專利名稱：用于細胞內靶向增殖和蛋白質合成的聚陰離子多價大分子的制作方法
技術領域：
總的來說，本發(fā)明涉及使用聚陰離子多價大分子對參與活化細胞的增殖和蛋白質合成的細胞內分子進行靶向的方法和組合物。具體來說，將與多元醇相連的多個硫酸鹽基團特異性靶向增殖和活化細胞的細胞質和細胞核。本發(fā)明還包含新的聚陰離子大分子化合物和制劑。發(fā)明背景和相關技術描述在最近幾十年間，在提高診斷和治療藥物的效能方面已經取得了許多進步。主要的成就是在急性病中做出的。目前，可以高效地治療急性病例如感染性疾病、急性血栓形成或急性血壓調節(jié)異常。大多數用于急性病的藥物治療對健康組織和器官沒有嚴重影響。由于藥物治療的時間短，因此健康組織和器官能夠從不想要的藥物效應中充分恢復。與持續(xù)時間短的急性病藥物治療通常伴隨著短時間藥物暴露，與此相反，慢性病的治療必然伴有人體長期持續(xù)地暴露于所應用的藥物。然而，長期持續(xù)暴露于藥物，往往對健康組織和器官有害。 在最近幾十年間，為了避免對健康組織和器官的不想要的嚴重藥物效應，采取了兩種不同策略。一方面，藥物研究集中在有希望進行疾病特異性的靶向機制表達的新的藥物靶點。就增殖和活化細胞中信號傳導機制的發(fā)現而言，已鑒定到大量新的靶點。然而，除了少數例外情況之外，對大多數新發(fā)現的藥物靶點的治療性攻擊沒有改進治療結果。另一方面，已投入大量努力來提高臨床確立的治療藥物的生物可利用度。為了提高生物可利用度，藥物研究集中于治療性或診斷性效應分子的化學修飾或藥物制劑。過去三十年來，靶向效應子結合物的用途已被確立。具體來說，將能夠誘導診斷或治療效應的分子與具有靶向性質的載體分子相連。由于免疫球蛋白的高結合親和性，蛋白質抗體或抗體片段常常被用作靶向遞送的載體分子。對于腫瘤疾病的治療來說，抗體可以將毒素或化療劑攜帶到腫瘤。由于抗體-效應子結合物與腫瘤的某些靶分子的強烈結合，在腫瘤環(huán)境中獲得了效應子的明顯更高的濃度。同時，在一系列實驗和臨床腫瘤中，已證明抗體-效應子結合物是有效的。靶向遞送效應分子的另一個優(yōu)點是降低了不想要的效應分子效應。詳細來說，沒有與具有靶向性質的載體相連的藥物分子中的大部分沒有到達疾病位點，而是僅僅被施加到人體中以便在血液中獲得所需的藥物濃度。因此，最大部分所施加的藥物從血液循環(huán)中消除，而沒有到達疾病位點。例如，可以被認作慢性病的惡性實體腫瘤在診斷和治療時具有I至10克的大小，因此占人體的O. 01至O. 001%。該比率說明了通過將應用的藥物導向所述疾病，可以顯著優(yōu)化藥物治療，因此能夠減少所用的劑量。然而，盡管在急性病治療中取得了顯著進展，但大多數治療不能實現慢性病的治愈。與急性病相反，大多數慢性病只有在與疾病相關的信號傳導和基因轉錄能夠被選擇性靶向時才可以被治療。為了實現這個目標，治療藥物必須充分透過細胞膜并在疾病的靶細胞內積累。由于基因轉錄和蛋白質合成的關鍵靶分子的遍在性表達，未來的治療藥物必須表現出在疾病位點處的選擇性攝入。未來的治療藥物的后一種特征是極為重要的，因為結合并抑制疾病過程之外的基因轉錄和蛋白質合成的關鍵調控子可能對人體有害。來自于科學研究的結果為超過500種因子在基因轉錄和蛋白質合成中的作用提供了證據。然而，在不同因子中，NF-K B和AP-I是關鍵的，并且已被確立為治療祀點(Letoha等，Mol. Pharmacol. 69:2027，2006 ;Sliva 等，Curr Cancer Drug Targets. 4:327，2004)。這兩種基因轉錄的調控子在細胞的活化和增殖中發(fā)揮核心作用，并且是不同的信號傳導級聯(lián)的下游信號。NF- κ B和AP-I兩者都位于細胞的細胞質和核中。對于NF- κ B和AP-I的治療性靶向來說，藥物必須滿足兩個重要的先決條件。首先，治療藥物必須以足夠的量透過細胞膜并在細胞質內積累。其次，治療藥物必須能夠辨別健康器官或組織中的細胞與疾病過程中的細胞。后一方面是極為重要的，因為NF- κ B和AP-I在人體的每個細胞中表達，這兩種疾病靶點的抑制可能明顯對敏感的人體功能有害。NF-κΒ (核因子-活化B細胞的κ輕鏈增強子)是一種控制DNA轉錄的蛋白質復合物。NF-κ B存在于幾乎所有動物細胞類型中，并參與對刺激因素例如應激、細胞因子、自由基、紫外輻射、氧化型LDL、和細菌或病毒抗原的細胞應答。NF-κ B在調控對感染的免疫應答中發(fā)揮關鍵作用。相反，已將NF-κ B的不正確調控與癌癥、炎性和自體免疫疾病、膿毒性休克、病毒感染和非正常免疫發(fā)育相關聯(lián)。NF- κ B還牽涉突觸可塑性和記憶的過程(Baud 等，Nat Drug Discov. 8:33，2009)。
NF-κ B被真核細胞廣泛用作控制細胞增殖和細胞存活的基因的調控子。因此，許多不同類型的人類腫瘤具有錯誤調控的NF- κ B :也就是說，NF- κ B具有組成型活性。活性NF-kB啟動保持細胞增殖并使細胞免于原本將通過凋亡導致其死亡的狀態(tài)的基因進行表達。NF-κ B的缺陷引起對凋亡的易感性增加，導致細胞死亡增加。因為NF-κ B控制參與炎癥的許多基因，因此在許多炎性疾病例如炎癥性腸病、關節(jié)炎、敗血癥、胃炎、哮喘等中發(fā)現NF- κ B具有長期活性，并不令人吃驚。許多被宣傳具有抗癌和抗炎活性的天然產物(包括抗氧化劑)，也已被顯不抑制 NF-κ B (Kaur 等，Curr Cancer Drug Targets 7:355,2007)?；罨鞍譏 (AP-I)是一種轉錄因子，其是異源二聚體蛋白，由屬于c-Fos、c_Jun、ATF和JDP家族的蛋白質構成。它對各種刺激因素包括細胞因子、生長因子、應激以及細菌和病毒感染作出響應而調控基因表達。AP-I進而控制許多細胞過程，包括分化、增殖和凋亡(Vesely 等，Mutat Res. 682:7，2009)。NF-K B和AP-I的活化引起參與腫瘤生長、凋亡、炎癥、自體免疫疾病和纖維化的大量信號傳導分子的編碼基因的轉錄。細胞因子例如白介素-I、白介素-6、TNF_a或生長因子如TGF-β，代表了 NF-κ B和AP-I活化的最重要的下游信號。具體來說，轉化生長因子β (TGF-β )是高度多效性的細胞因子，其控制細胞功能的許多方面，包括細胞增殖、分化、遷移、凋亡、粘附、血管發(fā)生、免疫監(jiān)視、和存活，因此代表了治療藥物的重要靶點(Jakowlew, Cancer Metastasis Rev 2006;25:435-57)。TGF-β 由許多細胞類型產生，總是存在于血漿中(以其潛伏形式)并滲透所有器官，與基質組分結合并產生這種免疫抑制分子的儲庫。無論如何，它在許多病理條件下過量產生。這包括肺纖維化、腎小球硬化癥、腎間質纖維化、肝硬化、克羅恩病、心肌癥、硬皮病和慢性移植物抗宿主疾病(Prud’ homme等，Lab Invest 2007;87:1077-91)。在腫瘤疾病中，TGF-β抑制早期病變的發(fā)展，但是這種效應后來喪失并且癌細胞產生TGF-β，這種TGF-β然后促進腫瘤轉移。該細胞因子也有助于腫瘤基質的形成、血管發(fā)生和免疫抑制(Jakowlew, Cancer Metastasis Rev2006;25:435-57)。有鑒于此，正在對抑制TGF-β活性的幾種方法進行研究，包括中和抗體、可溶性受體、受體激酶拮抗劑藥物和反義試劑。