I的單克隆抗體時的活性，參照編號5顯示添加#3的針對CAPRIN-I的單克隆抗體時的活性，參照編號6顯示添加PBS代替抗體時的活性。圖3顯示與癌細胞的細胞表面反應(yīng)的針對CAPRIN-I的單克隆抗體(#1 #3)的、對移植了表達CAPRIN-I的小鼠乳癌細胞株4T1的Balb/c小鼠的抗腫瘤效果的圖。參照編號7顯示施與了 #1的針對CAPRIN-I的單克隆抗體的小鼠的腫瘤的大小，參照編號8顯示施與了 #2的針對CAPRIN-I的單克隆抗體的小鼠的腫瘤的大小，參照編號9顯示施與了 #3的針對CAPRIN-I的單克隆抗體的小鼠的腫瘤的大小，參照編號10顯示施與了 PBS來代替抗體的小鼠的腫瘤的大小。
具體實施例方式本發(fā)明中使用的針對序列編號2 30中偶數(shù)的序列編號的多肽的抗體的抗腫瘤活性，可以如下所述，通過研究在體內(nèi)對荷癌動物的腫瘤增殖的抑制，或者通過研究在體外對表達該多肽的腫瘤細胞是否顯示介由免疫細胞或補體的細胞毒性，來進行評價。其中，編碼包含序列編號2 30中偶數(shù)的序列編號(即，序列編號2，4，
6......28，30)的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的多核苷酸的堿基序列，分別在序列編號I 29中
奇數(shù)的序列編號(S卩，序列編號1，3，5...... 27,29)中顯示。本發(fā)明公開的序列表的序列編號6、8、10、12和14所示的氨基酸序列是通過使用了源于狗睪丸組織的cDNA文庫和患乳癌的狗的血清的SEREX法，作為與在源于荷癌狗的血清中特異性地存在的抗體結(jié)合的多肽而被分離出的CAPRIN-I的氨基酸序列，另外，序列編號2和4所示的氨基酸序列是作為其人同源因子(同源物)而被分離出的CAPRIN-I的氨基酸序列，序列編號16所示的氨基酸序列是作為其牛同源因子而被分離出的CAPRIN-I的氨基酸序列，序列編號18所示的氨基酸序列是作為其馬同源因子而被分離出的CAPRIN-I的氨基酸序列，序列編號20 28所示的氨基酸序列是作為其小鼠同源因子而被分離出的CAPRIN-I的氨基酸序列，序列編號30所示的氨基酸序列是作為其雞同源因子而被分離出的CAPRIN-I的氨基酸序列(參照下述的實施例I)。已知CAPRIN-I在分裂間期的正常細胞發(fā)生活化和/或細胞分裂時表達。一直以來已知的是CAPRIN-I不在細胞表面表達，但根據(jù)本研究，可以明確CAPRIN-I蛋白質(zhì)的一部分在各種癌細胞的細胞表面表達。而且，可以明確識別包含序列編號37所示的氨基酸序列(優(yōu)選在序列編號37所示的氨基酸序列中含有的、序列編號69或序列編號70所示的氨基酸序列)、或與該氨基酸序列具有80%以上、優(yōu)選85%以上、更優(yōu)選90%以上、進一步優(yōu)選95%以上的序列同一性的氨基酸序列的CAPRIN-I蛋白質(zhì)的部分多肽的抗體，顯示抗腫瘤活性。本發(fā)明的抗體包含與上述CAPRIN-I蛋白質(zhì)的片段結(jié)合、且顯示抗腫瘤活性的所有抗體。本發(fā)明中使用的針對上述CAPRIN-I的抗體只要是可發(fā)揮抗腫瘤活性，就可以是任何種類的抗體，包含例如單克隆抗體、多克隆抗體、重組抗體、例如合成抗體、多特異性抗體、人源化抗體、嵌合抗體、單鏈抗體(scFv)等、人抗體、它們的抗體片段例如Fab和/或F(ab’)2、Fv等。這些抗體和其片段還可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法制備。在本發(fā)明中，期望是與CAPRIN-I蛋白質(zhì)或其部分多肽具有免疫反應(yīng)性(即，介由抗原-抗體反應(yīng)與CAPRIN-I蛋白質(zhì)結(jié)合)的抗體、優(yōu)選可與CAPRIN-I蛋白質(zhì)特異性地結(jié)合的抗體，優(yōu)選為單克隆抗體，但只要可穩(wěn)定地生產(chǎn)均質(zhì)的抗體，則也可以是多克隆抗體。另外，當(dāng)受試者是人時，為了避免或抑制排斥反應(yīng)，期望是人抗體或人源化抗體。這里，“與CAPRIN-I蛋白質(zhì)特異性地結(jié)合”是指 與CAPRIN-I蛋白質(zhì)特異性地結(jié)合，與CAPRIN-I蛋白質(zhì)以外的蛋白質(zhì)實質(zhì)上不結(jié)合。 本發(fā)明中可使用的抗體的抗腫瘤活性，可以如下所述，通過研究在體內(nèi)對荷癌動物的腫瘤增殖的抑制，或者通過研究在體外對表達該多肽的腫瘤細胞是否顯示介由免疫細胞或補體的細胞毒活性，來進行評價。進一步地，本發(fā)明中作為癌的治療和/或預(yù)防的對象的受試者是人、寵物、家畜類、競技用動物等哺乳動物，優(yōu)選的受試者是人。以下對于與本發(fā)明相關(guān)的抗原的制備、抗體的制備、以及藥物組合物進行說明。<抗體制備用抗原的制備>作為用于獲取本發(fā)明中使用的針對CAPRIN-I的抗體的致敏抗原使用的蛋白質(zhì)或其片段，可以源自人、狗、牛、馬、小鼠、大鼠、雞等，對成為其來源的動物種類沒有限制。但是優(yōu)選考慮與在細胞融合中使用的母細胞的適合性來選擇該蛋白質(zhì)或其片段，一般來說，優(yōu)選源于哺乳動物的蛋白質(zhì)，特別優(yōu)選源于人的蛋白質(zhì)。例如當(dāng)CAPRIN-I是人CAPRIN-I時，可以使用人CAPRIN-I蛋白質(zhì)和/或其部分肽、表達人CAPRIN-I的細胞等。人CAPRIN-I和其同源物的堿基序列和氨基酸序列例如可以通過訪問GenBank(美國 NCBI)，利用 BLAST、FASTA 等的算法(Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,90 :5873-5877,1993 ；Altschul et al. ,Nucleic Acids Res. 25 :3389-3402,1997)來得到。在本發(fā)明中，當(dāng)以人CAPRIN-I的堿基序列(序列編號I或3)或氨基酸序列(序列編號2或4)為基準時，包含與它們的ORF或成熟部分的堿基序列或氨基酸序列具有70% 100%、優(yōu)選80% 100%、更優(yōu)選90% 100%、進一步優(yōu)選95% 100%、例如97% 100%、98% 100%、99% 100%或99. 5% 100%的序列同一性的序列的核酸或蛋白質(zhì)成為靶。這里，序列同一性”是將2個序列在導(dǎo)入間隙或不導(dǎo)入間隙的情況下以形成最大的類似度的方式比對(對齊)時，相同氨基酸(或堿基)相對于氨基酸(或堿基)的總數(shù)的百分比(％)。CAPRIN-I蛋白質(zhì)的片段具有從作為抗體識別的最小單位的表位(抗原決定簇)的氨基酸長度、至小于該蛋白質(zhì)的全長的長度。表位是指在哺乳動物、優(yōu)選人中具有抗原性或免疫原性的多肽片段，其最小單位包含約7 12個氨基酸、例如8 11個氨基酸。因此，本發(fā)明的抗體的特征在于，識別包含序列編號37所示的氨基酸序列、或與該氨基酸序列具有80%以上、優(yōu)選85%以上、更優(yōu)選90%以上、進一步優(yōu)選95%以上的序列同一性的氨基酸序列中的約7 12個氨基酸、例如8 11個氨基酸的片段(作為具體例，為在序列編號37的氨基酸序列中含有的、序列編號69或序列編號70所示的氨基酸序列等)。上述的含有人CAPRIN-I蛋白質(zhì)和/或其部分肽的多肽可以按照例如Fmoc法(芴基甲基氧基羰基法)、tBoc法(叔丁基氧基羰基法)等的化學(xué)合成法進行合成(日本生化學(xué)會編、生化學(xué)實驗講座I、夕 > 八々質(zhì)O化學(xué)(蛋白質(zhì)的化學(xué))IV、化學(xué)修飾m F合成(化學(xué)修飾和肽合成)、東京化學(xué)同人(日本)、1981年)。另外，也可以利用各種市售的肽合成儀通過常規(guī)方法進行合成。另外，使用公知的基因工程學(xué)方法(SambiX)Ok等，MolecularCloning,第2版，Current Protocols in Molecular Biology(1989),Cold Spring HarborLaboratory Press、Ausubel 等，Short Protocols in Molecular Biology,第 3 版，Acompendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology(1995), JohnWiley & Sons等)，制備編碼上述多肽的多核苷酸，將該多核苷酸整合到表達載體中并導(dǎo)入宿主細胞，在該宿主細胞中生產(chǎn)多肽，由此可以得到目的多肽。編碼上述多肽的多核苷酸可以通過公知的基因工程學(xué)方法和/或使用了市售的核酸合成儀的常規(guī)方法來容易地制備。例如含有序列編號I的堿基序列的DNA可以通過使用人染色體DNA或cDNA文庫作為模板、使用以可擴增序列編號I中記載的堿基序列的方式設(shè)計的一對引物進行PCR來制備。PCR的反應(yīng)條件可以適當(dāng)設(shè)定，可以列舉例如，使用耐熱性DNA聚合酶(例如Taq聚合酶、Pfu聚合酶等)和含有Mg2+的PCR緩沖液，將包含在94°C保持30秒(變性)、在55°C保持30秒 I分鐘(退火)、在72°C保持2分鐘(延伸)的反應(yīng) 過程作為I個循環(huán)，例如進行30個循環(huán)后，在72°C反應(yīng)7分鐘的條件等，但不限定于此。對于PCR 的方法、條件等,例如記載于 Ausubel 等,Short Protocols in Molecular Biology,第3版,A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology(1995),John Wiley & Sons (特別是第 15 章)中。另外，基于本說明書中的序列表的序列編號I 30所示的堿基序列和氨基酸序列的信息，制備合適的探針和/或引物，使用該探針和/或引物來對人等的cDNA文庫進行篩選，由此可以分離所需的DNA。cDNA文庫優(yōu)選由表達序列編號2 30中偶數(shù)的序列編號的蛋白質(zhì)的細胞、器官或組織來制備。這樣的細胞或組織的例子是源于睪丸、白血病、乳癌、淋巴瘤、腦瘤、肺癌、大腸癌等的癌或腫瘤的細胞或組織。上述探針或引物的制備、cDNA文庫的構(gòu)建、cDNA文庫的篩選、以及目的基因的克隆等的操作對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是已知的，可以按照例如Sambrook等，Molecular Cloning,第2版，Current Protocols in MolecularBiology (1989)、Ausbel等(上述)等中記載的方法來進行。由這樣所得的DNA,可以得到編碼人CAPRIN-I蛋白質(zhì)或其部分肽的DNA。作為上述宿主細胞，只要是可表達上述多肽的細胞，就可以是任意的細胞，作為原核細胞的例子可以列舉大腸桿菌等，作為真核細胞的例子可以列舉猴腎臟細胞C0S1、中國倉鼠卵巢細胞CHO等的哺乳動物細胞、人胎兒腎臟細胞株HEK293、小鼠胚胎皮膚細胞株NIH3T3、芽殖酵母、裂殖酵母等的酵母細胞、蠶細胞、爪蟾卵細胞等，但不限于此。當(dāng)使用原核細胞作為宿主細胞時，作為表達載體，使用具有能在原核細胞中復(fù)制的起點、啟動子、核糖體結(jié)合部位、多克隆位點、終止子、抗藥性基因、營養(yǎng)缺陷型互補基因等的表達載體。作為大腸桿菌用表達載體，可以例示pUC系、pBluescriptII、pET表達系統(tǒng)、PGEX表達系統(tǒng)等。如果將編碼上述多肽的DNA整合到這樣的表達載體中，用該載體轉(zhuǎn)化原核宿主細胞后，培養(yǎng)所得的轉(zhuǎn)化體，則可以在原核宿主細胞中表達由上述DNA編碼的多肽。此時，也可以使該多肽作為與其他蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)來表達。當(dāng)使用真核細胞作為宿主細胞時，作為表達載體，使用具有啟動子、剪接區(qū)、多聚(A)添加部位等的真核細胞用表達載體。作為這種表達載體，可以例示pKAl、pCDM8、pSVK3、pMSG、pSVL、pBK-CMV、pBK-RSV、EBV 載體、pRS、pcDNA3、pYES2 等。與上述同樣地，如果將編碼上述多肽的DNA整合到這樣的表達載體中，用該載體轉(zhuǎn)化真核宿主細胞后，培養(yǎng)所得的轉(zhuǎn)化體，則可以在真核宿主細胞中表達由上述DNA編碼的多肽。當(dāng)使用pIND/V5-His、pFLAG-CMV-2、pEGFP-Nl、pEGFP-Cl等作為表達載體時，可以作為附加了 His標簽(例如(His)6 (His)ltl)、FLAG標簽、myc標簽、HA標簽、GFP等各種標簽的融合蛋白質(zhì)，而表達上述多肽。表達載體向宿主細胞中的導(dǎo)入可以使用電穿孔法、磷酸鈣法、脂質(zhì)體法、DEAE葡聚糖法、顯微注射、病毒感染、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、與細胞膜透過性肽的結(jié)合等周知的方法。為了從宿主細胞中分離純化目標多肽，可以將公知的分離操作組合來進行?？梢粤信e例如，利用了脲等的變性劑和/或表面活性劑的處理、超聲波處理、酶消化、鹽析或溶劑分別沉淀法、透析、離心分離、超濾、凝膠過濾、SDS-PAGE、等電點電泳、離子交換色譜法、疏水色譜法、親和色譜法、反相色譜法等，但不限于此。
<抗體的結(jié)構(gòu)> 抗體通常是至少含有2條重鏈和2條輕鏈的雜多聚體糖蛋白質(zhì)。IgM是不同的，其是由2條相同的輕(L)鏈和2條相同的重(H)鏈構(gòu)成的約150kDa的雜四聚體糖蛋白質(zhì)。典型地，各個輕鏈通過I個二硫共有鍵與重鏈連接，但各種免疫球蛋白同種型的重鏈間的二硫鍵的數(shù)目有變化。各個重鏈和輕鏈還具有鏈內(nèi)二硫鍵。各個重鏈在一端具有可變區(qū)(VH區(qū))，在該端部幾個恒定區(qū)與其連接。各個輕鏈具有可變區(qū)(VL區(qū))，在其相反的端具有I個恒定區(qū)。輕鏈的恒定區(qū)與重鏈最初的恒定區(qū)對齊，且輕鏈可變區(qū)與重鏈的可變區(qū)對齊?？贵w的可變區(qū)通過特定區(qū)域表現(xiàn)被稱為互補性決定區(qū)(CDR)的特定的可變性，從而賦予抗體以結(jié)合特異性?？勺儏^(qū)的相對保守的部分被稱為框架區(qū)(FR)。完整的重鏈和輕鏈的可變區(qū)分別含有通過3個⑶R連接的4個FR。3個⑶R在重鏈中從其N末端依次被稱為⑶RH1、⑶RH2、⑶RH3，同樣在輕鏈中被稱為⑶RL1、⑶RL2、⑶RL3。在抗體對抗原的結(jié)合特異性中，CDRH3最為重要。另外，各鏈的CDR通過FR區(qū)以接近的狀態(tài)被保持在一起，與來自其他鏈的CDR—同有助于抗體的抗原結(jié)合部位的形成。恒定區(qū)不直接有助于抗體與抗原結(jié)合，但表現(xiàn)各種效應(yīng)器功能，例如、對抗體依賴性細胞性細胞毒活性(ADCC)的參與、介由對Fe Y受體的結(jié)合而產(chǎn)生的吞噬作用、介由新生兒Fe受體(FcRn)的半衰期/清除速度、介由補體級聯(lián)的Clq構(gòu)成要素的補體依賴性細胞毒(CDC)。<抗體的制備>本發(fā)明的抗CAPRIN-I抗體是指與CAPRIN-I蛋白質(zhì)的全長或其片段具有免疫反應(yīng)性的抗體。這里，“免疫反應(yīng)性”是指在體內(nèi)抗體與CAPRIN-I抗原結(jié)合的特性，介由這種結(jié)合可以發(fā)揮損傷(例如、殺死、抑制或縮小)腫瘤的功能。即，本發(fā)明中使用的抗體只要能夠與CAPRIN-I蛋白質(zhì)結(jié)合而損傷腫瘤、例如白血病、淋巴瘤、乳癌、腦瘤、肺癌、食道癌、胃癌、腎癌、大腸癌等，則不問其種類。抗體的例子包含單克隆抗體、多克隆抗體、合成抗體、多特異性抗體、人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、抗體片段(例如Fab、F(ab’)2)等。另外，抗體是免疫球蛋白分子的任意類、例如IgG、IgE、IgM、IgA、IgD和IgY,或任意亞類、例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl、IgA2 等。