靶向TGF-β的新療法的益處正在熱切研究中(Prud，homme, Lab Invest 2007; 87:1077-91 ) 對于治療性干預來說，考慮到了其中病理過程以免疫系統(tǒng)的細胞與非細胞組分的缺陷和不受調控的相互作用為特征的所有自體免疫疾病，例如乳糜瀉、I型糖尿病(IDDM)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、干燥綜合征(Sjogren's syndrome)> Churg-Strauss綜合征、多發(fā)性硬化癥(MS)、橋本氏(hashimoto’ s)甲狀腺炎、格雷夫氏(Graves’ )病、特發(fā)性血小板減少性紫癜、阿狄森氏(Addisons)病、貧血癥、關節(jié)強直性脊椎炎、骨關節(jié)炎、白塞氏(Behcets)綜合征、口腔潰瘍、慢性疲勞、慢性阻塞性肺病(C0PD)、克羅恩(Crohns)病、庫興氏(Cushins)病、皰疹樣皮炎、皮肌炎、濕疹、纖維肌痛、脫發(fā)、肝炎、甲狀腺機能減退、扁平苔癬、美尼爾氏(Meniere’s)病、肌無力、萊特爾氏(Reiters)綜合征、肉樣瘤病、硬皮病、敗血癥、干燥綜合征、太陽中毒、SIRS (系統(tǒng)性炎性反應綜合征)和眼色素層炎(Masters等， Annu Rev Immunol2009;27:621-68)。在人類癌癥中，TGF-β通過NF-κ B或API的活化而產生，并通過在早期腫瘤發(fā)生期間降低TGF-β信號傳導和在晚期進展性疾病中增加TGF-β信號傳導兩方面來促進腫瘤發(fā)生。有證據表明，TGF-β調控腫瘤細胞的細胞周期活性，引起對腫瘤細胞增殖的控制。盡管正常細胞和已分化腫瘤細胞的生長被TGF-β阻斷，但未分化腫瘤細胞的生長受到刺激。TGF-β在未分化腫瘤細胞中的刺激作用是由突變的信號傳導途徑造成的。盡管TGF-β對原發(fā)腫瘤細胞的生長有影響，但通過刺激腫瘤細胞外滲，TGF-β是腫瘤轉移的最有力調控子之一。對腫瘤血管發(fā)生的影響是TGF-β刺激腫瘤生長和轉移的另一種機制(Tian等Future Oncol 2009;5:259-71)。已發(fā)現在許多腫瘤中TGF-β的水平升高，例如急性成淋巴細胞白血病、急性骨髓性白血病、腎上腺皮質癌、AIDS相關癌癥、AIDS相關淋巴瘤、星形細胞瘤、基底細胞癌、皮膚癌(非黑素瘤)、膽管癌、膀胱癌、骨癌、纖維組織細胞瘤、腦腫瘤、乳腺癌、支氣管腫瘤、伯基特氏(Burkitt)淋巴瘤、類癌瘤、宮頸癌、慢性淋巴細胞白血病、慢性髓細胞性白血病、慢性骨髓增殖性障礙、結腸癌、皮膚T-細胞淋巴瘤、蕈樣肉芽腫、胚胎性瘤、食管癌、眼癌、膽囊癌、胃癌、胃腸類癌瘤、生殖細胞瘤、神經膠質瘤、毛細胞白血病、頭頸癌、肝細胞(肝)癌、霍奇金氏(Hodgkin)淋巴瘤、胰島細胞瘤、腎(腎細胞)癌、喉癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑素瘤、間皮瘤、骨髓增生異常綜合征、鼻咽癌、卵巢癌、胰腺癌、甲狀旁腺癌、前列腺癌、良性前列腺增生、直腸癌、肉瘤、胃癌、甲狀腺癌、陰道癌(Jones等，Expert OpinTher Targets 2009;13:227-34)。TGF-β的關鍵性作用在心血管系統(tǒng)的疾病中也得到確證。與腫瘤中TGF-β誘導的機制非常類似，在心血管疾病中TGF-β合成的主要刺激因素也是NF-κ B的活化(Frangogiannis, Pharmacol Res 2008;58:88)。TGF- β 已牽涉許多心血管病，例如中風再灌注、局部缺血、心臟病發(fā)作、心肌炎、心內膜炎、心肌機能不全(Goumans等，TrendsCardiovasc2008; 18:293-8)0 TGF-β在新生內膜的發(fā)生和與血管成形術相關的收縮性重塑中具有重要作用。在動脈粥樣硬化中，它的作用尚未完全闡明，但是它控制免疫系統(tǒng)的能力對病變發(fā)生具有深遠影響，特別是通過影響所產生的病變的類型。TGF-β也能誘導動脈發(fā)生并顯著影響血管發(fā)生過程，具有促血管發(fā)生和抗血管發(fā)生兩種效應(Galinka等，AnnuRev Immunol 2009;27:165-97)。它也是各種心血管纖維化病、包括脈管系統(tǒng)、心臟和腎臟中的心血管纖維化病的發(fā)生的主要貢獻者。也已顯示，TGF-β在纖維化的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用。纖維化是在器官或組織中作為補救性或反應性過程而形成或發(fā)生過量的纖維狀結締組織，與作為器官或組織正常組分的纖維組織的形成相反。其實例是胰臟和肺臟的囊性纖維化、可作為肌肉注射的并發(fā)癥出現的注射纖維化、心內膜心肌纖維化、肺臟的特發(fā)性肺纖維化、縱隔纖維化、骨髓纖維化、腹膜后纖維化、進行性大塊纖維化、煤工塵肺的并發(fā)癥、腎源性系統(tǒng)纖維化(Pohlers 等，Biochim Biophys Acta, 2009，1792，746-756)。目前可用的抗TGF-β治療藥物具有幾種缺點。現有的用于治療自體免疫疾病的藥物的顯著缺點是它們的治療窗小。重復施用常常引起不良藥物作用和嚴重器官損傷。心毒性、腎毒性和肝炎是用于治療自體免疫疾病的臨床可用藥物的常見副作用(Cohen, International Journal of Clinical Practice 2007; 1922-1930)。在臨床背景中，大多數現有藥物被間斷施用，以避免不可逆的毒性。然而，間斷性治療計劃增加了疾病發(fā)展的風險。由于這些原因，對用于TGF-β相關疾病治療的更有效和耐受良好的藥物，存在著顯著需求。已知可以通過幾種引起受體信號傳導抑制的方法來抑制TGF-β。然而，這些方法受到體內效能有限和缺少耐受性的限制。阻斷TGF-β的反義寡核苷酸的合成已有描述(Flanders, Clinical Medicine &Research 2003，1，13-20)。反義寡核苷酸能夠減少TGF-β蛋白的合成。然而，這種方法常常引起TGF-β合成的不完全抑制。反義寡核苷酸的另一個缺點是積累在疾病位點處的藥物量少。TGF-β受體的小分子抑制劑(SMI)也是已知的(Hjelmeland 等，Mol Cancer Ther 2004;3:737-745)。這些分子經?？煽诜茫侨鄙僮銐虻哪褪苄院桶踩?。TGF-β受體的已知SMI的毒副作用是由于缺少特異性。已知的化合物不僅抑制TGF-β受體的信號傳導，而且抑制具有結構相似性的許多其他受體。結合TGF-β或阻斷TGF-β與其受體結合的抗體也是已知的。這些分子顯示出在疾病位點處充分積累，并長時間阻斷信號傳導(Saunier等，Curr Cancer Drug Targets2006; 6:565-78 )。然而，抗體具有幾個缺點，這限制了它們的治療性應用。首先，干擾TGF- β的抗體，由于免疫系統(tǒng)被帶有免疫系統(tǒng)組分結合位點的該抗體中的部分所激活，可能行使不想要的副作用。這種免疫系統(tǒng)的激活可能引起治療的毒性。另一個缺點可能是中和抗體的產生。中和抗體的出現經常在多次施用后被觀察到。在中和抗體的情況下，治療的效能降低。由于已知療法的局限，因此需要與活化的NF-K B和AP-I和TGF-β合成升高相關的疾病的新治療方法。新治療方法的終極目標是高效能和良好的耐受性。因此，本發(fā)明的目的是提供化合物和化合物類別，其易于合成并適用于治療與活化的NF-κ B或AP-I和細胞因子例如TGF-β的合成升高相關的疾病。根據本發(fā)明，意外發(fā)現聚陰離子多價大分子代表一類新的治療分子，其將效應分子選擇性遞送到增殖和活化細胞的細胞質和細胞核中。本發(fā)明提出了基于大量硫酸鹽基團在樹枝狀支化大分子載體上的多價組裝的聚陰離子大分子在診斷或治療性效應分子的細胞內遞送中的用途。更具體來說，本發(fā)明包含使用共價連接診斷或治療性效應分子的具有超支化結構的硫酸化多元醇作為藥物，來治療與活化的NF- κ B或AP-I和TGF- β合成升高相關的疾病。發(fā)明概述本發(fā)明的主題是