抗體進而除了糖基化以外，也可以通過乙?；?、甲?；?、酰胺化、磷酸化、或聚乙二醇(PEG)化等被修飾。以下顯示各種抗體的制備例?？贵w為單克隆抗體時，例如將表達CAPRIN-I的乳癌細胞株SK-BR-3等施與小鼠而進行免疫，從該小鼠取出脾臟，將細胞分離，然后使該細胞與小鼠骨髓瘤細胞融合，從所得的融合細胞(雜交瘤)中選擇產(chǎn)生具有癌細胞增殖抑制作用的抗體的克隆。將產(chǎn)生具有癌細胞增殖抑制作用的單克隆抗體的雜交瘤分離，培養(yǎng)該雜交瘤，利用普通的親和純化法從培養(yǎng)上清中純化抗體，由此可進行制備。產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤例如也可以如下地制備。首先，按照公知的方法，用致敏抗原對動物進行免疫。作為一般的方法，可以通過將致敏抗原向哺乳動物的腹腔內(nèi)或皮下注射來進行。具體來說，可以將致敏抗原利用PBS(磷酸鹽緩沖液，Phosphate-BufferedSaline)、生理鹽水等稀釋成合適量、進行懸浮，在所得的的液體中根據(jù)需要適量混合通常 的佐劑、例如弗氏完全佐劑，乳化后，每4 21天對哺乳動物施與數(shù)次。另外，致敏抗原免疫時也可以使用合適的載體。這樣將哺乳動物免疫，確認在血清中所需的抗體水平升高，然后從哺乳動物收集免疫細胞，進行細胞融合，作為優(yōu)選的免疫細胞特別可以列舉脾細胞。作為與上述免疫細胞融合的其它母細胞，使用哺乳動物的骨髓瘤細胞。該骨髓瘤細胞可以優(yōu)選使用公知的各種細胞株、例如P3U1 (P3-X63Ag8Ul)、P3 (P3x63Ag8. 653)(J. Tmmunol. (1979) 123,1548-1550)>P3x63Ag8U. I(Current Topics in Microbiology andImmunology (1978)81,1-7)、NS-I(Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Tmmunol· (1976)6，511-519)、MPC-Il(Margulies. D.H.et al.，Cell(1976)8,405-415)、SP2/0(Shulman,M. et al.，Nature (1978) 276,269-270)、FO (deSt. Groth，S. F. et al. , J. Immunol.Methods(1980)35，1-21)、S194(Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. (1978) 148,313-323)、R210(Galfre, G. et al.，Nature (1979) 277，131-133)等。上述免疫細胞與骨髓瘤細胞的細胞融合基本上可以按照公知的方法、例如Kohler和 Milstein 等的方法(Kohler, G. and Milstein, C. Methods EnzymoI. (1981)73,3-46)等來進行。更具體地，上述細胞融合例如可在細胞融合促進劑的存在下、在通常的營養(yǎng)培養(yǎng)液中實施。作為融合促進劑，可以使用例如聚乙二醇(PEG)、仙臺病毒(HVJ)等，進而根據(jù)需要為了提高融合效率，還可以添加使用二甲基亞砜等的助劑。免疫細胞與骨髓瘤細胞的使用比例可以任意地設(shè)定。例如優(yōu)選使免疫細胞相對于骨髓瘤細胞為I 10倍。作為上述細胞融合中使用的培養(yǎng)液，可以使用例如，對于上述骨髓瘤細胞株的增殖合適的轉(zhuǎn)/分鐘11640培養(yǎng)液、MEM培養(yǎng)液，其他可以在這種細胞培養(yǎng)中使用的通常的培養(yǎng)液，進一步也可以合并使用胎牛血清(FCS)等的血清補液。細胞融合是將規(guī)定量的上述免疫細胞和骨髓瘤細胞在上述培養(yǎng)液中充分混合，將預(yù)先加熱至37°C左右的PEG溶液(例如平均分子量1000 6000左右)以通常30 60%(w/v)的濃度添加、混合，由此形成作為目的的雜交瘤。接著，反復(fù)進行逐漸添加合適的培養(yǎng)液、離心除去上清的操作，由此除去對于雜交瘤的發(fā)育不優(yōu)選的細胞融合劑等。這樣得到的雜交瘤可以通過在通常的選擇培養(yǎng)液、例如HAT培養(yǎng)液(含有次黃嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶脫氧核苷的培養(yǎng)液)中培養(yǎng)來選擇。上述HAT培養(yǎng)液中的培養(yǎng)持續(xù)對于除了作為目的的雜交瘤以外的細胞(非融合細胞)滅絕充分的時間(通常數(shù)天 數(shù)周)。然后，實施通常的有限稀釋法，進行產(chǎn)生目的抗體的雜交瘤的篩選和單克隆化。另外，除了對人以外的動物免疫抗原來得到上述雜交瘤以外，還可以將人淋巴細胞、例如感染了 EB病毒的人淋巴細胞在體外(in vitro)用蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)表達細胞或其溶解物致敏，使致敏淋巴細胞與來自人的具有永久分裂能力的骨髓瘤細胞、例如U266 (注冊編號TIB196)融合，得到產(chǎn)生具有所需活性(例如、細胞增殖抑制活性)的人抗體的雜交瘤。這樣制備的產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤可以在通常的培養(yǎng)液中傳代培養(yǎng)，另外，可在液氣中長期保存。S卩，使用所需抗原或表達所需抗原的細胞作為致敏抗原，按照通常的免疫方法將其免疫，將所得的免疫細胞利用通常的細胞融合法與公知的母細胞融合，利用通常的篩選 法通過對單克隆抗體產(chǎn)生細胞(雜交瘤)進行篩選來制備。本發(fā)明中可使用的抗體的其它例子是多克隆抗體。多克隆抗體可以例如如下地得到。用天然的CAPRIN-I蛋白質(zhì)、或作為與GST等的融合蛋白質(zhì)而在大腸桿菌等微生物中表達的重組CAPRIN-I蛋白質(zhì)、或其部分肽對小鼠、產(chǎn)生人抗體的小鼠、兔等小動物進行免疫,得到血清。通過將該血清利用例如硫酸銨沉淀、蛋白質(zhì)A、蛋白質(zhì)G柱、DEAE離子交換色譜、偶聯(lián)有CAPRIN-I蛋白質(zhì)或合成肽的親和柱等進行純化來制備。這里，作為產(chǎn)生人抗體的小鼠，已知例如KM小鼠(3MJ > 7 7 — /Medarex)和Xeno小鼠(Amgen)(例如國際公開第W002/43478號、國際公開第W002/092812號等)。將這種小鼠用CAPRIN-I蛋白質(zhì)或其片段進行免疫時，可以由血液得到完全人多克隆抗體。另夕卜，可以從免疫后的小鼠中取出脾臟細胞，利用與骨髓瘤細胞的融合法制備人型單克隆抗體。抗原的調(diào)制可以根據(jù)使用了動物細胞的方法(日本特表2007-530068)或使用了桿狀病毒的方法(例如國際公開第W098/46777號等)等來進行。當(dāng)抗原的免疫原性低時，使其與白蛋白等具有免疫原性的巨大分子結(jié)合而進行免疫即可。此外，可以使用基因重組型抗體，該基因重組型抗體通過將抗體基因由雜交瘤克隆，整合到合適的載體中，并將其導(dǎo)入宿主，使用基因重組技術(shù)而產(chǎn)生(參照例如Carl，A. K. Borrebaeck, James,ff. Larrick,THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES,Published inthe United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990)。具體來說，由雜交瘤的 mRNA使用逆轉(zhuǎn)錄酶來合成抗體的可變區(qū)(V區(qū))的cDNA。如果可得到編碼目的抗體的V區(qū)的DNA，則將其與編碼所需的抗體恒定區(qū)(C區(qū))的DNA連接，將連接產(chǎn)物整合到表達載體中?；蛘咭部梢詫⒕幋a抗體的V區(qū)的DNA整合到含有抗體C區(qū)的DNA的表達載體中。以在表達控制區(qū)域、例如增強子、啟動子的控制下表達的方式整合到表達載體中。接著可以用該表達載體轉(zhuǎn)化宿主細胞，使抗體表達。本發(fā)明的抗CAPRIN-I抗體優(yōu)選是單克隆抗體。但也可以是多克隆抗體、轉(zhuǎn)基因抗體(嵌合抗體、人源化抗體等)等。單克隆抗體包含人單克隆抗體、非人的動物單克隆抗體(例如小鼠單克隆抗體、大鼠單克隆抗體、兔單克隆抗體、雞單克隆抗體等)、嵌合型單克隆抗體等。單克隆抗體可以通過培養(yǎng)雜交瘤來制備，所述雜交瘤通過將來自用CAPRIN-I蛋白質(zhì)免疫的非人哺乳動物(例如小鼠、產(chǎn)生人抗體的小鼠、雞、兔等)的脾細胞與骨髓瘤細胞的融合來得到。嵌合型抗體是將來自不同動物的序列組合而制備的抗體，例如是包含小鼠抗體的重鏈、輕鏈的可變區(qū)和人抗體的重鏈、輕鏈的恒定區(qū)的抗體等。嵌合抗體的制備可以使用公知的方法來進行，例如可以通過將編碼抗體V區(qū)的DNA和編碼人抗體C區(qū)的DNA連接，將其整合到表達載體中并導(dǎo)入宿主，而使其產(chǎn)生，從而得到。在下述的實施例中，制備人-雞嵌合型單克隆抗體，并確認了抗腫瘤效果。這些單克隆抗體包含具有序列編號43的氨基酸序列的重鏈可變(VH)區(qū)、和具有序列編號47的氨基酸序列的輕鏈可變(VL)區(qū)，其中，在該VH區(qū)包含由序列編號40的氨基酸序列表示的CDRl、由序列編號41的氨基酸序列表示的CDR2和由序列編號42的氨基酸序列表示的CDR3，該VL區(qū)域包含由序列編號44的氨基酸序列表示的CDRl、由序列編號45的氨基酸序列表示的CDR2和由序列編號46的氨基酸序列表示的CDR3。多克隆抗體包含對產(chǎn)生人抗體的動物(例如小鼠)用CAPRIN-I蛋白質(zhì)免疫而 得到的抗體。人源化抗體是也稱為重構(gòu)(reshaped)人抗體的改變抗體。人源化抗體通過將來自免疫動物的抗體的CDR移植到人抗體的互補性決定區(qū)中來構(gòu)建。其一般的基因重組方法也是已知的。具體來說，利用PCR法由以末端部具有重疊部分的方式制備的數(shù)個寡核苷酸合成DNA序列，該DNA序列是以將小鼠抗體或雞抗體的CDR和人抗體的框架區(qū)(frameworkregion ；FR)連結(jié)的方式設(shè)計的。將所得的DNA與編碼人抗體恒定區(qū)的DNA連接,接著整合到表達載體中，將其導(dǎo)入宿主而使其產(chǎn)生，從而得到(參照歐洲專利申請公開第EP239400號、國際公開第W096/02576號)。經(jīng)由⑶R連接的人抗體的FR可以選擇形成互補性決定區(qū)良好的抗原結(jié)合部位的FR。根據(jù)需要，也可以替換抗體的可變區(qū)中的框架區(qū)的氨基酸，以形成重構(gòu)人抗體的互補性決定區(qū)合適的抗原結(jié)合部位(Sato K. et al. , Cancer Research1993,53 :851-856) 0另外，也可以替換為各種來自人抗體的框架區(qū)(參考國際公開第W099/51743 號)。經(jīng)由CDR連結(jié)的人抗體的框架區(qū)可以選擇形成互補性決定區(qū)良好的抗原結(jié)合部位的框架區(qū)。根據(jù)需要，也可以替換抗體的可變區(qū)中的框架區(qū)的氨基酸，以形成重構(gòu)人抗體的互補性決定區(qū)合適的抗原結(jié)合部位(Sato K. et al. , Cancer Research 1993, 53 851-856)。在制備嵌合抗體或人源化抗體后，可以將可變區(qū)(例如FR)和/或恒定區(qū)中的氨
基酸用其它氨基酸替換等。氨基酸的替換例如是小于15個、小于10個、8個以下、7個以下、6個以下、5個以下、4個以下、3個以下、或2個以下的氨基酸、優(yōu)選I 5個氨基酸、更優(yōu)選I或2個氨基酸
的替換，替換抗體與未替換抗體應(yīng)在功能上等同。期望替換是保守的氨基酸替換，這是電荷、側(cè)鏈、極性、芳香族性等性質(zhì)類似的氨基酸間的替換。性質(zhì)類似的氨基酸例如可以分類為堿性氨基酸(精氨酸、賴氨酸、組氨酸)、酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)、無電荷極性氨基酸(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸)、無極性氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸、丙氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸)、支鏈氨基酸(蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、組氨酸)等。作為抗體修飾物，可以列舉例如與聚乙二醇(PEG)等各種分子結(jié)合的抗體。在本發(fā)明的抗體修飾物中，不限定結(jié)合的物質(zhì)。為了得到這樣的抗體修飾物，可以通過對所得的抗體實施化學(xué)修飾來得到。這些方法在本領(lǐng)域已經(jīng)被確立。這里，“在功能上等同”是指成為對象的抗體與本發(fā)明的抗體具有同樣的生物學(xué)或生物化學(xué)的活性，具體來說，是指具有損傷腫瘤的功能、以及在對人應(yīng)用時本質(zhì)上不發(fā)生排斥反應(yīng)等。作為這樣的活性，可以列舉例如細胞增殖抑制活性、或結(jié)合活性。作為用于調(diào)制與某多肽在功能上等同的多肽的本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法，已知有在多肽中導(dǎo)入突變的方法。例如只要是本領(lǐng)域技術(shù)人員，就可以使用定點誘變法(Hashimoto-Gotoh，T. et al.，(1995) Gene 152，271-275、Zoller，MJ.，and Smith,Μ. (1983)Methods Enzymol. 100, 468-500、Kramer, W. et al. , (1984) Nucleic AcidsRes.12,9441-9456、Kramer, ff. and Fritz, HJ. , (1987)Methods EnzymoI. 154,350-367、 Kunkel, TA.，(1985)Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82,488-492、Kunkel (1988) MethodsEnzymoI. 85，2763-2766)等，在本發(fā)明的抗體中導(dǎo)入適當(dāng)?shù)耐蛔儯纱酥苽渑c該抗體在功能上等同的抗體。識別由上述抗CAPRIN-I抗體所識別的CAPRIN-I蛋白質(zhì)的表位的抗體，可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法得到。例如，可以通過下述方法等來得到通過通常的方法(例如表位作圖(epitope mapping)等)確定由抗CAPRIN-I抗體識別的CAPRIN-I蛋白質(zhì)的表位，以具有該表位中所含的氨基酸序列的多肽為免疫原來制作抗體的方法；通過通常的方法確定制作的抗體的表位，選擇表位與抗CAPRIN-I抗體相同的抗體的方法等。這里，“表位”是指在哺乳動物、優(yōu)選人中具有抗原性或免疫原性的多肽片段，其最小單位包含約7 12個氨基酸、優(yōu)選8 11個氨基酸。本發(fā)明的抗體的親和常數(shù)KaQwXff)優(yōu)選至少為IO7M'至少為IO8M'至少為5 X IO8M'至少為IO9M'至少為5 X IO9M'至少為IOiqM'至少為5 X IOiqM'至少為IO11M'至少為5 X IO11M'至少為IO12M'或者至少為IO13M'本發(fā)明的抗體可以與抗腫瘤劑結(jié)合?？贵w與抗腫瘤劑的結(jié)合可以經(jīng)由具有與氨基、竣基、輕基、硫醇基等為反應(yīng)性的基團(例如、玻拍酸亞胺基、甲酸基、2_批唳基_■硫基、馬來酰亞胺基、烷氧基羰基、羥基等)的間隔物來進行。抗腫瘤劑的例子包含文獻等中記載的公知的下述抗腫瘤劑，即，紫杉醇、多柔比星、柔紅霉素、環(huán)磷酰胺、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、噻替哌、白消安、英丙舒凡、哌泊舒凡、benzodopa、卡波醌、meturedopa、uredopa、六甲蜜胺(altretamine)、三亞乙基三聚氰胺、三亞乙基磷酰胺、三亞乙基硫代磷酰胺(triethilenethiophosphoramide)、三輕甲基三聚氰胺(trimethyIolomelamine)、布拉他辛、布拉他辛酮、喜樹堿、苔蘚蟲素、海綿多聚乙酉先(callystatin)、cryptophycinl、cryptophycin8、海兔毒素(dolastatin)、倍癌霉素(duocarmycin)、艾槽塞洛素(eleutherobin)、水鬼蕉堿(pancratistatin)、匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)、spongistatin、苯丁酸氮芥、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀、異環(huán)磷酰胺、甲氮芥、鹽酸甲氧氮芥、美法侖、新氮芥(novembichin)、苯芥膽留醇(phenesterine)、潑尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、烏拉莫司汀、卡莫司汀、氯乙鏈脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀、卡奇霉素(calicheamicin)、達內(nèi)霉素(dynemicin)、氯屈膦酸、埃斯培拉霉素(esperamicin)、阿克拉霉素、放線菌素、安曲霉素(authramycin)、重氮絲氨酸、博來霉素、放線菌素C(cactinomycin)、卡柔比星(carabicin)、洋紅霉素、嗜癌菌素(carzinophilin)、色霉素、更生霉素、detorbicin、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素(adriamycin)、表柔比星、依索比星、伊達比星、麻西羅霉素(marcel Iomycin)、絲裂霉素C、霉酹酸(mycophenolic acid)、諾加霉素(nogalamycin)、橄欖霉素(olivomycins)、培洛霉素、甲基絲裂霉素(potf iromycin)、嘌呤霉素、三鐵阿霉素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素、鏈佐星、殺結(jié)核菌素(tubercidin)、烏苯美司、凈司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)、
二甲葉酸(denopterin)、蝶羅呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)、氟達拉濱(fludarabine)、6_巰嘌呤、硫咪嘌呤、硫鳥嘌呤、安西他濱、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮雜尿苷(azauridine)、卡莫氟、阿糖胞苷、二脫氧尿苷、去氧氟尿苷、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷(f Ioxuridine);雄激素類、例如卡普睪酮(calusterone)、屈 他雄酮丙酸酯、環(huán)硫雄醇、美雄烷、睪內(nèi)酮(testolactone)、氨魯米特、米托坦、曲洛司坦、亞葉酸(frolinic acid)、醋葡醒內(nèi)酯、醒磷酰胺糖苷、氨基乙酰丙酸、恩尿卩密唳(eniluracil)、安口丫 P定(amsacrine)、阿莫司汀(bestrabucil)、比生群(bisantrene)、依達曲沙(edatraxate)、defofamine、秋水仙胺(demecolcine)、地卩丫酉昆(diaziquone)、依氟鳥氨酸(elfornithine)、依利醋銨(elIiptinium)、埃博霉素(epothilone)、依托格魯(etoglucid)、香苑多糖、氯尼達明(Ionidamine)、美登素(maytansine)、安絲菌素(ansamitocine)、米托胍腙(mitoguazone)、米托蒽醌、mopidanmol、二胺硝 B丫 P定nitraerine、噴司他丁、蛋氨氮芥(phenamet)、卩比柔比星、洛索蒽酉昆(Iosoxantrone)、足葉草酸(podophyllinic acid)、2_乙基酰肼、甲節(jié)肼、雷佐生(razoxane)、根瘤菌素(rhizoxin)、西佐喃、錯螺胺(spirogermanium)、細交鏈抱菌酮酸(tenuazonic acid)、三乙撐亞胺苯醌(triaziquone)、桿孢菌素(roridine)A、蛇形菌素(anguidine)、聚氨酯、長春地辛、達卡巴嗪、甘露醇氮芥(mannomustine)、二溴甘露醇、二溴衛(wèi)矛醇(mitolactol)、哌泊溴燒(pipobroman)、gacytosine、多西他賽、瘤可寧、吉西他濱(gemcitabine)、6_硫鳥嘌呤、巰嘌呤、順鉬、奧沙利鉬、卡波鉬、長春堿、足葉乙甙、異環(huán)磷酰胺、米托葸醌、長春新堿、長春瑞濱、諾消靈(novantrone)、替尼泊苷、依達曲沙(edatrexate)、道諾霉素、氨蝶呤、希羅達(xeloda)、伊班膦酸鹽(ibandronate)、伊立替康、拓撲異構(gòu)酶抑制劑、二氟甲基鳥氨酸(DMFO)、視黃酸、卡培他濱(capecitabine)、以及它們的藥學(xué)上可接受的鹽或衍生物。另外，通過將本發(fā)明的抗體、和抗腫瘤劑合并使用施與，可以得到更高的治療效果。本方法對CAPRIN-I表達的癌患者，在外科的手術(shù)前后的任一者都可以適用。特別地，通過在手術(shù)后應(yīng)用，對目前用抗腫瘤劑單獨處理的CAPRIN-I表達的癌癥，可以得到更好的癌復(fù)發(fā)防止和/或生存時間的延長。作為可與本發(fā)明的抗體合并使用施與的抗腫瘤劑的例子，包含文獻等中公知的下述抗腫瘤劑，即，紫杉醇、多柔比星、柔紅霉素、環(huán)磷酰胺、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧唆、噻替哌、白消安、英丙舒凡、哌泊舒凡、benzodopa、卡波醌、meturedopa、uredopa、六甲蜜胺(altretamine)、三亞乙基三聚氰胺、三亞乙基磷酰胺、三亞乙基硫代磷酰胺(triethilenethiophosphoramide)、三輕甲基三聚氰胺(trimethyIoIomeIamine)、布拉他辛、布拉他辛酮、喜樹堿、苔蘚蟲素、海綿多聚乙酰(callystatin)、cryptophycinl、cryptophycin8> 海兔毒素(dolastatin)、倍癌霉素(duocarmycin)、艾槽塞洛素(eleutherobin)、水鬼蕉喊(pancratistatin)、匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)、spongistatin、苯丁酸氮芥、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷酉先胺(cholophosphamide)、雌莫司汀、異環(huán)磷酰胺、甲氮芥、鹽酸甲氧氮芥、美法侖、新氮芥(novembichin)、苯芥膽留醇(phenesterine)、潑尼莫司汀(prednimustine)、曲憐胺(trofosfamide)、烏拉莫司汀、卡莫司汀、氯乙鏈脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀、卡奇霉素(calicheamicin)、達內(nèi)霉素(dynemicin)、氯屈膦酸、埃斯培拉霉素(esperamicin)、阿克拉霉素、放線菌素、安曲霉素(authramycin)、重氮絲氨酸、博來霉素、放線菌素C(cactinomycin)、卡柔比星(carabicin)、洋紅霉素、嗜癌菌素(carzinophilin)、色霉素、更生霉素、detorbicin、6_重氮基_5_氧代-L-正亮氨酸、阿霉素(adriamycin)、表柔比星、依索比星、伊達比星、麻西羅霉素(marcelIomycin)、絲裂霉 素 C、霉酌·酸(mycophenolic acid)、諾加霉素(nogalamycin)、橄欖霉素(olivomycins)、培洛霉素、甲基絲裂霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三鐵阿霉素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素、鏈佐星、殺結(jié)核菌素(tubercidin)、烏苯美司、凈司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)、二甲葉酸(denopterin)、蝶羅呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)、氟達拉濱(fludarabine)、6_巰嘌呤、硫咪嘌呤、硫鳥嘌呤、安西他濱、阿扎胞苷(azacitidine)、6_氮雜尿苷(azauridine)、卡莫氟、阿糖胞苷、二脫氧尿苷、去氧氟尿苷、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷(f Ioxuridine)、卡普睪酮(calusterone)、屈他雄酮丙酸酯、環(huán)硫雄醇、美雄燒、睪內(nèi)酮(testolactone)、氨魯米特、米托坦、曲洛司坦、亞葉酸(frolinic acid)、醋葡醒內(nèi)酯、醒磷酰胺糖苷、氨基乙酰丙酸、恩尿卩密唳(eniluracil)、安口丫 P定(amsacrine)、阿莫司汀(bestrabucil)、比生群(bisantrene)、依達曲沙(edatraxate)、defofamine、秋水仙胺(demecolcine)、地卩丫醌(diaziquone)、依氟鳥氨酸(elfornithine)、依利醋銨(elIiptinium)、埃博霉素(epothilone)、依托格魯(etoglucid)、香苑多糖、氯尼達明(Ionidamine)、美登素(maytansine)、安絲菌素(ansamitocine)、米托胍腙(mitoguazone)、米托蒽醌、mopidanmol、二胺硝 B丫 P定nitraerine、噴司他丁、蛋氨氮芥(phenamet)、卩比柔比星、洛索蒽酉昆(Iosoxantrone)、足葉草酸(podophyllinic acid)、2_乙基酰肼、甲節(jié)肼、雷佐生(razoxane)、根瘤菌素(rhizoxin)、西佐喃、錯螺胺(spirogermanium)、細交鏈抱菌酮酸(tenuazonic acid)、三乙撐亞胺苯醌(triaziquone)、桿孢菌素(roridine)A、蛇形菌素(anguidine)、聚氨酯、長春地辛、達卡巴嗪、甘露醇氮芥(mannomustine)、二溴甘露醇、二溴衛(wèi)矛醇(mitolactol)、哌泊溴燒(pipobroman)、gacytosine、多西他賽、瘤可寧、吉西他濱(gemcitabine)、6_硫鳥嘌呤、巰嘌呤、順鉬、奧沙利鉬、卡波鉬、長春堿、足葉乙甙、異環(huán)磷酰胺、米托葸醌、長春新堿、長春瑞濱、諾消靈(novantrone)、替尼泊苷、依達曲沙(edatrexate)、道諾霉素、氨蝶呤、希羅達(xeloda)、伊班膦酸鹽(ibandronate)、伊立替康、拓撲異構(gòu)酶抑制劑、二氟甲基鳥氨酸(DMFO)、視黃酸、卡培他濱(capecitabine)、以及它們的藥學(xué)上可接受的(公知的)鹽或(公知的)衍生物。上述中，特別優(yōu)選使用環(huán)磷酰胺、紫杉醇、多西他賽、長春瑞濱。 或者，在本發(fā)明的抗體中，也可以結(jié)合文獻等中公知的211At、mI、125I、9°Y、186Re、188Re、153SM、212Bi、32p、175LU、176LU等放射性同位素。放射性同位素期望是可有效地用于治療或診斷腫瘤的同位素。本發(fā)明的抗體是與CAPRIN-I具有免疫反應(yīng)性的抗體、特異性地識別CAPRIN-I的抗體、或者與CAPRIN-I特異性地結(jié)合的抗體，是顯示對癌的細胞毒活性、或腫瘤增殖抑制作用的抗體。該抗體應(yīng)該是具有在施與該抗體的對象動物中能夠幾乎避免或完全避免產(chǎn)生排斥反應(yīng)的結(jié)構(gòu)的抗體。作為這樣的抗體，例如在對象動物為人時，可以列舉人抗體、人源化抗體、嵌合抗體(例如人-小鼠嵌合抗體)、單鏈抗體、雙特異性抗體等。這些抗體是重鏈和輕鏈的恒定區(qū)和可變區(qū)都源于人抗體的抗體；或重鏈和輕鏈的可變區(qū)中的互補性決定區(qū)(CDR1、CDR2和CDR3)源于非人的動物抗體，且框架區(qū)、以及重鏈和輕鏈的恒定區(qū)源于人抗體的抗體；或重鏈和輕鏈的可變區(qū)源于非人的動物抗體、且重鏈和輕鏈的恒定區(qū)源于人抗體的重組型抗體。優(yōu)選的抗體是前2種抗體。這些重組型抗體可以如下制備。由雜交瘤等產(chǎn)生抗體的細胞克隆編碼針對人CAPRIN-I的單克隆抗體(例如人單克隆抗體、小鼠單克隆抗體、大鼠單克隆抗體、兔單克隆抗體、雞單克隆抗體等)的DNA，將其作為模板利用RT-PCR法等來制備編碼該抗體的輕 鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的DNA,基于Kabat EU numbering system(Kabat等、Sequencesof Proteins of Immunological Interest,5th Ed. Public Health Service, NationalInstitute of Health, Bethesda, Md. (1991))來確定輕鏈和重鏈的各可變區(qū)的序列或各CDR1、CDR2、CDR3 的序列。進一步地，使用基因重組技術(shù)(Sambrook等，Molecular Cloning A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989))或 DNA 合成儀來制備編碼這些各可變區(qū)的DNA或編碼各CDR的DNA。其中，上述產(chǎn)生人單克隆抗體的雜交瘤可以通過在對產(chǎn)生人抗體的動物(例如小鼠)免疫人CAPRIN-I后，使從該免疫動物切除的脾細胞與骨髓瘤細胞融合來制備。另外，根據(jù)需要使用基因重組技術(shù)或DNA合成儀來制備編碼源于人抗體的輕鏈或重鏈的可變區(qū)和恒定區(qū)的DNA。對于人源化抗體的情況，制備將編碼源于人抗體的輕鏈或重鏈的可變區(qū)的DNA中的CDR編碼序列替換成與它們對應(yīng)的源于人以外的動物(例如小鼠、大鼠、雞等)的抗體的CDR編碼序列而得的DNA，將由此得到的DNA分別與編碼源于人抗體的輕鏈或重鏈的恒定區(qū)的DNA連接，由此可以制備編碼人源化抗體的DNA。對于嵌合抗體的情況，通過將編碼源于人以外的動物(例如小鼠、大鼠、雞等)的抗體的輕鏈或重鏈的可變區(qū)的DNA，分別與編碼源于人抗體的輕鏈或重鏈的恒定區(qū)的DNA連接，可以制備編碼嵌合抗體的DNA。對于單鏈抗體的情況，該抗體是將重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)通過接頭(linker)以直線狀連接而成的抗體，通過將編碼重鏈可變區(qū)的DNA、編碼接頭的DNA、和編碼輕鏈可變區(qū)的DNA結(jié)合，可以制備編碼單鏈抗體的DNA。其中，重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，任一者都源于人抗體，或者任一者都是人源抗體中僅CDR被源于人以外的動物(例如小鼠、大鼠、雞等)的抗體的CDR替換而得的。另外，接頭包含12 19個氨基酸，可以列舉例如15個氨基酸的(G4S) 3 (G.-B. Kim等，Protein Engineering Design and Selection 2007,20(9)425-432)。對于雙特異性抗體(diabody)的情況,該抗體是可與2個不同的表位特異性地結(jié)合的抗體，例如可以通過將編碼重鏈可變區(qū)A的DNA、編碼輕鏈可變區(qū)B的DNA、編碼重鏈可變區(qū)B的DNA、和編碼輕鏈可變區(qū)A的DNA以該順序進行結(jié)合(其中編碼輕鏈可變區(qū)B的DNA與編碼重鏈可變區(qū)B的DNA可通過編碼如上所述的接頭的DNA來結(jié)合)，來制備編碼雙特異性抗體的DNA。其中，重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)都源于人抗體，或者源于僅CDR被源于人以外的動物(例如小鼠、大鼠、雞等)的抗體的CDR替換而得的人抗體。將如上所述制備的重組DN A整合到I個或多個合適的載體中,將其導(dǎo)入宿主細胞(例如哺乳動物細胞、酵母細胞、昆蟲細胞等)，進行(共)表達，由此可以制備重組型抗體(P. J. Delves.，ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES.，1997 WILEY、P. Shepherdand C. Dean.，Monoclonal Antibodies.，2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS ；J. ff. Goding.,Monoclonal Antibodies !principles and practice. ,1993ACADEMIC PRESS)。由上述方法制備的本發(fā)明的抗體可以列舉例如以下(a) (f)的抗體。(a)包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的抗體，所述重鏈可變區(qū)包含序列編號40、41和42，所述輕鏈可變區(qū)包含序列編號44、45和46 (例如由序列編號43的重鏈可變區(qū)和序列編號47的輕鏈可變區(qū)構(gòu)成的抗體)。(b)包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的抗體，所述重鏈可變區(qū)包含序列編號48、49和50，所述輕鏈可變區(qū)包含序列編號52、53和54 (例如由序列編號51的重鏈可變區(qū)和序列編號55的輕鏈可變區(qū)構(gòu)成的抗體)。(c)包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的抗體，所述重鏈可變區(qū)包含序列編號56、57和58,所述輕鏈可變區(qū)包含序列編號60、61和62 (例如由序列編號59的重鏈可變區(qū)和序列編號63的輕鏈可變區(qū)構(gòu)成的抗體)。(d)包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的抗體，所述重鏈可變區(qū)包含序列編號73、74和75，所述輕鏈可變區(qū)包含序列編號77、78和79 (例如由序列編號76的重鏈可變區(qū)和序列編號80的輕鏈可變區(qū)構(gòu)成的抗體)。(e)包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的抗體，所述重鏈可變區(qū)包含序列編號81、82和83，所述輕鏈可變區(qū)包含序列編號85、86和87 (例如由序列編號84的重鏈可變區(qū)和序列編號88的輕鏈可變區(qū)構(gòu)成的抗體)。