一種藥物組合物，其包含硫酸化聚甘油以及與所述硫酸化聚甘油共價結合的治療性或診斷性效應分子。
在優(yōu)選實施方案中，藥物組合物具有式P (0S03_M+)n(L-G-E)m，其中P是多元醇大分子，所述多元醇大分子中數量為η的羥基被硫酸鹽基團OSO3IT取代，M是陰離子性硫酸根基團的陽離子性無機或有機反離子，E是治療性或診斷性效應分子，L是P與E之間的連接物或間隔基團，G是用于在L與E之間進行共價連接的反應性基團，m是1-100的數目。在更優(yōu)選的實施方案中，藥物組合物通過將所述硫酸化聚甘油和治療性或診斷性效應分子細胞內攝入到活化細胞或增殖細胞中，并通過在所述細胞中抑制NF-κ B和/或AP-I和/或抑制TGF-β合成，來治療疾病。一種結合物，其包含硫酸化聚甘油以及與所述硫酸化聚甘油共價結合的治療性或診斷性效應分子。在優(yōu)選實施方案中，結合物具有式P(0S03_M+)n(L-G-E)m，其中P是多元醇大分子，所述多元醇大分子中數量為η的羥基被硫酸鹽基團OSO3-M+取代，M是陰離子性硫酸根基團 的陽離子性無機或有機反離子，E是治療性或診斷性效應分子，L是P與E之間的連接物或間隔基團，G是用于在L與E之間進行共價連接的反應性基團，m是1-100的數目。在更優(yōu)選實施方案中，結合物具有式P (0S03_M+)n(L-G-E)m，其中數量為η的羥基被硫酸鹽基團OSO3IT取代，η是大于10的數目。在更加優(yōu)選的實施方案中，其中效應分子占結合物的小于50重量％，并且結合物在水中的溶解度在100mg/mL以上。在更加優(yōu)選的實施方案中，結合物包含硫酸化聚甘油以及與所述硫酸化聚甘油共價結合的治療性或診斷性效應分子，其通過細胞內攝入到活化細胞或增殖細胞中，并通過在所述細胞中抑制NF- κ B和/或AP-I和/或抑制TGF- β合成，來治療疾病。在更加優(yōu)選的實施方案中，結合物包含硫酸化聚甘油以及與所述硫酸化聚甘油共價結合的治療性或診斷性效應分子，用于治療選自癌癥、炎癥、自體免疫疾病和纖維化的疾病。在更加優(yōu)選的實施方案中，結合物包含硫酸化聚甘油以及與所述硫酸化聚甘油共價結合的治療性或診斷性效應分子，其通過所述硫酸化聚甘油和治療性或診斷性效應分子細胞內攝入到活化細胞或增殖細胞中，并通過在所述細胞中抑制NF-κ B和/或AP-I和/或抑制TGF- β合成，來治療疾病，其中以每次給藥lmg/kg至1000mg/kg的劑量執(zhí)行多次治療。在更加優(yōu)選的實施方案中，結合物包含a)聚合的聚甘油P，其由多官能起始分子上具有式(RO-CH2)2CH-OR的甘油重復單元構成，所述多官能起始分子是具有I至1，000個OH基團的多羥基化合物，其中R是H或其他甘油單元，所述核心具有O至67%的支化度和500至1，000，000g/mol的平均分子量，b)所述甘油單元的多個OH基團被-OSO3H 或-OSCVM+取代，其中-OSO3H或_0S03_M+基團的優(yōu)選數目大于10，并且獲得30至100%的硫酸化度X，其中M+是陽離子性無機或有機反離子，c)所述硫酸化聚甘油由此產生的平均分子量為1，000至5，000, 000g/mol,d)帶有官能團G的連接物單元L，其連接于至少一個OH基團直至最多100-X%的OH基團，其中所述官能團能夠與其他治療性或診斷性效應分子結合，其中X是硫酸化度，e)診斷性和/或治療性效應分子，其共價連接于一個直至最大可能數量的所述官能團，所述診斷性效應分子選自熒光染料或用于放射活性或順磁性金屬的螯合劑，所述治療性效應分子選自細胞抑制劑、抗血管生成藥物、光敏化劑、siRNA。在更加優(yōu)選的實施方案中，結合物具有式P (OSO3IT)n(L-G-E)m，其中L是支鏈或直鏈C1J-烷基，所述烷基中一個或多個不連續(xù)的亞甲基可以被選自O、S、NH、C(O)NH, C(O),so2、so、芳基、乙烯或乙炔的基團代替，并且其中G選自-oh、-oso3h、-oso3_、-nh2、-n3、-cooh、-sh、-so3'-c = Co一種具有通式P(OSCVlT)n(L-G)ni的硫酸化聚甘油，其通過細胞內攝入到活化細胞或增殖細胞中并通過在所述細胞中抑制NF-κ B和/或AP-I和/或抑制TGF-β合成來治療疾病，其中P表示聚甘油，所述聚甘油中數量為η的羥基被硫酸鹽基團OSO3-M+取代，M是陰離子性硫酸根基團的陽離子性無機或有機反離子，m是1-100的數目，L是連接物，G是用于與效應分子共價連接的反應性基團，其中L是支鏈或直鏈C1,-烷基，所述烷基中一個或多個不連續(xù)的亞甲基可以被選自O、S、NH、C(O)NH, C(O)、SO2, S0、芳基、乙烯或乙炔的基團代替，并且其中 G 選自-OH、-OSO3H' -OSO3' -NH2、-N3> -C00H、_SH、-SO3' -C = C。 在更優(yōu)選的實施方案中，硫酸化聚甘油通過細胞內攝入到活化細胞或增殖細胞中，并通過在所述細胞中抑制NF- κ B和/或AP-I和/或抑制TGF- β合成，來治療選自癌癥、炎癥、自體免疫疾病和纖維化的疾病。在更加優(yōu)選的實施方案中，硫酸化聚甘油通過細胞內攝入到活化細胞或增殖細胞中，并通過在所述細胞中抑制NF- κ B和/或AP-I和/或抑制TGF- β合成，來治療選自癌癥、炎癥、自體免疫疾病和纖維化的疾病，其中以每次給藥lmg/kg至1000mg/kg的劑量執(zhí)行多次治療。硫酸化聚甘油用于將治療性或診斷性效應分子遞送到對象的活化或增殖細胞內的用途，所述硫酸化聚甘油按照以下形式包含硫酸化聚甘油以及與所述硫酸化聚甘油共價結合的治療性或診斷性效應分子的結合物和在優(yōu)選實施方案中，式P(OSO3If)n(L-G-E)ni的結合物，其中P是多元醇大分子，所述多元醇大分子中數量為η的羥基被硫酸鹽基團OSO3-M+取代，M是陰離子性硫酸根基團的陽離子性無機或有機反離子，E是治療性或診斷性效應分子，L是P與E之間的連接物或間隔基團，G是用于在L與E之間進行共價連接的反應性基團，m是1-100的數目和在更優(yōu)選的實施方案中，式P(0S03_M+)n(L-G-E)m的結合物，其中數量為η的羥基被硫酸鹽基團OSO3IT取代，η是大于10的數目。硫酸化聚甘油用于將治療性或診斷性效應分子遞送到對象的活化或增殖細胞內的用途，，所述硫酸化聚甘油按照以下形式通式P(OSO3IT)n(L-G)m的硫酸化聚甘油，其通過細胞內攝入到活化細胞或增殖細胞中并通過在所述細胞中抑制NF- κ B和/或AP-I和/或抑制TGF- β合成來治療疾病，其中P表示聚甘油，所述聚甘油中數量為η的羥基被硫酸鹽基團OSO3-M+取代，M是陰離子性硫酸根基團的陽離子性無機或有機反離子，m是1-100的數目，L是連接物，G是用于與效應分子共價連接的反應性基團，其中L是支鏈或直鏈CV2tl-烷基，所述烷基中一個或多個不連續(xù)的亞甲基可以被選自O、S、NH、C (O) NH、C (O)、SO2, S0、芳基、乙烯或乙炔的基團代替，并且其中 G 選自-OH、-OSO3H, -OSO3' -NH2, -N3> -C00H、_SH、-SO3' -C = C和在更優(yōu)選的實施方案中，通過細胞內攝入到活化細胞或增殖細胞中并通過在所述細胞中抑制NF-κ B和/或AP-I和/或抑制TGF-β合成來治療選自癌癥、炎癥、自體免疫疾病和纖維化的疾病的硫酸化聚甘油。在更加優(yōu)選的實施方案中，涉及硫酸化聚甘油的用途，其中所述治療性或診斷性效應分子被共價連接到所述硫酸化聚甘油。硫酸化聚甘油的無水制劑，其按照如下形式包含硫酸化聚甘油以及與所述硫酸化聚甘油共價結合的治療性或診斷性效應分 子的結合物。