(f)包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的抗體，所述重鏈可變區(qū)包含序列編號89、90和91，所述輕鏈可變區(qū)包含序列編號93、94和95 (例如由序列編號92的重鏈可變區(qū)和序列編號96的輕鏈可變區(qū)構(gòu)成的抗體)。其中，序列編號40、41和42所示的氨基酸序列是雞抗體重鏈可變區(qū)的⑶R1XDR2和CDR3，另外，序列編號44、45和46所示的氨基酸序列分別是雞抗體輕鏈可變區(qū)的CDR1、CDR2和CDR3。另外，序列編號48,49和50、序列編號56，57和58、序列編號73,74和75、序列編號81、82和83、序列編號89、90和91所不的氣基酸序列是小鼠抗體重鏈可變區(qū)的CDR1、CDR2和CDR3。另外，序列編號52,53和54、序列編號60，61和62、序列編號77,78和79、序列編號85、86和87、序列編號93、94和95所示的氨基酸序列分別是小鼠抗體輕鏈可變區(qū)的 CDR1、CDR2 和 CDR3。另外，本發(fā)明的人源化抗體、嵌合抗體、單鏈抗體或雙特異性抗體例如是以下的抗體(用抗體(a)例示)。(i)重鏈的可變區(qū)包含序列編號40、41和42的氨基酸序列和源于人抗體的框架區(qū)的氨基酸序列，且輕鏈的可變區(qū)包含序列編號44、45和46的氨基酸序列和源于人抗體的框架區(qū)的氨基酸序列的抗體(例如，重鏈可變區(qū)中包含序列編號43的氨基酸序列、且輕鏈可變區(qū)中包含序列編號47的氨基酸序列的抗體)。(ii)重鏈的可變區(qū)包含序列編號40、41和42的氨基酸序列和源于人抗體的框架區(qū)的氨基酸序列，且重鏈的恒定區(qū)包含源于人抗體的氨基酸序列，以及輕鏈的可變區(qū)包含序列編號44、45和46的氨基酸序列和源于人抗體的框架區(qū)的氨基酸序列，且輕鏈的恒定區(qū)包含源于人抗體的氨基酸序列的抗體(例如，重鏈的可變區(qū)包含序列編號43的氨基酸序列，且重鏈的恒定區(qū)包含源于人抗體的氨基酸序列，以及輕鏈的可變區(qū)包含序列編號47的氨基酸序列，且輕鏈的恒定區(qū)包含源于人抗體的氨基酸序列的抗體)。并且，人抗體重鏈和輕鏈的恒定區(qū)和可變區(qū)的序列例如可以由NCBI (美國GenBank, UniGene等)獲得，例如對于人IgGl重鏈恒定區(qū)，可以參照注冊編號J00228的序列，對于人IgG2重鏈恒定區(qū)，可以參照注冊編號為J00230的序列，對于人IgG3重鏈恒定區(qū)，可以參照注冊編號為X03604的序列，對于人IgG4重鏈恒定區(qū)，可以參照注冊編號為K01316的序列，對于人輕鏈K恒定區(qū)，可以參照注冊編號為V00557、X64135、X64133等的 序列，對于人輕鏈λ恒定區(qū)，可以參照注冊編號為Χ64132、Χ64134等的序列。上述抗體優(yōu)選具有細胞毒活性，由此可以發(fā)揮抗腫瘤效果。另外，可以明確上述抗體中的重鏈和輕鏈的可變區(qū)、CDR的特定序列僅僅是用于例示，并不限于特定的序列。制備可產(chǎn)生針對人CAPRIN-I的其它人抗體或非人的動物抗體(例如小鼠抗體)的雜交瘤，回收由雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體，以與人CAPRIN-I的免疫結(jié)合性和細胞毒活性作為指標，來判定是否為目的抗體。由此識別目的的產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤后，如上所述，由該雜交瘤制備編碼目的抗體的重鏈和輕鏈的可變區(qū)的DNA，進行序列確定，將該DNA用于其他抗體的制備。進一步地，本發(fā)明的上述抗體只要具有特異性地識別CAPRIN-I這樣的特異性，則上述(a) (f)的各抗體的特別是框架區(qū)的序列和/或恒定區(qū)的序列中可以有I個或數(shù)個(優(yōu)選I或2個)氨基酸的替換、缺失或添加。其中，數(shù)個是指2 5個、優(yōu)選2個或3個。本發(fā)明進一步還提供編碼本發(fā)明的上述抗體的DNA、編碼上述抗體的重鏈或輕鏈的DNA、或編碼上述抗體的重鏈或輕鏈的可變區(qū)的DNA。例如在抗體(a)的情況下，這樣的DNA包含包含編碼序列編號40、41和42的氨基酸序列的堿基序列的、編碼重鏈可變區(qū)的DNA，包含編碼序列編號44、45和46的氨基酸序列的堿基序列的、編碼輕鏈可變區(qū)的DNA
坐寸ο由這些序列的DNA編碼的互補決定區(qū)(CDR)是決定抗體的特異性的區(qū)域，因此編碼抗體的這以外的區(qū)域(即，恒定區(qū)和框架區(qū))的序列可以是源于其它抗體的序列。這里，其它抗體也包含源于人以外的生物的抗體，但從降低副作用的觀點出發(fā)，優(yōu)選源于人的抗體。即，在上述DNA中，編碼重鏈和輕鏈的各框架區(qū)和各恒定區(qū)的區(qū)域優(yōu)選包含編碼源于人抗體的對應(yīng)氨基酸序列的堿基序列。進一步地，作為編碼本發(fā)明的抗體的DNA的其它例子，例如對于抗體(a)的情況，有包含編碼序列編號43的氨基酸序列的堿基序列的編碼重鏈可變區(qū)的DNA、編碼輕鏈可變區(qū)的區(qū)域含有編碼序列編號47的氨基酸序列的堿基序列的DNA等。這里，編碼序列編號43的氨基酸序列的堿基序列的例子是序列編號71的堿基序列。另外，編碼序列編號47的氨基酸序列的堿基序列的例子是序列編號72的堿基序列。在這些DNA中，編碼重鏈和輕鏈的各恒定區(qū)的區(qū)域優(yōu)選包含編碼源于人抗體的對應(yīng)氨基酸序列的堿基序列。本發(fā)明的DNA例如可以用上述的方法或以下的方法得到。首先，由與本發(fā)明的抗體相關(guān)的雜交瘤，使用市售的RNA提取試劑盒制備總RNA，使用隨機引物等通過逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA。接著通過使用在已知的小鼠抗體重鏈基因和輕鏈基因的各可變區(qū)中分別保存的序列的寡核苷酸作為引物的PCR法，擴增編碼抗體的cDNA。對于編碼恒定區(qū)的序列，可以通過利用PCR法擴增已知的序列來得到。DNA的堿基序列可以整合到序列確定用質(zhì)?；蚴删w中等通過常法來確定。認為本發(fā)明中使用的抗CAPRIN-I抗體對表達CAPRIN-I的癌細胞的抗腫瘤效果，是由表達CAPRIN-I的細胞的效應(yīng)器細胞抗體依賴的細胞毒性(ADCC)、或表達CAPRIN-I的細胞的補體依賴的細胞毒性(CDC)所引起的。因此，本發(fā)明中使用的抗CAPRIN-I抗體的活性評價，如以下實施例中具體所示的那樣，可以通過在體外對表達CAPRIN-I的癌細胞測定上述ADCC活性或⑶C活性來進行評價。 認為本發(fā)明中使用的抗CAPRIN-I抗體，與癌細胞上的CAPRIN-I蛋白質(zhì)結(jié)合，通過上述活性而表現(xiàn)抗腫瘤作用，因此在癌的治療或預(yù)防中是有用的。即，本發(fā)明提供以抗CAPRIN-I抗體為有效成分的、用于癌的治療和/或預(yù)防的藥物組合物。在將抗CAPRIN-I抗體以施與人體的目的(抗體治療)使用時，為了使免疫原性降低，優(yōu)選為人抗體和/或人源化抗體。并且，抗CAPRIN-I抗體與癌細胞表面上的CAPRIN-I蛋白質(zhì)的結(jié)合親和性越高，越可得到由抗CAPRIN-I抗體產(chǎn)生的更強的抗腫瘤活性。因此，如果可以獲得與CAPRIN-I蛋白質(zhì)具有高的結(jié)合親和性的抗CAPRIN-I抗體，則可以期待更強的抗腫瘤效果，可以適合作為以癌的治療和/或預(yù)防為目的的藥物組合物。作為高的結(jié)合親和性，如上所述，結(jié)合常數(shù)(親和常數(shù))KaGimZXff)優(yōu)選至少為IO7M'至少IO8M'至少為5X IO8M'至少為IO9M'至少為5X IO9M'至少為IOiqM'至少為5X IOkiM'至少為IO11M'至少為5X IO11M'至少為IO12M'或至少為IO13M'〈對表達抗原的細胞的結(jié)合〉抗體與CAPRIN-I結(jié)合的能力可以利用如實施例中所述的使用了例如ELISA、蛋白質(zhì)印跡法、免疫熒光和流式細胞儀分析等的結(jié)合分析來特定。<免疫組織化學(xué)染色>識別CAPRIN-I的抗體，可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法中的免疫組織化學(xué)，使用由外科手術(shù)期間從患者得到的組織、或從擔(dān)載了接種有自然地或在轉(zhuǎn)染后表達CAPRIN-I的細胞系的異種移植組織的動物得到的組織進行低聚甲醛或丙酮固定而得的冷凍切片或用低聚甲醛固定并進行石蠟包埋而得的組織切片，關(guān)于與CAPRIN-I的反應(yīng)性進行試驗。為了進行免疫組織化學(xué)染色，可以將對CAPRIN-I具有反應(yīng)性的抗體用各種方法進行染色。例如通過與辣根過氧化物酶復(fù)合山羊抗小鼠抗體或山羊抗雞抗體反應(yīng)，能夠可視化?！此幬锝M合物〉本發(fā)明另外提供用于癌的治療和/或預(yù)防的藥物組合物，其特征在于，含有與由序列編號2 30中偶數(shù)的序列編號表示的CAPRIN-I的部分多肽具有免疫反應(yīng)性的上述抗體或其片段作為有效成分，所述CAPRIN-I的部分多肽具有序列編號37所示的氨基酸序列、或與該氨基酸序列具有80%以上的序列同一性的氨基酸序列。本發(fā)明的用于癌的治療和/或預(yù)防的藥物組合物的靶只要是表達CAPRIN-I基因的癌(細胞)即可，沒有特別限定。本說明書中使用的“腫瘤(瘤)”和“癌”這樣的術(shù)語是指惡性新生物，可以互換使用。作為在本發(fā)明中成為對象的癌，是表達編碼具有序列編號2 30中偶數(shù)的序列編號的氨基酸序列的CAPRIN-I蛋白質(zhì)的基因的癌，優(yōu)選是乳癌、腦瘤、白血病、肺癌、淋巴瘤、肥大細胞瘤、腎癌、宮頸癌、膀胱癌、食道癌、胃癌和大腸癌。
這些特定的癌中，包含例如乳腺癌、復(fù)合型乳腺癌、乳腺惡性混合腫瘤、乳管內(nèi)乳頭狀腺癌、肺腺癌、鱗狀細胞癌、小細胞癌、大細胞癌、作為神經(jīng)上皮組織性腫瘤的神經(jīng)膠質(zhì)瘤、室管膜瘤、神經(jīng)元腫瘤、胎兒型的神經(jīng)外胚層腫瘤、神經(jīng)鞘瘤、纖維神經(jīng)瘤、腦脊膜瘤、慢性淋巴細胞白血病、淋巴瘤、消化道淋巴瘤、消化器官淋巴瘤、小 中細胞型淋巴瘤、盲腸癌、升結(jié)腸癌、降結(jié)腸癌、橫結(jié)腸癌、乙狀結(jié)腸癌、直腸癌，但不限于此。另外，成為對象的優(yōu)選的受試者是哺乳動物，是包含例如靈長類、寵物、家畜類、競技用動物等的哺乳動物，特別優(yōu)選是人、狗和貓。當(dāng)將本發(fā)明中使用的抗體作為藥物組合物使用時，可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法進行制劑化。例如，可以以與水或水以外的藥學(xué)上可接受的液體的無菌性溶液、或懸浮液劑的注射劑的形式非經(jīng)口地使用。例如，認為可以與藥理學(xué)上可接受的載體或介質(zhì)、具體來說為滅菌水和/或生理鹽水、植物油、乳化劑、懸浮劑、表面活性劑、穩(wěn)定劑、香味劑、賦形劑、媒介物(vehicle)、防腐劑、結(jié)合劑等適當(dāng)組合，通過以一般被認為是制藥實施所要求的單位用量方式混和來進行制劑化。這些制劑中的有效成分量是可得到指示范圍的適合用量的量。用于注射的無菌組合物可以使用注射用蒸餾水這樣的媒介物按照通常的制劑實施來處方。作為注射用的水溶液，可以列舉例如生理鹽水、含有葡萄糖和/或其它輔助劑、例如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露醇、氯化鈉的等滲液，也可以與適當(dāng)?shù)娜芙庵鷦?、例如醇、具體為乙醇、多元醇例如丙二醇、聚乙二醇、非離子性表面活性劑例如聚山梨醇酯80 (TM)、HC0-60合并使用。作為油性液可以列舉芝麻油、大豆油，其可以與作為溶解助劑的苯甲酸芐酯、芐醇合并使用。另外，還可以與緩沖劑例如磷酸鹽緩沖液、醋酸鈉緩沖液、鎮(zhèn)痛劑例如鹽酸普魯卡因、穩(wěn)定劑例如芐醇、苯酚、抗氧化劑配合。制備的注射液通常填充到合適的安瓿中。施與為經(jīng)口或非經(jīng)口，優(yōu)選非經(jīng)口施與，具體來說，可以列舉注射劑型、經(jīng)鼻施與劑型、經(jīng)肺施與劑型、經(jīng)皮施與型等。作為注射劑型的例子，可以通過例如靜脈內(nèi)注射、肌內(nèi)注射、腹腔內(nèi)注射、皮下注射等全身或局部性地施與。另外，可以根據(jù)患者的年齡、體重、性別、癥狀等選擇合適的施與方法。作為含有抗體或編碼抗體的多核苷酸的藥物組合物的施與量，可以例如以一次每Ikg體重為O. OOOlmg至IOOOmg的范圍來選擇。或者可以例如以每個患者O. 001 IOOOOOmg/個體的范圍來選擇施與量，但未必限于這些數(shù)值。施與量、施與方法根據(jù)患者的體重、年齡、性別、癥狀等不同而變化，只要是本領(lǐng)域技術(shù)人員就可以適當(dāng)選擇。通過將含有本發(fā)明的抗體或其片段的上述藥物組合物施與受試者，可以治療和/或預(yù)防癌、優(yōu)選乳癌、腦瘤、白血病、肺癌、淋巴瘤、肥大細胞瘤、腎癌、宮頸癌、膀胱癌、食道癌、胃癌和大腸癌。進一步地，本發(fā)明還包含癌的治療和/或預(yù)防方法，該方法包括以下步驟將本發(fā)明的藥物組合物與上述例示的抗腫瘤劑或包含抗腫瘤劑的藥物組合物組合，合并使用施與受試者。本發(fā)明的抗體或其片段與抗腫瘤劑可以同時施與受試者，或者分別施與受試者。分別施與時，任一藥物組合物可以在先也可以在后，它們的施與間隔、施與量、施與途徑和施與次數(shù)可由專業(yè)醫(yī)師適當(dāng)選擇。同時施與的其它藥物劑型還包含例如將本發(fā)明的抗體或其片段與抗腫瘤劑在藥理學(xué)上可接受的載體(或介質(zhì))中混合并進行制劑化而得的藥物組合物。另外，對于含有抗腫瘤劑的上述藥物組合物和劑型的任一者，可以適用對于含有 本發(fā)明的抗體的藥物組合物和劑型的處方、制劑化、施與途徑、用量、癌等的說明。因此，本發(fā)明還提供用于癌的治療和/或預(yù)防的組合藥物，其包含本發(fā)明的藥物組合物、和含有上面例示的抗腫瘤劑的藥物組合物。另外，本發(fā)明還提供用于癌的治療和/或預(yù)防的藥物組合物，其在含有本發(fā)明的抗體或其片段、和抗腫瘤劑的同時，含有藥理學(xué)上可接受的載體?！炊嚯暮虳NA>本發(fā)明進而還提供與上述抗體(a) (f)相關(guān)的以下多肽和DNA。(i)包含序列編號43、序列編號51、序列編號59、序列編號76、序列編號84和序列編號92的氨基酸序列的多肽，和作為編碼該多肽的DNA的、分別包含序列編號71、序列編號103、序列編號105、序列編號97、序列編號99和序列編號101的堿基序列的DNA。(ii)包含序列編號47、序列編號55、序列編號63、序列編號80、序列編號88和序列編號96的氨基酸序列的多肽，和作為編碼該多肽的DNA的、分別包含序列編號72、序列編號104、序列編號106、序列編號98、序列編號100和序列編號102的堿基序列的DNA。(iii)選自序列編號40,41和42、序列編號48,49和50、序列編號56,57和58、序列編號73、74和75、序列編號81、82和83、以及序列編號89、90和91所示的氨基酸序列中的重鏈⑶R多肽，和編碼該多肽的DNA。(iv)選自序列編號44、45和46、序列編號52、53和54、序列編號60、61和62、序列編號77、78和79、序列編號85、86和87、和序列編號93、94和95所示的氨基酸序列中的輕鏈⑶R多肽，和編碼該多肽的DNA。這些多肽和DNA如上所述，可以使用基因重組技術(shù)來制作?！幢景l(fā)明的要點〉以下歸納上述說明的本發(fā)明。(I)用于癌的治療和/或預(yù)防的藥物組合物，其特征在于，含有與由序列編號2 30中偶數(shù)的序列編號表示的CAPRIN-I的部分多肽具有免疫反應(yīng)性的抗體或其片段作為有效成分，所述CAPRIN-I的部分多肽具有序列編號37所示的氨基酸序列、或與該氨基酸序列具有80%以上的序列同一性的氨基酸序列。(2)用于癌的治療和/或預(yù)防的藥物組合物，其特征在于，含有與由序列編號2 30中偶數(shù)的序列編號表示的CAPRIN-I的部分多肽具有免疫反應(yīng)性的抗體或其片段作為有效成分，所述CAPRIN-I的部分多肽具有在序列編號37所示的氨基酸序列中含有的序列編號69或70所示的氨基酸序列、或與該氨基酸序列具有80%以上的序列同一性的氨基酸序列。(3)如上述(I)或⑵所述的藥物組合物，其中，上述癌是乳癌、腦瘤、白血病、淋巴瘤、肺癌、肥大細胞瘤、腎癌、宮頸癌、膀胱癌、食道癌、胃癌或大腸癌。(4)如上述(I) (3)中任一項所述的藥物組合物，其中，上述抗體為單克隆抗體或多克隆抗體。(5)如上述(I) (4)中任一項所述的藥物組合物，其中，上述抗體為人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、單鏈抗體或雙特異性抗體。(6)抗體，其與多肽具有免疫反應(yīng)性，所述多肽具有序列編號37所示的氨基酸序 列、或與該氨基酸序列具有80%以上的序列同一性的氨基酸序列。