硫酸化聚甘油的無水制劑，其按照如下形式通式P(OSO3IT)n(L-G)m的硫酸化聚甘油，其通過細胞內攝入到活化細胞或增殖細胞中并通過在所述細胞中抑制NF- κ B和/或AP-I和/或抑制TGF- β合成來治療疾病，其中P表示聚甘油，所述聚甘油中數量為η的羥基被硫酸鹽基團OSO3-M+取代，M是陰離子性硫酸根基團的陽離子性無機或有機反離子，m是1-100的數目，L是連接物，G是用于與效應分子共價連接的反應性基團，其中L是支鏈或直鏈CV2tl-烷基，所述烷基中一個或多個不連續(xù)的亞甲基可以被選自O、S、NH、C (O) NH、C (O)、SO2, S0、芳基、乙烯或乙炔的基團代替，并且其中 G 選自-OH、-OSO3H, -OSO3' -NH2, -N3> -C00H、_SH、-SO3' -C = C。在更加優(yōu)選的實施方案中，無水制劑通過細胞內攝入到活化細胞或增殖細胞中，并通過在所述細胞中抑制NF- κ B和/或AP-I和/或抑制TGF- β合成，來治療疾病。在更加優(yōu)選的實施方案中，無水制劑用于治療選自癌癥、炎癥、自體免疫疾病和纖維化的疾病。在更加優(yōu)選的實施方案中,無水制劑以每次給藥lmg/kg至1000mg/kg的劑量執(zhí)行
多次治療。在更加優(yōu)選的實施方案中，無水制劑包含含有緩沖鹽和/或選自蔗糖、甘露糖、海藻糖的至少一種低溫防護劑的冷凍干燥物。附圖簡述圖I是具有樹枝狀聚甘油骨架的大分子聚陰離子聚硫酸的示例性化學結構的示意圖。起始分子是TMP。該式顯示了樹枝狀、超支化、硫酸化聚甘油的主要結構實體。各種衍生物的合成描述在實施例I和2中。圖2是具有聚(酰胺基胺)樹枝狀化合物骨架(Biocon jug. Chem. 20:693, 2009)的大分子聚陰離子聚硫酸的示例性化學結構的示意圖。樹枝狀化合物的硫酸化與聚甘油同樣地執(zhí)行。該式顯示了具有90%平均硫酸化的化合物。圖3是具有Boltorn聚酯樹枝狀化合物骨架(Bioconjug. Chem. 14:817, 2003)的大分子聚陰離子聚硫酸的示例性化學結構的示意圖。樹枝狀化合物的硫酸化與聚甘油同樣地執(zhí)行。該式顯示了具有83%平均硫酸化的化合物。圖4顯示了具有實施例2的連接物的硫酸化聚甘油。所述實施例包括具有硫酸化甘油的代表性結構亞單元和連有連接物的亞單元的大分子硫酸化聚甘油骨架(球泡)的示意圖。圖5顯示了硫酸化聚甘油與實施例3的屬于花青染料類型的診斷性效應分子的結合物。所述實施例包括具有硫酸化甘油的代表性結構亞單元和連有連接物和效應分子的亞單元的大分子硫酸化聚甘油骨架(球泡)的示意圖。圖6顯示了硫酸化聚甘油與實施例4的屬于螯合劑類型的用于放射標記的診斷性效應分子(放射診斷和放射療法)的結合物、以及與實施例5的用于MRI的金屬絡合物的結合物。實施例包括具有硫酸化甘油的代表性結構亞單元和連有連接物和效應分子的亞單元的大分子硫酸化聚甘油骨架(球泡)的示意圖。圖7顯示了硫酸化聚甘油與實施例6的屬于光敏化劑、細胞抑制劑(苯丁酸氮芥和紫杉醇)和siRNA類型的治療性效應分子的結合物。所述實施例包括具有硫酸化甘油的代表性結構亞單元和連有連接物和效應分子的亞單元的大分子硫酸化聚甘油骨架(球泡)的示意圖。圖8顯示了在細胞化學染色(使用DAPI的核染色)中，體外溫育I小時的A549人類肺癌細胞對不同分子量的熒光三甘油或聚甘油結合物(ICC染料)的細胞攝取(實施例7)。圖9顯示了在細胞化學染色(使用DAPI的核染色)中，體外溫育4小時的A549人類肺癌細胞對ICC-三甘油結合物和硫酸化大分子肝素和硫酸化聚甘油(實施例3c)的細胞攝取。只有硫酸化聚甘油(SPG)集中在細胞內(實施例8)。

圖10通過流式細胞測量分析(FACS)顯示出單核細胞能夠以非常高的量攝入硫酸化聚甘油(實施例3c的化合物)，而淋巴細胞僅顯示出少量攝取(實施例9)。圖11證實了硫酸化聚甘油誘導TGF-β -I從CASKI細胞釋放的統(tǒng)計學顯著的抑制。將細胞處理48小時，并通過ELISA檢測培養(yǎng)上清液中的TGF-β -I (實施例10)。圖12顯示出通過SPR/Biacore測量到硫酸化聚甘油(SPG)、帶有連接物的硫酸化聚甘油(SPGL)和帶有效應分子的結合物以高親和性與細胞內轉錄因子NF-κ B結合。結合親和性隨硫酸化程度和分子量的增加而增加，其由IC5tl值的降低所顯示。連接物和效應分子不妨礙結合親和性(實施例11)。圖13強調了硫酸化聚甘油誘導肺A549腫瘤細胞生長(圖13A)和代謝活性(圖13B)的統(tǒng)計學顯著和生物學相關的抑制。將A549細胞與硫酸化聚甘油一起培養(yǎng)7天，并檢測細胞數量和代謝活性。顯示了培養(yǎng)7天后腫瘤細胞數量(A)和MTT試驗(B)的結果(MW±SD)(實施例 12)。圖14顯示了用硫酸化聚甘油或PBS (對照)治療的裸鼠(A549肺癌模型)的腫瘤體積的時間過程。在治療45天后，日劑量為30mg/kg體重的硫酸化聚甘油(化合物P3)抑制腫瘤生長，顯示出強治療效果(實施例13)。圖15證實了用硫酸化聚甘油每日皮下治療患有膠原蛋白誘導的關節(jié)炎的大鼠和健康對照的效果。在用硫酸化聚甘油以30mg/kg的日劑量治療后，臨床評分值、滑膜中的肥大細胞數量和炎性浸潤受到影響，表明了顯著的治療結果(實施例14)。圖16顯示了患有膠原蛋白誘導的類風濕性關節(jié)炎的麻醉大鼠的熒光圖像，其中硫酸化聚甘油與花青染料的結合物(化合物P26/E2，實施例3b)快速和大量攝取，并且患關節(jié)炎的關節(jié)中的熒光對比度(10分鐘)隨著疾病活性而增加(從低至高，評分值為I至3)。箭頭指示具有高熒光對比度的患關節(jié)炎的關節(jié)(實施例17)。、
圖17顯示了在皮膚炎癥(接觸性超敏反應)的小鼠模型中，硫酸化聚甘油與用64Cu放射性標記的DOTA的結合物(化合物P17/E13，實施例4a)的PET圖像。麻醉小鼠的圖像在發(fā)炎的耳組織中顯示出高對比度。箭頭指示發(fā)炎區(qū)域(實施例18)。圖18證實了硫酸化聚甘油與紫杉醇(泰素)的結合物(實施例6b的化合物)與沒有結合的紫杉醇(泰素)相比，增加了肺腫瘤細胞A549的細胞生長和代謝活性的抑制。顯示了在培養(yǎng)48小時后的腫瘤細胞數量(圖18A)和MTT試驗(圖18B)的結果(麗土SD，n=4)(實施例19)。圖19顯示了在與結合有VEGF-siRNA的硫酸化聚甘油(SPG)(實施例6e)或單獨的VEGF-siRNA溫育后，A549肺癌細胞系中的VEGF生產。在48h條件細 胞培養(yǎng)基中通過ELISA測量VEGF蛋白。每個柱是來自于三次獨立實驗的三個測量值的平均值土SEM (實施例 20)。圖20顯示了本發(fā)明的ICG (圖20a)、ICG類似物(圖20b)的化學結構，以及用作診斷效應分子的優(yōu)選衍生物的結構(圖20c-d)。圖21顯示了在O. 9%NaCl中，硫酸化聚甘油與花青染料的結合物(化合物P17/E1，實施例3c)的熒光由于聚集而降低。發(fā)明詳述本發(fā)明的目的是提供用于治療腫瘤疾病、炎癥、自體免疫疾病和纖維化的藥物，所述藥物的特征在于治療有效性高和耐受性良好。本發(fā)明的聚陰離子多價大分子特別是由于其令人吃驚的高效能和即使在施用高劑量后的良好耐受性，適用于將效應分子遞送到增殖和活化細胞的細胞質和細胞核中，以診斷和治療腫瘤疾病、炎癥、自體免疫疾病和纖維化。一條系統(tǒng)研究過的細胞途徑是具有高分子量的大分子的胞吞作用。胞吞作用是細胞通過將分子(例如大分子)與它們的細胞膜一起吞入，借以從細胞外部吸收所述分子的過程。它是被身體的所有細胞利用的通用機制，因為對細胞重要的大多數物質和底物是大的極性分子，不能通過疏水的質膜或細胞膜。胞吞作用過程在健康細胞和參與疾病過程的細胞兩者中都存在(Liu 等，PLOS Biology 2009; 7:1000204)。特別是當大分子結構的大分子或基于粒子的實體(有機或無機納米粒子)到達細胞膜時，涉及到胞吞作用機制。因此，通過使用大分子載體分子，已實現了靶向性質提高的藥物的設計。具體來說，已經合成了品種廣泛的聚合實體或樹枝狀化合物(ori等,Adv DrugDeliv Rev. 57:609，2005 ；Haag 等，Angew. Chem. Int. Ed. 45:1198, 2006)。對于分子的靶向性質來說，大分子的化學修飾已被廣泛接受。大量證據表明，置于大分子上的陽離子結構能夠使大分子通過胞吞作用跨過細胞膜。就此而言，陽離子大分子被用于診斷和治療效應子的細胞內遞送(Paleos等,Curr Top Med Chem. 8:1204，2008)。然而，由于人類生物體中每個細胞運用胞吞作用機制的普遍能力，陽離子大分子被每個細胞攝入。因此，藥物遞送涉及具有陽離子元件的組分和結構(例如W02009142893)。這引起藥物治療的許多不想要的效應和毒性，以及藥物在不希望的身體區(qū)室中的沉積。陽離子肽穿膜肽(Penetratin)被鑒定為NF-κ B 的細胞內抑制劑(Letoha 等，Mol. Pharmacol. 69:2027，2006)。已知由于完整細胞的細胞膜的負電荷引起排斥并阻止細胞膜滲透，因此大多數陰離子結構不被細胞攝取。已經描述了品種廣泛的具有聚陰離子狀態(tài)的大分子實體。其中包括天然存在的化合物例如蛋白聚糖、脂質雙層表面、微管和多核苷酸例如DNA或RNA。它們在基因轉錄和蛋白質合成中發(fā)揮中心作用。其他化合物是人造的聚合大分子或樹枝狀化合物例如聚氨基酸、聚羧酸鹽和合成的寡核苷酸。由于完整細胞的細胞膜的負電荷，因此可以預期聚陰離子大分子與細胞膜的靜電相互作用可能引起排斥并阻止細胞膜滲透。因此，不知道聚陰離子大分子是否可用于將效應分子遞送到增殖和活化細胞的細胞質和細胞核中。事實上，由于單獨作為藥物效應子給藥的RNA或siRNA不能充分集中在細胞中，因此已經做出大量努力以借助陽離子性或特殊載體分子將RNA或siRNA遞送至細胞內區(qū)室(Jeong等，Bioconjug. Chem. 20:5，2009)。原則上，已知有許多大分子化合物已被用作藥物遞送載體。這些大分子可以在它們的聚合或樹枝狀骨架的化學結構類型、陰離子頭部電荷的附著、分子量和從完全線性至超支化結構范圍內的支化程度方面有差異。聚合骨架的化學性質可以源自于聚合反應以引起多分散分子量分布、或被適度合成以提供具有限定的結構和分子量的樹枝狀化合物。經過充分研究的實例是聚酰胺基胺(PAMAM)、聚賴氨酸(PU、聚乙烯亞胺(PEI)，它們都被合成為直鏈或支鏈結構的多分散聚合物、或限定化學結構的樹枝狀化合物。對于本技術領域的專業(yè)人員來說，已知大分子實體例如PAMAM、PEI、PL等的細胞攝取的普遍潛在機制是基于如上討論的胞吞途徑。關于大分子藥物遞送的其他信息可以在下列文獻 中發(fā)現Saovapakhiran 等，Bioconjug. Chem. 20:693，2009 ；Seib 等，J. Contr. Release117:291, 2007 ；Nori 等，Adv Drug Deliv Rev. 57:609, 2005 ；Haag 等，Angew. Chem. Int.Ed. 45:1198，2006。令人吃驚的是，已發(fā)現硫酸化多元醇化合物類型的樹枝狀聚陰離子大分子通過特異性機制集中于細胞內。相同分子量但是不具有硫酸鹽基團的多元醇不能集中在人類A549肺癌細胞中。具體來說，將具有5kDa至208kDa范圍內的分子量不同但不具有硫酸鹽基團、因此僅具有多元醇骨架上的游離羥基的超支化樹枝狀聚甘油用熒光羰花青染料(ICC)標記，以比較性測量在人類A549肺癌細胞中的細胞內攝入。本發(fā)明人驚訝地發(fā)現，如果不帶有多個硫酸鹽基團，只有分子量為120kDa及以上的大分子才能通過胞吞作用被人類A549肺癌細胞攝入。此外，分子量最高20kDa并且不具有硫酸鹽基團的超支化樹枝狀聚甘油不能通過胞吞作用跨過細胞膜(實施例7，圖2)，而分子量最高20kDa的硫酸化聚甘油被集中在細胞內。由于硫酸化的樹枝狀聚甘油被攝入到細胞內，這清楚地顯示出硫酸化的樹枝狀聚甘油與非硫酸化的樹枝狀聚甘油相比的優(yōu)勢。還已發(fā)現，當裝配在大分子載體上的硫酸鹽基團的數量低于某個值時，低聚硫酸鹽不顯示出細胞內集中，并且對NF-κ B不具有適度的結合親和性。與花青染料結合的基于甘油的支化硫酸化樹枝狀化合物(第一代具有4個硫酸鹽，第二代具有8個硫酸鹽，第三代具有16個硫酸鹽)，在所有情況下都顯示出對NF-κ B的結合親和性為IC5(I>1000(本發(fā)明的實施例11)?？梢缘贸鼋Y論，大量硫酸鹽基團在聚合或樹枝狀載體骨架上的多價裝配，是導致令人吃驚地鑒定到的細胞內集中以及轉錄因子NF-κ B各AP-I的結合的性質的關鍵允許因素，并且對硫酸鹽基團的最少數量有要求。因此，優(yōu)選的是表現出數量超過10個硫酸鹽基團、更優(yōu)選超過15個硫酸鹽基團、更加優(yōu)選超過20個硫酸鹽基團、最優(yōu)選超過25個硫酸鹽基團的硫酸化聚甘油和硫酸化聚甘油結合物。因此，新的創(chuàng)造性性質是當陰離子電荷以多個裝配在大分子中時，陰離子電荷能夠起到進入細胞內部的特異性載體和效應子的功能，用于增殖和蛋白質合成的細胞內靶向。更具體來說，將陰離子性硫酸根基團共價連接到大分子載體分子上，引起上述令人吃驚地鑒定到的細胞內集中以及轉錄因子NF-κ B和AP-I的結合以及TGF-β合成的抑制的性質。根據本發(fā)明，令人吃驚地發(fā)現，分子大小低于通過胞吞作用過程集中于細胞內部的大分子性質(正如對不具有硫酸鹽基團的聚甘油所顯示的，其需要高得多的分子量才能集中于細胞中；參見上文)的硫酸化聚甘油，通過不涉及胞吞作用的特異性機制被特異性運輸到細胞內。詳細來說，關于使用分子量低于20kDa的硫酸化聚甘油的運輸機制的研究，為目前尚不了解的用于有機陰離子大分子的內流泵提供了證據。所述內流泵特異性存在于增殖和活化細胞中。在生理pH范圍內利用聚陰離子特征的聚合物或樹枝狀化合物可以是磺酸鹽、硫酸鹽、膦酸鹽、磷酸鹽、羧酸鹽。向大分子中以合成導入這些基團是多種多樣的；一種合理的方式是將多元醇的羥基轉變成硫酸鹽以提供聚硫酸鹽。反應條件決定轉化程度(詳情參見下文)。硫酸化聚甘油首先由Tiirk等作為一類新的聚陰離子大分子描述(BioconjugateChemistry 15，2004，162-167)。WO 2008/015015描述了發(fā)現抑制凝血的不同物質。從該現 有技術公布中，沒有關于細胞內集中和選擇性結合于NF-κ B和AP-I以及抑制TGF-β釋放的提示?；谂c二磺酸化萘偶聯(lián)的聚酰胺基胺(PAMAM)或聚賴氨酸骨架的聚陰離子樹枝狀化合物，已知作為殺微生物藥物候選物用于預防HIV (McCarthy等，Molecular Pharmaceutics 2005, 2, 312-318 ；ffitvrouw 等，MolecularPharmacol. 2000, 58, 1100-1108)。所述化合物靶向病毒粒子細胞膜上的受體。從這些數據不能推導出能夠在人類細胞系中實現細胞內靶向。在高于ED5tl濃度2500倍的濃度下，觀察到細胞滲透，其表明細胞滲入的非特異性機制。此外，意外地發(fā)現聚陰離子多元醇適合于將診斷和治療性效應分子遞送到靶細胞中，因此可用作治療藥物的載體。W093018793描述了用于遞送到內皮細胞的聚陰離子藥物結合物的制備。在W093018793中概述的實施例涉及用于內皮細胞靶向遞送的肝素藥物結合物的制備。