(7)抗體，其與多肽具有免疫反應(yīng)性，所述多肽具有在序列編號37所示的氨基酸序列中含有的序列編號69或70所示的氨基酸序列、或與該氨基酸序列具有80%以上的序列同一性的氨基酸序列。(8)如上述(6)或(7)所述的抗體，其對于表達CAPRIN-I蛋白質(zhì)的癌細胞具有細胞毒活性。(9)抗體，其包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，且與CAPRIN-I蛋白質(zhì)具有免疫反應(yīng)性，所述重鏈可變區(qū)包含序列編號40、41和42，所述輕鏈可變區(qū)包含序列編號44、45和46。(10)抗體，其包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，且與CAPRIN-I蛋白質(zhì)具有免疫反應(yīng)性，所述重鏈可變區(qū)包含序列編號48、49和50，所述輕鏈可變區(qū)包含序列編號52、53和54。(11)抗體，其包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，且與CAPRIN-I蛋白質(zhì)具有免疫反應(yīng)性，所述重鏈可變區(qū)包含序列編號56、57和58,所述輕鏈可變區(qū)包含序列編號60、61和62。(12)抗體，其包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，且與CAPRIN-I蛋白質(zhì)具有免疫反應(yīng)性，所述重鏈可變區(qū)包含序列編號73、74和75，所述輕鏈可變區(qū)包含序列編號77、78和79。(13)抗體，其包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，且與CAPRIN-I蛋白質(zhì)具有免疫反應(yīng)性，所述重鏈可變區(qū)包含序列編號81、82和83，所述輕鏈可變區(qū)包含序列編號85、86和87。(14)抗體，其包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，且與CAPRIN-I蛋白質(zhì)具有免疫反應(yīng)性，所述重鏈可變區(qū)包含序列編號89、90和91，所述輕鏈可變區(qū)包含序列編號93、94和95。(15)如上述(6) (14)中任一項所述的抗體，其為人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、單鏈抗體或雙特異性抗體。(16)用于癌的治療和/或預(yù)防的藥物組合物，其特征在于，含有上述(6) (15)中任一項所述的抗體或其片段作為有效成分。(17)如上述(16)所述的藥物組合物，其中，上述癌為乳癌、腦瘤、白血病、淋巴瘤、肺癌、肥大細胞瘤、腎癌、宮頸癌、膀胱癌、食道癌、胃癌或大腸癌。(18)用于癌的治療和/或預(yù)防的組合藥物，其包含上述⑴ (5)中任一項所述的藥物組合物、或上述(16)或(17)所述的藥物組合物；和含有抗腫瘤劑的藥物組合物。(19)癌的治療和/或預(yù)防方法，其包括以下步驟將上述(6) (15)中任一項所述的抗體或其片段、或上述(16)或(17)所述的藥物組合物施與受試者。
(20)癌的治療和/或預(yù)防方法，其包括以下步驟對受試者合并使用上述(18)所述的組合藥物的各藥物組合物。實施例以下，基于實施例更為具體地說明本發(fā)明，但本發(fā)明的范圍不限于這些具體例。實施例I利用了 SEREX法的新的癌抗原蛋白的鑒定(l)cDNA文庫的制作通過酸胍-酹-氯仿方法(Acid guanidium-Phenol-Chloroform法)從健康狗的睪丸組織提取總RNA,并且使用01igotex-dT30 mRNA純化試劑盒(寶酒造社制)，按照試劑盒附帶的說明書純化多聚A RNA。
使用如此獲得的mRNA (5 μ g)合成狗睪丸cDNA噬菌體文庫。在cDNA噬菌體文庫的制作中使用cDNA合成試劑盒、ZAP-cDNA合成試劑盒、ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning試劑盒(STRATAGENE公司制)，按照試劑盒中附帶說明書制作文庫。制作的cDNA噬菌體文庫的大小是7. 73X 105pfu/mlo(2)利用血清的cDNA文庫的篩選使用上述制作的狗睪丸cDNA噬菌體文庫進行免疫篩選。具體地，感染宿主大腸桿菌(XLl-Blue MRF’)使得Φ90Χ 15mm的NZY瓊脂糖平板上形成2210個克隆，在42°C培養(yǎng)3 4小時，形成溶菌斑(噬斑)，用滲透了 IPTG (異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)的硝酸纖維素膜(Hybond C Extra GE Healthcare Bio-Scinece 公司制)在 37°C覆蓋該平板 4 小時，由此使蛋白質(zhì)誘導(dǎo)、表達，在該膜上轉(zhuǎn)印蛋白質(zhì)。然后回收該膜，并浸入到含有0.5%脫脂奶粉的TBSdOmM Tris-HCl，150mM NaCl pH值7. 5)中，在4°C振搖過夜，由此抑制非特異性反應(yīng)。使該濾膜與稀釋了 500倍的患病狗血清在室溫下反應(yīng)2 3小時。作為上述患病狗的血清，使用由患有乳癌的狗中收集的血清。這些血清在_80°C保存，在即將使用前進行前處理。血清的前處理方法利用以下的方法。即，使宿主大腸桿菌(XLl-Blure MRF’)感染沒有插入外來基因的λ ZAP表達噬菌體后，在NZY平板培養(yǎng)基上于37°C培養(yǎng)過夜。接著在平板中加入含有0. 5M NaCl的0. 2M NaHCO3PH值8. 3的緩沖液，在4°C靜置15小時后，將上清液作為大腸桿菌/噬菌體提取液回收。接著，使回收的大腸桿菌/噬菌體提取液流經(jīng)NHS-柱(GE Healthcare Bio-Science公司制)，將源于大腸桿菌 噬菌體的蛋白質(zhì)固定化。使患病狗的血清流經(jīng)該固定了蛋白質(zhì)的柱進行反應(yīng)，將吸附在大腸桿菌和噬菌體上的抗體從血清中除去。將直接流過該柱的血清級分用含有0.5%脫脂奶粉的TBS稀釋500倍，將所得物用作免疫篩選材料。將該處理血清和印跡了上述融合蛋白的膜用TBS-T (0. 05%吐溫20/TBS)洗滌4次，然后與作為二抗的已經(jīng)用含有0. 5%脫脂奶粉的TBS稀釋5000倍的山羊抗狗IgG (Goatanti Dog IgG-h+I HRP conjugated BETHYL Laboratories 公司制)在室溫反應(yīng) I 小時，通過使用了 NBT/BCIP反應(yīng)液(Roche公司制)的酶顯色反應(yīng)來檢測，從Φ90χ15πιπι的NZY瓊脂糖平板上收集與顯色反應(yīng)陽性部位相對應(yīng)的集落，并將其溶解于500 μ I的SM緩沖液(IOOmM NaCl，IOmM MgClSO4, 50mM Tris-HCl，0. 01 % 明膠，pH值 7. 5)中。以與上述同樣的方法重復(fù)二次、三次篩選，直至顯色反應(yīng)陽性集落單一化，從而篩選30940個與血清中的IgG反應(yīng)的噬菌體克隆，并分離了 5個陽性克隆。(3)分離的抗原基因的同一性檢索
為了對通過上述方法分離的5個陽性克隆進行堿基序列分析，進行將噬菌體載體轉(zhuǎn)換成質(zhì)粒載體的操作。具體地，將宿主大腸桿菌(XLl-Blue MRF’)調(diào)制成吸光度0D_為
1.O的溶液，將該溶液200 μ I與250 μ I純化的噬菌體溶液、以及I μ I ExAssist輔助噬菌體(STRATAGENE公司制)混合，隨后在37°C反應(yīng)15分鐘，添加3ml LB培養(yǎng)基，在37°C培養(yǎng)
2.5 3小時，立即用70°C的水浴保溫20分鐘，然后進行4°C、1000 X g、15分鐘的離心分離，收集上清液作為噬菌粒溶液。隨后，將噬菌粒宿主大腸桿菌(SOLR)調(diào)制成吸光度0D_為
I.O的溶液，將該溶液200 μ I與10 μ I純化的噬菌體溶液混合，隨后在37°C反應(yīng)15分鐘，將50 μ I接種于含有氨芐青霉素(終濃度50 μ g/ml)的LB瓊脂培養(yǎng)基，并且在37°C培養(yǎng)過夜。收集轉(zhuǎn)換的SOLR單集落，在含有氨芐青霉素(終濃度50 μ g/ml)的LB培養(yǎng)基中在37°C培養(yǎng)后，使用QIAGEN plasmid Miniprep Kit (QIAGEN公司制)純化具有目的插入物的質(zhì)粒DNA。 使用序列編號31記載的T3引物和序列編號32記載的T7引物，通過引物步移法， 對純化的質(zhì)粒進行插入物全長序列的分析。通過該序列分析，獲得了序列編號5、7、9、11、13所記載的基因序列。使用該基因的堿基序列和氨基酸序列(序列編號6、8、10、12、14)來進行同源性檢索程序BLAST檢索(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/),從而進行與已知基因的同源性檢索，結(jié)果判明獲得的5個基因均是編碼CAPRIN-I的基因。這五個基因之間的序列同一性，在被翻譯為蛋白質(zhì)的區(qū)域中，為堿基序列100%，氨基酸序列99%。與編碼該基因的人同源因子的基因的序列同一性，在被翻譯為蛋白質(zhì)的區(qū)域中，為94%的堿基序列同一性、98%的氨基酸序列同一性。人同源因子的堿基序列示于序列編號1、3，氨基酸序列示于序列編號2、4。此外，在被翻譯為蛋白質(zhì)的區(qū)域中，與編碼所獲得的狗基因的牛同源因子的基因的序列同一性為94%的堿基序列同一性、97%的氨基酸序列同一性。牛同源因子的喊基序列不于序列編號15，氣基酸序列顯不于序列編號16。另外，在被翻譯為蛋白質(zhì)的區(qū)域中，編碼人同源因子的基因與編碼牛同源因子的基因之間的序列同一性為94%的堿基序列同一性、93% 97%的氨基酸序列同一性。此外，在被翻譯為蛋白質(zhì)的區(qū)域中，與編碼所獲得的狗基因的馬同源因子的基因的序列同一性為93%的堿基序列同一性、97%的氨基酸序列同一性。馬同源因子的堿基序列示于序列編號17，氨基酸序列示于序列編號18。另外，在被翻譯為蛋白質(zhì)的區(qū)域中，編碼人同源因子的基因與編碼馬同源因子的基因之間的序列同一性為93%的堿基序列同一性、96%的氨基酸序列同一性。此外，在被翻譯為蛋白質(zhì)的區(qū)域中，與編碼所獲得的狗基因的小鼠同源因子的基因的序列同一性為87% 89%的堿基序列同一'丨生、95% 97%的氨基酸序列同一'丨生。小鼠同源因子的堿基序列不于序列編號19、21、23、25、27，氨基酸序列示于序列編號20、22、24、26、28。另外，在被翻譯為蛋白質(zhì)的區(qū)域中，編碼人同源因子的基因與編碼小鼠同源因子的基因之間的序列同一性為89% 91%的堿基序列同一性、95% 96%的氨基酸序列同一性。此外，在被翻譯為蛋白質(zhì)的區(qū)域中，與編碼所獲得的狗基因的雞同源因子的基因的序列同一性為82%的堿基序列同一性、87%的氨基酸序列同一性。雞同源因子的堿基序列示于序列編號29，氨基酸序列示于序列編號30。另外，在被翻譯為蛋白質(zhì)的區(qū)域中，編碼人同源因子的基因與編碼雞同源因子的基因之間的序列同一性為81% 82%的堿基序列同一性、86%的氨基酸序列同一性。(4)各組織中的基因表達分析
對由上述方法得到的基因，利用RT-PCR法研究狗和人的正常組織和各種細胞株中的表達。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)如下進行。S卩，使用TRIZOL試劑(invitrogen公司制)并按照附帶的說明書從各組織50 IOOmg和各細胞株5 IOX IO6個細胞中提取總RNA。使用該總 RNA,利用 Superscript First-Strand Synthesis System for RT_PCR(invitrogen 公司制)按照附帶的說明書合成cDNA。PCR反應(yīng)使用取得的基因特異性引物(在序列編號33和34中記載)如下進行。即，以使通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)制備的樣品為0.25 μ 1，上述引物為各2 μ M，dNTP為各O. 2mM、ExTaq聚合酶(寶酒造社制)為O. 65U的方式添加各試劑和附帶的緩沖液，調(diào)節(jié)至總量25 μ 1，使用Thermal Cycler (BIO RAD公司制)，將94°C -30秒、600C -30秒、72°C -30秒的循環(huán)重復(fù)30次。此外，上述基因特異型引物是擴增序列編號5的堿基序列(狗CAPRIN-I基因)中的第206 632位堿基的區(qū)域和序列編號I的堿基序列(人CAPRIN-I基因)中的第698 1124位堿基的區(qū)域的引物。為了進行比較對照，同時使用GAPDH特異性引物(在序列編號35和36中記載)。其結(jié)果如圖I所示，在健康的狗組織中，在睪丸中發(fā)現(xiàn)強的表達，另一方面在狗乳癌和腺癌組織中有表達。進一步地，還一并確認了所獲得的基因的人同源因子的表達，結(jié)果與狗CAPRIN-I基因同樣地，在正常組織中能夠確認表達的僅為睪丸，但在癌細胞的情況下，在乳癌、腦瘤、白血病、肺癌、食道癌細 胞株等多種的癌細胞株中檢測到表達，尤其在大量乳癌細胞株中確認了表達。由這些結(jié)果可確認，CAPRIN-I在除睪丸之外的正常組織中觀察不到表達，另一方面，在大量癌細胞中表達，尤其在乳癌細胞株中表達。此外，在圖I中，縱軸的參照編號I表示上述鑒定的基因的表達圖譜，參照編號2表示作為比較對照的GAPDH基因的表達圖譜。(5)免疫組織化學(xué)染色 (5)-I小鼠和狗正常組織中的CAPRIN-I的表達將小鼠(Balb/c，雌性)和狗(比格犬，雌性)在乙醚麻醉下和氯胺酮/異氟烷麻醉下放血，開腹后，將各器官(胃、肝、眼球、胸腺、肌肉、骨髓、子宮、小腸、食道、心臟、腎、唾液腺、大腸、乳腺、腦、肺、皮膚、腎上腺、卵巢、胰腺、脾臟和膀胱)分別轉(zhuǎn)移至加入有PBS的IOcm平皿中。在PBS中切開各器官，用含有4%低聚甲醛(PFA)的O. IM磷酸鹽緩沖液(pH值7. 4)回流固定過夜。棄去回流液，用PBS漂洗各器官的組織表面，將含有10%蔗糖的PBS溶液添加入50ml容量的離心管中，然后將各組織置于管中，使用轉(zhuǎn)子在4°C振搖2小時。替換成含有20%蔗糖的PBS溶液，在4°C靜置直至組織沉降，然后替換成含有30%蔗糖的PBS溶液，在4°C靜置直至組織沉降。取出組織并使用手術(shù)刀切下所需的部分。接著，加入OCT化合物(Tissue Tek公司制)使其浸潤組織表面，隨后將組織置于Cryomold(冷凍切片包埋模具)上。將Cryomold置于干冰上使其迅速冷凍，然后使用低溫恒溫器(LEICA公司制)將組織切成10 20 μ m薄片，并且用電吹風(fēng)對每個載玻片風(fēng)干30分鐘，由此制備置有薄切片組織的載玻片。接著，將載玻片置于充滿PBS-T (含有0. 05%吐溫20的生理鹽水)的染色瓶，將每隔5分鐘更換PBS-T的操作進行3次。使用Kimwipes擦掉切片周圍的多余水分，用DAK0PEN(DAK0公司制)包圍后，作為封閉液，對小鼠組織施用MOM小鼠Ig封閉試劑(VECTASTAIN公司制)，對狗組織施用含有10% FBS的PBS-T溶液，置于保濕室中在室溫靜置I小時。接著，將實施例4制備的與癌細胞表面反應(yīng)的、具有序列編號43的重鏈可變區(qū)和序列編號47的輕鏈可變區(qū)的針對CAPRIN-I的單克隆抗體(單克隆抗體#1)用封閉液調(diào)制成10 μ g/ml溶液，將該溶液施加于載玻片，在保濕室中于4°C靜置過夜。在用PBS-T洗滌3次，每次10分鐘后，向載玻片中施加用封閉液稀釋250倍的MOM生物素標記抗IgG抗體(VECTASTAIN公司制)，在保濕室中于室溫靜置I小時。在用PBS-T洗滌3次，每次10分鐘后，向載玻片上施加抗生物素蛋白-生物素ABC試劑(VECTASTAIN公司制)，在保濕室中于室溫靜置5分鐘。在用PBS-T洗滌3次，每次10分鐘后，向載玻片上施加DAB顯色液(DAB10mg+30%H202 10 μ 1/0. 05Μ Tris-HCl (pH值 7. 6)，50ml)，在保濕室中于室溫靜置 30 分鐘。用蒸餾水淋洗，然后施加蘇木精試劑(DAK0公司制)，于室溫靜置I分鐘后，用蒸餾水淋洗。依次地放入70 %、80 %、90 %、95 %和100 %各乙醇溶液中各I分鐘，隨后使其在二甲苯中靜置過夜。取出載玻片，用Glycergel Mounting Medium(DAK0公司制)封片，隨后觀察。其結(jié)果是，在唾液腺、腎、結(jié)腸和胃的各組織中僅在細胞內(nèi)觀察到微弱程度的CAPRIN-I表達；然而在細胞表面上沒有觀察到CAPRIN-I表達。此外，在來自其它器官的組織中完全沒有觀察到表達。此外，本結(jié)果在使用具有序列編號47的重鏈可變區(qū)和序列編號55的輕鏈可變區(qū)的針對CAPRIN-I的單克隆抗體(單克隆抗體#2)、具有序列編號59的重鏈可變區(qū)和序列編號63的輕鏈可變區(qū)的針對CAPRIN-I的單克隆抗體(單克隆抗體#3)、具有序列編號76的重鏈可變區(qū)和序列編號80的輕鏈可變區(qū)的針對CAPRIN-I的單克隆抗體(單克隆抗體#4)、 具有序列編號84的重鏈可變區(qū)和序列編號88的輕鏈可變區(qū)的針對CAPRIN-I的單克隆抗體(單克隆抗體#5)、和具有序列編號92的重鏈可變區(qū)和序列編號96的輕鏈可變區(qū)的針對CAPRIN-I的單克隆抗體(單克隆抗體#6)時，也是同樣的。