提供了肝素藥物結合物結合到內皮細胞膜上的證據。沒有提供關于肝素藥物結合物適合于將藥物遞送到內皮細胞的細胞質的信息。與W093018793 —致，本發(fā)明人發(fā)現，肝素不能以適宜的濃度跨過細胞膜，并且不能將診斷效應子遞送到細胞內。肝素的分子量在7kDa至30kDa范圍內，低于胞吞性細胞內攝取所需的大小。此外，本發(fā)明的實驗結果由此證實了肝素不能集中于細胞內(本發(fā)明的實施例8)。更具體來說，對于本發(fā)明來說，治療性效應子是能夠直接或間接誘導針對靶細胞的抑制或毒性效應的分子。與增殖和活化不可缺少的某個細胞內靶點結合的治療性效應子代表直接效應子。本發(fā)明人驚訝地發(fā)現，屬于硫酸化聚甘油類型的聚陰離子多元醇，由于與NF-κ B和AP-I強烈結合而表現出強且持續(xù)時間長的細胞內積累(實施例8)。相反，不具有硫酸鹽基團的多元醇在溫育停止后快速從細胞的細胞質中消除(實施例7)。概括來說，本發(fā)明人驚訝地發(fā)現，聚陰離子多元醇以高親和性結合于細胞內靶分子，由此防止快速消除。這種意外發(fā)現的性質證實了與基于多元醇的載體骨架相連的多個硫酸鹽基團表現出直接治療效應，因此根據本發(fā)明，硫酸鹽基團是直接效應子。本發(fā)明人證實這些針對NF-κ B的效應子非常有效地抑制TGF-β的合成(實施例10)。由于TGF-β是自體免疫疾病、敗血癥、SIRS、纖維化、癌癥和心血管疾病中的主要介導物，因此能夠觀察到最終的治療效果。
基于上面鑒定和描述的性質，發(fā)現硫酸化多元醇最適合用于將其他診斷和治療性效應分子遞送到細胞內。這些對本發(fā)明來說的間接治療效應子是能夠不依賴于NF- κ B和AP-I的活性抑制而誘導對靶細胞的其他抑制或毒性效應的分子。因此，聚陰離子多元醇的特別性質是將治療和診斷性效應子遞送到細胞內，其顯示出與單獨的相應治療和診斷性分子相比，在細胞內的積累和攝入持續(xù)時間更長。治療和診斷性分子與屬于聚甘油類型的硫酸化多元醇共價結合，由此在硫酸化聚甘油與治療和診斷性效應子之間產生結合物。因此，有鑒于上面概述的發(fā)現，本發(fā)明包含使用聚陰離子大分子來靶向參與活化細胞的增殖和蛋白質合成的細胞內分子。在具體情況中，與多元醇相連的多個硫酸鹽基團被特異性靶向增殖和活化細胞的細胞質和細胞核。已發(fā)現，所述靶向與胞吞作用的已知細胞攝取機制和已知發(fā)生在每種細胞類型中的大分子攝取具有本質上的不同。本發(fā)明證實了 聚陰離子大分子在低于胞吞作用途徑的分子量下是有效的，并且對于活化和增殖細胞是選擇性的(實施例8和實施例9)。專業(yè)技術人員理解，活化細胞是代謝活性提高的細胞?；罨毎梢酝ㄟ^MTT測定法來鑒定。此外，細胞活化可以通過在不同細胞類型例如分離的外周血單核細胞或造血細胞系的上清液中檢測不同的炎性細胞因子來證實。因此，根據本發(fā)明，活化細胞包括免疫系統(tǒng)的細胞或腫瘤細胞。免疫系統(tǒng)的細胞可以是例如單核細胞、巨噬細胞或淋巴細胞。在上述發(fā)現的基礎上，本發(fā)明包括具有下列通式的化合物的用途P (0S03_M+)n(L-G-E)m，其中P=其中多個羥基被硫酸鹽基團OSO3If取代的大分子，硫酸根基團的數量優(yōu)選為n>10，M=陰離子性硫酸根基團的陽離子性無機或有機反離子，E=治療性或診斷性效應分子，L=P與E之間的連接物或間隔基團，G是用于在L與E之間連接的反應性基團，m=0-100。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明包括通式P (OSO3IT)n(L-G-E)m的化合物的用途，其中P=其中多個羥基被硫酸鹽基團OSO3IT取代的多元醇，硫酸根基團的數量優(yōu)選為n>10，M=陰離子性硫酸根基團的陽離子性無機或有機反離子，E=治療性或診斷性效應分子，L=P與E之間的連接物或間隔基團，G=用于在L與E之間連接的反應性基團，m=0-100o在更優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明包括通式P (OSO3IT)n(L-G-E) m的化合物的用途，其中P=其中多個羥基被硫酸鹽基團OSO3-M+取代的聚甘油，硫酸根基團的數量優(yōu)選為n>10，M= 陰離子性硫酸根基團的陽離子性無機或有機反離子，E=治療性或診斷性效應分子，L=P與E之間的連接物或間隔基團，G=用于在L與E之間連接的反應性基團，m=0-100o共價連接了治療性或診斷性效應分子的聚陰離子多元醇是新的，并且以前未被描述過。因此，本發(fā)明包括具有下列通式的化合物P (0S03_M+)n(L-G-E)m，其中P=其中多個羥基被硫酸鹽基團OSO3IT取代的多元醇，硫酸根基團的數量優(yōu)選為n>10，M=陰離子性硫酸根基團的陽離子性無機或有機反離子，E=治療性或診斷性效應分子，L=P與E之間的連接物或間隔基團，G=用于在L與E之間連接的反應性基團，m=l-100。具有共價連接的連接物單元以與治療性或診斷性效應分子共價結合的聚陰離子多元醇是新的，并且以前未被描述過。因此，本發(fā)明包括具有下列通式的化合物P (0S03_M+)n(L-G-E)m，其中P=其中多個羥基被硫酸鹽基團OSO3IT取代的多元醇，硫酸根基團的數量優(yōu)選為n>10，M=陰離子性硫酸根基團的陽離子性無機或有機反離子，E=治療性或診斷性效應分子，L- = P與E之間的連接物或間隔基團，G=用于在L與E之間連接的反應性基團，m=l-100。在更優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明包括通式P(0S03_M+)n(L-G-E)m的化合物，其中P=其中多個羥基被硫酸鹽基團OSO3-M+取代的聚甘油，硫酸根基團的數量優(yōu)選為n>10，M=陰離子性硫酸根基團的陽離子性無機或有機反離子，E=治療性或診斷性效應分子，L=P與E之間的連接物或間隔基團，G=用于在L與E之間連接的反應性基團，m=l-10。具有共價連接的連接物單元以與治療性或診斷性效應分 子共價結合的硫酸化聚甘油是新的，并且以前未被描述過。因此，本發(fā)明包括具有下列通式的化合物P(0S03_M+)n(L-G-E)m，其中P=其中多個羥基被硫酸鹽基團OSO3IT取代的聚甘油，硫酸根基團的數量優(yōu)選為n>10，M=陰離子性硫酸根基團的陽離子性無機或有機反離子，L=用于P與E之間共價連接的連接物或間隔基團，G=用于在L與E之間連接的反應性基團，
m=l-100o硫酸根基團的可能數量取決于大分子的分子量。作為具體實施方案，大分子基于聚甘油，所述聚甘油由甘油單元的重復單元構成，每個單元能夠在大分子中提供一個OH基團。例如，根據理論單分散分子計算，10，000g/mol的聚甘油核心能夠提供135個OH基團，2，000g/mol的聚甘油核心能夠提供27個OH基團(參見下面進一步的解釋)。在實施方案的更詳細描述中，本發(fā)明的化合物是硫酸化聚甘油，其包含a)聚合的聚甘油核心，其由多官能起始分子上的具有式(RO-CH2)2CH-OR的甘油重復單元構成，所述多官能起始分子是具有I至1，000個OH基團、優(yōu)選I至4個OH基團的多羥基化合物，其中R是H或其他甘油單元，所述核心具有O至67%、優(yōu)選20至67%、更優(yōu)選高于 60% 的支化度，以及 500 至 1，000, 000g/mol、優(yōu)選 2，000 至 20，000g/mol、更優(yōu)選 4，000至15，000g/mol、最優(yōu)選7，000至10，000g/mol的平均分子量，b)所述甘油單元的多個OH基團被-OSO3H或-0S03_M+取代，使得-OSO3H或_0S03_M+基團的數量大于16，并且獲得30至100%的硫酸化度X，其中M+是陽離子性無機或有機反離子，c)由此產生的所述硫酸化聚甘油的平均分子量為1，000至5，000，000g/mol，優(yōu)選為 4，000 至 50，000g/mol，更優(yōu)選為 6，000 至 30，000，最優(yōu)選為 10，000 至 20，000g/mol。