(5) -2狗乳癌組織中的CAPRIN-I的表達使用在病理診斷中診斷為患有惡性乳癌的狗的冷凍乳癌組織108份樣本，用與上述同樣的方法制備冷凍切片載玻片，并進行使用了在實施例4中制備的單克隆抗體#1的免疫組織化學(xué)染色。作為其結(jié)果，在108個樣本中，確認有100個樣本(92.5% )表達CAPRIN-1，特別是在異型度高的癌細胞表面有強烈表達。此外，本結(jié)果在使用單克隆抗體#2、#3、#4、#5和#6時，也是同樣的。(5)-3人乳癌組織中的CAPRIN-I的表達使用石蠟包埋的人乳癌組織陣列(ΒΙ0ΜΑΧ公司制)的188個乳癌組織樣本，進行免疫組織化學(xué)染色。將人乳癌組織陣列在60°C處理3小時后，放入裝滿了二甲苯的染色瓶中，將每隔5分鐘替換二甲苯的操作進行3次。接著用乙醇和PBS-T代替二甲苯，進行同樣的操作。在裝滿了含有O. 05% Tween20的IOmM檸檬酸緩沖液(pH值6. O)的染色瓶中加入人乳癌組織陣列，在125°C處理5分鐘后，在室溫下靜置40分鐘以上。將切片周圍的多余水分用Kimwipes擦去，用DAK0PEN包圍，適當(dāng)?shù)渭覲eroxidase Block(DAK0公司制)。在室溫下靜置5分鐘后，加入到裝滿了 PBS-T的染色瓶中，將每隔5分鐘替換PBS-T的操作進行3次。作為封閉液，加入含有10% FBS的PBS-T溶液，在保濕室內(nèi)、在室溫下靜置I小時。接著加入將在實施例4制備的與癌細胞表面反應(yīng)的單克隆抗體#1用含有5% FBS的PBS-T溶液調(diào)制成10 μ g/ml而得的溶液，在保濕室內(nèi)、在4°C靜置過夜，用PBS-T進行10分鐘3次洗漆，然后，滴加適量的 Peroxidase Labelled Polymer Coniugated(DAK0 公司制)，在保濕室內(nèi)、在室溫下靜置30分鐘。利用PBS-T進行10分鐘3次洗滌，加入DAB顯色液(DAK0公司制)，在室溫下靜置10分鐘左右后，丟棄顯色液，用PBS-T進行10分鐘3次洗滌，用蒸餾水沖洗，依次加入到70%、80%、90%、95%、100%的各乙醇溶液中各I分鐘，然后在二甲苯中靜置過夜。取出載玻片，用Glycergel Mounting Medium(DAK0公司制)封片后,進行觀察。作為其結(jié)果，在全部188份乳癌組織樣本中，確認有138份樣本(73% )較強地表達CAPRIN-I0此外，本結(jié)果在使用單克隆抗體#2、#3、#4、#5和#6時，也是同樣的。(5)-4人惡性腦瘤中的CAPRIN-I的表達使用石蠟包埋的人惡性腦瘤組織陣列(ΒΙ0ΜΑΧ公司制)的247份惡性腦瘤組織樣本，利用與上述(5)-3同樣的方法進行使用了在實施例4中制備的單克隆抗體#1的免疫組織化學(xué)染色。作為其結(jié)果，在全部247份惡性腦瘤組織樣本中，227份樣本(92% )觀察到強烈的CAPRIN-I表達。并且，本結(jié)果在使用單克隆抗體#2、#3、#4、#5和#6時，也是同樣的。(5)-5人乳癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的CAPRIN-I表達使用石蠟包埋的人乳癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織陣列(ΒΙ0ΜΑΧ公司制)的150份人乳癌轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)組織樣本，利用與上述(5)-3同樣的方法進行使用了在實施例4中制備的單克 隆抗體#1的免疫組織化學(xué)染色。作為其結(jié)果，在全部150份乳癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織樣本中，136份樣本(90% )觀察到強烈的CAPRIN-I表達。S卩，判定CAPRIN-I在由乳癌轉(zhuǎn)移的癌組織中也強烈地表達。此外，本結(jié)果在使用單克隆抗體#2、#3、#4、#5和#6時，也是同樣的。
(5) -6人各種癌組織中的CAPRIN-I的表達使用石蠟包埋的人各種癌組織陣列(ΒΙ0ΜΑΧ公司制)的樣本，利用與上述同樣的方法進行使用了在實施例4中制備的單克隆抗體#1的免疫組織化學(xué)染色。作為其結(jié)果，CAPRIN-I在食道癌、結(jié)腸癌、直腸癌、肺癌、腎癌、膀胱癌和宮頸癌中確認有強的表達。此外，本結(jié)果在使用單克隆抗體#2、#3、#4、#5和#6時，也是同樣的。實施例2新的人癌抗原蛋白的制備(I)重組蛋白質(zhì)的制備基于實施例I中獲得的序列編號I的基因，通過以下方法制備人同源基因的重組蛋白質(zhì)。PCR如下進行以由實施例I中制作的各種組織·細胞cDNA通過RT-PCR法可以確認表達的cDNA I μ I、含有SacI和XhoI限制性酶切割序列的兩種引物(序列編號38和39中記載)各O. 4 μ M、0. 2mM dNTP、I. 25U PrimeSTAR HS聚合酶(寶酒造社制))的方式，添加各試劑和附帶的緩沖液，使總量為50 μ 1，使用Thermal Cycler (BIO RAD公司制)，將98°C -10秒、68°C -2. 5分鐘的循環(huán)重復(fù)30次。此外，上述2種引物是擴增編碼序列編號2的氨基酸序列全長的區(qū)域的引物。PCR后，將擴增的DNA利用I %瓊脂糖凝膠進行電泳，使用 QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN 公司制)純化約 2. Ikbp 的 DNA 片段。將純化的DNA片段連接到克隆載體pCR_Blunt(Invitrogen公司制)中。將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，然后回收質(zhì)粒，通過測序確認擴增的基因片段與目的序列一致。用SacI和XhoI限制性酶處理與目的序列一致的質(zhì)粒，然后用QIAquick Gel ExtractionKit純化后，將目的基因序列插入到用SacI、XhoI限制性酶處理后的大腸桿菌用表達載體pET30a(Novagen公司制)中。通過使用該載體能夠產(chǎn)生His標簽融合型的重組蛋白質(zhì)。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達用大腸桿菌BL21(DE3)中，用ImM IPTG誘導(dǎo)表達，由此在大腸桿菌中表達目的蛋白質(zhì)。(2)重組蛋白質(zhì)的純化將上述得到的表達序列編號I的基因的各重組大腸桿菌在含有30 μ g/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中在37°C培養(yǎng)，直至在600nm的吸光度達到O. 7左右，然后添加異丙基-β -D-I-硫代吡喃半乳糖苷至終濃度ImM，在37°C培養(yǎng)4小時。此后，以4800轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘收集菌體。將該菌體顆粒懸浮在磷酸緩沖生理鹽水中，進一步以4800轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，進行菌體的洗滌。將菌體懸浮在磷酸緩沖生理鹽水中，然后在冰上超聲破碎。將大腸桿菌超聲破碎液以6000轉(zhuǎn)/分鐘離心分離20分鐘，將所得的上清液作為可溶性級分，將沉淀物作為不溶性級分。將可溶級分添加至根據(jù)常規(guī)技術(shù)制備的鎳螯合柱(載體ChelateingSepharose (商標)Fast Flow (GE Health Care 社);柱體積5ml ;50mM 鹽酸緩沖液(pH 值8. O)作為平衡緩沖液)。用10倍柱體積的50mM鹽酸緩沖液(pH值8. O)和含有20mM咪唑的20mM磷酸鹽緩沖液(pH值8. O)洗去未吸附的級分，然后立即用含有IOOmM咪唑的20mM磷酸鹽緩沖液(pH值8. O)溶出6個床。將通過考馬斯染色法確認了目的蛋白質(zhì)的溶出的含有IOOmM咪唑的20mM磷酸鹽緩沖液(pH值8. O)溶出級分添加至強陰離子交換柱(載體QSepharose (商標)Fast Flow (GE Health Care 社);柱體積5ml ;作為平衡緩沖液的 20mM 磷酸緩沖液(pH值8. O))。用10倍柱體積的20mM磷酸緩沖液(pH值7. O)和含有200mM氯化鈉的20mM磷酸緩沖液(pH值7. O)洗去未吸附的級分，然后立即用含有400mM氯化鈉的20mM磷酸緩沖液(pH值7. O)溶出5個床，獲得具有序列編號2所示氨基酸序列的各蛋白質(zhì)的純化級分。將200 μ I通過上述方法獲得的各純化樣品分注到Iml的反應(yīng)用緩沖液(20mMTris-HCl, 50mM NaCl,2mM CaCl2, pH 值 7· 4)中，然后添加 2 μ I 腸激酶(Novagen 公司制)后，在室溫靜置過夜進行反應(yīng)，切斷His標簽,使用Enterokinase Cleavage CaptureKit (Novagen公司制)按照附帶的說明書進行純化。隨后，使用超濾NANOSEP IOK0MEGA(PALL社制)，將I. 2ml由上述方法獲得的純化樣品用生理用磷酸緩沖液(日水制藥社制)置換，然后用0·22μηι HT Tuffryn Acrodisc (PALL公司制)實施無菌過濾,將所得物用于以下實驗。實施例3針對CAPRIN-I的雞和小鼠單克隆抗體的制備將實施例2中制備的序列編號2所示抗原蛋白(人CAPRIN-1) 300 μ g與等量的弗氏完全佐劑混合，將該混合物用作I只雞的抗原溶液。將抗原液施與7周齡的雞的腹腔內(nèi)，每4周施與7次，完成免疫。從最后免疫起4日后分別取出脾臟，然后將其在兩片無菌的載玻片之間磨碎，將用PBS(-)(日水社制)洗滌并以1500轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘移除上清液的操作重復(fù)3次，獲得脾臟細胞。將獲得的脾臟細胞與使用鳥類網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病病毒通過轉(zhuǎn)化法由雞建立的缺少輕鏈的雞骨髓瘤細胞以5 I的比例混合，向其中添加通過使加熱至37°C的200 μ I含有10% FBS的MDM培養(yǎng)基與800 μ I PEG1500(《一V >力'一社制)混合而制得的PEG溶液，靜置5分鐘以進行細胞融合。以1700轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，移除上清液后，將細胞用300ml添加了 2%當(dāng)量的Gibco公司制的HAT溶液的含有10% FBS的MDM培養(yǎng)基(HAT選擇培養(yǎng)基)懸浮，并且以每孔各100 μ I接種于30塊96孔板(5 >
社制)中。在37°C、5% CO2的條件下培養(yǎng)7天，獲得因脾臟細胞與雞骨髓瘤細胞的融合而產(chǎn)生的雜交瘤。以由制備的雜交瘤產(chǎn)生的抗體對CAPRIN-I蛋白的結(jié)合親和力作為指標來篩選雜交瘤。將實施例2中制備的CAPRIN-I蛋白溶液(I μ g/ml)以每孔100 μ I的量添加至96孔板，并使該板在4°C靜置18小時。各孔用PBS-T洗滌3次后，以每孔400 μ I的量添加0.5%牛血清白蛋白(BSA)溶液(7 7社製)，使該板在室溫靜置3小時。移除溶液，用每孔400 μ I的PBS-T洗滌各孔3次后，以每孔100 μ I的量添加上述獲得的雜交瘤的各培養(yǎng)上清液，使該板在室溫靜置2小時。用PBS-T洗滌各孔3次，然后以每孔100 μ I的量添加用PBS稀釋5000倍的HRP標記抗雞IgY抗體( '> ^社製)，并且在室溫靜置I小時。用PBS-T洗滌孔3次后，以每孔100 μ I的量添加TMB底物溶液(Thermo公司制)，并且靜置15 30分鐘，進行顯色反應(yīng)。在顏色顯現(xiàn)后，以每孔100 μ I的量添加IN硫酸以終止該反應(yīng)，使用吸光度計測定在450nm的吸光度值和在595nm的吸光度值。作為其結(jié)果，選出了數(shù)個產(chǎn)生吸光度值高的抗體的雜交瘤。將選出的雜交瘤以每孔O. 5個的量添加至96孔板并培養(yǎng)。I周后，觀察到在孔中形成單個集落雜交瘤。進一步培養(yǎng)這些孔中的細胞，以從克隆的雜交瘤產(chǎn)生的抗體對CAPRIN-I蛋白的結(jié)合親和力作為指標，選擇雜交瘤。將實施例2中制備的CAPRIN-I蛋白溶 液(I μ g/ml)以每孔100 μ I的量添加至96孔板，并在4°C靜置18小時。將各孔用PBS-T洗滌3次，然后以每孔400 μ I的量添加O. 5% BSA溶液，并在室溫靜置3小時。移除溶液，用每孔400 μ I的PBS-T洗滌孔3次后，以每孔100 μ I的量添加上述獲得的雜交瘤的各培養(yǎng)上清液，并在室溫靜置2小時。用PBS-T洗滌各孔3次后，以每孔100 μ I的量添加用PBS稀釋5000倍的HRP標記抗雞IgY抗體(SIGMA公司制)，并且在室溫靜置I小時。用PBS-T洗滌孔3次后，以每孔100 μ I的量添加TMB底物溶液(Thermo公司制)，并且靜置15 30分鐘，進行顯色反應(yīng)。在顏色顯現(xiàn)后，以每孔100μ I的量添加IN硫酸以終止該反應(yīng)，使用吸光度計測定450nm和595nm的吸光度值。作為其結(jié)果，獲得了多個產(chǎn)生與CAPRIN-I蛋白顯示反應(yīng)性的單克隆抗體的雜交瘤株。接下來，在這些單克隆抗體當(dāng)中選出與表達CAPRIN-I的乳癌細胞的表面顯示反應(yīng)性的單克隆抗體。具體地，在I. 5ml容量的微量離心管中離心分離5 X IO5個人乳癌細胞株MDA-MB-231V，向其中添加上述各雜交瘤的培養(yǎng)上清液100 μ 1，在冰上靜置I小時。在用PBS洗滌后，添加用含有O. I % FBS的PBS稀釋30倍的FITC標記山羊抗雞IgG (H+L)抗體(SouthernBiotech公司制)，并在冰上靜置I小時。在用PBS洗滌后，使用卜> ”
O” >株式會社的FACS Caliber測定熒光強度。另一方面，使用雜交瘤培養(yǎng)用培養(yǎng)基進行與上述同樣的操作，制備對照的樣品。作為其結(jié)果，選出了 I個與對照相比熒光強度強、即與表達CAPRIN-I的乳癌細胞的細胞表面反應(yīng)的單克隆抗體(單克隆抗體#1)。另外，為了制作小鼠單克隆抗體，將實施例2中制備的序列編號2所示抗原蛋白(人CAPRIN-1) 100 μ g與等量的MPL+TDM佐劑(V ι社製)混合，將該混合物用作I只小鼠的抗原溶液。將抗原溶液施與6周齡的Balb/cc小鼠(日本SLC公司制)的腹腔內(nèi)后，每I周施與7次，完成免疫。從最后免疫起3日后分別取出脾臟，然后將其在兩片無菌的載玻片之間磨碎，將用PBS(-)(日水社制)洗滌并以1500轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘移除上清液的操作重復(fù)3次，獲得脾臟細胞。將獲得的脾臟細胞與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0(由ATCC購入)以10 : I的比例混合，向其中添加通過使加熱至37°C的200 μ I含有10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基與800 μ I PEG1500 (>力' 一社制)混合而制得的PEG溶液，靜置5分鐘以進行細胞融合。以1700轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，移除上清液后，將細胞用150ml添加了 2%當(dāng)量的Gibco公司制的HAT溶液的含有15% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基(HAT選擇培養(yǎng)基)懸浮，并且以每孔各100 μ I接種于15塊96孔板，社制)中。在37°C、5% CO2的條件下培養(yǎng)7天，獲得因脾臟細胞與骨髓瘤細胞的融合而產(chǎn)生的雜交瘤。以由制備的雜交瘤產(chǎn)生的抗體對CAPRIN-I蛋白的結(jié)合親和力作為指標來篩選雜交瘤。將實施例2中制備的CAPRIN-I蛋白溶液(I μ g/ml)以每孔100 μ I的量添加至96孔板，并使該板在4°C靜置18小時。各孔用PBS-T洗滌3次后，以每孔400 μ I的量添加0.5%牛血清白蛋白(BSA)溶液(7 7社製)，使該板在室溫靜置3小時。移除溶液，用每孔400 μ I的PBS-T洗滌各孔3次后，以每孔100 μ I的量添加上述獲得的雜交瘤的各培養(yǎng)上清液，使該板在室溫靜置2小時。用PBS-T洗滌各孔3次，然后以每孔100 μ I的量添加用PBS稀釋5000倍的HRP標記抗小鼠IgG(H+L)抗體(Invitrogen公司制)，并且在室溫靜置I小時。用PBS-T洗滌孔3次后，以每孔100 μ I的量添加TMB底物溶液(Thermo公司制)，并且靜置15 30分鐘，進行顯色反應(yīng)。