根據本發(fā)明，“支化度”是指通過聚合過程中甘油單元的兩個可用OH基團都與兩個其他單體分子(在陰離子聚合的情況下是縮水甘油)的反應獲得的支化的程度。支化度為O表示完全直鏈的聚甘油，沒有甘油單元附著于甘油單元的兩個OH基團上。67% (2/3)的支化度是對于高支化聚甘油來說理論上可獲得的最大值，意味著甘油單元的所有OH基團都已與兩個其他甘油單元反應。根據本發(fā)明，使用20至67%支化的聚合的聚甘油核心。優(yōu)選使用高度支化的結構，優(yōu)選具有30至67%、更優(yōu)選50至67%的支化度，特別優(yōu)選具有高于60%的支化度。聚合的聚甘油核心通過在縮水甘油的開環(huán)聚合期間分別使用(多)官能起始分子或引發(fā)劑來生產。起始分子或引發(fā)劑分別是具有I至1，000、優(yōu)選I至100、更優(yōu)選I至10、最優(yōu)選I至4個OH基團的多羥基化合物。起始分子具有通式R-(OH)x，其中R可以是在陰離子聚合條件下穩(wěn)定的任何分子，X是I至1，000、優(yōu)選I至100、更優(yōu)選I至10、最優(yōu)選I至4。優(yōu)選，所使用的引發(fā)劑是三或四官能引發(fā)劑，例如1，1，I-三羥基甲基丙烷(TMP)或1，1，I-三羥基甲基乙烷(TME)作為優(yōu)選的三官能引發(fā)劑，或季戊四醇(PE)作為優(yōu)選的四官能引發(fā)劑。起始分子或引發(fā)劑分別能夠攜帶其他官能團，例如特別是SH基團、NH2基團。在具體實施方案中，起始分子含有OH基團和/或其他異質官能團(例如用適合的保護基團衍生的SH、NH2)。另一種起始分子可以是具有3個以上、優(yōu)選10個以上、更優(yōu)選20個以上OH基團的小的聚合的聚甘油。其他適合的引發(fā)劑、異質官能團和保護基團，對于本技術領域的專業(yè)人員來說是已知的。根據本發(fā)明，術語“聚甘油核心”是指在多官能起始分子上通過聚合過程產生的具有式(RO-CH2)2CH-OR的甘油重復單元構成的聚合分子。因此，核心只包含游離羥基和C、H、O元素。核心的分子量可以通過例如質譜術(MALDI)測定。核心經歷進一步衍生化或官能化，產生本發(fā)明的化合物。這些官能化包括使用本技術領域的專業(yè)人員已知的適合試劑進行硫酸化，或包括連接物分子的共價連接。優(yōu)選，使用SO3和吡啶的復合物作為硫酸化試劑。該試劑將-OH基團轉變成-OSO3H或-0S03_Na+基團。所述硫酸化試劑優(yōu)選以對應于所需硫酸化度的濃度使用。這意味著硫酸化試劑以相對于待轉化的聚合的聚甘油核心的OH基團等摩爾或更高摩爾當量的濃度使用。因此，可以通過SO3與聚甘油的OH基團的比率來調整 所得到的官能化，即硫酸化。根據本發(fā)明，“硫酸化度”是指聚合的聚甘油核心的甘油單元的官能化(硫酸化)OH基團相對于總OH基團數的百分數。官能化得自于甘油單元的一個或多個OH基團被-OSO3H或-0S03_M+基團的取代，或得自于帶有-OSO3H或-0S03_M+基團的低聚間隔基團在甘油單元的一個或多個OH基團處的連接。陽離子性反離子M+選自無機堿金屬鈉、鉀、鋰、鈣或有機陽離子化合物葡甲胺、賴氨酸、甘氨酸或其混合物。優(yōu)選的是產生-0S03_Na+基團的鈉。對于多元醇、特別是聚甘油來說，本發(fā)明提供的數據表明，聚合物的分子量參數以及羥基的硫酸化度，對于提高與細胞內靶的結合親和性來說是重要的。意外地發(fā)現，硫酸化度的增加和分子量的增加兩者都增加與NF- κ B的結合親和性。這種增加是出乎意料的，并且是所述分子的新性質的強力指示。因此，優(yōu)選的硫酸化聚甘油是核心分子量高于3，OOOg/mol、更優(yōu)選高于6，000g/mol、更加優(yōu)選高于10，000g/mol的聚甘油。優(yōu)選的硫酸化度高于38%，更優(yōu)選高于50%，更加優(yōu)選高于76%，更優(yōu)選高于86%，最加優(yōu)選高于90%。優(yōu)選的值和100%的最大可實現程度被理解為是基于通過硫的元素分析得到的測量值的±5%的通用標準誤差。取決于引發(fā)劑和聚合條件的選擇，聚合的聚甘油核心達到一定支化度和可任意調整的平均分子量，所述分子量不是確定的分子量，而是覆蓋一定分子量范圍的分布。這種所謂的多分散性可以由多分散性指數(PDI)來描述。PDI被定義為Mw/Mn，其中Mw是重均分子量，Mn是數均分子量。高硫酸化聚甘油的優(yōu)選多分散性指數低于2. 3，更優(yōu)選低于I. 8，最優(yōu)選低于I. 5。用于描述聚甘油核心的平均分子量是數均分子量Mn。如上所述,硫酸化反應對本技術領域的專業(yè)人員來說是已知的。硫酸化優(yōu)選通過使用三氧化硫復合物(吡啶-SO3、三甲胺-SO3、三乙胺-SO3、二甲基甲酰胺-SO3)來實現。硫酸化在分離的聚甘油上執(zhí)行，或在聚合反應后通過向聚合反應器直接加入硫酸化試劑在一個步驟中執(zhí)行。這種用于獲得本發(fā)明的硫酸化聚甘油的一步程序是新的，并且以前未被描述。通過改進硫酸化條件，將硫酸化度提高到超過現有技術水平。硫酸化試劑的I. 2倍過量與在至少18小時的反應時間內將反應溫度維持在高于80°C、優(yōu)選高于90°C相組合，適合于獲得高于85%的硫酸化度。令人吃驚的是，沒有檢測到分解和副產物。意外地發(fā)現，對硫酸化聚甘油所演示的附著于大分子的附加連接物單元，不妨礙本發(fā)明的作用方式和化合物的使用。在實施例11中顯示了用連接物進行修飾導致與沒有連接物的硫酸化聚甘油相比，與NF- K B的結合親和性具有相同的IC5tl值。使用連接物修飾的合成方法，然后進行硫酸化和去保護步驟，以產生具有反應性官能團的衍生物，這顯示出可以獲得與診斷和/或治療性效應分子的有效的共價結合。W02008/015015宣稱了帶有信號傳導分子的聚甘油硫酸鹽，然而沒有講授通過合理的連接物修飾獲得這樣的結合物的詳細合成信息，并且沒有示例所述結合物。W02008/015015沒有提供關于信號傳導分子的化學詳情以及如何使用的技術解決方案。此外，沒有提供也不清楚使支持所使用的術語“荷載”或“結合于”的合成化學類型。連接物單元L是附著于至少一個OH基團的帶有官能團的烷基，官能團G有能夠與其他治療性或診斷性效應分子E結合的潛力。根據本發(fā)明，連接物連接于至少一個OH基團，由此形成醚、羧酸酯、磺酸酯、氨基甲酸酯、硫代氨基甲酸酯、脲、硫脲、三唑鍵。本發(fā)明的帶有附加連接物的聚甘油硫酸鹽是新的，并且以前未被描述過。因此，在實施方案的更詳細描述中，本發(fā)明的化合物是具有連接物的硫酸化聚甘油 P (OSO3IT)n (L-G)m，其包含a)聚合的聚甘油P，其由多官能起始分子上的具有式(RO-CH2)2CH-OR的甘油重復單元構成，所述多官能起始分子是具有I至1，000個OH基團、優(yōu)選I至4個OH基團的多羥基化合物，其中R是H或其他甘油單元，所述核心具有O至67%、優(yōu)選20至67%、更優(yōu)選高于60% 的支化度，以及 500 至 1，000, 000g/mol、優(yōu)選 2，000 至 20，000g/mol、更優(yōu)選 4，000 至15，000g/mol、最優(yōu)選7，000至10，000g/mol的平均分子量，b)所述甘油單元的多個OH基團被-OSO3H 或-OSCVM+取代，其中-OSO3H或_0S03_M+基團的優(yōu)選數量大于10，并且獲得30至100%的硫酸化度X，其中M+是陽離子性無機或有機反離子，c)所述硫酸化聚甘油由此產生的平均分子量為1，000至5，000，000g/mol，優(yōu)選為4，000 至 50，000g/mol，更優(yōu)選為 6，000 至 30，000，最優(yōu)選為 10，000 至 20，000g/mol,d)帶有官能團G的連接物單元L，其連接于至少一個OH基團直至最多100-X%的OH基團，其中所述官能團有能夠與其他治療性或診斷性效應分子結合的潛力，其中X是硫