在顏色顯現(xiàn)后，以每孔100 μ I的 量添加IN硫酸以終止該反應(yīng)，使用吸光度計測定在450nm的吸光度值和在595nm的吸光度值。作為其結(jié)果，選出了數(shù)個產(chǎn)生吸光度值高的抗體的雜交瘤。將選出的雜交瘤以每孔O. 5個的量添加至96孔板并培養(yǎng)。I周后，觀察到在孔中形成單個集落的雜交瘤。進一步培養(yǎng)這些孔中的細胞，以從克隆的雜交瘤產(chǎn)生的抗體對CAPRIN-I蛋白的結(jié)合親和力作為指標，選擇雜交瘤。將實施例3中制備的CAPRIN-I蛋白溶液(I μ g/ml)以每孔100 μ I的量添加至96孔板，并在4°C靜置18小時。將各孔用PBS-T洗滌3次，然后以每孔400 μ I的量添加O. 5% BSA溶液，并在室溫靜置3小時。移除溶液，用每孔400 μ I的PBS-T洗滌孔3次后，以每孔100 μ I的量添加上述獲得的雜交瘤的各培養(yǎng)上清液，并在室溫靜置2小時。用PBS-T洗滌各孔3次后，以每孔100 μ I的量添加用PBS稀釋5000倍的HRP標記抗小鼠IgG(H+L)抗體(^ >匕卜口夕工 >公司制)，并且在室溫靜置I小時。用PBS-T洗滌孔3次后，以每孔100 μ I的量添加TMB底物溶液(Thermo公司制)，并且靜置15 30分鐘，進行顯色反應(yīng)。在顏色顯現(xiàn)后，以每孔100 μ I的量添加IN硫酸以終止該反應(yīng)，使用吸光度計測定450nm和595nm的吸光度值。作為其結(jié)果，獲得了 50個產(chǎn)生與CAPRIN-I蛋白顯示反應(yīng)性的單克隆抗體的雜交瘤株。接下來，在這些單克隆抗體當(dāng)中選出與表達CAPRIN-I的乳癌細胞的表面顯示反應(yīng)性的單克隆抗體。具體地，在I. 5ml容量的微量離心管中離心分離IO6個人乳癌細胞株MDA-MB-231V,向其中添加上述各雜交瘤的培養(yǎng)上清液100 μ 1，在冰上靜置I小時。在用PBS洗滌后，添加用含有O. 1% FBS的PBS稀釋500倍的FITC標記山羊抗小鼠IgG抗體(、>^卜口夕工 > 公司制)，并在冰上靜置I小時。在用PBS洗滌后，使用夕卜今>、J >株式會社的FACS Caliber測定熒光強度。另一方面，使用將沒有任何處理的6周齡的Balb/c小鼠的血清用雜交瘤培養(yǎng)用培養(yǎng)基稀釋500倍而出的物質(zhì)代替抗體進行與上述同樣的操作，作為對照。作為其結(jié)果，選出了 5個與對照相比熒光強度強、即與乳癌細胞的細胞表面反應(yīng)的單克隆抗體(#2、#3、#4、#5和#6)。 實施例4選出的抗體所具有的特征(I)抗CAPRIN-I單克隆抗體的可變區(qū)基因的克隆從產(chǎn)生實施例3中選出的與表達CAPRIN-I的乳癌細胞的細胞表面反應(yīng)的單克隆抗體的、源于雞的雜交瘤株中提取mRNA，通過使用了對于源于雞FRl的序列和源于雞FR4的序列為特異性的引物的RT-PCR法，獲得本抗體的重鏈可變(VH)區(qū)和輕鏈可變(VL)區(qū)的基因。另外，從2株產(chǎn)生與表達CAPRIN-I的乳癌細胞的細胞表面反應(yīng)的單克隆抗體的、源于小鼠的雜交瘤株中提取mRNA，通過使用了對于源于小鼠FRl的序列和源于小鼠FR4的序列為特異性的引物的RT-PCR法，獲得各抗體的重鏈可變(VH)區(qū)和輕鏈可變(VL)區(qū)的基因。為了確定序列，將這些基因克隆到pCR2. I載體(Invitrogen公司制)中。(1)-1 RT-PCR使用High Pure RNA Isolation Kit (Roche公司制)從IO6個的各雜交瘤株提取總 RNA 后，使用 PrimeScriptII 1st strand cDNA Synthesis Kit (Takara 公司制)合成cDNA。這些操作按照各試劑盒所附帶的說明書來進行。以合成的cDNA作為模板，使用KOD-Plus-DNA聚合酶(Τ0Υ0Β0公司制)，按照常規(guī)方法利用PCR法分別擴增雞抗體重鏈基因可變區(qū)和雞抗體輕鏈基因可變區(qū)、小鼠抗體重鏈基因可變區(qū)和小鼠抗體輕鏈基因可變區(qū)。 為了獲取雞抗體的VH區(qū)的基因，使用了對雞重鏈FRl序列為特異性的引物和對雞重鏈FR4序列為特異性的引物。另外為了獲取VL區(qū)的基因，使用了對雞輕鏈FRl序列為特異性的引物和對雞輕鏈FR4為特異性的引物。小鼠抗體的VH和VL區(qū)的基因的獲取也同樣地使用了對小鼠重鏈FRl序列為特異性的引物、對小鼠重鏈FR4序列為特異性的引物和對小鼠輕鏈FRl序列為特異性的引物和對小鼠輕鏈FR4為特異性的引物。使用上述得到的各PCR產(chǎn)物，利用瓊脂糖凝膠進行電泳，切出VH區(qū)和VL區(qū)各自的DNA帶。DNA片段使用QIAquick Gel purification kit (QIAGEN公司制)并按照附帶的說明書來進行。純化的各DNA使用TA克隆試劑盒(Invitrogen公司制)克隆到pCR2. I載體中。將連結(jié)的載體利用常規(guī)方法轉(zhuǎn)化到DH5感受態(tài)細胞(Τ0Υ0Β0公司制)中。將各個轉(zhuǎn)化體的各10個克隆在培養(yǎng)基(100 μ g/ml氨芐青霉素)中、在37°C培養(yǎng)過夜后，將各質(zhì)粒DNA使用Qiaspin Miniprep kit (QIAGEN公司制)進行純化。(I)-2序列確定上述得到的各質(zhì)粒中的VH區(qū)和VL區(qū)的基因序列分析，使用M13正向引物(序列編號64)和M13反向引物(序列編號65)，利用熒光測序儀(ABI公司制DNA測序儀3130XL)，并使用ABI公司制的BigDye Terminator Ver3. I循環(huán)測序試劑盒,按照其附帶的說明書來進行。其結(jié)果可以確定各基因序列(在10個克隆中分別一致)。得到的編碼源于雞的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的基因序列示于序列編號71，氨基酸序列示于序列編號43，編碼輕鏈可變區(qū)的基因序列示于序列編號72，氨基酸序列示于序列編號47。另外，得到的編碼源于小鼠的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的基因序列分別示于序列編號71、序列編號103、序列編號105、序列編號97、序列編號99和序列編號101，氨基酸序列分別示于序列編號51、序列編號59、序列編號76、序列編號84和序列編號92，編碼輕鏈可變區(qū)的基因序列分別示于序列編號104、序列編號106、序列編號98、序列編號100和序列編號102，氨基酸序列分別示于序列編號55、序列編號63、序列編號80、序列編號88和序列編號96。S卩，可以確認，單克隆抗體#1包含序列編號43的重鏈可變區(qū)和序列編號47的輕鏈可變區(qū)，其中，重鏈可變區(qū)中的⑶Rl 3分別包含序列編號40、序列編號41、序列編號42的氨基酸序列，輕鏈可變區(qū)中的CDRl 3分別包含序列編號44、序列編號45、序列編號46的氨基酸序列。另外，可以確認#2包含序列編號51的重鏈可變區(qū)和序列編號55的輕鏈可變區(qū)，其中，重鏈可變區(qū)中的⑶Rl 3分別包含序列編號48、序列編號49、序列編號50的氨基酸序列，輕鏈可變區(qū)中的CDRl 3分別包含序列編號52、序列編號53、序列編號54的氨基酸序列。另外，可以確認#3包含序列編號59的重鏈可變區(qū)和序列編號63的輕鏈可變區(qū)，其中，重鏈可變區(qū)中的⑶Rl 3分別包含序列編號56、序列編號57、序列編號58的氨基酸序列，輕鏈可變區(qū)中的CDRl 3分別包含序列編號60、序列編號61、序列編號62的氨基酸序列。另外，可以確認#4包含序列編號76的重鏈可變區(qū)和序列編號80的輕鏈可變區(qū)，其中，重鏈可變區(qū)中的⑶Rl 3分別包含序列編號73、序列編號74、序列編號75的氨基酸序列，輕鏈可變區(qū)中的CDRl 3分別包含序列編號77、序列編號78、序列編號79的氨基酸序列。另外，可以確認#5包含序列編號84的重鏈可變區(qū)和序列編號88的輕鏈可變區(qū)，其中，重鏈可變區(qū)中的⑶Rl 3分別包含序列編號82、序列編號83、序列編號84的氨基酸序列，輕鏈可變區(qū)中的CDRl 3分別包含序列編號85、序列編號86、序列編號87的氨基酸序 列。另外，可以確認#6包含序列編號92的重鏈可變區(qū)和序列編號96的輕鏈可變區(qū)，其中，重鏈可變區(qū)中的⑶Rl 3分別包含序列編號90、序列編號91、序列編號92的氨基酸序列，輕鏈可變區(qū)中的CDRl 3分別包含序列編號94、序列編號95、序列編號96的氨基酸序列。(2)人-雞嵌合重組抗體和小鼠-雞嵌合抗體的制備將上述(I)中得到的、序列編號43所示的雞單克隆抗體#1的重鏈可變區(qū)的基因擴增片段的兩端進行限制性酶處理后，進行純化，將所得片段按照常規(guī)方法插入到已經(jīng)插入了含有序列編號66的源于雞抗體的前導(dǎo)序列和含有序列編號67的人IgGl的H鏈恒定區(qū)的pcDNA4/myc-His (Invitrogen公司制)載體中。另外，將序列編號47所示的雞單克隆抗體#1的輕鏈可變區(qū)的基因擴增片段的兩端進行限制性酶處理后，進行純化，將所得片段按照常規(guī)方法插入到已經(jīng)插入了含有序列編號66的源于雞抗體的前導(dǎo)序列和含有序列編號68的人IgGl的L鏈恒定區(qū)的pcDNA3. 1/myc-His (Invitrogen公司制)載體中。接著，將插入了序列編號43所示的雞單克隆抗體#1的重鏈可變區(qū)的上述重組載體、和插入了序列編號47所示的雞單克隆抗體#1的輕鏈可變區(qū)的上述重組載體導(dǎo)入到CHO-Kl細胞(由理研七^ 。獲得)中。具體地，將在12孔培養(yǎng)板的每I孔中用Iml含有10% FBS的Ham’ sF12培養(yǎng)基(Invitrogen公司制)培養(yǎng)的2X IO5個CHO-Kl細胞用PBS(-)洗滌后，以每孔Iml的量重新加入含有10% FBS的Ham’ sF12培養(yǎng)基，在加入后的孔中添加將溶解在30μ I的OptiMEM(Invitrogen公司制)中的上述各載體250ng與Polyfect transfection reagent (QIAGEN公司制)30 μ I混合而成的混合物。將導(dǎo)入了上述重組載體的CH0-K1細胞在添加了 200 μ g/mlZeocin (Invitrogen公司制)和200 μ g/mlGeneticin(Roche公司制)的含有10% FBS的Ham，sF12培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，向96孔板中以每孔0. 5個的方式接種導(dǎo)入了上述重組載體的CH0-K1細胞，制備穩(wěn)定地產(chǎn)生具有雞單克隆抗體#1的可變區(qū)的人-雞嵌合抗體#1(#1)的細胞株。將制備的細胞株使用150cm2燒瓶、以5X IO5個/ml使用不含血清的OptiCHO培養(yǎng)基(Invitrogen公司制)30ml培養(yǎng)5天,得到含有#1的培養(yǎng)上清液。同樣地，將序列編號43所示的雞單克隆抗體#1的重鏈可變區(qū)的基因擴增片段的兩端進行限制性酶處理后，進行純化，將所得片段按照常規(guī)方法插入到已經(jīng)插入了源于雞抗體的前導(dǎo)序列和小鼠IgGl的H鏈恒定區(qū)的pcDNA4/myc-His (Invitrogen公司制)載體中。另外，將序列編號47所示的雞單克隆抗體#1的輕鏈可變區(qū)的基因擴增片段的兩端進行限制性酶處理后，進行純化，將所得片段按照常規(guī)方法插入到已經(jīng)插入了源于雞抗體的前導(dǎo)序列和小鼠IgGl的L鏈恒定區(qū)的pcDNA3. 1/myc-His (Invitrogen公司制)載體中。將其與上述同樣地導(dǎo)入CHO-Kl細胞，制備穩(wěn)定地產(chǎn)生具有雞單克隆抗體#1的可變區(qū)的小鼠-雞嵌合抗體#1的細胞株。將制備的細胞株使用150cm2燒瓶、以5X IO5個/ml使用不含血清的OptiCHO培養(yǎng)基(Invitrogen公司制)30ml培養(yǎng)5天，得到含有小鼠-雞嵌合抗體#1的培養(yǎng)上清液。(3)使用了抗CAPRIN-I抗體#I、#2、#3、#4、#5和#6的各種癌細胞表面的CAPRIN-I的表達接著對于確認表達CAPRIN-I基因的乳癌細胞株7種(MDA_MB_157，T47D，MRK-nu-1, MDA-MB-231V, BT20, SK-BR-3， MDA-MB-231T)和其它乳癌細胞株 3 種(MDA-MB-231C, MCF-7，ZR75-1)、神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞株 5 種(T98G，SNB19, U251，U87MG，U373)、腎癌細胞株4種(Caki-l，Caki-2，A498，ACHN)、胃癌細胞株2種(MNK28，MNK45)、大腸癌細 胞株 5 種(HT29, LoVo, Caco2, SW480, HCTl 16)、肺癌細胞株 3 種(A549、QG56、PC8)、白血病細胞株4種(AML5，Namalwa, BDCM、RPI1788)、淋巴瘤細胞株I種(Ramos)、宮頸癌細胞株I種(SW756)、膀胱癌細胞株I種(T24)、食道癌細胞株I種(KYSE180)，使用上述(2)所得的含有#1的CHO-Kl細胞的培養(yǎng)上清液和實施例3中得到的產(chǎn)生#2、#3、#4、#5和#6的雜交瘤的培養(yǎng)上清液，研究在各細胞的細胞表面上的CAPRIN-I蛋白質(zhì)的表達。在I. 5ml容量的微量離心管中離心分離各細胞株分別IO6細胞。向其中添加上述(2)中得到的含有#1的CHO-Kl細胞的培養(yǎng)上清液和實施例3中得到的產(chǎn)生#2、#3、#4、#5和#6的雜交瘤的培養(yǎng)上清液(100 μ I)，在冰上靜置I小時。在用PBS洗滌后，添加用含有O. I % FBS的PBS稀釋500倍的FITC標記山羊抗人IgG (H+L)抗體(SouthernBiotech公司制)和FITC標記抗小鼠IgG(H+L)抗體(Invitrogen公司制)，并在冰上靜置I小時。在用PBS洗滌后，使用 夕卜7 > y >株式會社的FACS Caliber測定熒光強度。另一方面，使用沒有導(dǎo)入抗體基因的CHO-Kl細胞的培養(yǎng)上清液和雜交瘤培養(yǎng)用的培養(yǎng)基進行與上述同樣的操作，制備陰性對照。作為其結(jié)果，添加了 #1、#2、#3、#4、#5和#6的抗體的細胞與對照相比，熒光強度均增強20%以上。具體地，當(dāng)使用#1的抗體時，SK-BR-3表現(xiàn)4700%的熒光強度的增強，MDA-MB-231V表現(xiàn)5500%的熒光強度的增強。另外，當(dāng)使用#2、#3、#4、#5和#6的抗體時，也表現(xiàn)熒光強度的增強。由此可以確認，CAPRIN-I蛋白質(zhì)在上述人癌細胞株的細胞膜表面上表達。并且，上述熒光強度的增強率利用各細胞的平均熒光強度(MFI值)的增加率表示，通過以下算式來算出。平均熒光強度的增加率(熒光強度的增強率)(％) = ((與抗人CAPRIN-I抗體反應(yīng)的細胞的MFI值)-(對照MFI值))+ (對照MFI值)X 100。(4)抗CAPRIN-I抗體#1、#2、#3、#4、#5和#6對癌細胞的抗腫瘤效果(ADCC活性)接著，評價針對CAPRIN-I的抗體#1、#2、#3、#4、#5和#6的對各種人癌細胞的細胞毒活性。將實施例3和上述⑵中得到的產(chǎn)生#1、#2、#3、#4、#5和#6的各細胞培養(yǎng)上清液用Hitrap ProteinA SepharoseFF (GE ’飛社制)純化，置換為PBS (-)，將用O. 22 μ m的過濾器(S V 社制)過濾而得的產(chǎn)物用作活性測定用的抗體。將IO6個人乳癌細胞株MDA-MB-157收集到50ml容量的離心管中，加入IOOyCi的鉻51，在37°C孵育2小時。然后用含有10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基洗滌3次，向96孔V底板中每孔添加各IO3個，作為靶細胞。向其中分別添加上述純化抗體I μ g，進一步地添加5X IO4個從人末梢血按照常規(guī)方法分離的淋巴細胞，在37°C、5% CO2的條件下培養(yǎng)4小時。培養(yǎng)后，測定從受到損傷的腫瘤細胞中釋放的培養(yǎng)上清液中的鉻51的量，算出抗CAPRIN-I抗體對癌細胞的細胞毒活性。在陰性對照中，代替抗體，而使用添加了 PBS的樣品、添加了同種型對照抗體的樣品。作為其結(jié)果，#1、#2和#3對MDA-MB-157分別顯示40%,26. 4%和32. 4%的細胞毒活性(參考圖2)。此外，#4、#5和#6分別顯示31. 0%、30. 9%和19. 0%的細胞毒活性。此時，添加了作為陰性對照的PBS時、和添加了同種型對照抗體時的活性分別為I. 1%,