酸化度。優(yōu)選的是式(I)、(II)或(III)的硫酸化聚甘油
權利要求
1.藥物組合物，其包含硫酸化聚甘油以及與所述硫酸化聚甘油共價結合的的治療性或診斷性效應分子。
2.權利要求I的藥物組合物，其為式P(OSO3IT)n(L-G-E)m,P是多元醇大分子，其中數量為n的羥基被硫酸鹽基團OSO3-M+取代，M是陰離子性硫酸根基團的陽離子性無機或有機反離子，E是治療性或診斷性效應分子，L是P與E之間的連接物或間隔基團，G是用于在L與E之間進行共價連接的反應性基團，和m是1-100的數目。
3.權利要求I或2的藥物組合物，其通過所述硫酸化聚甘油和治療性或診斷性效應分子細胞內攝入到活化細胞或增殖細胞中，并通過在所述細胞中抑制NF- K B和/或AP-I和/或抑制TGF- ^合成，來治療疾病。
4.結合物，其包含硫酸化聚甘油和與所述硫酸化聚甘油共價結合的治療性或診斷性效應分子。
5.權利要求4的結合物，其為式P(OSO3IT)n(L-G-E)m,P是多元醇大分子，其中數量為n的羥基被硫酸鹽基團OSO3-M+取代，M是陰離子性硫酸根基團的陽離子性無機或有機反離子，E是治療性或診斷性效應分子，L是P與E之間的連接物或間隔基團，G是用于在L與E之間進行共價連接的反應性基團，和m是1-100的數目。
6.權利要求4或5的結合物，其為式P(OSO3IT)n(L-G-E)m，其中數量為n的羥基被硫酸鹽基團OSO3IT取代，且n是大于10的數目。
7.權利要求4至6的結合物，其中所述效應分子占所述結合物的小于50重量％，并且所述結合物在水中的溶解度在100mg/mL以上。
8.權利要求4至7的結合物，其包含硫酸化聚甘油以及與所述硫酸化聚甘油共價結合的治療性或診斷性效應分子以通過細胞內攝入到活化細胞或增殖細胞中并通過在所述細胞中抑制NF- K B和/或AP-I和/或抑制TGF- ^合成來治療疾病。
9.權利要求4至8的結合物，其包含硫酸化聚甘油以及與所述硫酸化聚甘油共價結合的治療性或診斷性效應分子以治療選自癌癥、炎癥、自體免疫疾病和纖維化的疾病。
10.權利要求4至9的結合物，其包含硫酸化聚甘油以及與所述硫酸化聚甘油共價結合的治療性或診斷性效應分子以按照權利要求3或4來治療疾病，其中以每次給藥lmg/kg至1000mg/kg的劑量進行多次治療。
11.權利要求4至10的結合物，其包含 a)聚合的聚甘油P，其由在多官能起始分子上的式(RO-CH2)2CH-OR的甘油重復單元構成，所述多官能起始分子是具有I至1，000個OH基團的多羥基化合物，其中R是H或其他甘油單元，核心具有0至67%的支化度、500至1，000, 000g/mol的平均分子量， b)所述甘油單元的多個OH基團被-OSO3H或-0S03_M+取代，其中-OSO3H或_0S03_M+基團的優(yōu)選數目大于10，并且獲得30至100%的硫酸化度X，其中M+是陽離子性無機或有機反離子， c)由此產生的硫酸化聚甘油的平均分子量為1，000至5，000，000g/mol, d)帶有官能團G的連接物單元L，其連接于至少一個OH基團直至最多100-X%的OH基團，官能團能夠與其他治療性或診斷性效應分子結合，其中X是硫酸化度， e)診斷性和/或治療性效應分子，其共價連接于一個直至最大可能數量的所述官能團，診斷性效應分子選自熒光染料或用于放射活性或順磁性金屬的螯合劑，并且治療性效應分子選自細胞抑制劑、抗血管生成藥物、光敏化劑、siRNA。
12.權利要求5至11的結合物，其為式P(OSO3IT)n(L-G-E)m，其中L是支鏈或直鏈C1^20-烷基，所述烷基中一個或多個不連續(xù)的亞甲基可以被選自O、S、NH、C (0) NH、C (0)、SO2,SO、芳基、乙烯或乙炔的基團代替，并且其中G選自-oh、-oso3h、-oso3_、-nh2、-n3、-cooh、-sh、~S03、_C 三 Co
13.—種通式P(OSO3IT)n(L-G)m的硫酸化聚甘油，其通過細胞內攝入到活化細胞或增殖細胞中并通過在所述細胞中抑制NF-k B和/或AP-I和/或抑制TGF-P合成來治療疾病，其中P表示聚甘油，所述聚甘油中數量為n的羥基被硫酸鹽基團OSO3-M+取代，M是陰離子性硫酸根基團的陽離子性無機或有機反離子，m是1-100的數目，L是連接物，G是用于與效應分子共價連接的反應性基團，其中L是支鏈或直鏈C1,-烷基，所述烷基中一個或多個不連續(xù)的亞甲基可以被選自O、S、NH、C (0) NH、C (0)、SO2, S0、芳基、乙烯或乙炔的基團代替，并且其中 G 選自-OH、-OSO3H' -OSO3' -NH2、-N3> -C00H、_SH、-SO3' -C = C。
14.權利要求13的硫酸化聚甘油，其通過細胞內攝入到活化細胞或增殖細胞中，并通過在所述細胞中抑制NF- K B和/或AP-I和/或抑制TGF- ^合成，來治療選自癌癥、炎癥、自體免疫疾病和纖維化的疾病。
15.權利要求13的硫酸化聚甘油，其通過細胞內攝入到活化細胞或增殖細胞中并通過在所述細胞中抑制NF-k B和/或AP-I和/或抑制TGF-P合成來治療選自癌癥、炎癥、自體免疫疾病和纖維化的疾病，其中以每次給藥lmg/kg至1000mg/kg的劑量進行多次治療。
16.權利要求4、5和6的硫酸化聚甘油用于將治療性或診斷性效應分子遞送到對象的活化或增殖細胞內的用途。
17.權利要求13和14的硫酸化聚甘油用于將治療性或診斷性效應分子遞送到對象的活化或增殖細胞內的用途。
18.權利要求16和17的硫酸化聚甘油的用途，其中所述治療性或診斷性效應分子與所述硫酸化聚甘油共價連接。
19.權利要求4的硫酸化聚甘油的無水制劑。
20.權利要求13的硫酸化聚甘油的無水制劑。
21.權利要求19和20的無水制劑，其通過細胞內攝入到活化細胞或增殖細胞中，并通過在所述細胞中抑制NF- K B和/或AP-I和/或抑制TGF- ^合成，來治療疾病。
22.權利要求19和20的無水制劑，其用于治療選自癌癥、炎癥、自體免疫疾病和纖維化的疾病。
23.權利要求19和20的無水制劑,其中以每次給藥lmg/kg至1000mg/kg的劑量進行多次治療。
24.權利要求19和20的無水制劑，其包含含有緩沖鹽和/或選自蔗糖、甘露糖、海藻糖的至少一種低溫防護劑的冷凍干燥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及使用聚陰離子多價大分子對參與活化細胞的增殖和蛋白質合成的細胞內分子進行靶向的方法和組合物。具體來說，將與多元醇相連的多個硫酸鹽基團特異性靶向增殖和活化細胞的細胞質和細胞核。本發(fā)明還包含新的聚陰離子大分子化合物和制劑。
文檔編號A61K47/48GK102781478SQ201180008313
公開日2012年11月14日 申請日期2011年1月31日 優(yōu)先權日2010年2月3日
發(fā)明者凱·理查, 弗洛里安·保勒斯, 皮婭·維克爾, 米歇爾·席爾內, 萊內爾·哈格, 馬里·維恩哈特 申請人:米韋林有限公司