2.O %。同樣地，研究抗體#1、#2、#3、#4、#5和#6對作為其它的人癌細胞的、神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞株T98G、U373、肺癌細胞株A549、QG56、腎癌細胞株Caki-I、ACHN、宮頸癌細胞株SW756、膀胱癌細胞株T24、食道癌細胞株KYSE180、胃癌細胞株MKN28、MKN45、大腸癌細胞株SW480、白血病細胞株AML5和淋巴瘤細胞株Ramos的細胞毒活性，結(jié)果對T98G，#1顯示為18. 0%的活性、#2 #6顯示為12%以上的活性(同種型對照為I. 3% )，對U373，#l顯示為23. 3%的活性、#2 #6顯示為16%以上的活性(同種型對照為3% )，對A549，#l顯示為36. 3% 的活性、#2 #6顯示為24%以上的活性(同種型對照為2.6% )，對Q G56，#1顯示為33. O %的活性、#2 #6顯示為20%以上的活性(同種型對照為O. 2% )，對Ca k i_l，#1顯示為27. O %的活性、#2 #6顯示為23%以上的活性(同種型對照為3. 0% )，對ACHN，#1顯示為26. 0%的活性、#2 #6顯示為14%以上的活性(同種型對照為I. 5% )，對S W756，#1顯示為29. 7%的活性、#2 #6顯示為16%以上的活性(同種型對照為2. 5% )，對T24，#1顯示為25. 6%的活性、#2 #6顯示為18%以上的活性(同種型對照為2. I % )，對K Y SE180, #1顯示為27. 6%的活性、#2 #6顯示為22%以上的活性(同種型對照為
3.0% )，對MNK28，#1顯示為21. 7%的活性、#2 #6顯示為15%以上的活性(同種型對照為I. 7% )，對MNK45，#1顯示為25. 3%的活性、#2 #6顯示為10%以上的活性(同種型對照為2. 3% )，對S W 480，#1顯示為26. 9%的活性、#2 #6顯示為17%以上的活性(同種型對照為1.3% )，對AML5，#1顯示為13. I %的活性、#2 #6顯示為10%以上的活性(同種型對照為3. 0% )和對Ramos，#1顯示為11. 7%的活性、#2 #6顯示為10%以上的活性(同種型對照為4. 1% )。由以上的結(jié)果表明，獲得的抗CAPRIN-I抗體(#1、#2、#3、#4、#5和#6)損傷了表達CAPRIN-I的各種人癌細胞。(5)抗CAPRIN-I抗體#1、#2和#3對癌細胞的抗腫瘤效果(CDC活性)接著，評價針對CAPRIN-I的抗體#1、#2和#3對癌細胞的細胞毒活性(⑶C活性)。將從兔采集的血液放入Eppendorf管中，在室溫靜置60分鐘后，以3000轉(zhuǎn)/分鐘離心分離5分鐘，由此制備⑶C活性測定用的血清。將IO5個作為人乳癌細胞的MDA-MB-231V收集到50ml容量的離心管中，加入100 μ Ci的鉻51，在37°C孵育2小時后，用含有10% FBS的RPMI培養(yǎng)基洗滌3次。然后用含有上述制備的兔血清50%的RPMI培養(yǎng)基懸浮，向96孔V底板中每孔添加各IO3個。向其中分別添加實施例3和上述(2)中所得的#1、#2和#3各
Iμ g，在37°C、5% CO2的條件下培養(yǎng)4小時。培養(yǎng)后，測定從受到損傷的腫瘤細胞中釋放的培養(yǎng)上清液中的鉻51的量，算出各抗體對MDA-MB-231V的⑶C活性。作為其結(jié)果，#1、#2和#3的抗體均顯示30%以上的⑶C活性。因此，可以明確#1、#2和#3通過⑶C活性，可以損傷表達CAPRIN-I的腫瘤細胞。(6)結(jié)合親和性為了算出上述抗體#1對于CAPRIN-I分子的親和常數(shù)Ka，將實施例2中制作的CAPRIN-I重組蛋白質(zhì)利用Acetate4. 5溶液(GE公司制)制成20 μ g/ml的濃度后，按照常法使用胺偶聯(lián)試劑盒(Amine Coupling Kit) (GE公司制)，并利用胺偶聯(lián)固定法固定在傳感芯片CM5(GE公司制)上。作為比較對照(參考細胞)，使用利用相同方法將20yg/ml的源于牛血清的白蛋白固定了的傳感芯片。將固定了 CAPRIN-I分子的傳感芯片設(shè)置在BIAC0RE2000上，以20 μ L/分鐘的流速流過40 μ L調(diào)制成各濃度(100、80、40、20、10、5、
2.5 μ g/mL)的抗體溶液(分析物)，測定抗體結(jié)合在固定于傳感芯片的CAPRIN-I分子上時的表面等離子體共振角，得到RU值(Resonance Unit)。接著測定流入流動的緩沖液HBS-EP溶液(GE公司制)、抗體從CAPRIN-I分子解離時的共振角，得到此時的RU值。對于比較對 照(參考細胞)的傳感芯片，也同樣地流入抗體溶液，測定固定反應(yīng)時以及解離反應(yīng)時的共振角，得到背景的RU值。在流入各濃度的抗體前，流入Glycine2. 0(GE公司制)，使固定了CAPRIN-I以及源于牛血清的白蛋白的傳感芯片再生，進行下次的樣品測定。由所得的各抗體濃度的RU值、使用親和性分析軟件BIAevaluation求得結(jié)合速度常數(shù)(kj以及解離速度常數(shù)U，算出親和常數(shù)Ka( = kon/koff)，結(jié)果抗體#1的親和常數(shù)Ka為4. 6X IO7M'實施例5小鼠活體內(nèi)的抗CAPRIN-I抗體#1、#2和#3的抗腫瘤效果(I)小鼠腫瘤細胞移植小鼠中的抗腫瘤效果接著，評價獲得的針對CAPRIN-I的抗體#1、#2和#3在荷癌小鼠活體內(nèi)的抗腫瘤效果。使用的抗體與上述同樣，使用將產(chǎn)生#1、#2和#3的各細胞的培養(yǎng)上清液進行柱純化而得的抗體。使用移植了表達CAPRIN-I的小鼠來源的癌細胞株的荷癌小鼠，研究#1、#2和#3的抗體的抗腫瘤效果。在40只Balb/c小鼠(日本SLC社制)的背部皮下以每只5X IO5個的量移植4T1細胞(由ATCC購入)，使腫瘤生長至直徑為5mm左右的大小。其中，對于30只荷癌小鼠，以每只各自200μ g(200l·! I)的量腹腔內(nèi)施與#1、#2和#3的抗體，對于I種抗體施與10只。然后，2天共計3次、向各荷癌小鼠的腹腔內(nèi)施與等量的各抗體，每天測量腫瘤的大小，觀察抗腫瘤效果。另一方面，對剩余的10只荷癌小鼠，施與PBS(-)來代替抗體，將其作為對照組。作為抗腫瘤效果的觀察結(jié)果，對于施與了針對CAPRIN-I的抗體#1、#2和#3的研究組，將開始施與抗體時的腫瘤體積設(shè)為100%時，第4天腫瘤分別萎縮至51%、84%、93%，第6天腫瘤萎縮至31%、56%、70%左右，第8天腫瘤萎縮至9%、34%、54%，第10 14天腫瘤基本完全萎縮(參考圖3)。另一方面，對于施與了 PBS(-)的對照組，在第4天、第6天、第8天、第11天腫瘤分別增大至約230%、290%、470%、800% (參考圖3)。由該結(jié)果表明，獲得的#1、#2和#3的抗體對表達CAPRIN-I的源于小鼠的癌細胞，在活體內(nèi)發(fā)揮強的抗腫瘤效果。其中腫瘤的大小使用長徑X短徑X短徑X0. 5的算式來算出體積。(2)人腫瘤細胞移植小鼠中的抗腫瘤效果接著，對于取得的針對CAPRIN-I的抗體#1在荷癌小鼠活體內(nèi)的抗腫瘤效果進行評價。使用的抗體#1與上述同樣地使用將產(chǎn)生抗體的細胞的培養(yǎng)上清液進行了柱純化而成的抗體。在10只5周齡Balb/c-nu/nu小鼠(日本SLC公司制)的側(cè)腹部以每只IO7個移植表達CAPRIN-I的源于人的癌細胞株Z R75-1 (由ATCC購入)，在細胞移植后第4天開始施與抗體。對于5只荷癌小鼠，以每只200μ g的量腹腔內(nèi)施與抗體#1,作為比較對照組，對于剩余的5只荷癌小鼠，等量施與人IgG對照抗體。然后3天施與I次各抗體，測量腫瘤的大小，觀察抗腫瘤效果。其結(jié)果是在將比較對照組的腫瘤體積的平均值設(shè)為100%時，施與了抗體#1的組在癌細胞移植后第21天，腫瘤體積的平均為66%。接著，對于取得的針對CAPRIN-I的抗體#3在荷癌小鼠活體內(nèi)的抗腫瘤效果進行評價。使用的抗體#3與上述同樣地使用將產(chǎn)生抗體的細胞的培養(yǎng)上清液進行了柱純化而成的抗體。在10只5周齡Balb/c-nu/nu小鼠(日本SLC公司制)的背部皮下以每只IO6個移植表達CAPRIN-I的源于人的癌細胞株MCF7(由ATCC購入)，在腫瘤的直徑變?yōu)?mm左右的大小后，開始施與抗體。作為比較對照組，對于剩余的5只荷癌小鼠，等量施與PBS (-)，測量腫瘤的大小，觀察抗腫瘤效果。其結(jié)果是在將比較對照組的腫瘤體積的平均值設(shè)為100%時，施與了抗體#3的組在癌細胞移植后第26天，腫瘤體積的平均為45%。由該結(jié)果表明，取得的#1和#3的抗體對于表達CAPRIN-I的源于人的癌細胞，在活體內(nèi)發(fā)揮抗腫瘤效果。實施例6抗CAPRIN-I抗體#1、#2、#3、#4、#5和#6所結(jié)合的CAPRIN-1蛋白質(zhì)中的表位的鑒定 使用實施例4(2)中獲得的、與癌細胞的細胞表面反應(yīng)的針對CAPRIN-I的抗體#1、#2、#3、#4、#5和#6，進行由這些抗體識別的CAPRIN-I蛋白質(zhì)中的表位肽的鑒定。合成包含人CAPRIN-I蛋白質(zhì)的氨基酸序列中的12 16個氨基酸的93個候選肽，分別以lmg/ml的濃度用DMSO溶解。將各肽溶解在O. IM碳酸鈉緩沖液(pH值9. 6)中，使其形成30 μ g/ml的濃度，向96孔板'、y ”社制、制品編號436006)的每孔中各添加100 μ I，在4 C靜直一夜。丟棄液體，每孔各添加200 μ I IOmM乙醇胺/0. IM碳酸鈉緩沖液(PH值9. 6)，在室溫下靜置I小時后，舍棄液體，利用含有O. 5% Tween20的PBS(PBST)洗滌2次，由此制作將各肽固相了的板。向其中以每孔50 μ I的量添加實施例4(2)中所得的含有人-雞嵌合單克隆抗體(#1)和小鼠單克隆抗體(#2、#3、#4、#5和#6)的細胞培養(yǎng)上清液，在室溫振搖I小時后，除去液體，利用PBST洗滌3次。接著，向人-雞嵌合單克隆抗體孔中加入將標記了 HRP的抗人IgGdnvitrogen公司制)抗體利用PBST稀釋3000 4000倍而得到2次抗體溶液50 μ 1，向小鼠單克隆抗體中加入將標記了 HRP的抗小鼠IgG(Invitrogen公司制)抗體利用PBST稀釋3000 4000倍而得到2次抗體溶液50 μ I后，除去液體，利用PBST洗滌6次。以每孔100 μ I的量添加TMB底物溶液(Thermo公司制)，并靜置15 30分鐘，進行顯色反應(yīng)。在顏色顯現(xiàn)后，以每孔100μ I的量添加IN硫酸以終止反應(yīng)，使用吸光度計測定450nm和595nm的吸光度值。作為其結(jié)果，作為#1 #6的針對CAPRIN-I的單克隆抗體均識別的CAPRIN-I的部分序列，鑒定有序列編號37的多肽。進而，作為單克隆抗體#1、#4和#5識別的、上述序列編號37的多肽中的部分序列，鑒定有序列編號69的肽，作為單克隆抗體#2、#3和#6識別的、上述序列編號37的多肽中的部分序列，鑒定有序列編號70的肽。因此，判斷序列編號37的多肽包含抗CAPRIN-I抗體#1、#2、#3、#4、#5和#6的表位區(qū)域。產(chǎn)業(yè)可利用性本發(fā)明的抗體可用于癌的治療和/或預(yù)防。
將本說明書中引用的所有刊物、專利和專利申請直接作為參考引入本說明書中。序列表自由文本 序列編號31 36、38、39、64、65 :引物
權(quán)利要求
1.用于癌的治療和/或預(yù)防的藥物組合物，其特征在于，含有與由序列編號2 30中偶數(shù)的序列編號表示的CAPRIN-I的部分多肽具有免疫反應(yīng)性的抗體或其片段作為有效成分，所述CAPRIN-I的部分多肽具有序列編號37所示的氨基酸序列、或與該氨基酸序列具有80%以上的序列同一性的氨基酸序列。
2.用于癌的治療和/或預(yù)防的藥物組合物，其特征在于，含有與由序列編號2 30中偶數(shù)的序列編號表示的CAPRIN-I的部分多肽具有免疫反應(yīng)性的抗體或其片段作為有效成分，所述CAPRIN-I的部分多肽具有在序列編號37所示的氨基酸序列中含有的序列編號69或70所示的氨基酸序列、或與該氨基酸序列具有80%以上的序列同一性的氨基酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的藥物組合物，其中，上述癌是乳癌、腦瘤、白血病、淋巴瘤、肺癌、肥大細胞瘤、腎癌、宮頸癌、膀胱癌、食道癌、胃癌、或大腸癌。
4.根據(jù)權(quán)利要求I 3中任一項所述的藥物組合物，其中，上述抗體為單克隆抗體或多克隆抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求I 4中任一項所述的藥物組合物，其中，上述抗體為人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、或雙特異性抗體。
6.抗體，其是與多肽具有免疫反應(yīng)性的抗體，所述多肽具有序列編號37所示的氨基酸序列、或與該氨基酸序列具有80%以上的序列同一性的氨基酸序列。
7.抗體，其是與多肽具有免疫反應(yīng)性的抗體，所述多肽具有在序列編號37所示的氨基酸序列中含有的序列編號69或70所示的氨基酸序列、或與該氨基酸序列具有80%以上的序列同一性的氨基酸序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的抗體，其對于表達CAPRIN-I蛋白質(zhì)的癌細胞具有細胞毒活性。
9.抗體，其包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，且與CAPRIN-I蛋白質(zhì)具有免疫反應(yīng)性，所述重鏈可變區(qū)包含序列編號40、41和42，所述輕鏈可變區(qū)包含序列編號44、45和46。
10.抗體，其包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，且與CAPRIN-I蛋白質(zhì)具有免疫反應(yīng)性，所述重鏈可變區(qū)包含序列編號48、49和50，所述輕鏈可變區(qū)包含序列編號52、53和54。
11.抗體，其包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，且與CAPRIN-I蛋白質(zhì)具有免疫反應(yīng)性，所述重鏈可變區(qū)包含序列編號56、57和58,所述輕鏈可變區(qū)包含序列編號60、61和62。
12.抗體，其包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，且與CAPRIN-I蛋白質(zhì)具有免疫反應(yīng)性，所述重鏈可變區(qū)包含序列編號73、74和75，所述輕鏈可變區(qū)包含序列編號77、78和79。
13.抗體，其包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，且與CAPRIN-I蛋白質(zhì)具有免疫反應(yīng)性，所述重鏈可變區(qū)包含序列編號81、82和83，所述輕鏈可變區(qū)包含序列編號85、86和87。
14.抗體，其包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，且與CAPRIN-I蛋白質(zhì)具有免疫反應(yīng)性，所述重鏈可變區(qū)包含序列編號89、90和91，所述輕鏈可變區(qū)包含序列編號93、94和95。
15.如權(quán)利要求6 14中任一項所述的抗體，其為人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、單鏈抗體或雙特異性抗體。
16.用于癌的治療和/或預(yù)防的藥物組合物，其特征在于，含有權(quán)利要求6 15中任一項所述的抗體或其片段作為有效成分。
17.如權(quán)利要求16所述的藥物組合物，其中，上述癌為乳癌、腦瘤、白血病、淋巴瘤、肺癌、肥大細胞瘤、腎癌、宮頸癌、膀胱癌、食道癌、胃癌或大腸癌。
18.用于癌的治療和/或預(yù)防的組合藥物，其包含權(quán)利要求I 5中任ー項所述的藥物組合物、或權(quán)利要求16或17所述的藥物組合物；和含有抗腫瘤劑的藥物組合物。
19.癌的治療和/或預(yù)防方法，其包括以下步驟將權(quán)利要求6 15中任一項所述的抗體或其片段、或權(quán)利要求16或17所述的藥物組合物施與受試者。
20.癌的治療和/或預(yù)防方法，其包括以下步驟對受試者合并使用權(quán)利要求18所述的組合藥物的各藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明鑒定在癌細胞的表面特異性地表達的癌抗原蛋白質(zhì)、涉及以癌抗原蛋白質(zhì)為靶的抗體的作為癌的治療和/或預(yù)防劑的用途，具體來說，本發(fā)明提供用于癌的治療和/或預(yù)防的藥物組合物，其特征在于，含有與由序列編號2～30中偶數(shù)的序列編號表示的CAPRIN-1的部分多肽具有免疫反應(yīng)性的抗體或其片段作為有效成分，所述CAPRIN-1的部分多肽具有序列編號37所示的氨基酸序列、或與該氨基酸序列具有80％以上的序列同一性的氨基酸序列。
文檔編號A61K39/395GK102821788SQ20118001734
公開日2012年12月12日 申請日期2011年2月4日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月4日
發(fā)明者岡野文義, 齋藤孝則, 小林真一, 井戶隆喜, 成田義規(guī) 申請人:東麗株式會社